JPS6215464A - 逆受身凝集反応用非特異反応吸収剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト血液等に存在する特定の抗原を測定する逆
受身凝集反応を改良するものである。

〔従来の技術〕

逆受身凝集反応は、赤血球等の担体粒子に測定対象の抗
原に対する抗体を結合させ、との粒子が当該抗原の存在
によって凝集する反応を利用して抗原を測定する方法で
あるが、従来はこの抗体に兎、山羊等に免疫して得たポ
リクローナル抗体が利用されていた。

ところが、ポリクローナル抗体を取得するためには、免
疫源として抗原を大量に使用し、さらにポリクローナル
抗体の精製工程においてもアフィニティークロマトグラ
フィーのカラムにやはり抗原を使用するところから、抗
原が高価な場合にはコストが問題であった。また、ポリ
クローナル抗体は免疫動物の固体差、さらにはアフィニ
ティークロマトグラフィー等の精製工程において変性を
生じて製品のロフト差の問題さらには抗体活性の低下あ
るいはバラツキの問題もあった。これらは製品管理ある
いは工程管理の負担を増大させるばかりでなく、担体粒
子に感作される抗体量が粒子面積に制限されることから
検出感度の低下にもつながっていた。

一方、これらの問題点を解決した方法として抗体にモノ
クローナル抗体を利用する方法が開発されている（特開
昭５７−８６０５１号公報、特開昭５７−１１８１５９
号公報及び％開昭５８−１２７１６７号公報）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところが、このモノクローナル抗体を利用した場合には
非特異反応が高頻度で発生するためにこの方法は実用化
されるに至っていない。

例えば、マウスモノクローナル抗体を血球に感作してヒ
トα−７エトノロテインを測定する際に従来の血清希釈
用液等を利用した場合には、健常人血清で２０〜５０％
、リューマチ患者血清では５０〜９０％の頻度で非特異
反応が発生することが本発明者の実験で確認されている
。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者はこのような問題点を解決して種々の利点を有
するモノクローナル抗体を利用した方法を実用化するべ
く鋭意検討を重ねた結果、測定対象と異種の抗原に対す
る抗体がこの非特異反応吸収剤として極めてすぐれてい
ることを見出して本発明を児成するに至った。

すなわち、本発明は、凝集反応する担体粒子に感作され
ているモノクローナル抗体と同種の動物由来であって、
測定対象の抗原と異なる抗原に対スルモノクローナル抗
体よりなる、モノクローナル抗体を利用した逆受身凝集
反応用の非特異反応吸収剤に関するものである。

本発明の非特異反応吸収剤に利用されるモノクローナル
抗体（り下、「本発明のモノクローナル抗体」という。

）はまず、凝集反応する担体粒子に感作されているモノ
クローナル抗体（以下、「感作モノクローナル抗体」と
いう。）と同種の動物由来のものである。これは感作モ
ノクローナル抗体がマウス由来のものであれば本発明の
モノクローナル抗体もやはりマウス由来のものでなけれ
ばならないことを意味する。動物は、マウスのほか、ラ
ット、ヒト等を含み、その種類は特に制限されない。

次に、本発明のモノクローナル抗体は測定対象の抗原と
異なる抗原に対するものである。抗原の種類は特に限定
されないが、例えば、α−フェトプロティン（ＡＦ’Ｄ
　）癌胎児性抗原（ＣＥＡ　）免疫グロブリン（ＩｇＥ
　、　ＩｇＡ等）、アルブミン、フェリチン等の怖漿蛋
白質、ＨＢ！Ｉ抗原、ヘルペスウィルス等のウィルス抗
原、フィブリン分解生成物、グロスタグランジン、テス
トステロン、プロゲステロン、サイロキシン等のホルモ
ン、ジゴキシン、テオフィリン、フェノパルビタール、
フェニトイン、ペニシリン、アミカシン等の薬物等の４
［臓器、崩中あるいは尿中等に存在する抗原などである
。

又、抗原特異性は明らかでないが、ミエローマ市来のモ
ノクローナル抗体も、本発明のモノクローン”ル抗体に
含まれる。

このようなモノクローナル抗体は一般的なモノクロ“−
ナル抗体の製法に準じて取得するととができる。例えば
゛→ラウス測定対象の抗原と異なるいずれかの抗原をア
ジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓細胞を取
り出してポリエチレングリコール等を用いてマウスミエ
ローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞のなか
から当該抗体を産生ずるものをクローニングによってモ
ノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中で増殖さ
せる。

増殖させたモノクローン細胞は腹腔中にて多量の単一抗
体すなわちモノクローナル抗体を産生じ、腹水中に貯留
する。この腹水から、ケ゛ルクロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー等によって、ポリクローナル
抗体の場合に見られる。

免疫動物の個体差製品のロフト差、抗体活性の低下等の
問題もなく再現性よく、グロブリン画分、すなわちモノ
クローナル抗体が精製される。

このよ゛うにして得られた本発明のモノクローナル抗体
はそのままでも非特異反応吸収剤として充分使用しうる
が、特に検体中にリューマ゛チ因子等が含まれている場
合にはこれを変性処理することによって非特異反応吸収
能を高めることができる。

変性処理はポリクローナル抗体について知られている変
性処理、例えば熱処理、酸処理、ジメチルスルホキシド
処理などを利用できる。処理の程度は一般に知られてい
る条件よりも強くするのがよく、例えば熱処理の場合に
は６０〜６５℃では１〜２時間程度、酸処理の場合には
−１２，３〜２．８では１日〜２日間程度、ジメチルス
ルホキシド処理の場合には７〜８ＭＫて３０分〜１時間
程度が適当である。

本発明のモノクローナル抗体は血清希釈用液に添加して
使用するのが簡便である。添加量は検体が健常人血清の
場合には未変性のものを１〜１０μ９ｆｉｌ程度、通常
２μｇ２涌ｌ程度でよく、検体がリューマチ患者血清の
場合には変性品を５〜５００μｇ／ｆｎｌ程度使用した
モノクローナル抗体、又は変性の方法によって異なるが
、通常１０〜１００μｉ／ｆｎｌ程度でよい。このモノ
クローナル抗体は１種でもよく、また２種以上を併用し
てもよい。２種以上の場合の添加量は合計で上記の量に
なればよい。一方、このモノクローナル抗体は血清希釈
用液と別途に検体と接触させてもよい。その場合には、
検体と感作モノクローナル抗体が反応する際あるいはそ
れ以前に検体へ作用させるようにする。

本発明の非特異反応吸収剤を適用する逆受身凝集反応は
担体粒子に感作される抗体がモノクローナル抗体であれ
ばその種類は問うところではなく、測定対象抗原は例え
ば前述の抗原が含まれる。モノクローナル抗体を感作す
る担体粒子も羊、ニワトリなどの赤血球（ホルマリン等
による固定したものも含む。）のほか、微生物担体（特
公昭５０−２７３０号、特公昭５２−４８１６８号など
）、ゼラチン粒子（特開昭５７−１５３６５８号など）
、ラテックスなどの合成高分子粒子、ベントナイト、カ
オリンなど抗原抗体反応に基づく凝集反応に用いうるも
のであればいかなるものであってよい。

測定試薬キットには、通常との感作粒子及び本発明のモ
ノクローナル抗体を含む血清希釈用液のほか、復元液、
対照粒子、対照用陽性血清、非特異反応吸収用粒子など
が含まれる。

〔作用〕

本発明者は、種々検討の結果、血清には′２種の非特異
反応因子が存在すると判断するに至った。

その−は異種抗体と呼ばれるもので、これがマウスイム
ノグロブリン（モノクローナル抗体）等をも認識して非
特異反応をひき起こす。もうひとつはリューマチ因子、
すなわちリューマチ患者血清中に存在する抗グロブリン
因子である。本発明のモノクローナル抗体はこれらの因
子と反応して非特異反応を防止しているものと考えられ
る。

〔実施例〕

実施例１ 公知の細胞融合法により、抗原（ヒ）　ＡＦＰ　（ＪＡ
ＨＢａヒトＩｇＥ等）をマウスに免疫し得られたリンノ
や球とはエローマ細胞とをポリエチレングリコール等で
融合してモノクローナル抗体産生ノ・イブリドーマを確
立し多量のモノクローナル抗体を得た。

ＡＦＰと反応しないモノクローナル抗体（抗ＣＥＡ。

抗）ＩＢｍ　、抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体等）を
１〜２■／ｄ濃度に調整し、６３℃にて１．５時間加熱
処理をした。

リン酸二ナトリウム・１２水塩　　　１９．２０５３Ｎ
リン酸カリウム　　　　　　　　　　　２．９０８９　
ｇＮａｐｔ４．３８３１ 健康家兎血清（ＮＲ８）　　　　　　　　１０ｍ１Ｎａ
Ｎｓ　　　　　　　　　　　　　　　１．５１蒸留水　
　　　　　　　　　　１０００１１Ｉｌ上表に示した組
成の溶液に熱変性させた前記のモノクローナル抗体を所
定の濃度となるように添加したものを希釈用液とした。

公知の方法によシ、ニワトリ赤血球をホルマリンで固定
した後、ＰＢＳで１０万倍に希稀したタンニン酸溶液で
処理した。この赤血球の５１　ＰＢＳ浮遊液１容量部と
抗原認識部位の異なる（特異性の異なる）抗ヒトＡＦＰ
モノクローナル抗体三種類を混合した３０μｇ７ｗｔｔ
濃度のＰＢＳ溶液１容量部を混合し、３７℃に３０分間
赤血球の表面にモノクローナル抗体を吸着させた。次い
で３０００　ｒｐｍで１０分間遠心沈澱して赤血球を回
収し、ＰＢＳで３回遠心洗浄した。

この操作によシモノクローナル抗体吸着血球を作製した
。

前述の希釈用液を使用して、抗ＡＦＰモノクローナル抗
体感作赤血球とリューマチ患者血清との反応を調べた。

リューマチ患者血清はあらかじめ他の試験方法（ＲＩＡ
法、　ＦｉＩＡ法）によりＡＦＰ値が５ｎＪ／ｍ／以下
であることを確認した。

リューマチ患者血清との反応はマイクロプレート法にて
行なった。操作法は下記に示した。

まず希釈用液をウェルＩ６１に５０μｌ、ウェルＪｆ６
２以降は２５μｊずつ入れ、さらにウェル４１に血清を
５μｌ入れた。ダイリーーター（２５μ！送シ用）にて
ウェルＡ１から順に２ｎ希釈し、室温にて３０分放置し
念。３０分後先に作製し九モノクローナル抗体感作血球
浮遊液を希釈用液にて０．６係セルに調整し、ウェルＳ
１から順に２５μｌずつ滴下した。振とり撹拌後室温に
静置し、約１時間牛後凝集像を判定した。

結果を下表に示した。

２例のり＝Ｌ−マチ患者而面清ついてのみ示したか、面
清によって凝集力価が異なっていた。しかしながら凝集
力価の高い自消であっても、熱変性モノクローナル抗体
を１００μｌｉ／ｍｌ濃度となるように希釈液へ添加す
れば、非特異凝集因子を同時吸収することが出来、非特
異凝集反応の発生は皆無であった。

一方、この熱変性モノクローナル抗体を加え々かった場
合には８０〜９０係のりｍ−マチ患者血清について非特
異凝集反応が発生した。

実施例２ 実施例１で得た抗ＡＦＰモノクローナル抗体以外のモノ
クローナル抗体を１〜２　ｑ／ｍｌ濃度に調整し、０．
１Ｍグリシン・塩酸（ｐＨ２，３）溶液にて透析し酸変
性させた。変性後生塩素塩水にて透析して０．１　Ｍグ
リシン・塩酸溶液を除去した。

実施例１と同じ１　％　ＮＲ８含有ＰＢＳ溶液に酸変性
させた上記のモノクローナル抗体を所定の濃度に添加し
て希釈用液を調製した。

この希釈用液と実施例１と同じ抗ＡＦＰモノクローナル
抗体感作穐球を用い、実施例１と同様に１゜てマイクロ
プレート法でり、−ｖチ患者自清との反応を調べたとこ
ろ、いずれのモノクローナル抗体の場合も実施例１と同
様に非特異凝集因子を除去することができた。

実施例３ 実施例１に示す組成の１係ＮＲ８含有０．１５ＭＰＢＳ
溶液に実施例１で得た抗ＡＦＰモノクローナル抗体以外
の未熱変性モノクローナル抗体を２μＩ／ｍｌになるよ
うに加えて希釈用液を調製した。この希釈用液と実施例
１と同じ抗ＡＦＰモノクローナル抗体感作崩球を用い、
健常人崩潰について非特異凝集反応の発生率を調べたと
ころ、非特異凝集反応の発生は皆無であった。

一方、抗ＡＦＰモノクローナル抗体以外のモノクローナ
ル抗体を希釈用液に加えなかった場合の非特異凝集反応
発生率は２０〜５０係であった。

〔発明の効果〕

本発明の非特異反応吸収剤を使用することにより、モノ
クローナル抗体を逆受身凝集反応に利用しても健常人穐
清はむろんのことり一−マチ患者怖清についても非特異
凝集反応の発生を完全に防止できる。本発明の非特異反
応吸収剤はモノクローナル抗体の逆受身凝集反応への利
用をはじめて実用的に可能にしたものであり、これにょ
９、ＡＦＰその他一般に高価なものが多い抗原の使用量
を犬山に低下させてコストダウンをさせる仁とができる
。また、モノクローナル抗体の品質が安定しておりかつ
製造段階で変性、失活の問題がないところから測定結果
に対する信頼度を高めるとともに検出感度を向上させる
ことができる。従来のポリクローナル抗体を使用した場
合のＡＦＰ検出感度は２５〜５０　ｎ、Ｉ　／ｍｌ程度
であったが、モノクローナル抗体を使用することにより
５〜１０　ｎｌ　／ｍｌまで高めることができた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）凝集反応する担体粒子に感作されているモノクロ
   ーナル抗体と同種の動物由来であって、測定対象の抗原
   と異なる抗原に対するモノクローナル抗体よりなる、モ
   ノクローナル抗体を利用した逆受身凝集反応用の非特異
   反応吸収剤
2. （２）測定対象の抗原と異なる抗原に対するモノクロー
   ナル抗体が血清希釈用液中に含まれた状態にある特許請
   求の範囲第１項記載の非特異反応吸収剤
3. （３）測定対象の抗原と異なる抗原に対するモノクロー
   ナル抗体が蛋白変性処理によって処理されたものである
   特許請求の範囲第１項記載の非特異反応吸収剤