JPH01214760A - 免疫学的簡易測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、第１の抗体を多孔質膜に担持した抗体担持膜
と第２の抗体をラテックス粒子に担持した抗体担持ラテ
ックスを用〜・、肉眼により容易に判定可能な免疫学的
測定方法に関する。

（従来技術） 近年、生体物質例えばホルモン、血液因子、薬物、これ
らの代謝産物等の検出又は血中、尿中その細体液中にお
ける濃度の測定が疾患の病態、診断、予後の判定、治療
法の決定などに重要な意義を持つようになってきた。こ
れらの測定方法としては理化学的方法、生化学的方法、
免疫学的方法などがあり、このうち免疫学的方法は微量
成分を特異的に精度よ（測定できることから、ホルモン
、血液因子などの測定に広く応用されている。この方法
は通常測定対象となる物質（以下「被測定物質」と呼ぶ
）を抗原として、ウサギ、モルモット、ヒツジなどの動
物を免疫して得た抗体を用い、その抗原−抗体反応を利
用するものであり、測定手段、方法等によって、ゲル内
拡散法、免疫電気泳動、沈降反応、凝集反応、放射免疫
測定法、酵素免疫測定法など種々の方法が考案され、利
用されている。

このうち、血球、カオリン、ベントナイト、ポリスチレ
ンラテックス等の微粒子（担体）に抗原又は抗体を吸着
感作させた感作担体粒子と、それに対応する抗体もしく
は抗原との反応を利用した凝集反応又は凝集阻止反応は
、簡便で比較的感度がよいことから広く応用されており
、この方法を用〜・た性腺刺激ホルモン、ステロイドホ
ルモン、フイプリノゲン、ＦＤＰ　（フィブリン・フイ
プリノゲン分解産物）などの測定は臨床上広く用いられ
ている。凝集反応又は凝集阻止反応に用いられる担体と
しては、血球及びポリスチレンラテックスが最も多（利
用されており、特にラテックス凝集反応はガラス板上で
極めて短時間に測定が行われることから、手軽であり、
緊急を要する検査Ｋ特に利点を有している。しかしラテ
ックス凝集反応及び凝集阻止反応では未反応のラテック
ス粒子の存在下で反応したラテックス粒子の凝集を見る
ことになるため、しばしば反応像が不明瞭となり判定が
つきにくい場合がある。最近に至り、放射免疫反応にお
ける放射性物質の代わりに酵素を用いる酵素免疫反応（
ＥＩＡ　）が広く用いられている。酵素免疫反応は、例
えば酵素標識抗体な用いて競合法又は非競合法により抗
原−抗体反応を行い、抗原と結合した酵素標識抗体又は
未結合の酵素と基質を反応させ、必要に応じ、さらに呈
色剤を加えたのち、分光光度計を用いて比色することに
より検体中の抗原量を測定する方法である。メンプラン
、チューブなどに第１の抗体を固定したサンドインチを
原理としたＥＩＡでは、前記のラテックス凝集反応及び
凝集阻止反応より高い感度が得られるが、第１の抗体と
検体の反応、第２の抗体−酵素結合物の反応及び呈色反
応と３段階の反応が必要であり、反応時間がかかると共
に操作が煩雑である。さらには、酵素免疫反応を利用し
、比色計を用いることなく肉眼で判定する方法として、
繊維の多孔性マトリックス内に抗体感作粒子を保持固定
し、この抗体感作保持繊維上で被検液中の抗原と反応さ
せ、洗浄後さらに酵素標識抗体と反応させ、余分な酵素
標識抗体を洗浄除去したのち、基質溶液を加え、繊維上
で発色した色により被検液中の被測定物質を検出する方
法が知られている（特開昭６２−２２８１６７号公報参
照）。

このように酵素免疫反応は色の変化により被検液中の被
測定物質の存在を認めることができるが、その測定には
特別な場合を除き分光光度計などの特殊な装置が必要で
あり、また酵素を用いることがら失活や保存安定性の面
で問題が生じていた。一方、所望の成分又はこの成分に
対する特異的結合剤をコロイド状金属粒子に結合させる
ことにより得られる標識された成分を用いる方法が開示
されている（特開昭６０−１８５１６０号公報参照）。

しかしコロイド状金属粒子を用いる方法は、反応を促進
させるために加温したり、反応に長時間を必要としてい
た。

また感度を高めるためにプロッティング媒体の表面に結
合したコロイド状金属粒子に乳酸銀、硝酸銀などの物理
的現像剤を用いてコントラストをだす必要があった。し
かも、これらのコロイド状金属粒子は保存安定性の面で
問題があった。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは簡便な操作で容易に肉眼による判断
ができ、かつ高感度な測定方法について研究した結果、
ラテックス粒子の粒径より大きい孔径を有する多孔質担
体膜に第１の抗体を担持させた抗体担持膜及び第１の抗
体と抗原決定基の異なる第２の抗体を該担体膜と異なる
色で着色したラテックスに担持させた抗体担持ラテック
スを用いる方法を見い出し、本発明を完成した。

本発明は、被検液中に含まれる抗原を、ラテックス粒子
の粒径より大きい孔径を有する多孔質担体膜（以下担体
膜という）に担持された第１の抗体と反応させ、生成す
る抗原−抗体複合物を、該担体膜と異なる色のラテック
ス粒子に担持され、第１の抗体と抗原決定基を異にする
第２の抗体と反応させることを特徴とする、被検液中の
抗原の免疫学的測定方法である。

本発明方法によれば、反応時間を短縮することができ、
また高感度であるため測定結果の判定が容易である。

抗体を作製するために用いられる抗原としては例えば下
記の抗原があげられる。

ペプチドホルモン例えば成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮
質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）　、メラミン細胞刺激ホル
モン（ＭＳＨ）、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（
ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（（ＬＨ）、卵胞刺激ホル
モン（ＦＳＨ）　、オキシトシン、閉経婦人尿性腺刺激
ホルモン（ＨＭＧ　）等の下垂体ホルモン、カルシトニ
ン、副甲状腺ホルモン等のカルシウム代謝調節ホルモン
、インシュリン、プロインシュリン、膵グルカゴン等の
膵ホルモン、ガストリン、セクレチン等の消化管ホルモ
ン、アンギオテンシン、プラジキニン等の血管に作用す
るホルモン、ヒト絨毛性乳腺刺激ホルモン（ｈＣＧ　）
、ヒト胎盤催乳ホルモｙ　（ｈＰＬ　）　等の胎盤ホル
モン等、及びホルモン以外の物質例えば前立腺悸酸性ホ
スファターゼ（ＰＡＰ　）　、アルカリ性ホスファター
ゼ、−一゛　乳酸脱水素酵素、トランスア ミナーゼ、トリプシン、ペプシノーゲン等の酵素、α−
フェトプロティン（ＡＦＰ　）、ガン胎児性抗原（ＣＥ
Ａ　）等のガン特異物質、免疫グロブリンｏ（Ｉｇｏ）
、フイプリンーフイブリノゲン分解産物（ＦＤＰ　）　
、抗トロンビンＩｌｌ　（ＡＴ■）、トランスフェリン
等の血清蛋白成分、リュウマチ因子、セロトニン、ウロ
キナーゼ、フェリチン、すブスタンスＰ等があげられる
。

本発明に用いられる抗体は、公知の方法により、抗原を
動物に投与して免疫し、抗体力価が所定値以上に達した
動物から抗血清を採取し、必要に応じて精製することに
より得られる。本発明においては抗原決定基を異にする
抗体としてモノクロナル抗体も用いることができる。モ
ノクロナル抗体は、公知の手法を適宜に選択、組み合わ
せてモノクロナル抗体産生融合細胞株を形成し、この細
胞株を利用して産生、取得することができる（例えば特
開昭６０−２０１４９号公報参照）。これらの抗体には
抗体分子ＩｇＧを酵素で処理して得られるＦａｂ、　Ｆ
ａビ、Ｆ（ａｂ’）２の画分も含まれる。

一担体膜及びラテックス粒子に担持させる抗体としては
、被測定物に対して抗原決定基の異なる抗体が用いられ
る。例えば担体膜に担持させる第１の抗体としてモノク
ロナル抗体を用いる場合には、ラテックス粒子に担持さ
せる第２の抗体として、第１のモノクロナル抗体と抗原
決定基を異にするモノクロナル抗体又は同一抗原に対す
るポリクロナル抗体を用いる。また第１の抗体としてポ
リクロナル抗体を用いる場合には、第２の抗体としてモ
ノクロナル抗体又はポリクロナル抗体を用いることがで
きる。

本発明に用いられる担体膜としては例えば濾紙、セルロ
ースアセテートメンプラン、ニトロセルロースメンプラ
ン、イムノダインイムノアフイニテイメンプランなどが
あげられる。これらの担体膜は、膜表面に孔を有してお
り、その孔は膜の表面から裏面に連通していることが必
要であり、未反応のラテックス粒子が通過できるもので
ある。このため担体膜の孔径は用いるラテックス粒子の
粒径より大きいことが必要である。担体膜の孔径は、通
常は約０．２〜１０μｍ。

好ましくは約０．４５〜１０μｍである。担体膜の孔径
とラテックス粒子の直径の比は３：１〜１５：１が好ま
しい。

担体膜は、ラテックス粒子が白色のときは抗原に結合し
た第２の抗体担持ラテックスが明瞭に判別できるよう着
色されている必要がある。

これらの着色膜としては市販のメンブランフィルタ−１
Ｆ紙などが用いられる。

担体膜への第１の抗体の担持は常法により行うことがで
き、例えばセルロースアセテートメンプラ／、ニトロセ
ルロースメンプラノへの抗体の担持は、乾燥メンプラン
に抗体溶液を滴下又は浸漬させ、乾燥したのち不活性蛋
白質などで未吸着部分をブロックして担持させることが
できる。また、濾紙を臭化シアンで活性化し、１級アミ
ンとカップリングさせたのち抗体を結合させる方法、同
様に臭化シアンで活性化し、エチレンジアミン化合物と
低温で反応させ、ω−アミン誘導体を製造したのち抗体
を加えることにより製造することができる（基礎生化学
実験法２丸善株式会社参照）。イムノダイ／アフイニテ
イメンプランへの抗体の担持も、公知の方法により行う
ことができる。

本発明に用いられる第２の抗体担持ラテックスとしては
、従来のラテックス凝集又は凝集阻止反応で用いられる
抗体担持ラテックスがあげられる。ラテックス粒子の例
としては、ポリスチレンラテックス、スチレン−ブタジ
ェンコポリマーラテックス、ポリビニルトルエンラテッ
クス、ビニルトルエン−ｔ−ブチルスチレンコポリマー
ラテックス、スチレン−メタアクリレートコポリマーラ
テックスなど、及び官能基としてカルボキシル基、第１
級アミノ基又はカルボアミド基（−ｃｏＮＨｔ　）を有
し、かつ基体が前記ラテックスから成る反応性高分子ラ
テックスなどがあげられる。

ラテックス粒子の粒径は適宜に選択できるが、平均粒径
が約０，０１〜２μｍ、特に約０．０５〜１０．８μｍ
のものが好ましい。

ラテックス粒子は前記の担持膜が白色のときは、市販の
着色したラテックス粒子、例えば日本合成ゴム社製ポリ
スチレンラテックス粒子（赤、ピンク、青、黄、緑など
）を用いることができる。また担持膜が白色以外の色で
着色されている場合は、ラテックス粒子は抗原と結合し
たとき明瞭に判別できる色のものが用いられる。

例えば担持膜が黄色のときは、ラテックス粒子の色は赤
色、青色又は緑色など、また担持膜が青色のときはラテ
ックス粒子の色は白色、黄色などコントラストの強い色
を用いるのが好ましい。

前記のラテックス粒子に、被測定物質に対する第２の抗
体を担持させる方法としては、公知の方法例えばラテッ
クス粒子に抗体を物理的に吸着させる手法及び化学的に
結合させる手法のいずれの手法も利用することができる
。本発明において、第２の抗体担持ラテックス粒子とは
、これらの任意の手法を適宜に選択利用してラテックス
粒子に第２の抗体を担持させたすべての担持ラテックス
粒子を意味する。

抗体を吸着によりラテックス粒子に担持させるには、抗
体の溶液とラテックス粒子の懸濁液を混合すればよく、
これにより容易に第２の抗体担持ラテックス粒子が得ら
れる。抗体は多く　゛の場合カルボキシル基及び第１級
アミノ基を有する。抗体を化学的にラテックス粒子に結
合させるには、例えば前記の官能基を有する反応性高分
子ラテックスと抗体を例えばカルボジイミド法を用いて
結合させる。

第１の抗体担持膜及び第２の抗体担持ラテックス粒子の
組み合せから成る免疫化学的測定試薬としては、例えば
下記の測定試薬があげられる。

（１）抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈｃａ　）モノ
クロナル抗体担持ニトロセルロースメンプランと抗ｈＣ
Ｇポリクロナル抗体担持ラテックス粒子、 （２）抗前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ　）ポリク
ロナル抗体メンプ２ンフィルターと抗ＣＡモノクロナル
抗体担持ラテックス粒子、 （３）抗α−フェトプロティン（ＡＦＰ　）モノクロナ
ル抗体担持戸紙と抗ＡＦＰモノクロナル抗体担持ラテッ
クス粒子、 （４）抗ガン胎児性抗原（ＣＥＡ　）ポリクロナル抗体
相持イムノダインイムノアフイニテイメンプランと抗Ｃ
ＥＡモノクロナル抗体担持ラテックス、 （５）抗フィブリン・フィプリノゲン分解産物（ＦＤＰ
）モノクロナル担持ニトロセルロースメンプランと抗Ｆ
ＤＰモノクロナル抗体担持ラテックス、（６）抗ヒト生
長ホルモン（ｈＣＧ　）ポリクロナル抗体担持涙紙と抗
ＣＥモノクロナル抗体担持ラテックスなど。

本発明を実施するに際しては、被検液中に含まれる抗原
な担体膜に担持された第１の抗体と反応させる。

抗原と第１の抗体を反応させるには、第１の抗体担持膜
に被検液又はその希釈液を滴下することが好ましい。こ
れにより第１の抗体に被検液中の抗原が結合し、抗原−
抗体複合物が生成する。

次いで必要に応じ担体膜を水、緩衝液などで洗浄したの
ち、第２の抗体担持ラテックスを滴下し、抗原−抗体複
合物と第２の抗体を反応させる。

次いで水、緩衝液などで洗浄し、未反応ラテックス粒子
を洗い流す。

緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液などが用いられ、これらは不活性蛋白質として牛血清
アルブミン（ＢＳＡ　）、家兎血清アルブミン（ＢＳＡ
　）などを含有していてもよい。０．０５〜０．２％Ｂ
ＳＡ含「トリス−塩酸緩衝液を用いることが好ましい。

被検液中に抗原が存在すると、担体膜上に担体膜と異な
る色の第２の抗体担持ラテックス粒子が結合され、抗原
と結合しなかった第２の抗体担持ラテックス粒子は膜の
孔より流出され、抗原と結合した第２の抗体担持ラテッ
クスだけが残る。このラテックス粒子が結合した部分の
担体膜の色が変わり、容易に肉眼により判別することが
できる。被検液中に抗原が存在しないときは、第２の抗
体を担持したラテックス粒子は担体膜の孔より全て流出
し、担体膜の色は変化しない。この際、第１の抗体を識
別しやすい形状、例えば一定の直径を有するスポット状
、星形、十などの記号として担体膜に担持しておくと判
定が容易であり好ましい。また第１の抗体担持膜は、被
検液の中へ浸漬してもよいが、予め筒状の容器、好まし
くは検体を上から滴下したとき、下から吸収又は吸引で
きるような装置に保持することが好ましい。

実施例１ （１−ａ）抗ｈＣＧ特異的モノクロナル抗体の製造Ｂａ
１ｂ／ｃ　ＷウスにｈＣｏ　（１００００ｔｕ／ｍｐ）
をコンプリートフロインドアジュバントと共に３週間隔
で３回背部皮下投与し、さらに３週後ｈＣＧを腹腔内投
与した。最終免疫３日後の牌細胞と骨髄腫細胞（ＮＳ−
１）とを常法により細胞融合を行い、ＨＡＴ選別後、ク
ローニングを繰り返してｈＣＧ特異抗体を分泌する融合
細胞株を得た。

この融合細胞をプリスタンＱ、　５　ｍｌを予め腹腔内
投与したＢａ　１　ｂ／ｃマウスの腹腔内に投与し、腹
水腫瘍を形成させ、腹水を採取した。得られた腹水を硫
安分画、次いでアフィゲル−プロティンＡマグスキット
（ａｆｆｉｇｅｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＭＡＰ８ＫＩ
Ｔ　、　Ｂｉｏｌａｄ社製）によりＩｇＧを精製し、凍
結乾燥して白色粉末の抗ｈＣＧ特異的モノクロナル抗体
を得た。

（１−ｂ）抗ｈＣＧポリクロナル抗体の製造家兎にｈＣ
Ｇ　１　ｍ１ｉｌをコンプリートフロインドアジュバン
トと共に背部皮下投与し、１力月後にさらにｈＣＧを６
週間隔で２回皮下及び足聴投与を行い、最終免疫３週間
後に全採血して血清を分離し抗血清を得た。得られた抗
血清を５６°Ｃ１３０分間非働化後、硫安分画、ＤＥＡ
Ｅ−セルロースクロマトグラフィ、セファデックスＧ２
００ゲル濾過により精製したのち凍結乾燥し、白色粉末
の抗ｈＣＧポリクロナル抗体を得た。

（１−Ｃ’）抗ｈＣＧ特異的モノクロナル抗体固定化メ
ンプランの製造 孔径５μｍの白色のニトロセルロースメンズラン（東洋
ｐ紙社製、直径２０＋１ｍ１）を精製水で洗浄して水切
り後、３７℃、湿度８０％の恒温恒湿器中に１５分間放
置後、（１−ａ）で得られた抗ｈＣＧモノクロナル抗体
の５００　ｐｇ／ｍｌ　（０，９％ＮａＣ１含有２０　
ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液、ｐＨ８，２）溶液を２μＪ
ずつメンプランの中央部にスポットし、前記の恒温恒湿
器中で６０分間静置した。次いで抗体スポット部以外を
ブロックするために５％ＢＳＡ溶液に浸漬して３７℃、
４５分間加温した。トリス−塩酸緩衝液で２回洗浄し、
０．１％ＢＳＡ含有トリスー塩酸緩衝液に浸漬後、水切
り、乾燥し、白色の抗ｈＣＧ特異的モノクロナル抗体固
定化メンプランを製造した。

（１−ｄ）抗ｈＣＧ抗体感作ラテックス試薬の製造（１
−ｂ）で得られた抗ｈＣＧポリクロナル抗体１０■を４
　ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ８，２）に溶解したのち
、攪拌下に赤色ポリスチレンラテックス（固形分１０％
、日本合成ゴム社製、粒径０゜３０５　ｔｔ　）　１．
　Ｏａｔを滴下混合し、室温で３０分間及び５６℃で３
０分間攪拌を続けた。次いで冷却後、遠心分離した。得
られた沈殿をグリシン緩衝液１０ｍ１に懇濁し、遠心分
離する操作を２回繰り返したのち、沈殿を１％ＢＳＡ含
有グリシン緩衝液１０ｍＡ’に懸濁させ、室温で１時間
攪拌したのち遠心分離した。この洗浄操作を６回繰り返
したのち、０．１％ＢＳＡ含有グリシン緩衝液２０ｍ１
に懸濁し、抗ｈＣＧポリクロナル抗体感作ラテックスを
製造した。

（１−ｅ）測定法 （１−ｃ）で製造した抗ｈＣＧ特異的モノクロナル抗体
固定メンプランを多孔性樹脂の上に載せ、支持枠にセッ
トして反応に供した。０．１％ＢＳＡ含有トリスー塩酸
緩衝液を用い、各種濃度の標準ｈＣＧ溶液を調製し、そ
の溶液のそれぞれ２００μ２を中央部に滴下して吸収さ
せた。次いで（１−ａ）で得られた抗ｈＣＧポリクロナ
ル抗体感作ラテックス試薬を２滴（約７０μりをその上
に滴下し、試薬がメンプランに吸収されたのち、直ちに
０．１％ＢＳＡ含有トリス緩衝液（ｐＨ８，２）を滴下
して未反応ラテックスをメンプラン下に洗浄除去し、肉
眼により包着スポットの有無を判定した。対照としてｈ
ＣＧ溶液の代わりに０．１％ＢＳＡ含有トリス緩衝液を
用いた。その結果を第１表に示す。

第　　１　　表 表中の＋は赤色のスポットが見られたもの、−は何ら着
色がみられなかったもの、士は極くわずか着色されたも
のを示す。以下に示す実施例においても同様の意味を表
わす。

次いで、妊婦尿１０例について従来法（ラテックス凝集
反応法、感度２０　Ｑ　ｍｉｕ／ｍｌ）と比較検討した
。なお各妊婦尿中のｈＣＧ濃度はラジオイムノアッセイ
法（ＲＩＡ）にて定量した。その結果を第２表に示す。

第　　２　　表 これより明らかなように本発明方法はラテックス凝集反
応法に比して感度が高いことが知られる。なお反応操作
は２分以内で行うことができる。

実施例２ （２−ａ）抗ｈＬＨ特異的モノクロナル抗体の製造ｈＬ
Ｈを抗原として、実施例（１−ａ）と同様にＢａ１ｂ／
Ｃマウスに免疫し、その牌細胞を用いて細胞融合を行い
、ｈＬＨ特異的モノクロナル抗体を分泌する融合細胞株
並びにｈＣＧ、　ｈＬＨ及びｈＦｓＨと交差反応するα
−サブユニットを認識するモノクロナル抗体を分泌する
融合細胞株を得た。各細胞株を予めブリスタン投与した
Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの腹腔内に投与し、腹水腫瘍を形成
させて腹水を得た。得られた腹水を硫安分画及びアフィ
ゲル−プロティンＡラプスキットにより精製し、凍結乾
燥して白色粉末のモノクロナル抗体を得た。得られた抗
ｈＬＨ特異的モノクロナ、ル抗体はメンプラン固定に用
い、α−サブユニットを認識するモノクロナル抗体はラ
テックス粒子の感作に用い′た。

（２−ｂ）抗ｈＬＨモノクロナル抗体固定化メンプラン
の製造 孔径８μＴｒＬ豊トロセルロースメンプラン（ザルトリ
ウス社製）を直径２０１ｆｌｌの円形に切断し、実施例
（１−ｂ）と同様にして（２−ａ）で得られた抗ｈＬＨ
抗体を固定化して、抗ｈＬＨ抗体固定化メンプランを製
造した。

（２−ｃ）抗ｈＬＨモノクロナル抗体感作ラテックス試
薬の製造 （２−ａ）で得られたα−サブユニットを認識するモノ
クロナル抗体２■を４　ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ８
，２）に溶解したのち、攪拌下、青色ポリスチレンラテ
ックス（固形分１０％、日本合成ゴム社製、粒径０．６
５５　ｐ　）　１．０　ｍｌを滴下混合し、室温で１時
間攪拌し、さらに５６℃で３０分間加温した。冷却後、
実施例（１−ａ）と同様にして抗ｈＬＨモノクロナル抗
体感作ラテックス試薬を製造した。

（２−ａ）測定法 実施例（１−ｅ）と同様にして、抗ｈＬＨモノクロナル
抗体固定メンプランを多孔性樹脂より成る吸収体の表面
に装着し、これを支持枠にセットし、反応に供した。０
．１％ＢＳＡ含有トリス緩衝液で各種濃度のｈＬＨ溶液
を調製し、その５００μ形をメンプランに滴下吸収させ
、次いで（２−Ｃ）で得た抗り、ＬＨ抗体感作ラテック
ス試薬を３滴（約１００４）滴下した。試薬をメンプラ
ンに吸収させたのち、０．１％ＢＳＡ含有トリス緩衝液
を滴下して未反応ラテックス試薬を洗浄除去した。

対照としてｈＬＨ溶液の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ト
リス緩衝液を用い、同様に操作した。判定は肉眼により
青色スポットの有無により行った。

その結果を第６表に示す。

第　　３　　表 これより明らかなように測定感度Ｑ、　Ｑ　５１ｕｆｉ
ｌ（５０ｍ１ｕ７ｆｎｌ　）と極めて高感度な試薬が得
られた。また測定に要した時間は２分以内であった。

実施例３ （３−ａ）抗ｈＦＳＨ特異的モノクロナル抗体の製造ｈ
ＦｓＨを抗原として、実施例（１−ａ）と同様にしてＢ
ａ１ｂ／ｃマウスに免疫し、その牌細胞を用いて細胞融
合を行い、抗ｈＦｓＨ特異的モノクロナル抗体を分泌す
る融合細胞株を得た。この細胞株を予めプ゛リスタン処
理したＢｂｌｂ／ｃマウスの腹腔内に投与し、腹水腫瘍
を形成させて腹水を得た。

得られた腹水を硫安分画及びアフィゲル−プロティンＡ
リプスキットにより精製したのち凍結乾燥し、白色粉末
の抗ｈＦｓＨ特異的モノクロナル抗体を得た。このモノ
クロナル抗体はラテックス粒子を感作するのに用いた。

Ｕ−ｂ）抗ＨＭＧ抗体の製造 家兎にＨＭＧ　１〜をコンプリートフロインドアジュバ
ントと共に背部皮下投与し、さらに皮下及び跣間投与に
より３週間隔で２回投与した。

最終免疫６週間後に全採血し、血清を分離して抗血清を
得た。この抗血清を５６℃、３０分間非働化後、硫安分
画、ＤＦ：ＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、セフ
ァデックスＧ２００ゲル濾過によりＩｇＧを精製したの
ち凍結乾燥し、抗ＨＭＧ抗体を得た。得られた抗ＨＭＧ
抗体はメンプランの固定に用いた。

（３−ｃ）抗ＨＭＧ抗体固定化メンプランの製造孔径３
．０μの黒色メンプラン（東洋ｐ紙社製）を直径２０Ｉ
ＩＩＩＩの円形に切断し、実施例（１−ｃ）と同様にし
て（３−ｂ）で得られた抗ＨＭＧ抗体を固定化し、抗Ｈ
ＭＧ抗体固定化メンプランを製造した。

（３−ｄ）抗ｈＦＳＨ特異的モノクロナル抗体感作うテ
クス試薬の製造 （３−ａ）で得られた抗ｈＦｓＨ特異的モノクロナル抗
体１１ｎ９をグリシン緩衝液（ｐＨ８，２）４ｍＪに溶
解したのち、攪拌下に白色のポリスチレンラテックス（
固形分１０％、ダウケミカル社製、粒径ｏ、　１０３μ
）　１．　ｏ　ｍｌを滴下混合し、室温で１時間攪拌後
さらに５６℃、３０分間加温した。

冷却後、実施例（１−ｄ）と同様に洗浄操作を行い、０
．１％ＢＳＡ含有グリシン緩衝液（ｐＨ８，２）２０ｍ
／に懸濁し、抗ｈＦｓＨ特異的モノクロナル抗体感作ラ
テックス試薬を製造した。

（３−ｅ）測定法 （？１−Ｃ）で得られた抗ＨＭＧ抗体固定化メンプラン
と（５−ｄ）で得られた抗ｈＦｓＨ特異的モノクロナル
抗体感作ラテックス試薬を用い、実施例（１−ｅ）と同
様にしてｈＦＳＨを測定した。その結果を第４表に示す
。

第　　４　　表 実施例４ （４−ａ）抗ｈＰＬ抗体の製造 家兎にｈＰＬ　１１９をコンプリートフロインドアジュ
バントと共に背部皮下投与し、１力月後にさらに皮下及
び針量投与を３週間隔で２回投与した。最終免疫６週間
後に全採血して血清を分離し抗血清を得た。得られた抗
血清を５６℃、３０分間非勧化したのち、硫安分画、Ｄ
ＥＡＥ　−セルロースクロマトグラフィー及びセファデ
ックスＧ−２００によるゲル濾過によりＩｇＧを精製し
、さらに凍結乾燥して抗ｈＰＬ抗体の白色粉末を得た。

（４−ｂ）抗ｈＰＬ抗体固定化メンプランの製造孔径６
μのポールイムノダインイムノアフイニテイメンプラン
（ポール・ビオメディカル・プロダクト・コーポレーシ
ョン製、白色）の乾燥メンプランを直径２０ＩＩＩＩＩ
の円径に切断し、（４−ａ）で製造した抗ｈＰＬ抗体の
リン酸緩衝液（１０ｒｎ９／ｍ１％Ｉ）Ｈ７，２）をメ
ンプランの中央部に５μＪずつスポットしたのち室温で
乾燥した。次いでリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で３回洗
浄後、５％ＢＳＡリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に浸漬し
、３７℃、４５分間加温した。次いで前記の緩衝液で３
回洗浄後室湛で乾燥して抗ｈＰＬ固定化メンプランを得
た。

（４−ｃ）抗ｈＰＬ抗体感作ラテックス試薬の製造（４
−ａ）で得られた抗ｈＰＬ抗体５１１１９を４　ｒｎｌ
のグリシン緩衝液（ｐＨ８，２）に溶解後、攪拌下、黒
色ポリスチレンラテックス（日本合成ゴム社製、粒径０
．２０９μ）　１．　□　ｍｅ、を滴下混合し、室温で
１時間攪拌し、さらに５６℃で３０分間加温した。冷却
後、実施例（１−ａ）と同様に洗浄操作を行ったのち、
０．１％ＢＳＡ含有グリシン緩衝液２Ｑ　ｍｌに懸濁し
、抗ｈＰＬ抗体感作ラテックス試薬を製造した。

（４−ａ）測定法 （４−ｂ）で得られた抗ｈＰＬ抗体固定化メンプランと
（４−Ｃ）で得られた抗ｈＰＬ抗体感作ラテックス試薬
を用い、実施例（１−ｅ）と同様にしてｈＰＬを測定し
た。その結果を第５表に示す。

第　　５　　表

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 被験液中に含まれる抗原を、ラテックス粒子の粒径より
   大きい孔径を有する多孔質担体膜に担持された第１の抗
   体と反応させ、生成する抗原−抗体複合物を、該担体膜
   と異なる色のラテックス粒子に担持され、第１の抗体と
   抗原決定基を異にする第２の抗体と反応させることを特
   徴とする、被験液中の抗原の免疫学的測定方法。