JP5409361B2 - 猫免疫不全ウイルスワクチン接種猫の検査方法、および該検査用抗原 - Google Patents
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Description
〔1〕 猫のFIVワクチン接種歴の有無を検査する方法であって、猫へのFIVワクチンの接種により産生され、FIV感染によっては産生されない抗体を検出することを特徴とする検査方法、
〔2〕 抗原抗体反応法によって前記抗体が検出された場合に、被検猫はFIVワクチン接種歴が有るものと判定する、〔1〕に記載の検査方法、
〔3〕 猫への接種により抗体が産生され得る物質を、前記抗原抗体反応法における抗原として用いる、〔2〕に記載の検査方法、
〔4〕 前記物質がFIVワクチンに含まれる物質(ただし、FIVもしくはFIV由来の物質を除く)である、〔3〕に記載の検査方法、
〔5〕 前記物質が細胞を構成する物質である、〔3〕に記載の検査方法、
〔6〕 前記細胞を構成する物質が、細胞膜、細胞質、核、または細胞骨格である、〔5〕に記載の検査方法、
〔7〕 前記細胞が猫由来の細胞である、〔5〕または〔6〕に記載の検査方法、
〔8〕 前記細胞が猫以外の動物由来の細胞である、〔5〕または〔6〕に記載の検査方法、
〔9〕 被検猫由来の血清、血漿、または全血を被検試料とする、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の検査方法、
〔10〕 〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の検査方法において抗原として用いられる物質を有効成分とする、FIVワクチン接種猫検査薬、
〔11〕 前記物質が細胞を構成する物質である、〔10〕に記載のFIVワクチン接種猫検査薬、
〔12〕 前記細胞を構成する物質が、細胞膜、細胞質、核、または細胞骨格である、〔11〕に記載のFIVワクチン接種猫検査薬、
〔13〕 前記細胞が猫由来の細胞である、〔12〕に記載のFIVワクチン接種猫検査薬、
〔14〕 前記細胞が猫以外の動物由来の細胞である、〔12〕に記載のFIVワクチン接種猫検査薬、
を提供するものである。
また本発明は以下を提供する。
〔15〕 猫へのFIVワクチンの接種により産生され、FIV感染によっては産生されない抗体を検出する工程を含む、猫のFIVワクチン接種歴の有無を検査する方法であって、抗原抗体反応法によって前記抗体が検出された場合に被検猫はFIVワクチン接種歴が有るものと判定され、前記抗体が検出されない場合に被検猫はFIVワクチン接種歴が無いものと判定される検査方法。
〔16〕 〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の検査方法において抗原として用いられる物質の、FIVワクチン接種猫検査薬の製造における使用。
本発明は猫について、FIVワクチン接種歴の有無を検査する方法を提供する。本発明の検査方法の好ましい態様としては、猫へのFIVワクチンの接種により産生され、FIV感染によっては産生されない抗体を検出することを特徴とする方法である。
1.猫の飼育環境中には存在しないか、猫が曝露される可能性が無い、あるいは極めて低い物質
2.猫に施用されるワクチンや医薬品中には存在しない物質
3.通常の(免疫前の)猫の血清とは反応しない物質
4.抗原性を有する物質
5.猫に対して無害(毒性が低い)である物質
<材料と方法>
RPMI1640培養液で培養したFeT-J細胞を、リン酸緩衝食塩水(PBS−)で2回洗浄し、細胞数が約2.0×107/mLになるようにPBS−に再浮遊した。この細胞浮遊液にTritonX-100を最終濃度0.05%になるように加え、4℃で1時間、ゆっくり撹拌して細胞を溶解した。このうち一部を20,000×g、10分間遠心し、回収した上清を0.2μmフィルターでろ過したものをホルマリン未処理抗原とした。残りにはホルマリンを最終濃度0.3%になるように加え、室温で36時間以上撹拌してホルマリン処理(固定)した。これを20,000×g、10分間遠心し、回収した上清を0.2μmフィルターでろ過したものをホルマリン処理抗原とした。
FIVワクチン群の全ての血清は、FeT-J細胞から調製したELISA抗原に対して、強く反応した。この際、抗原にホルマリン処理を施すことにより、FIVワクチン群の血清に対する反応性がO.D.値の比にして1.9〜5.6倍も高くなることが確認された(表1)。一方、FIV感染群の血清は、ホルマリン未処理抗原に対してもホルマリン処理抗原に対しても、ほとんど反応を示さなかった(表1)。
<材料と方法>
SPF猫12頭に、市販の猫3種混合ワクチン(猫汎白血球減少症ウイルス、猫カリシウイルス、猫伝染性鼻気管炎ウイルス)を接種し、3種混合ワクチン群とした。SPF猫4頭に、市販の猫白血病ワクチンを接種し、猫白血病ワクチン群とした。SPF猫4頭に、猫3種混合ワクチンと猫白血病ワクチンを接種し、猫3種+猫白血病ワクチン群とした。これらのワクチンはいずれも2週間隔で2回接種し、2回目のワクチン接種の2週後に採取した血清を検体とした。FIVワクチン群は、SPF猫14頭にFIVワクチンを3週間隔で3回接種し、3回目のワクチン接種の3週後に採取した血清を検体とした。
FIVワクチン群では細胞成分に対して強い反応が認められた。一方、猫3種混合ワクチン群、猫白血病ワクチン群および猫3種+猫白血病ワクチン群では、僅かに細胞成分に反応している個体も見られたが、いずれの群も、細胞成分に対する反応性は、FIVワクチン群に比較して明らかに低いものであった(図1)。
従って、このような細胞成分に対する血清の反応性は、FIVワクチンを接種した猫に特異的なものであることが示された。
<材料と方法>
猫のリンパ球に由来する細胞株であるFeT-J細胞および3201細胞、猫の腎臓に由来する細胞株であるCRFK細胞、猫の胎仔に由来する細胞株であるfcwf-4細胞、およびアフリカミドリザルの腎臓に由来する細胞株であるVero細胞を用いた。それぞれの細胞を培養し、実施例1と同様にして可溶化およびホルマリン処理をおこない、ELISA用抗原とした。
ELISAを実施例2と同様にしておこない、各細胞の細胞成分に対する反応性の違いを確認した。
FIVワクチン群の血清は、猫由来のいずれの細胞株の細胞成分に対しても高い反応を示した。加えて、サル由来であるVero細胞の細胞成分に対しても高い反応を示した。一方、FIV感染猫血清は、どの細胞株の細胞成分に対しても反応しなかった(図2)。
<材料と方法>
FeT-J細胞を、市販の細胞分画キット(Calbiochem, Subcellular ProteoExtract Kit)を用いて、細胞質、細胞膜、細胞核および細胞骨格に分画した。各分画を実施例1と同様にしてホルマリン処理し、ELISA用抗原とした。各分画のELISA用抗原は、蛋白質量が200 ng/wellとなるように固相化用緩衝液で希釈し、96穴ELISAプレートに固相化した。
ELISAを実施例2と同様にしておこなった。
FIVワクチンを接種した猫の血清は、いずれの細胞分画とも反応を示し、特に細胞膜と細胞骨格に強く反応した。一方、FIV感染猫の血清はいずれの細胞分画とも反応せず、猫3種混合ワクチンを接種した猫の血清では微弱な反応を示すのみであった(表2)。
<材料と方法>
FeT-J細胞を、細胞数が約2.0×108/mLになるようにPBS−に浮遊し、出力200 W、10分間の超音波処理を施して細胞を破砕した。これを実施例1と同様にしてホルマリン処理し、20,000×g 10分間遠心した上清を0.2μmフィルターでろ過してFeT-J細胞成分抗原とした。
FIVワクチン接種猫血清は、TM peptide抗原とFeT-J細胞成分抗原のいずれに対しても反応を示した。一方、FIV感染猫血清は、TM peptide抗原に対して強い反応を示したが、FeT-J細胞成分抗原に対しては反応しなかった。また、SPF猫血清は、どちらの抗原に対しても反応を示さなかった(図3)。
従って、ドットブロット法を用いても、細胞成分に対する血清の反応性を調べることにより、FIVワクチン接種猫とFIV感染猫を区別できることが示された。
<材料と方法>
粒径40 nmの金コロイド溶液1 mLに、pH8.0になるように0.1 M炭酸カリウムを1μL添加し、更に0.5 mg/mL抗猫IgG山羊血清を40μL添加して撹拌後、室温で1時間静置した。次に、10%BSA加2 mM Borax溶液を100μL添加して撹拌後、室温で1時間静置した。15,000 rpmで10分間遠心して上清を除去し、沈殿を1 mLの標識抗体保存液(1%BSA, 0.15 M NaCl, 0.1%NaN3, 10 mM Tris-HCl, pH8.0)で再浮遊した。再度15,000 rpmで10分間遠心して上清を除去し、沈殿を0.25 mLの標識抗体保存液に再浮遊して金コロイド標識抗猫IgG抗体とした。
FIVワクチン接種猫血清では、陽性ラインと対照ラインが確認された。一方、FIV感染猫血清とSPF猫血清では、対照ラインのみが確認された(図4)。
従って、細胞成分を用いたワクチン接種猫の鑑別診断法は、簡易診断法として一般的に用いられるイムノクロマト法にも応用可能であることが示された。
Claims (9)
- 猫のFIVワクチン接種歴の有無を検査する方法であって、猫へのFIVワクチンの接種により産生され、FIV感染によっては産生されない抗体を検出することを特徴とする検査方法であり、ここで、前記抗体がFIVの培養に使用される培養細胞の細胞成分に対するものであり、抗原抗体反応法によって前記抗体が検出された場合に、被検猫はFIVワクチン接種歴が有るものと判定し、猫への接種により抗体が産生され得る物質を、該抗原抗体反応法における抗原として用いる方法であり、さらにここで、該物質がFIVワクチンに含まれる物質(ただし、FIVもしくはFIV由来の物質を除く)であり、かつ、該物質はFIVの培養に使用される培養細胞を構成する物質である、検査方法。
- 前記細胞を構成する物質が、細胞膜、細胞質、核、または細胞骨格である、請求項1に記載の検査方法。
- 前記細胞が猫由来の細胞である、請求項1または2に記載の検査方法。
- 前記細胞が猫以外の動物由来の細胞である、請求項1または2に記載の検査方法。
- 被検猫由来の血清、血漿、または全血を被検試料とする、請求項1〜4のいずれかに記載の検査方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の検査方法において抗原として用いられる物質を有効成分とする、FIVワクチン接種猫検査薬。
- 前記細胞を構成する物質が、細胞膜、細胞質、核、または細胞骨格である、請求項6に記載のFIVワクチン接種猫検査薬。
- 前記細胞が猫由来の細胞である、請求項7に記載のFIVワクチン接種猫検査薬。
- 前記細胞が猫以外の動物由来の細胞である、請求項7に記載のFIVワクチン接種猫検査薬。
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