JPH11346768A - イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質の抗原性を有する蛋白質及び抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗体測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド
蛋白質の抗原性を有する蛋白質、及び抗ＣＤＶ−ＮＰ抗
体測定試薬を提供する。 【解決手段】 平均分子量が約５８キロダルトンであ
り、かつパラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属
するイヌジステンパーウイルス(Canine DistemperViru
s)の構成蛋白質の一つであるヌクレオカプシド蛋白質の
抗原性を有することを特徴とする蛋白質、及び該蛋白質
を担体又は膜に固定した抗原を有効成分として含有する
抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗
体検出試薬。 【効果】 特別な機器及び熟練を必要とすること無く、
簡単、迅速、かつ正確に抗ＣＤＶ−ＮＰ抗体を測定する
ことが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、パラミクソウイル
ス科モルビリウイルス属に属するイヌジステンパーウイ
ルス(Canine Distemper Virus:以下、ＣＤＶと記載する
ことがある。）の構成蛋白質の一つであるヌクレオカプ
シド蛋白質（以下、ＮＰと記載することがある。）の抗
原性を有する蛋白質、及び該蛋白質を担体又は膜に固定
した抗原を有効成分として含有する抗イヌジステンパー
ウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗体測定試薬、に関す
る。本発明の試薬によれば、熟練技術者を必要とするこ
となく、検体（血清）の採取現場において、イヌジステ
ンパーウイルス感染の診断、ワクチンの効果の判定、及
び接種時期の判定等を、簡便、正確、かつ迅速に行うこ
とが可能であり、本発明の試薬は、獣医学上その意義は
極めて大きいものである。尚、本明細書において「イヌ
ジステンパーウイルスのヌクレオカプシド蛋白質」と
は、該ウイルス粒子中の核酸（ＲＮＡ）に結合している
蛋白質自体を意味し、核酸と蛋白質との複合体を意味す
るものではない。また、百分率は特に断りのない限り重
量による値である。

【０００２】

【従来の技術】イヌジステンパーは、麻疹ウイルス、牛
疫ウイルス等と同一のパラミクソウイルス科モルビリウ
イルス属に属するＣＤＶにより惹起されるイヌの伝染病
の一種である。ＣＤＶは、６種類の蛋白質から構成され
ており、それらの中でＣＤＶ−ＮＰの占める割合が最も
大きいことが知られている［ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・ウイロロジー(Journal of General Virology) 、
第６４巻、第１２０５ページ、１９８３年］。ＣＤＶ
は、主として肉食動物に感染し、強い神経親和性及び神
経毒性を有し、特にイヌに対して高い頻度で急性脳炎、
亜急性又は慢性脳炎（老犬脳炎：old dog encephaliti
s) を惹起し、死に至らしめることが知られている（獣
医学、第７巻、第２７ページ、１９９０年）。また、イ
ヌジステンパーは、ミンク、キツネ等の毛皮生産のため
に飼養されている動物に空気感染することが知られてい
るので（畜産大事典編集委員会編、「新編畜産大事
典」、第１１８１ページ、養賢堂、１９９６年）、これ
らの産業にとってもその影響は大きい。

【０００３】わが国では、イヌへのジステンパーワクチ
ン接種は任意接種となっているが、最近の研究によれ
ば、イヌジステンパーの症例の増加が報告されており
［ジャーナル・オブ・ベタリナリー・メディカル・サイ
エンス(Journal of Veterinaly Medical Science) 、第
５８巻、第５４７ページ、１９９６年］、昨今のペット
ブームに伴う飼い犬の増加から、ワクチン接種の必要性
の有無を、簡便、かつ迅速に判定することが可能な試薬
の開発が待望されている。

【０００４】従来、ＣＤＶ感染の診断方法として、感染
動物の組織学的観察又は組織及び体液からのウイルス粒
子の確認がある。これらの方法は、いずれも、検体中の
ウイルス力価が高く、極めて限定された時期に検体を採
取して、直ちに検査を行うことが必要であるが、これら
の方法は、検査を行う特別な機器及び熟練技術者が必要
であり、かつ結果の判定までに長時間を要するという欠
点があった。一方、ＣＤＶ感染を血清学的に診断する方
法としては、血清中に存在するＣＤＶに対する抗体を検
出する方法が一般的であり、例えば、ウイルス中和試験
法［国立予防衛生研究所学友会編、「ウイルス実験学各
論（改訂２版）」、第５２ページ、第７２ページ及び第
１３２ページ、丸善、１９８２年］、及び最近開発され
た酵素免疫測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assa
y：以下、ＥＬＩＳＡ法と記載する。) が知られている
［ジャーナル・オブ・ベタリナリー・メディカル・サイ
エンス(Journal of Veterinary Medical Science) 、第
５７巻、第７６１ページ、１９９５年］。

【０００５】しかしながら、これらの方法は、いずれも
測定の操作が標準化されていないこと、操作が煩雑であ
ること、操作に熟練を要すること、特別な機器を要する
こと、結果の判定に長時間を要すること等から、簡便性
及び実用性に乏しいという欠点があった。ＣＤＶ感染の
診断、ワクチンの接種による抗体獲得の調査を、簡便、
迅速、かつ高い信頼度で行うためには、ＣＤＶに含まれ
る物質（抗原性物質）を効率良く量産し、抗原抗体反応
により検出することが、最も望ましいことである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、抗ＣＤ
Ｖ−ＮＰ抗体に対して抗原性を有する蛋白質の効率的な
製造方法、及び該蛋白質を抗原として用いる抗ＣＤＶ−
ＮＰ抗体測定試薬の製造方法を開発するために鋭意研究
を重ねた結果、バキュロウイルスに属する夜盗蛾核多角
体病ウイルス(Autographa Californica Nuclear Polyhe
dorosis Virus:以下、ＡｃＮＰＶと記載することがあ
る。）の多角体蛋白質構造遺伝子を、ＣＤＶ−ＮＰをコ
ードする遺伝子領域（ＲＮＡ）に相補的なＤＮＡ配列に
より組換えた組換えバキュロウイルスを、昆虫細胞(Spo
doptera frugiperda Cell:以下、Ｓｆ細胞と記載す
る。）に感染させた組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ細
胞より採取した物質が、本来のＣＤＶ−ＮＰに極めて類
似する性質を有すること、及び該蛋白質を担体又は膜に
固定した試薬が抗ＣＤＶ−ＮＰ抗体と特異的に、かつ鋭
敏に反応することを見い出し、本発明を完成した。

【０００７】即ち、本発明の目的は、ＣＤＶ−ＮＰの抗
原性を有する蛋白質を提供することである。本発明の他
の目的は、ＣＤＶの診断、ＣＤＶワクチン接種による抗
体獲得の調査、ＣＤＶワクチンの接種時期の判定等を、
特別な機器及び熟練技術者を要することなく、簡便、迅
速、かつ高い信頼度で実施し得る試薬を提供することで
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明の第一の発明は、平均分子量が約５８キロダルトンで
あり、かつパラミクソウイルス科モルビリウイルス属に
属するイヌジステンパーウイルス(Canine Distemper Vi
rus)の構成蛋白質の一つであるヌクレオカプシド蛋白質
の抗原性を有することを特徴とする蛋白質であり、本発
明は、該蛋白質が、該蛋白質をコードする遺伝子領域と
相補的な配列を有するＤＮＡを組込んだ組換えバキュロ
ウイルスを昆虫由来の細胞に感染させた組換えバキュロ
ウイルス感染昆虫細胞から採取され、配列番号２に記載
されたアミノ酸配列を有することを望ましい態様として
いる。

【０００９】前記課題を解決する本発明の第二の発明
は、平均分子量が約５８キロダルトンであり、かつパラ
ミクソウイルス科モルビリウイルス属に属するイヌジス
テンパーウイルス(Canine Distemper Virus)の構成蛋白
質の一つであるヌクレオカプシド蛋白質の抗原性を有す
る蛋白質を担体又は膜に固定した抗原を有効成分として
含有する抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド
蛋白質抗体検出試薬であり、本発明は、該蛋白質が、該
蛋白質をコードする遺伝子領域と相補的な配列を有する
ＤＮＡを組込んだ組換えバキュロウイルスを昆虫由来の
細胞に感染させた組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞
から採取され、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を
有すること、膜が、合成高分子膜、又は天然高分子膜で
あること、及び担体が、合成高分子、天然高分子、又は
金属高分子であることを望ましい態様としている。

【００１０】

【発明の実施の形態】次に、本発明について更に詳細に
説明する。以下、まず、本発明の第一の発明であるＣＤ
Ｖ−ＮＰの抗原性を有する蛋白質について説明する。本
発明のＣＤＶ−ＮＰの抗原性を有する蛋白質は、ＣＤＶ
−ＮＰをコードする遺伝子領域と相補的な配列を有する
ＤＮＡを、ＡｃＮＰＶの多角体蛋白質構造遺伝子プロモ
ーター領域に、作用可能な状態で組込んだバキュロウイ
ルスに感染したＳｆ細胞から採取する。本発明のＣＤＶ
−ＮＰの抗原性を有する蛋白質の産生に必要な組換えバ
キュロウイルスの製造方法は公知の方法であり、次に、
その代表的な製造方法を例示するが、本発明は以下に例
示した方法に限定されるものではない。ＣＤＶ（例え
ば、ＨＫ株等）から、ＮＰをコードする遺伝子ＲＮＡと
相補的なＤＮＡ配列を含む配列を常法により調製し、そ
のＤＮＡをバキュロウイルス転移ベクターのクローニン
グ部位に挿入し、組換えベクターを製造する。組換えバ
キュロウイルスの作出法の概略を模式的に示したのが図
１であり、その方法を、この図に基づいて説明すれば次
のとおりである。

【００１１】１）ＣＤＶ−ＮＰをコードする遺伝子 ＣＤＶは、パラミクソウイルス科モルビウリウイルス属
のＲＮＡウイルスであり、そのウイルス粒子の構成蛋白
質であるＮＰをコードする遺伝子の塩基配列は、例え
ば、Onderstepoort 株について知られている［ジャーナ
ル・オブ・ウイロロジー(Journal of Virology) 、第５
３巻、第６８４ページ、１９８５年、及びウイロロジー
(Virology)、第１９３巻、第６６ページ、１９９３
年］。ＣＤＶ−ＮＰをコードする遺伝子領域は、公知の
手段により取得することが可能であり、例えば、ＨＫ株
から次の方法により取得することができる。

【００１２】ＣＤＶに感染したアフリカミドリザル腎
（Ｖｅｒｏ）細胞の培養上清よりウイルス粒子を超遠心
分離し、得られたウイルス粒子からゲノムＲＮＡを抽出
する。ＣＤＶゲノムＲＮＡの回収は、ウイルス粒子をプ
ロテイナーゼＫ及びソジウムドデシル硫酸存在下で加温
処理し、これをフェノール：クロロホルム：イソアミル
アルコール溶液（２５：２４：１）により抽出し、取得
することができる。

【００１３】回収されたゲノムＲＮＡを鋳型とし、ま
た、現在までに公知となっている塩基配列［ジャーナル
・オブ・ウイロロジー(Journal of Virology) 、第５３
巻、第６８４ページ、１９８５年、及びウイロロジー(V
irology)、第１９３巻、第６６ページ、１９９３年］を
参考にして、任意に合成ＤＮＡプライマーを作製し、逆
転写反応及びポリメラーゼ・チェイン反応（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ法）により目的の遺伝子断片を増幅させ、適当なプラ
スミドＤＮＡ、例えば、ｐＵＣ１９上にクローニングす
る。得られた遺伝子断片が目的の遺伝子断片であるか否
かについては、この遺伝子断片の塩基配列を決定し、既
知の遺伝子配列と比較することにより、類推することが
でき、更に、該遺伝子断片を各種真核細胞発現用のプラ
スミドＤＮＡに挿入し、リン酸カルシウム法により各種
細胞に導入し、抗イヌジステンパーウイルス抗体と反応
する５８キロダルトンの蛋白質の発現を確認することに
より、得られた遺伝子断片が、目的とする断片であるこ
とを確認することができる。より具体的には、後記する
実施例において詳記するが、このＤＮＡは、配列番号１
に記載したＤＮＡ配列を有している。

【００１４】２）ｃＤＮＡからのＤＮＡ断片の切出し クローン（ｐＵＣ−ＨＫＮ：ｃＤＮＡ）を含むプラスミ
ド［図１の（ａ）］を、ＮＰをコードする領域をプライ
マーとしたポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐ
ＣＲ）法を用いて増幅させたＤＮＡ断片［図１の
（ｂ）］を得る。この増幅させる遺伝子の５′末端には
該遺伝子が有する翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、また、
３′末端には該遺伝子が有する翻訳停止コドン（ＵＡ
Ａ）を包含させる。

【００１５】３）バキュロウイルス転移ベクターへのＤ
ＮＡ断片の挿入 転移ベクターｐＡｃＹＭ１［図１の（ｃ）。ジャーナル
・オブ・ジェネラル・ウイロロジー(Journal of Genera
l Virology) 、第６８巻、第１２３３ページ、１９８７
年、及びウイロロジー（Virology）、第１７３巻、第６
７４ページ、１９８９年］は、多角体遺伝子を含むＡｃ
ＮＰＶゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したＤ
ＮＡ断片を、アンピシリン耐性を有するプラスミドｐＵ
Ｃ８にクローニングしたものである。転移ベクターｐＡ
ｃＹＭ１のクローニング部位を制限酵素Ｓｍａ Ｉを用
いて公知の方法により切断し、その多角体プロモーター
に関して、前記ＤＮＡ断片をその読取り方向に配向して
挿入し、組換えベクターｐＢａｃＨＫＮを作製する［図
１の（ｄ）］。前記の挿入部位と、挿入されたＤＮＡ断
片の配向とが正しいことを公知の方法で確認し、組換え
ベクターを得る。次に、得られた組換えベクターを用い
てＣＤＶ−ＮＰ遺伝子に相当するＤＮＡ断片をＡｃＮＰ
Ｖの多角体蛋白質構造遺伝子の一部と組換えることによ
り組換えバキュロウイルスを製造する。

【００１６】４）組換えバキュロウイルスの取得 得られた組換えベクターｐＢａｃＨＫＮ［図１の
（ｄ）］とＡｃＮＰＶの多角体蛋白質構造遺伝子の一部
とをＳｆ細胞中で相同組換えにより組換えを行い、組換
えバキュロウイルスＡｃＨＫＮが得られる。

【００１７】前記組換えバキュロウイルスの取得及び該
ウイルスの遺伝子の発現に用いられるＳｆ細胞は、細胞
内でＡｃＮＰＶが増殖可能であれば如何なる細胞であっ
ても使用することが可能である。例えば、Ｓｆ細胞とし
ては、Ｓｆ９、Ｓｆ２１ＡＥ等の株化細胞が知られてお
り（石田 功・安東民衛編、「遺伝子発現実験マニュア
ル」、第２３５ページ、講談社、１９９５年］、Ｓｆ９
細胞は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collectio
n）からＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１として容易に入手
することができる。また、Ｓｆ細胞の培養条件は、公知
ではあるが、例えば、２７℃、ｐＨ６．２であり、使用
する培地としては１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清及び１
０％（Ｖ／Ｖ）バクト・トリプトース・ブロース（Bact
o TriptoseBroth：以下、ＢＴＢと記載することがあ
る。Ｄｉｆｃｏ社製）を含むグレース培地（ギブコＢＲ
Ｌ社製）を例示できるが、培養条件及び培地は、前記の
ものに限定されない。

【００１８】得られた組換えバキュロウイルスＡｃＨＫ
ＮをＳｆ細胞に公知の方法で感染させ、常法により適当
な成育条件下で増殖させることによりＣＤＶ−ＮＰ遺伝
子が発現される。成育条件を例示すれば、次のとおりで
ある。即ち、組換えウイルスＡｃＨＫＮに感染したＳｆ
細胞を、適当な培養容器に１０％ウシ胎児血清及び１０
％（Ｖ／Ｖ）ＢＴＢを含むグレース培地と共に入れ、２
７℃で３〜４日間静置状態で培養する。前記のとおり、
組換えウイルスＡｃＨＫＮをＳｆ細胞に公知の方法で感
染させ、常法により適当な成育条件下で増殖させ、ＣＤ
Ｖ−ＮＰ遺伝子が細胞内に発現されたＳｆ細胞から発現
した蛋白質を採取する。発現した蛋白質の採取は、常法
の生化学的な精製方法により実施され、特に限定されな
いが、より詳しくは、次に例示する方法を使用すること
が望ましい。

【００１９】組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ細胞を、
無血清グレース培地で洗浄し、遠心分離して上清を除去
し、蛋白質分解酵素阻害剤を含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．
６）に懸濁し、超音波処理により細胞を破砕し、遠心分
離して上清を回収し、分子量１００キロダルトン以上の
物質を除去可能なメンブレンフィルターにより濾過し、
精製する。得られた蛋白質は、配列番号２に記載したア
ミノ酸配列を有している。以上のとおりの方法により得
られたＣＤＶ−ＮＰの抗原性を有する蛋白質は、 ａ）平均分子量が５８キロダルトンであること、 ｂ）パラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属する
イヌジステンパーウイルス(Canine Distemper Virus)の
構成蛋白質の一つであるヌクレオカプシド蛋白質の抗原
性を有すること、の理化学的及び生物学的性質を有して
いた。

【００２０】次に、本発明の第二の発明である抗ＣＤＶ
−ＮＰ抗体測定試薬について説明する。本発明の抗ＣＤ
Ｖ−ＮＰ抗体測定試薬には、大別して三通りの態様があ
り、その一は、該蛋白質を担体に固定した抗原を用い、
酵素免疫反応を測定原理とする試薬（以下、試薬Ａと記
載する。）であり、その二は、該蛋白質を担体粒子に固
定した抗原を用い、粒子凝集反応を測定原理とする試薬
（以下、試薬Ｂと記載する。）であり、その三は、該蛋
白質を膜に固定した抗原、吸収材及びイヌ型イムノグロ
ブリン（以下、イムノグロブリンをＩｇと記載する。）
と結合する蛋白質を固定した担体粒子の組合せからな
り、ペーパークロマトグラフィーを用いた抗原抗体反応
を測定原理とする試薬（以下、試薬Ｃと記載する。）で
ある。

【００２１】次に、これらの試薬について、その製造法
及びこれらの試薬を用いた抗ＣＤＶ−ＮＰ抗体測定方法
を説明する。 Ｉ．試薬Ａについて １）抗原蛋白質の固定 前記本発明の第一の発明であるＣＤＶ−ＮＰの抗原性を
有する蛋白質を、公知の物理吸着法又は化学結合（共有
結合）法（日本臨床検査自動化学会誌別冊、第１２巻、
第２号、第５５ページ、１９８７年）により、担体の表
面に固定する。担体としては、例えば、マイクロタイト
レーションプレート、ラテックス粒子等の合成高分子、
ゼラチン、赤血球等の天然高分子、金コロイド粒子等の
金属高分子を好適なものとして例示することができる
が、使用する担体の材質は、特に限定されない。即ち、
抗原蛋白質が担体より脱離しなければ、どのような材質
の担体を用いることも可能であり、また、どのような固
定方法でも蛋白質の担体への感作方法として使用するこ
とができる。得られた抗原固定担体は、検体との非特異
的な吸着を防止するために、０．０５から５％程度のウ
シ血清アルブミン（シグマ社製。以下、ＢＳＡと記載す
る。）等を含む溶液によりブロッキング処理を行うこと
が望ましい。

【００２２】２）酵素免疫測定法による測定 被検動物から採取した血清を、０．０５％（容量）のポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウリル酸（Ｔｗｅｅ
ｎ−２０。バイオラッド社製）、０．５％ＢＳＡ、及び
０．１％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳ緩衝液によ
り希釈する。該希釈液を、抗原蛋白質を固定したマイク
ロタイトレーションプレートのウエル内に１００μｌ添
加し、３７℃にて１時間保持し、その後、ウエル内の反
応液を除去する。次に、被検動物のＩｇＧと結合する酵
素標識抗体を含む溶液を添加し、３７℃で１時間保持
し、その後、ウエル内の反応液を除去する。最後に、基
質溶液を添加し、陰性標準品（検体希釈用緩衝液であ
り、吸光度を認めない対照液。）との発色を比較し、陰
性標準品と同等の発色を示している検体を陰性と判定
し、陰性標準品よりも濃い発色を呈している検体を陽性
と判定する。

【００２３】ＩＩ．試薬Ｂについて １）粒子凝集法による測定 被検動物から採取した血清を、０．５％ＢＳＡ及び０．
１％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝液（以下、トリ
ス緩衝液と記載する。）により希釈し、マイクロピペッ
トで正確に６８μｌ秤取し、反応板のサークル内に滴下
する。次に、トリス緩衝液に懸濁させた抗原蛋白質固定
担体粒子を含む溶液１８μｌを、反応板のサークル内に
滴下し、反応板を穏やかに回転させてサークル内の液を
１０分間均一に混合する。次いで、陰性標準品（検体希
釈用緩衝液であり、凝集を生じない。）との状態を比較
し、陰性標準品と同一の状態を維持している検体を陰性
と判定する。尚、測定時間を１０分間と規定したのは、
予め前記の公知の方法により陽性と判定された多数の検
体について、本発明の試薬Ｂにより凝集するまでの時間
を測定し、試験した結果、１０分間保持すれば、いずれ
の検体も凝集することが確認されたからである。

【００２４】本発明の試薬Ａを使用すれば、検体の滴下
から発色の確認までを約２．５時間で行うことが可能で
ある。また、本発明の試薬Ｂを使用すれば、検体の滴下
から凝集の有無の判定までを約１０分間で行うことが可
能であり、その操作はわずか２回である。しかも、前記
のいずれの試薬においても、測定は、発色の有無あるい
は担体粒子の凝集の有無を観察するのみであるから、特
別な機器又は熟練技術者の判定を必要とせず、初心者で
も簡単に実施することが可能である。

【００２５】ＩＩＩ．試薬Ｃについて １）該蛋白質を固定した膜の調製 膜の材質としては、市販のナイロン、ニトロセルロー
ス、ポリビニリデンジフルオライド等の合成又は天然高
分子のいずれも使用できる。また、抗原蛋白質の膜への
固定方法としては、物理吸着法、化学結合（共有結合）
法、その他いずれの方法も使用することができる。即
ち、抗原蛋白質が膜より脱離しなければどのような材質
を用いることも可能である。得られた抗原蛋白質固定膜
は、検体又はイヌ型イムノグロブリンと結合する蛋白質
を固定した担体粒子との非特異的な吸着を防止するため
に、０．０５から５％程度のＢＳＡ等でブロッキング処
理を行い、乾燥条件下で保存することが望ましい。

【００２６】２）イヌ型イムノグロブリンと結合する蛋
白質固定担体粒子の調製 担体粒子としては、市販ラテックス粒子等の合成高分
子、ゼラチン等の天然高分子、又は、金コロイド等の金
属高分子を好適なものとして例示することができる。担
体粒子は、肉眼での判定を容易に行うために着色されて
いることが望ましい。ただし、金属高分子のコロイド粒
子は、本質的に色調を有するため着色する必要はない。
イヌ型イムノグロブリンと結合する蛋白質としては、抗
イヌＩｇＧ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体等を例示できるが、
これらのものに限定されるものではない。これらのイヌ
型イムノグロブリンと結合する蛋白質は、市販品であっ
ても良く、また、公知の方法によって調製することもで
きる。得られたイヌ型イムノグロブリンと結合する蛋白
質を感作した担体粒子は、コロイド化学的安定性の向
上、又は膜及び検体との非特異的な結合を防止する目的
で、０．０５から５％程度のＢＳＡ等を含有した緩衝液
中に懸濁して保管することが望ましい。

【００２７】３）吸収材 吸収材は、試験に使用される各試薬を十分に吸収可能で
あり、滴下された検体及び各反応試薬の膜上の移動速度
が変動しない材質であることが望ましい。そのような材
質として、綿、ろ紙、多孔性プラスチック等を好適なも
のとして例示することができるが、前記の性能を有する
ものであれば、他の材質であっても使用することが可能
である。また、吸収材の大きさは、試験時に滴下される
検体及び各反応試薬が完全に吸収されるものであれば、
どのような大きさであっても良い。

【００２８】４）試薬の組立て まず、線状に抗原蛋白質を固定した膜を短冊状（例え
ば、幅５〜２０ｍｍ、長さ約５０ｍｍ程度）に裁断し、
裁断した膜を同一の大きさの支持体（例えば、プラスチ
ック等）に固定する。次に、短冊状の膜の片端に適当な
大きさの吸収材を配設する。この吸収材は、検体の展開
を容易にする機能を有している。支持体への膜の固定に
は、接着剤、粘着テープ等を用いることができる。以上
により、本発明の試薬Ｃが調製される。

【００２９】５）抗ＣＤＶ−ＮＰ抗体測定方法 被検動物から採取した血清を緩衝液により希釈し、これ
を支持体に固定され、短冊状に裁断された膜の一端に適
当量を滴下する。滴下された検体は、ペーパークロマト
グラフィーにおいて、ろ紙が溶媒を展開するのと同様
に、検体が膜上を展開し、線状に固定された抗原蛋白質
の部分に到達する。ここで、抗原蛋白質と検体中の抗Ｃ
ＤＶ−ＮＰ抗体との免疫複合体が形成される。

【００３０】次に、イヌ型イムノグロブリンを結合する
蛋白質を感作させた担体粒子の懸濁液を、検体を滴下し
た位置と同一の位置に滴下する。該懸濁液も同様に膜上
を展開し、抗原蛋白質と検体中の抗ＣＤＶ−ＮＰ抗体と
の免疫複合体が形成された部位に到達する。その位置
で、膜−抗原蛋白質−抗ＣＤＶ−ＮＰ抗体−抗イヌ型イ
ムノグロブリン蛋白質−担体粒子複合体が形成され、膜
上には該担体粒子の着色が肉眼で確認できる。一方、検
体中に抗ＣＤＶ−ＮＰ抗体が存在しない場合は、該複合
体が形成されないので、着色は認められない。本発明の
試薬Ｃを使用した場合、抗イヌ型イムノグロブリン蛋白
質を感作した担体粒子の着色が認められた場合は陽性と
判定され、着色が認められなかった場合は陰性と判定さ
れる。

【００３１】本発明の試薬Ｃを使用した場合、検体の滴
下から着色の有無の判定までを約１０分間で行うことが
可能であり、その操作はわずか２回である。しかも、判
定は、担体粒子の着色の有無を調べるのみであることか
ら、特別な機器及び熟練技術者を必要とせず、初心者で
も簡単に実施することができる。

【００３２】以上、本発明を詳細に説明したが、次に、
試験例を示して、本発明を更に具体的に説明する。 試験例１ この試験例では、イヌジステンパーの血清学的診断方法
として従来から使用されているウイルス中和（以下、Ｖ
Ｎと記載する。）試験を次のとおり実施した。 １）被検試料 (1) 個体番号１〜４：ＣＤＶワクチン未接種個体から採
取した血清 (2) 個体番号５〜７：ＣＤＶワクチン接種個体から採取
した血清 (3) 個体番号８〜９：ＣＤＶ感染個体から採取した血清 (4) 陰性標準品 ：検体希釈用緩衝液 ２）試験方法 被検血清を５６℃で３０分間加熱処理した後、イーグル
のＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地に５（ｖ／
ｖ）％のウシ胎児血清と０．２６％のトリプト−スフォ
スフェイトブロース粉末を加えた溶液（Maintenance Me
dium、以下、ＭＭと記載することがある。）を用いて１
０倍希釈より２倍段階希釈し、これに２００ＴＣＩＤ₅₀
／０．１ｍｌのＣＤＶを含むＭＭを等量加え、室温で２
時間反応させた。反応終了後、各混合液を９６ウエルの
マイクロタイトレーションプレートの３個のウエルへ１
００μｌずつ分注し、更に、これらのウエルへ１×１０
⁵ 個／ｍｌのＶｅｒｏ細胞を浮遊させたＭＭをウエル当
たり５０μｌ分注し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で
６日間培養した。培養後、ＣＤＶによる細胞変性効果の
有無を顕微鏡にて観察し、３ウエル中２ウエル以上で細
胞変性効果を抑制する最高血清希釈倍数の逆数により、
その被検血清の中和抗体価とした。

【００３３】３）試験結果 この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明
らかなとおり、ＣＤＶワクチン接種歴又はＣＤＶ感染歴
を有する被検個体から採取された血清においては、陰性
標準品及びワクチン未接種の個体から採取された血清と
比較して、高い中和抗体価が観察された。ＶＮ試験は、
ＣＤＶが該ウイルスに対して感受性のある細胞への感
染、及び増殖能を失なわさせる試料中に含有される抗体
（中和抗体）の力価を測定する試験である。該ＶＮ試験
は、感度及び特異性とも高く、定量試験が可能である
が、培養細胞と無菌操作が必要なこと、操作が標準化さ
れていないこと、更に、結果の判定に長時間を要するこ
と等の欠点がある。

【００３４】

【表１】

【００３５】試験例２ 試験例１と同一の被検試料を用い、本発明の試薬Ａによ
る試験を実施した。 １）試験方法 後記する実施例２と同一の方法により製造した本発明の
試薬Ａを用い、イヌ血清中の抗ＣＤＶ−ＮＰ抗体との反
応性を、ＥＬＩＳＡ法により、次のとおり試験した。

【００３６】マイクロタイトレーションプレートのウエ
ル内に、前記０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（バイオラッ
ド社製）及び０．５％ＢＳＡを添加したＰＢＳ緩衝液
（以下、ＰＢＳ溶液と記載する。）により、５００倍に
希釈した検体を１００μｌ添加し、３７℃にて１時間反
応させた。反応終了後、ウエルを洗浄溶液にて５回洗浄
し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％ＢＳＡを添
加したＰＢＳ溶液により２０００倍に希釈した西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと記載する。）標識
抗イヌＩｇＧ抗体（ザイメッド社製）を１００μｌ添加
し、３７℃にて１時間反応させた。反応終了後、ウエル
を洗浄溶液にて５回洗浄し、オルトフェニレンジアミン
溶液（シグマ社製）を１００μｌ添加し、室温で１５分
間発色させた。発色後、２Ｍ硫酸溶液を１００μｌ添加
し、各検体の発色を陰性標準品と比較し、更に、４９５
ｎｍにおける吸光度を測定した。

【００３７】２）試験結果 この試験の結果は表２に示すとおりである。表２から明
らかなとおり、ＣＤＶワクチン接種歴又はＣＤＶ感染歴
を有する被検個体から採取された血清においては、陰性
標準品と比較して高い発色が認められた。一方、ＣＤＶ
ワクチン未接種の個体においては、陰性標準品と同等の
発色であった。以上の試験結果から、本発明の試薬によ
りＣＤＶ感染の診断、及びワクチン接種効果を正確に判
定することが可能であり、本発明の試薬は、従来にない
優れた試薬であることが判明した。

【００３８】

【表２】

【００３９】試験例３ 試験例１と同一の被検試料を用い、本発明の試薬Ｂによ
る試験を行った。 １）試験方法 後記する実施例３と同一の方法により製造した本発明の
試薬Ｂ１８μｌ、及び希釈した検体（試験例１で用いた
ものと同一の検体）６８μｌをポリスチレンスライド板
上に滴下し、十分に混合し、次いで、スライド板を緩か
に揺動させ（毎分約１５回転）、凝集反応が出現するま
での時間を測定した。 ２）試験結果 この試験の結果は表３に示すとおりである。表３から明
らかなとおり、ＣＤＶワクチン接種歴又はＣＤＶ感染歴
を有する被検個体から採取された血清においては、１０
分間以内の極めて短時間に担体粒子の凝集が認められ
た。一方、ＣＤＶワクチン未接種の個体及び陰性標準品
においては、凝集を認めなかった。以上のことから、本
発明の試薬によりＣＤＶ感染の診断、及びワクチン接種
効果を正確に判定することが可能であり、本発明の試薬
は、従来にない優れた試薬であることが判明した。

【００４０】

【表３】

【００４１】試験例４ 試験例１と同一の被検試料を用い、本発明の試薬Ｃによ
る試験を行った。 １）試験方法 後記する実施例４と同一の方法により製造した本発明の
試薬Ｃを用い、吸収材を固定した側と反対側に、希釈し
た検体（試験例１で用いたものと同一の検体）１５μｌ
を滴下し、検体が吸収材に十分に染み込むまで静置し
た。次に、イヌ型イムノグロブリンと特異的に結合する
蛋白質固定ラテックス粒子懸濁液（０．０２％）２０μ
ｌを滴下し、吸収材に十分染み込むまで静置した。最後
に、線状に固定した抗原蛋白質の反応部分の着色の有無
を確認した。

【００４２】２）試験結果 この試験の結果は表４に示すとおりである。表４から明
らかなとおり、ＣＤＶワクチン接種歴又はＣＤＶ感染歴
を有する被検個体から採取された血清においては、１０
分間以内の極めて短時間に着色が観察された。一方、Ｃ
ＤＶワクチン未接種の個体及び陰性標準品においては、
着色を認めなかった。以上のことから、本発明の試薬に
よりＣＤＶ感染の診断、及びワクチン接種効果を正確に
判定することが可能であり、本発明の試薬は、従来にな
い優れた試薬であることが判明した。

【００４３】

【表４】

【００４４】

【実施例】次に、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明は、以下の実施例により何ら限定され
るものではない。 実施例１ １）ＣＤＶ−ＮＰ遺伝子由来のＤＮＡの取得 超遠心分離法により濃縮したウイルス粒子から、ＣＤＶ
ゲノムＲＮＡを回収するために、２５０μｌの濃縮ウイ
ルス液に１．５μｌの１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）、６μｌの０．５ＭＥＤＴＡ溶液、３μｌの１０ｍ
ｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液及び３７．５μｌの１０
％ＳＤＳ溶液を加え、３７℃で３０分間反応させた。こ
れをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール
溶液（２５：２４：１）により２回抽出操作を反復し、
水層の部分を回収し、水層に３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウム溶液（ｐＨ５．２）及びエタノール１ｍｌを添加
し、−８０℃で２０分間静置し、その後、１５０００回
転で１０分間遠心して沈殿を回収し、１００μｌのＴＥ
緩衝液（ｐＨ８）に溶解させた。回収したＲＮＡの濃度
は、２８０ｎｍの吸光度を測定して決定した。

【００４５】ゲノムＲＮＡよりｃＤＮＡを合成する逆転
写反応は、次のとおり実施した。即ち、ＲＮＡに対し
て、蒸留水を３５μｌ、１０倍濃度の逆転写反応用緩衝
液［０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、０．５
Ｍ塩化カリウム、８０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍ
ジチオスレイトール］を５μｌ、１０μＭ濃度のランダ
ムプライマーを１μｌ、１０μＭ濃度の配列番号３に記
載されたＣＤｌ−Ｐ１プライマーを１μｌ、リボヌクレ
アーゼ阻害剤（３８単位／μｌ。和光純薬工業社製）を
１μｌ添加して総量４３μｌに調整し、９０℃で５分間
静置し、その後、氷水中で急冷し、更に、１μｌのリボ
ヌクレアーゼ阻害剤、５μｌのデオキシヌクレオチド混
合液（各１０ｍＭ）、１μｌの逆転写酵素（２９単位／
μｌ。生化学工業社製）を添加し、４２℃で９０分間反
応させた。

【００４６】ＣＤＶ−ＮＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増
幅させるＰＣＲ反応のために作製したプライマーの塩基
配列は、既に報告されているOnderstepoort 株の塩基配
列［ウイロロジー、第１９３巻、第６６ページ、１９９
３年］を参考にして、配列番号３及び配列番号５に記載
されている合成ＤＮＡを作製して用いた。前記合成した
一本鎖ｃＤＮＡの２μｌに対して、蒸留水を１４μｌ、
１０倍濃度のＰｆｕポリメラーゼ用バッファー（ポリメ
ラーゼに添付のもの）を２μｌ、１０μＭ合成プライマ
ー（配列番号３及び配列番号５）を各０．５μｌ、デオ
キシリボヌクレオチド混合液（各２ｍＭ）を５μｌ、Ｐ
ｆｕポリメラーゼ（Stratagene社製。２．５単位／μ
ｌ）を０．５μｌ添加し、流動パラフィンを重層し、９
４℃９０秒、５６℃３０秒、７２℃２分を１サイクルと
したＰＣＲを３０サイクル実施し、予想される１．８３
ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【００４７】この反応液を、フェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１）溶液
により抽出し、ウルトラフリーＣ３ＴＫでプライマー及
びデオキシリボヌクレオチドを除去し、これを３０μｌ
の１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトー
ル、６ｍＭＡＴＰを含有する７０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶解し、１０単位のＴ４ポリヌクレオ
チドカイネースを添加し、３７℃で１時間反応させ、Ｄ
ＮＡ断片の５′末端をリン酸化した。このＤＮＡ断片
を、プラスミドベクターｐＵＣ１９のＳｍａ Ｉサイト
にクローニングした。以上の操作により構築したプラス
ミドを、ｐＵＣ−ＨＫ−Ｎ（ＣＤｌ−Ｐ１）と命名し
た。

【００４８】２）組換えバキュロウイルスの作出 プラスミドｐＵＣ−ＨＫ−Ｎ（ＣＤＩ−Ｐ１）よりＮＰ
遺伝子の上流に存在する非翻訳領域を除去したＮＰ遺伝
子断片を得る目的で、該プラスミドを鋳型として、更
に、配列番号４及び配列番号５に示した合成プライマー
を用い、前記と同一条件でＰＣＲを実施し、目的とする
１．７４ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断
片の塩基配列は配列番号１に記載したとおりであった。
本断片は、既知のＣＤＶ−ＮＰ蛋白質と同様に５２３ア
ミノ酸残基からなる配列番号２に記載した蛋白質をコー
ドしており、そのアミノ酸配列は、既知のＣＤＶのＮＰ
蛋白質と９６％の相同性を有していた。これらの解析結
果から、得られたＤＮＡ断片は、目的とするＣＤＶ−Ｎ
Ｐをコードしている断片であることが確認された。

【００４９】組換えバキュロウイルスを作出するため
に、上記１．７４ＫｂｐのＤＮＡ断片をバキュロウイル
ス転移ベクターｐＡｃＹＭ１のＳｍａ Ｉサイトに挿入
した。挿入したＤＮＡ断片が転移ベクター上の多角体プ
ロモーターに対して正しく配向していることは、構築さ
れた転移ベクターを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＰｖｕＩ
Ｉにより消化した場合、１．２７ＫｂｐのＤＮＡ断片が
出現することにより確認した。得られた転移ベクター
を、ｐＢａｃＨＫＮと命名した。

【００５０】ＣＤＶ−ＮＰをコードする遺伝子領域と相
補的な配列を有するＤＮＡを挿入された組換えバキュロ
ウイルスの作出は、次のとおり実施した。即ち、１μｇ
のｐＢａｃＨＫＮ、２０ｎｇの制限酵素Ｂｓｕ３６ Ｉ
で消化した野生型バキュロウイルスＢａｃＰＡＫ６（Cl
onetech 社製）のゲノムＤＮＡ、４μｌのリポフェクチ
ン（ギブコＢＲＬ社製）を混合し、蒸留水を添加して総
量を１６μｌに調整し、室温で１５分間静置した。これ
とは別に、３５ｍｍの培養用ディッシュに２ｍｌの培養
用メディウム（１０％ウシ胎児血清と０．２６％のBact
o Triptose Brothを含むグレースメディウム）とともに
植込んだ１×１０⁶ 個のＳｆ２１ＡＥ細胞を用意し、植
込みに用いた培養用メディウムを１ｍｌの無血清グレー
スメディウムに置換し、前記のＤＮＡ混合溶液をこれに
移すことにより、該ＤＮＡの該細胞への導入を行った。
ＤＮＡ混合溶液を加えられた細胞は一晩無血清のままで
培養した後、１ｍｌの培養用メディウムを添加し、更
に、培養を続けた。ＤＮＡを導入された細胞内では、バ
キュロウイルスゲノムＤＮＡと転移ベクターＤＮＡの間
で相同組換えを起こすことが予想され、これによって生
成する組換えウイルスは、ＤＮＡを導入された細胞の培
養上清からプラッククローニング法により得ることがで
きた。得られた組換えウイルスを、ＡｃＨＫ−Ｎと命名
した。

【００５１】組換えバキュロウイルスＡｃＨＫ−Ｎを感
染させたＳｆ２１ＡＥ細胞をウエスタンブロッティング
により解析した結果、抗ＣＤＶ抗体と特異的に反応する
分子量約５８キロダルトンの蛋白質が大量に発現してい
ることが確認された。

【００５２】３）抗原性を有する蛋白質の製造 該組換えバキュロウイルスをＳｆ２１ＡＥ細胞に感染さ
せ、該感染細胞を、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（シグマ社製）、４０ｍＭエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム（和光純薬社製）、及び１００単位
のトラジロール（バイエル社製）を含む炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．６。以下、炭酸緩衝液と記載する。）に懸濁し、
超音波処理して細胞を破砕し、遠心分離（１５，０００
回転で１５分間）し、上清を回収し、得られた上清を抗
原希釈液で１０倍に希釈し、分子量１００キロダルトン
以上の物質を除去可能なメンブレンフィルター（ミリポ
ア社製）に通液し、抗原蛋白質を含む溶液を得た。

【００５３】蛋白質含量をＢＣＡプロテインアッセイキ
ット（ピアス社製）により測定した結果、約０．３ｍｇ
／ｍｌであり、１×１０⁷ 個のＳｆ９細胞当たりの蛋白
質量は、約２ｍｇと算出された。

【００５４】実施例２ １）抗原蛋白質を固定したマイクロタイトレーションプ
レートの調製 前記実施例１と同一の方法により得られた抗原蛋白質溶
液を、炭酸緩衝液により蛋白質濃度４μｇ／ｍｌに希釈
し、この溶液２００μｌをポリスチレン製９６穴マイク
ロタイトレーションプレート（ヌンク社製。商標「マキ
シソープ」）の各ウエルに添加し、４℃で１日間静置し
た。反応終了後、前記蛋白質溶液を除去し、０．０５％
（Ｖ／Ｖ）のポリオキシエチレンソルビタンモノラウリ
ル酸（Ｔｗｅｅｎ−２０。バイオラッド社製）を添加し
たＰＢＳ溶液（ｐＨ７．０。以下、洗浄溶液と記載す
る。）でウエル内を３回洗浄した。次に、１％のゼラチ
ン（バイオラッド社製）を添加した炭酸緩衝液を２００
μｌずつ各ウエルに添加し、４℃で１日以上静置し、抗
原蛋白質を感作したマイクロタイトレーションプレート
を作製した。

【００５５】２）測定の実施 前記試験例１と同一の方法によりＥＬＩＳＡ法により試
験した結果、ＣＤＶワクチン接種歴又はＣＤＶ感染歴を
有する被検個体から採取された血清においては、陰性標
準品及びＣＤＶワクチン未接種の個体と比較して高い発
色が認められた。

【００５６】実施例３ １）抗原蛋白質を固定したラテックス粒子懸濁液の調製 前記実施例１と同一の方法により調製した抗原蛋白質
を、トリス緩衝液（ｐＨ７．５。１０ｍＭトリス、１５
０ｍＭ塩化ナトリウム）で蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌに調
整し、この溶液３ｍｌに、粒子の直径が０．２μｍの市
販ポリスチレンラテックス粒子（日本合成ゴム社製。１
０ｗ／ｖ％）１．５ｍｌを添加し、３７℃で２時間撹拌
し、次いで、４℃で遠心分離し（１５，０００回転、１
５分間）、沈殿を０．５％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナ
トリウムを含むトリス緩衝液に懸濁し、超音波処理によ
り分散させ、抗原蛋白質固定ラテックス粒子懸濁液を得
た。

【００５７】２）測定の実施 前記試験例２と同一の方法により測定を実施した。 ３）測定の結果 ＣＤＶワクチン接種歴を有する血清、及びＣＤＶ感染歴
を有する血清のいずれにおいても１０分間以内に特異的
な凝集が確認された。これらの検体は、実施例２におい
てすべて陰性標準品よりも濃い発色が認められ、高い吸
光度を示した試料なので、両者の結果は良く一致した。

【００５８】実施例４ １）抗原蛋白質を固定した膜の調製 前記実施例１と同一の方法により調製した抗原蛋白質
を、トリス緩衝液により希釈し、マイクロピペットを用
いて市販のニトロセルロースメンブレン（アドバンテッ
ク社製）に線状に塗布した。十分に乾燥し、その後、非
特異的な吸着を防止するため、０．５％のＢＳＡを添加
した緩衝液によりブロッキング処理を行い、十分に乾燥
させて抗原蛋白質固定膜を得た。 ２）イヌ型イムノグロブリンと特異的に結合する蛋白質
を固定させたラテックス粒子懸濁液の調製 市販の抗イヌＩｇＧヤギ抗体（カッペル社製。１ｍｇ／
ｍｌ）０．３ｍｌに、粒子の直径が０．２μｍの市販ポ
リスチレン性赤色ラテックス粒子（日本合成ゴム社製。
１０ｗ／ｖ％）０．０５ｍｌを添加し、トリス緩衝液
０．４５ｍｌを添加し、３７℃で２時間撹拌し、次い
で、４℃で遠心分離し（１５，０００回転、１５分
間）、沈殿を０．５％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリ
ウムを含むトリス緩衝液に懸濁し、超音波処理により分
散させ、イヌ型イムノグロブリンと特異的に結合する蛋
白質固定ラテックス粒子懸濁液を得た。

【００５９】３）反応容器の組立て 前記抗原蛋白質を固定化した膜を、厚さ約０．３ｍｍの
プラスチック板に接着させ、幅約５ｍｍ、長さ約５０ｍ
ｍの短冊状に裁断した。これを厚さ約１ｍｍの成型され
たプラスチック容器内部に接着して固定した。次に、検
体及び各試液を容易に展開させる目的で、膜の片端に吸
収材としてセルロース（アドバンテック社製）を接着
し、この吸収材全部を包み込むために、プラスチック板
の両端から膜の一部までを粘着テープで覆い、測定試薬
を得た。 ４）測定の実施 前記試験例３と同一の方法により測定を実施した。 ５）測定結果 ＣＤＶワクチン接種歴を有する血清、及びＣＤＶ感染歴
を有する血清のいずれにおいても１０分間以内に着色が
認められ、陽性と判定された。また、この結果は、実施
例２及び３の結果と良く一致していた。

【００６０】以上のとおり、測定の操作は、希釈した検
体の滴下及びラテックス粒子懸濁液の滴下のわずか２回
であり、検体の滴下から判定までに要した時間は約１０
分間と短時間であった。

【００６１】

【発明の効果】以上詳記したとおり、本発明は、新規な
イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質の抗
原性を有する蛋白質、及び抗イヌジステンパーウイルス
ヌクレオカプシド蛋白質抗体測定試薬に関するものであ
り、本発明にれば、次のような効果が奏される。 １）ＣＤＶ−ＮＰの抗原性を有する蛋白質を効率良く生
産することが可能である。 ２）ＣＤＶ−ＮＰの抗原性を有する蛋白質により適切な
担体を感作させた試薬を量産することが可能である。 ３）ＣＤＶ−ＮＰの抗原性を有する蛋白質により適切な
膜を感作させた試薬を量産することが可能である。 ４）本発明の試薬は、イヌ血清中に存在する抗ＣＤＶ−
ＮＰ抗体を、特別な機器及び熟練技術者を必要とするこ
となく、検体（血清）の採取現場において簡単に測定す
ることを可能とする。 ５）ＣＤＶ感染及びワクチン効果の判定の操作回数を顕
著に短縮することができる。 ６）ＣＤＶ感染の診断、及びワクチン効果の判定を簡
便、かつ迅速に行うことができ、医療上の価値が極めて
大きい。

【００６２】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１７３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 起源： 生物名：イヌジステンパーウイルス 株名：ＨＫ株 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ：６．．１５７４ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： CCAATATGGC TAGCCTTCTT AAAAGCCTCA CGCTGTTCAA GAGGACTCGG GACCAACCCC 60 CTCTTGCCTC TGGCTCCGGG GGAGCAATAA GAGGAATAAA GCATGTCATT ATAGTCCTAA 120 TCCCGGGTGA TTCAAGCATT GTTACAAGAT CTCGACTATT GGATAGACTT GTTAGGTTGG 180 TTGGTGATCC AGAAATCAAC GGCCCTAAAT TAACTGGGAT CTTAATCAGT ATCCTCTCCT 240 TGTTCGTGGA GTCCCCTGGA CAGTTGATCC AGAGGATCAT AGACGACCCT GATGTAAGCA 300 TCAAGTTAGT AGAGGTAATA CCAAGCATCA ACTCTGTTTG CGGTCTTACA TTTGCATCCA 360 GAGGAGCAAG TCTGGATTCT GAGGCAGATG AGTTCTTCAA AATTGTAGAC GAAGGGTCGA 420 AAGCTCAAGG GCAATTAGGC TGGTTGGAGA ATAAGGATAT AGTAGACATA GAAGTTGATG 480 ATGCTGAGCA ATTCAATATA TTACTAGCTT CCATCTTGGC TCAAATTTGG ATCCTGCTAG 540 CTAAAGCGGT GACTGCTCCT GATACTGCAG CCGACTCGGA GATGAGAAGG TGGATTAAGT 600 ATACCCAGCA AAGACGTGTG GTCGGAGAAT TTAGAATGAA CAAAATCTGG CTTGATATTG 660 TTAGAAACAG GATTGCTGAG GACCTATCTT TGAGGCGATT CATGGTGGCA CTCATTTTGG 720 ACATCAAAAG ATCCCCAGGG AACAAGCCTA GAATTGCTGA AATGATTTGT GATATAGATA 780 ACTACATTGT GGAAGCTGGG TTAGCTAGTT TCATCCTAAC TATCAAGTTT GGCATTGAAA 840 CTATGTATCC GGCTCTTGGG TTGCATGAGT TTTCCGGAGA ATTAACAACT ATTGAATCCC 900 TCATGATGCT ATATCAACAG ATGGGTGAAA CAGCACCATA CATGGTTATC TTGGAAAACT 960 CTGTTCAAAA CAAATTTAGT GCAGGGTCCT ACCCATTGCT CTGGAGTTAT GCTATGGGGG 1020 TTGGTGTTGA ACTTGAGAAC TCCATGGGAG GATTAAATTT CGGTCGATCT TACTTTGACC 1080 CAGCCTACTT CAGACTCGGG CAAGAAATGG TTAGACGATC TGCAGGCAAA GTAAGCTCCG 1140 CACTTGCTGC CGAGCTTGGC ATCACCAAGG AGGAAGCTCA GCTGGTGTCA GAAATAGCAT 1200 CCAAGACAAC AGAGGACCGG ACGATTCGAG CTACTGGTCC CAAGCAATCC CAAATTACCT 1260 TCCTGCACTC GGAAAGATCC GAAGTCGCTA ATCAACAACC CCCGACCATC AACAAGAGGT 1320 CCGAAAACCA GGGAGGAGAC AGATACCCCA TTCACTTCAG TGATGAAAGG CCTCCAAGGC 1380 ACACCCCAGA CGTCAACAGC TCTGAACGGA GTGAGCCACG CCACGACACC CAAATTATCC 1440 AAGATGATGG AAATGATGAT GACCGGAAAT CGATGGAAGC AATCGCCAAG ATGAGGATGC 1500 TTACTAAGAT GCTCAGTCAA CCTGGGACCA GTGAAGATGG TTCTCCTGTT TATAATGATA 1560 GAGAGCTACT CAATTAAATA TTCAAGACCA GTCCTGCATC AGTCAACAAT TATCATTCTA 1620 AACTCATTAT AAAAAACTTA GGACCCAGGT CCAACAAACC CGATCAACCA TTCATCCAAC 1680 CACCCGTTCT ATCCCTAAAT GGCAGAGGAA CAGGCCTACC ATGTCAGCAA AGGGCT 1735

【００６３】 配列番号：２ 配列の長さ：５２３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：イヌジステンパーウイルス 株名：ＨＫ株 配列の特徴：Ｎタンパク質 配列： Met Ala Ser Leu Leu Lys Ser Leu Thr Leu Phe Lys Arg Thr Arg Asp 5 10 15 Gln Pro Pro Leu Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ile Arg Gly Ile Lys 20 25 30 His Val Ile Ile Val Leu Ile Pro Gly Asp Ser Ser Ile Val Thr Arg 35 40 45 Ser Arg Leu Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu Val Gly Asp Pro Glu Ile 50 55 60 Asn Gly Pro Lys Leu Thr Gly Ile Leu Ile Ser Ile Leu Ser Leu Phe 65 70 75 80 Val Glu Ser Pro Gly Gln Leu Ile Gln Arg Ile Ile Asp Asp Pro Asp 85 90 95 Val Ser Ile Lys Leu Val Glu Val Ile Pro Ser Ile Asn Ser Val Cys 100 105 110 Gly Leu Thr Phe Ala Ser Arg Gly Ala Ser Leu Asp Ser Glu Ala Asp 115 120 125 Glu Phe Phe Lys Ile Val Asp Glu Gly Ser Lys Ala Gln Gly Gln Leu 130 135 140 Gly Trp Leu Glu Asn Lys Asp Ile Val Asp Ile Glu Val Asp Asp Ala 145 150 155 160 Glu Gln Phe Asn Ile Leu Leu Ala Ser Ile Leu Ala Gln Ile Trp Ile 165 170 175 Leu Leu Ala Lys Ala Val Thr Ala Pro Asp Thr Ala Ala Asp Ser Glu 180 185 190 Met Arg Arg Trp Ile Lys Tyr Thr Gln Gln Arg Arg Val Val Gly Glu 195 200 205 Phe Arg Met Asn Lys Ile Trp leu Asp Ile Val Arg Asn Arg Ile Ala 210 215 220 Glu Asp Leu Ser Leu Arg Arg Phe Met Val Ala Leu Ile Leu Asp Ile 225 230 235 240 Lys Arg Ser Pro Gly Asn Lys Pro Arg Ile Ala Glu Met Ile Cys Asp 245 250 255 Ile Asp Asn Tyr Ile Val Glu Ala Gly Leu Ala Ser Phe Ile leu Thr 260 265 270 Ile Lys Phe Gly Ile Glu Thr Met Tyr Pro Ala Leu Gly Leu His Glu 275 280 285 Phe Ser Gly Glu Leu Thr Thr Ile Glu Ser Leu Met Met Leu Tyr Gln 290 295 300 Gln Met Gly Glu Thr Ala Pro Tyr Met Val Ile Leu Glu Asn Ser Val 305 310 315 320 Gln Asn Lys Phe Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Leu Leu Trp Ser Tyr Ala 325 330 335 Met Gly Val Gly Val Glu Leu Glu Asn Ser Met Gly Gly Leu Asn Phe 340 345 350 Gly Arg Ser Tyr Phe Asp Pro Ala Tyr Phe Arg Leu Gly Gln Glu Met 355 360 365 Val Arg Arg Ser Ala Gly Lys Val Ser Ser Ala Leu Ala Ala Glu Leu 370 375 380 Gly Ile Thr Lys Glu Glu Ala Gln Leu Val Ser Glu Ile Ala Ser Lys 385 390 395 400 Thr Thr Glu Asp Arg Thr Ile Arg Ala Thr Gly Pro Lys Gln Ser Gln 405 410 415 Ile Thr Phe Leu His Ser Glu Arg Ser Glu Val Ala Asn Gln Gln Pro 420 425 430 Pro Thr Ile Asn Lys Arg Ser Glu Asn Gln Gly Gly Asp Arg Tyr Pro 435 440 445 Ile His Phe Ser Asp Glu Arg Pro Pro Arg His Thr Pro Asp Val Asn 450 455 460 Ser Ser Glu Arg Ser Glu Pro Arg His Asp Thr Gln Ile Ile Gln Asp 465 470 475 480 Asp Gly Asn Asp Asp Asp Arg Lys Ser Met Glu Ala Ile Ala Lys Met 485 490 495 Arg Met Leu Thr Lys Met Leu Ser Gln Pro Gly Thr Ser Glu Asp Gly 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Asn Asp Arg Glu Leu Leu Asn 515 520

【００６４】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 起源： 生物名：イヌジステンパーウイルス 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 他の情報：／ｌａｂｅｌ＝ｐｒｉｍｅｒ 配列： ACAAAGTTGG CTAAGGATAG

【００６５】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 起源： 生物名：イヌジステンパーウイルス 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 他の情報：／ｌａｂｅｌ＝ｐｒｉｍｅｒ 配列： CCAATATGGC TAGCCTTCTT

【００６６】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 起源： 生物名：イヌジステンパーウイルス 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍｉｓｃ ｆｅａｔｕｒｅ 存在位置：１．．１７ 他の情報：／ｌａｂｅｌ＝ｐｒｉｍｅｒ 配列： AGCCCTTTGC TGACATG

【図面の簡単な説明】

【図１】バキュロウイルス転移ベクターｐＢａｃ−ＨＫ
Ｎの作製方法を示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 上田 進 埼玉県所沢市中新井３−２−19 (72)発明者 島村 誠一 神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 原田 義次 神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 大久保 重敏 神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 平均分子量が約５８キロダルトンであ
   り、かつパラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属
   するイヌジステンパーウイルス(Canine Distemper Viru
   s)の構成蛋白質の一つであるヌクレオカプシド蛋白質の
   抗原性を有することを特徴とする蛋白質。
2. 【請求項２】 該蛋白質が、該蛋白質をコードする遺伝
   子領域と相補的な配列を有するＤＮＡを組込んだ組換え
   バキュロウイルスを、昆虫由来の細胞に感染させた組換
   えバキュロウイルス感染昆虫細胞から採取され、配列番
   号２に記載されたアミノ酸配列を有する請求項１に記載
   の蛋白質。
3. 【請求項３】 平均分子量が約５８キロダルトンであ
   り、かつパラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属
   するイヌジステンパーウイルス(Canine Distemper Viru
   s)の構成蛋白質の一つであるヌクレオカプシド蛋白質の
   抗原性を有する蛋白質を担体又は膜に固定した抗原を、
   有効成分として含有する抗イヌジステンパーウイルスヌ
   クレオカプシド蛋白質抗体測定試薬。
4. 【請求項４】 該蛋白質が、該蛋白質をコードする遺伝
   子領域と相補的な配列を有するＤＮＡを組込んだ組換え
   バキュロウイルスを昆虫由来の細胞に感染させた組換え
   バキュロウイルス感染昆虫細胞から採取され、配列番号
   ２に記載されたアミノ酸配列を有する請求項３に記載の
   抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗
   体測定試薬。
5. 【請求項５】 膜が、合成高分子膜、又は天然高分子膜
   である請求項３又は請求項４のいずれか１項に記載の抗
   イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド蛋白質抗体
   測定試薬。
6. 【請求項６】 担体が、合成高分子、天然高分子、又は
   金属高分子である請求項３又は請求項４のいずれか１項
   に記載の抗イヌジステンパーウイルスヌクレオカプシド
   蛋白質抗体測定試薬。