JPH01254869A - 免疫的に結合可能の物質の測定法及び診断剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、免疫的に結合可能の多価物質を免疫的に結合
可能の物質に対する特異性反応体少なくとも２種の存在
でまたヒト血清試料中の障害因子を補償する阻害剤の存
在で測定する改良された方法並びにこれに適した試薬に
［」する。

従来の技術 免疫的に結合可能の物質例えば多価抗原（ペプチド、蛋
白質、多糖類、ウィルス、細菌、特異細胞）を空間的に
異なる各抗原決定基に対応する２つ又は場合によっては
それ以上の抗体を使用して迅速に測定する方法は放射免
疫分析又は酵素免疫分析によるサンドイッチ検定法（２
一部位−免疫検定法）として公知である。この公知測定
法は最も慣用されているものであり、この場合測定すべ
き抗原（試料）は第１抗体くこれは固相でセファロース
、アガロース、プラスチックチューブ及び同様のものの
ような適者な担持材料に結合されているか又は例えばビ
オチン塞化のように均一に液状で存在する）及び液相の
第２又は他のｆｉｆｌされた抗体の特定量でインキュベ
ートされる。第２の及び場合によっては他の抗生の特異
性は、これが第１抗体とは異なる測定すべき抗原の決定
基に対応するように選択するのが有利であり、これによ
り試験感１５を阻害する可能性のある、測定すべき抗原
の同ｅ結合箇所に各抗体が同時発生することは阻止され
る。第１の固相結合されているか又はビオチン塞化され
た抗体並びに第２又は他の液状で存在するＦ５＝ｔＡさ
れた抗体は共に過剰量で添加される。それぞれの抗原は
第１の抗体に固定されｔ：活性度（Ａｋｔｊｖｉｔ、Ｉ
ｔ）又は溶液に残存する免疫的に結合されていない活性
度を介して測定するごとができる。　７８者の場合には
漂識された第２抗体を特定された量で加えることが必要
である６゜ 免疫的サンドイッチ検定法に対してはその必要な特異性
により特にモノクローナル抗体（ｈｌＡＫｓ）から誘導
された完全ＩｇＧ５又はその免疫反応性フラグメント（
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２　）が使用される、しかしこの
試験には、ポリクローナル抗体（ＰＡＫｓ　）から生じ
る免疫反応性成分を使用することもできる。

前記の２一部位−免疫検定法では測定すべき分析体に対
する特異性抗体を使用するにもかかわらず、非特異反応
を引き起こすヒト血清試料がかなりの頻度で生じる。こ
れは臨床処置のためその数値に相応して余裕を持たせた
場合好ましくない結果をもたらす、非特異反応の発生は
資料中に存在する物質（これは測定すべき分析体（多価
抗原）と同様に、しかし他の作用部位で、特異性免疫グ
ロブリン試薬（障害因子）を形成する）に起因する。

従って通常この種の免疫検定法は、特異性抗体が生じる
のと同じ動物種からの非特異性免疫グロブリン又は免疫
グロブリンフラグメント（−ｍにこれは免疫グロブリン
Ｇ、ｔｇＧである）を予防的に過剰量で添加する［アジ
ソン（（，１４゜Ａｄｄｉｓｏｎ）著ｒラジオイムノア
ッセイ・アンド・リレーテッド・プロスイージャズ・イ
ン・メデイシンＪ　（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐｒｏ−ｃｅｄｕｒｅｓ
　ｉｎ　１４ｅｄｉｃｉｎｅ）、第１巻、第１３１頁〜
第１４７頁、１９７４年：欧州特許出願公闇第０１７４
０２６号明細書］、一般にマウスから生じる特異性モノ
クローナル抗体を使用し初めて以来、免疫検定法におい
て上記の障害を除去するため多量の非特異性マウスＩｇ
Ｇが、マウス−血清、マウス−腹水又は分離したマウス
−免疫グロブリンの形で必要とされている（約３００〜
５００ｕｇ／ｍ、”ＣＩｊｎ　Ｃｈｅｗ、”、Ｕ、第１
４９１頁〜第１４９５頁、１９８６年）０例えば欧州特
許出願公開第０１７４０２６号明細書によれば適切な非
特異性マウス−又はラットＴｇＧ約３０ｕｇ／ｌｘＱを
前記形式の免疫検定法で加えることによって特定の血清
でまた特殊な場合（ネガティブ試料）にのみ障害は完全
に補償される。しかし要求されるキロ規模でマウス−Ｉ
ＫＧを準備することは現在の実施可能な方法では経済的
に不可能であり、またｆ５理的観点からも批判的である
。

上記形式の免疫検定法での障害を阻止するための本質的
な手段は、この免疫検定法で使用される特異性抗体の少
なくとも１つとしてＦａｂ−又はＦ（ａｂ’）２−フラ
グメントを使用することである、これにより　ＩｇＧの
Ｆｃ一部分に対応する試料におけるすべての障害因子（
リウマチ因子、例えば１ｇ＋４のような抗−Ｆｃ−免疫
グロブリン）は、特異性免疫試薬の１つでその作用部位
を失い、従って補償する必要はなくなる。

しかし多くのヒト血清では免疫検定法で、Ｆｃ−不含の
特異性抗体試薬を使用したにもかかわらず更に障害が生
じる。これは血清中のＦａｂ−又はＦ（ａｂ′）２に対
応する物質に起因する。欧州特許第００８３８６９号明
細書によればこれらの障害因子はＦａｂ一部位に、しか
もＦｃ一部位が除去された場合にのみ認められる。これ
は相応する免疫検定法で、測定すべき抗原に対する非特
異性の、自然の又は網状化されたＦａｂ−又はＦ（ａｂ
’）２−フラグメントを加えることによって除去するこ
とができる（欧州特許第００８３８６９号明細書）。

この場合凝集されたＦａｂ−又はＦ（ａｂ’　）２−フ
ラグメントは自然成分に比べて２〜３倍もの高い障害除
去作用を示す、これに対し２完全非特−“シ性Ｋ　ｇＧ
ｓは欧州特許第００８３８６９号明４ｌｌｌ書によれば
自然形でもまた凝集された形でも上記の免疫検定法にお
いて障害除去作用を有さない、更にこの方法は、測定す
べき抗原に対する特異性免疫グロブリン試薬の他に高価
な非特異性免疫グロブリン試薬を多ＭＬに必要とすると
いう著しい欠点を有する（これは経済的並びに債理的に
重大な問題点を有する）、更に例えば障害を除去するた
めには有効と思われる凝集された非特異性のＦｃ−不合
免疫グロブリンフラグメントを少なくとも　ＬＯＱｕｇ
／耐使用する。

発明が解決しようとする課題 従って本発明は特異性反応体としてＦｃ−含有及びＦｃ
−不含の特異性抗体試薬を用いて免疫検定法での非特異
性反応を補償する新規可能性を提供することを根本課題
とし、これによりヒト直情における完全ＩｇＧ５及びＦ
ａｂ−又はＦ（ａｂ’）２−フラグメントに対応する障
害因子を確実に除去しまた倫理面の′Ｊｆ慮下に改良さ
れた試験システムを経済的に利用することを可能にする
ことである。

課題を解決するための手段 この課題は本発明によれば、第１勅物種又は人間の体液
中の免疫的に結合可能の物質を、第２勅物種の免疫的に
結合可能の物質に対する↑、？異性反応体少なくとも２
種の存在でまた障害因子を補償する阻害剤の存在で測定
する方法において、障害因子を補償するため反応混合物
を第２及び／又は第３動物種の免疫的に結合可能の物質
に対する非特異性で、モノクローナル又はポリクローナ
ル抗体から誘導された凝集体０．１〜５０ｕｇ／−と接
触させることを特徴とする、免疫的に結合可能の物質の
測定法によって解決される。

免疫的に結合可能の物質としては特に多価抗原例えばペ
プチド、蛋白質、多糖類、ウィルス、細菌及び他の特異
細胞又はこれらの成分が挙げられる。それぞれ測定すべ
き免疫的に結合可能の物質に対する特異性反応体として
はポリクローナル並びにモノクローナル抗体を使用する
ことができるが、この場合［ｇＧｓ及びその免疫反応性
成分例えばＦａｂ−又はＦ（ａｂ’　）２−フラグメン
トを組合わせて使用するのが有利である。特に有利なの
は２種又は場合によってはそれ以上の特異性反応体を使
用することであり、その少なくとも１つはＦａｂ−又は
Ｆ（ａｂ’）２−フラグメントであり、他の特異性反応
体は完全ＩｇＧ５である。

障害を補償するための、免疫的に結合可能の物質に対す
る非特異性抗体−凝集体としては、免疫的に結合可能の
物質に対する非特異性ＴｇＧｓの凝集体を使用するのが
有利であり、特に好ましいのは非特異性ＩｇＧ及び他の
巨大分子からなるＩｇＧ−凝集体である。この場合特異
性反応体の少なくとも１種と同じ動物種から生じる非特
異性１　ｇＧｓが有利である。巨大分子としては例えば
Ｆａｂ−又はＦ（ａｂ’）２−フラグメント、すなわち
マウス又は池の種から誘導される１４　Ａ　Ｋ　ｓ又は
ＰＡＫｓから得られるＦｃ−不含ＩｇＧ−フラグメント
又は蛋白質（例えばアルブミン）、多糖類（例えばデキ
ストラン）又は他の不溶性ポリマーが適している、更に
例えばマウス−ＩｇＧから架橋性牛−ＩｇＧ（ｖｅｒｂ
ｒｌｌｃｋｅｎｄｅｓ旧ｎｄｅｒ−ＩｇＧ）を介して形
成されるヘテロポリマーを障害補償のために使用するこ
とができる。特に有利なのはＩｇＧ−分子及びＦｃ不含
ＩｇＧ−フラグメントからなる凝集体であり、この場合
１ν異性反応体の１つと同じ動物種から生じるＩｇＧｓ
ＪｆｆｌびにＦｃ不含ＩｇＧ−フラグメントも使用され
る。この　ｒｇＧ／Ｆａｂ−又はＦ（ａｂ’）２−ポリ
マーは純粋な［ｇＧ−凝集体の約３倍の改良された障害
除去作用を示す０個々の薄情試料との関連において障害
を効果的に除去するにはＩｇＧ−コボマー０．１〜５０
ｕｇ／−で十分であり、有利には５〜２５ｕｇ／　ｍＱ
の濃度で、特に有利には５〜最高１０ｕｇ／ｍ１２の濃
度で操作する。それというのも多くの場合非特異性Ｉｇ
Ｇ−凝集体は一層僅かな添加ｉ１で完全に有効であるか
らである。

本発明の殴れた実施態様の１つによればヒト血清の障害
因子を補償するには、分子量３２０．０００ダルトン及
び以上の非特異性ホモポリマー又はヘテロボロマーＩｇ
Ｇ−凝集体又は［ｇＧ／Ｆａｂ−又はＦ（ａｂ’　＞２
−凝集体を使用する。　ＩＫＧ−凝集体は、特異性反応
体の少なくとも１つがもたらされる種の［［Ｇを含みま
た有利には特異性反応体の少なくとも１つと同じサブク
ラスに属する。この場合分子ｆｆｌ　３２０，０００〜
ｔｏ、ｏｏｏ、ｏｏｏダルトンのポリマーＩｇＧ調剤を
使用するのが有利であり、その際血清障害因子に対する
補償作用は分子量の増大と共に上昇する９本発明の特に
有利な実施態様は２個又はそれ以上の特異性マウス−又
はラット−１４ＡＫ−反応体での２一部位−免疫検定法
であり、そのうちの少なくとも１つの反応体はＦａｂ−
又はＦ（ａｂ’）２−フラグメントであり、他の反応体
の少なくとも１つはＦｃ−含有ＩｇＧである。

障害因子を補償するため分子１ｉ　３２０，０００ダル
トン以上のホモポリマー又はヘテロポリマーの非１、′
？異性【ｇＧ−凝集体又はＩｇＧ／Ｆａｂ−又はＦ（ａ
ｂ’　）２−凝集体を加えるが、その際非特異性凝集体
に含まれるＩｇＧｓ及びＦａｂ−又はＦ（ａｂ’）２−
フラグメントはモノクローナルでありまた特異性反応体
の少なくとも１つと同じ種及びサブクラスに由来する。

この場合非特異性ＩｇＧ−又はＦａｂ−フラグメントが
腹水、発酵又は遺伝子工学を介して微生物中で発現する
ことにより製造されるか否かは＋６１題ではない。

本発明方法により障害を補償するのに適した、重合化さ
れた非特異性ｒｊＧ−分子又は非特異性ＩＨＧ−／Ｆａ
ｂ−又はＦ（ａｂ’　）２−凝集体は、被分析試料を生
じる種とは異なる種から得る必要がある。

一般にヒト血清を分析するための免疫測定法ではマウス
から誘導される特異性モノクローナル抗体又はその免疫
反応性フラグメントを使用する。しかし特異性抗体試薬
は他の動物種に由来するものであってもよい、障害除去
のため添加された非特異性抗＃：凝集体はマウスから得
るか又はマウスＩｇＧ又はそのＦａｂ−フラグメントと
組合わせて他の第１種のものとは異なる動物種から得る
こともできる。ＰＡえば特異性抗体試薬としてマウスＭ
ＡＫｓ又はマウスＩｚＧｓを使用する免疫検定法で、障
害除去のためにマウス−Ｉ　ｇＧ／牛−ＩｇＧヘテロポ
リマー（ｓ、ｏ）を使用することもできる。

非特異性ＩｇＧ−凝集体又はｒｇＧ　／　Ｆａｂ−又は
Ｆ〈ａｂ′）２−７ｆＩ集体を本発明で添加することに
よって、測定すべき免疫原に対する特異性反応体少なく
とも２個（そのうちの少なくとも１つはＦ　ａ　ｂ　−
又はＦ（ａｂ’　）２−フラグメントから誘尋）を用い
ての免疫検定法で非特異性反応の補償に関して、自然Ｔ
　ｇＧｓに比べてファクタ２０〜１０００また自然又は
凝集されたＦｃ−不合ＩｇＧ−フラグメントに比べてフ
ァクタ２０〜１５００又は３倍もの高められた作用効果
を得ることができる。これはＩｇＧ−含有非特異性反応
体が、モノクローナル又はポリクローナル抗体のＦｃ−
不合特異性免疫グロブリン試薬が１１与する免疫検定法
で、主としてＦａｂ−又はＦ（ａｂ′）２−フラグメン
トに向けられた障害の補６１を生じるとは予測し得なか
ったことから驚くべきことである。更に最新の技術水準
としての欧州特許第００８３８６９号明細書は当業者を
むしろ逆の結論に導く、すなわちこの特許明細書には、
自然ｒｇＧｓ並びに１１集されたＩ　ｇＧｓがそこに記
戊された免疫凝集試験では障害除去効果を示さず、障害
除去のためには特異性凝集のために添加された抗Ｊ≦（
と同様　［ＫＧ不合でなければならないことが強調され
ている。

非特シ”４性ｒｇＧはそれ自体と又は抗体フラグメント
と＝］ｌＥびに蛋白質、多糖類又は他の水溶性巨大分子
と熱の作用により化学的にか又は共有することなく生物
学的親和性（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）の相互作用を介して
文献から公知の方法により網状化可能である。いずれの
場合にも水性紐掛溶液中で可溶性の凝集体が生じる。化
学的網状化は例えばホモ−及びヘテロニ官能性の化学的
結合腕（Ｌｉｎｋｅｒ）によって蛋白質又は活性化デキ
ストランを介してか或はＩｇＧ−分子又はその及び／又
は他のＦｃ−不含フラグメントのカルボジイミドとの自
己網状化によって行われる。更に抗体モノマーは二硫化
物還元及び再酸化を介してか又はその炭化水素成分の酸
化を介してそれ自体と又は適当な巨大分子と網状化する
ことが可能である。化学的結合体としては例えばビス（
マレインイミド）−メチルエステル、ジメチルースペル
イミダート、ジサクシンイミジルースベレート、グルタ
ルジアルデヒド、Ｎ−サクシンイミジルー３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネート、Ｎ−５−アジド−２−
二トロペンゾイルサクシンイミド、Ｎ−サクシンイミジ
ル（４−ヨード−アセチル）−アミノベンゾエート、又
はマレインイミドヘキサノイルサクシンイミダートとＳ
−アセチル−メルカプトコハク酸無水物又は類似化合物
との組成物を挙げることができる。活性化デキストラン
は例えば特定された分子量のアミノデキストランからマ
レインイミドヘキサノイルサクシンイミダートを用いて
製造することができ、これを引続きメルカプトアセチル
−誘導体化された非特異性ＩｇＧ−分子址で網状化する
。生物学的親和性の相互作用とは一般に、例えばビオチ
ン／アビジン〈又はストレプトアビジン）、ハプテン／
アンチ−ハプテン抗体、抗原／アンチ抗原−抗体、配位
子／結合蛋白！′ｒ（例えばチロキシン／チロキシン結
合蛋白質）、ホルモン／受容体の各対で存在するような
結合を意味する。適当な１実施態様では非特異性ｒｇＧ
を少なくとも２ｇ所でビオチン基化し、ストレプトアビ
ジンを加えるか又はＩｇＧを少なくとも２個のジゴキシ
ゲニン分子で誘導体化し、モノクローナル又はポリクロ
ーナルのアンチ−ジゴキシン抗体で網状化する。同様に
ポリ−ヒトアルブミンをモノクローナルアンチ−ヒトア
ルブミン抗体と反応させることによって生じる凝集体も
適当である。

その都度得られる凝集体−ｍ製混合物は透析後直ちに使
用することができるか、又は例えばゲル濾過により増大
する分子量に応じて分画し、引続き障害因子を補償する
ため免疫検定法に直接使用することができる。

試験混合物に添加した特異性反応体の１、つ、有利には
Ｆｃ−含有ＩＫＧ−抗体は、当業者に周知の方法で例え
ばアガロース又はプラスチックチューブ及び同様のもの
のような担持材料に固相として結合されているか又は例
えばビオチンと結合して液相として存在する。ビオチン
塞化された第１の抗体を使用する場合、まず抗原及び標
識された第２の特異性反応体からなる複合体を形成し、
次いでこれをその場でビオチン結合性蛋白ｆｆ１ｆ３’
ｌえばアビジン又はストレプトアビジンで被覆された担
持材料に結合させる。しかしその際同時に第１のビオチ
ン塞化された抗体を用いての他の試験も実施することが
できる。すなわち抗原をビオチン塞化ＭＡにと反応させ
、その場で又は特定の予備インキュベーション期の後に
ビオチン結合固相に結合し、その後に初めて第２の特異
性反応体と合する。またまず抗原を第２の特異性反応体
と、次いでビオチン塞化抗体と反応させることもできる
。第２のまた場合によっては別の特異性反応体（これは
有利にはＦｃ−一不含のＩｇＧ−フラグメントである）
のＭＡＲ化は酵素、蛍光性、化学発光性又は放射性物質
との結合によって得ることができる。この種の抗体誘導
体を標識化する方法は当業者にとっては例えば石川（Ｅ
、ｒｓｈｉｋａｙａ）その他の論文−Ｊ、　ｏｆＩａ＋
＋１ｕｎｏａｓｓａｙ”、４−５（１９８３年）、第２
０９頁〜第３２７頁から公知であり、ここではこれ以上
の説明は必要ないものと考える。

本発明の他の対象は、２一部位−免疫検定法で免疫的に
結合可能の多価物質を測定するための、先に記載した非
特異性抗体凝集体を含む診断剤である。

この診断剤は、１つカ月ｇＧ−分子でありまた少なくと
も１つがＦｃ−不含ＩｇＧ−フラグメントである２つ又
は場合によってはそれ以上の特異性抗体と共に、適当な
緩衝液系及び前記の非特異性抗体〜凝集体並びに場合に
よっては別の通常使用される助剤例えば反応促進剤、清
浄剤又は安定剤を含む、適当な緩衝液系としては例えば
燐酸塩ｌｌ１ｍ液（ｐＨ７，０）　２（１−６０ｍ１４
又はＩＩＥＰＥＳ　５０ｍＭ／　ＮａＣｌ　−緩ｆＸＴ
液系１０１００ｌ１　ｐＨ７，４）を使用することがで
きる６反応促進剤としては例えばデキストランサルフェ
ート又はポリエチレングリコール６０００〜４．０００
０を、清浄剤としては例えばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）
ｘ−１００、ツイーン（Ｔｖｅｅｎ　）２０又はプルロ
ニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ　６ｇをまた適当な安定
剤としてはフェノール、オキシピリオン、クロルアセト
アミド、メルチオレート等を挙げることができる。

診断剤は分子！　３２０，０００ダルトン及びそれ以上
、有利には１０，０００，０００ダルトンまでの非特異
性抗体−凝集体を０．１〜５０ｕｇ／ｍ、有利には５〜
２５ｕｇ／　ｍＱ、特に好ましくは５〜１ｏｕｇ／−の
濃１９で含む。

診断剤は溶液又は無水化学試薬の形で吸収性相体に塗布
されてか又は開放フィルム状で存在し、ていてもよい。

場合によっては所望のｐＨ値に緩衝された溶液形の本発
明による診断剤は有利には、試験に必要な全試薬を含む
、安定性の理由から試験に必要な試薬を、固有の検査に
際して初めて混合さｈる２種又はそれ以上の溶液に分割
することも可能である。この場合非特異性抗体−凝集体
が適当な緩ｆＲ？ｒｉ系に別個に又は／及び１つ又は／
及び２つの或は他の特異性抗体と一緒に、存在するか又
は否かは問題ではない。

診断剤を試験リボン状で製造するには吸収性担体、有利
には濾紙、セルロース又は合成ｍ維フリースに、試験リ
ボンを製造するのに通常使用される必要な試薬を易Ｎ発
性溶剤例えば水、メタノール、エタノール又はアセトン
中に溶かした溶液を含浸させる。これは１含浸工程で行
う、しかじ含浸処理を数工程で行うこともしばしば有利
であり、この場合にはそれぞれ診断剤の成分の１部を含
む溶液を使用する。

更に診断剤を試験リボン状に製造するには、フィルム結
合剤及び顔料の他に特異性抗体又は−フラグメント、前
記の非特異性抗体（フラグメント）−凝集体、適当な緩
衝液系及び診断剤に対して通常使用されるその他の添加
剤を含む開放フィルムを使用することもできる。

完成した試験紙及び試験フィルムはそのまま使用するか
又は自体公知の方法で担体箔に接着させてか又は有利に
は西ドイツ国特許第２１１８４５５号明細書に基づきプ
ラスチックと細かい網目の網状物との間に封入し、検査
すべき体液（例えば血液、血漿、血清）と接触させるこ
ともできる。

本発明は少なくとも２個の抗原決定基を有するすべての
抗原を測定するのに適している。この例はチレオトロビ
ン（ＴＳＩ＋）　、発がん抗原（ＣＥＡ）、肝炎ウィル
ス（Ｂ型肝炎表面抗原、１ｌｌｌｓ　）、１−フェト蛋
白質（八ＦＰ）　、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ＩＩｃ
Ｇ）　、黄体形成ホルモン（Ｌｌｌ）、卵胞刺激ホルモ
ン（ＦＳＨ）　、Ｂｚ−低分子グロブリン、酸性前立腺
フォスファターゼ、７０ラクチン、フェリチン及びイン
シュリンである。

〔実施例〕

久の実施例につき本発明を説明する。

例　　１ ホモ２官能性試薬との網状化によるモノクローナルマウ
ス−Ｉｔｇ（）−４実体の製造モノクローナルＭＡＫ　
５５−　ＩｇＧ（＞　９５　％純度；サブクラス組成Ｋ
Ｓ　ｒｌ；特異性抗−クレアチンキナーゼ）全腹水から
硫酸アルミニウム沈殿及びＤＥＡＥ−イオン交換体での
りａマドグラフィに工り単離する（　Ａ、　Ｊｏｈｎｓ
ｔｏｎｅ　ｕｎｄ　Ｒ。

Ｔｈｏｒｐｅ、　Ｉｍｍｕｎｏ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
ｉｎ　ｐｒａｃｔｉｃｅ＋　Ｂｌａｃｋ−ｗｅｌｌ　５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　１９
８２．４４〜４５頁）。

ＩｇＧ　５０！ｎ９（Ｉ−０，０２５Ｍ重炭酸塩／炭９
４１衝Ｈ（ｐＨ９，５）　５ｔｎｔ中にｇかす。この溶
液に、１２．５％ゲルタールジアルデヒドＭ１７μｔを
ぎペット導入し、２５℃で２時間インキュベートする。

引続き、この溶液を水浴中で冷却し、５　Ｑ　ｍＭ　）
　ＩＪエタノールアミン緩衝液でｐＨ８，２まで調節す
る。この溶液にｖｆｒ製ホウ水素化ナトリウム溶液（ホ
ウ水素化ナトリウム８ｍ９／再蒸溜水１　ｙｔｔ　）　
０．６　ｍｌ’ｔｍえ、ｉｆ！Ｉｃ　Ｏ”Ｏｒ　２．５
時間インキュベートする。Ｏ〜４”Ｃで、ＮａＣ２０，
２Ｍを含有するｌ　Ｑ　ｒｎＭ燐酸塩緩衝液（市７３５
）に対する１６時間の透析にエリ、過剰の試薬を除去す
る。この透析液を限外Ｉ！ｌ過により１．２５ｍｔまで
濃縮する。このｎ＃縮物（粗製混合物）の１部分を直接
、障害除去のｔめに使用する；ＲＤちその１．□　ｒｎ
ｉ　ｔ−ＡＣＡ　２２−充填物（ＬＫ８　）　！−有す
るｒル濾過カラム全通丁クロマトグラフィにかける。カ
ラムの寸法２×４０傭、操作緩衝液１０　ＤＯＭ燐酸塩
／　１００　ｍＭ　ＮａＣ２（Ｘ　７−５　）　ｏカラ
ムのｓａｉ’ｔσＶ−モニターを用い２８０　ｎｍで蛋
白質含分に関して＠奄し、分別する。翳められｔＩＭ白
質含有溶雌範囲のフラクション全問じ叶の４グール（Ｐ
ｏｏｌ　）に染める。会知分子４の蛋白・宵を用いるゲ
ルクロマドグラフイカラムの較正にエリ、これらのプー
ルを、分子前範囲１６００００〜４００　［）Ｄｏ、４
０００００〜１０００Ｌ１００、ＩＱｏ　００００〜２
００００００及び２００００００〜１０００００００に
分類することができる。

これらのプール金的２〜／　ｍｅの蛋白質濃度までｓ倍
の後に、種々の分子量範囲の工ｇｃ）−凝集体溶液を障
害１余去のｔめに使用することができる。

例　　２ ヘテｏ２官能性試薬との網状化によるモノクａ−ナルマ
ウス−１ｇｆｌ　−柴集体の製造ａ）　　ＭＡＫ　３３
−　ＩｇＧ−Ｍ　Ｈ（マイレンイミＦヘキサノイル−Ｍ
ＡＫ　３３−　ＩｇＧ）　）の製造ＭＡＫ　５３−　Ｉ
ｇＧ　ｆ　ＯＯ”９ｋ　３０　ｍＭｉＲＭｆ’Ｍ緩衝液
（ｐ）１７−１）４ｆｆｉ／中に溶か丁。この溶液に、
ジメチルスルホキシド中のマレインイミドヘキサノイル
スクシンイミデートの０．２ＭＡＷ液２０μｌ＜４μモ
ル）をピペット導入する。この反応混合換金２５℃で１
時間インキュベートし、久イテ、５　Ｑ　ＯＩＩＭ　Ｎ
ａＣＡ　′ｆ！：含有するｔｏｍｕｓ酸塩緩衛液（ｒＪ
（６，１）に対して０〜４℃で１６時間透析させる。Ｍ
ＡＫ　３３−　ＩｇＧ　−Ｍ　Ｈ２２ダ／廓ｊ？ｉ−含
有する溶液４．４５ｍ／が得られる。

ｂ）　　ＭＡＫ　３３−　Ｉｇｏ　−ＳＡＭＳ　（Ｒ−
アセチルメルカプトスクシニル−ＭＡＫ　５３−　Ｘｇ
Ｃ）　）の製造 ＭＡＫ　５５−　ＩｇＧ）　１００　ｒｎ９を０．１Ｍ
燐酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）　ｄｍｔ中に溶かす。この
溶液に、ジメチルスルホキシＶ中の無水Ｓ−アセチル−
メルカプトコハク酸の０．２５　Ｍ溶液４０μｔをピペ
ット導入する。反応γ昆合物金２５°Ｃで１時間インキ
ュベートし、仄いで、５　Ｑ　ｎｏＭ　ＮａＣｔを含有
する１０ｔｏＭＩＩｉ［［緩衝液（＋剥６．１）に対し
て０〜４°Ｃで、１６時間透析させる。ＭＡＫ　３５−
ｒｇｏ　−８ＡＭ８２１．８　ｍ９／　ｍｌ　ｋ含有す
る４、４５ｍ１が得られる。

Ｃ’）　　ＭＡＫ　３５−　ＩｇＧ　−Ｍ　ＨとＭＡＫ
　５３−　ＩｇＧ　−ＭＳ（メルカプトスｙ　シニル−
ＭＡＫ　５５−ｒｇｏ）との網状化 ＭＡＫ　３３−　ｒｇｃｋ　−ＳＡＭＳ５０９　ｋ　、
２　ｍＭエチレンシアミン四酢酸を含有する２５　ｍＭ
燐酸堪緩衝ｆｅＬ（緩衝１Ａ）（ｐＨ６，５）中ノ１５
り／ｆｆ１Ｊの１度まで擢釈Ｔる。この溶液に、１Ｍヒ
トａキシルアミンＦＪ液７５μｔｒピペット導入し、２
５℃で２０分インキュベートすル。

ＭＡＫ　３５−　ｘｇｏ　−Ｍ　８４４〜を含有するこ
の溶液５　ｍｌを緩衝液Ａで６．０　ｍまで稀釈する。

この溶液に、ＭＡＫ　３５−　ＩｇＧ　−ＭＷ　８８ｒ
ｎ９’ｔ”含有する溶液４　ｍＡ金加える。この１合物
を２５°Ｃで４０分間インキユベートシ、次いで、網状
化反応の停止のｔめに２ｍＭまでシスティンと加える。

更に、２５℃で５０分間のインキュベーションの後に、
Ｎ−メチルマレインイミド５　ｍＭまでを加え、更に２
５℃で１時間保持する。この反応ｍ液′ｋＮａＣ４０−
２Ｍ　ｋ含有する１　０　ｍＭ　惰ｒｎ順緩衝液（ＰＨ
７，５’）に対して透析させる。う析液を限外（ｌ！過
に＝９蛋白質濃度６５η／　ｍｌまで濃縮し、遠心に工
？雀かな濁り金改〈。このＬ５な透析物（［混合＊＞に
関するＭＡＫ　３３−凝集体の分子量分布を第１因に示
す□このクロマトグラフィの仕様：　Ｅ（ＰＬＯ−’）
’ル渚過カラムＴＳＫ　Ｇ　４０００　ｓ　ｗ　（ＬＫ
Ｂ　）でのクロマトグラフィ、２８０ｎｍでのＩＪＶ−
吸光覚を示す。流速ｉ　ｍｌ　／　ｍｉｎ、紙移動０．
５傭／ｍｉｎ、作業緩衝液：　０．Ｉ　Ｍｉｌｌ酸塩（
出６．８）。

この凝集体１合物に直接又は分子量フラクションに分＠
（例１におけると同様にＡｃ　２２−りａマドグラフィ
）の後に、障害除去の之めに使用することができる。

例　　６ アミノデキストランを介しての網状化によるａ）　　Ｓ
−アセチルチオアセチル−アミノブ中ストランの製造 アミノデキストラフ　（Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｔ　４　Ｑ　
、ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　；アミノ基２８／分子１７ｒ
４００００）ｊＯｃｌＷｋ３ｃ］ｍＭ燐酸ｊｆｉ　（ｐ
７４７．１　）　４ｄ中に溶かす。この溶液に、ジメチ
ルスルホキシＶ中の０．２Ｍ　　Ｓ−ア七チルチオアセ
チルスクシンイミデート溶液０．２５　ｍｌをピペット
導入する。

反応烏合物を２５℃で１時間インキュベートし、久イで
、ＮａＣ６５０ｍｕ　ｋ含有する１ＱｍＭＪ酸塩援衝液
（ＰＩ−１６，１）に対して透析させる。収ｆ：溶液４
．５ｍｌ中のＳ−アセチルチオアセチルアミノデキスト
ラン９０■。

ｂ）臥に３３−工ｇＧ−ＭＷとチオアセチル−アミノデ
キストランとの網状化 Ｓ−アセチルチオアセチル−アミノブキストラ／２０η
／　ｍｌ　ｆ有する溶液２Ｍを注童深くＱ、ｌ　Ｍ　Ｎ
ａＯＨでｐ）１６．５に調節し、エチレンシアミンの四
酢Ｃ便２ｍＭ″１で全添加する。この溶液に、１Ｍメト
キシルアミンｍ液４０μｔ２ピペット導入し、２５℃で
２０分間インキュベートする。引続き、この溶液を２５
　ｍＭ燐酸塩１衝液（ｐＨ６，５）で６．８１まで稀釈
し、ＭＡＫ３３−Ｉｇｏ−ＭＨ（例２ａと同様にして製
造）　１５８．４ダを含有する溶液７．２祷を加える。

２５′Ｃで６０分間のイン中ユベーションの後に、この
反応混合物にシスティン２ｍＭまでを加え、６！］分後
に、付加的にこれにＮ−メチルマレインイミド５ｍＭ′
！でｔ加える。２５℃で更に１時間後に、この重合体ｔ
−１Ｑ　ｍＭ燐酸塩緩衝液（ｐ）ｉ７−５　／　５０　
ｍＭ　ＮａＣ１）に対して透析させる。備かなＰＡｒ）
の遠心除去の後に、蛋白質含分７．１ｍ９／　ｍｌのＭ
ＡＫ　３３−　Ｉｇ（）−デギストランー凝集体の溶液
１９．５ｍ／が得られる。

例　　４ ウシーＩｇＧｉ介する網状化によるＭＡＫ　５５−Ｉｇ
Ｇ−倹県体の製造 ａ）ウシ−ＩｇＣ）　−Ｍ　）Ｔ−製造ポリクａ−ナル
中−ＩｇＧ　１００ｒｎｑｅ例２　ａ）と同様に、マレ
インイミドへΦサメイルスクシンイミデート４μ −　ＩｇＧ　−Ｍ）Ｔ　２　２　’＋９／ｄｋ含有する
溶液４．４　５１Ｒｔ。

ｂ）　　ＭＡＫ３　５　−　５ＡＴＡ　（　Ｓ−アセチ
ルチオアセチル−ＭＡＫ　３　３　−　１８Ｇ　）の製
造ＭＡＫ　３　６−　ＩｇＣ　１　０　０１１１１？に
５　０　ｍＭ燐酸塩援衝液（ｐＨ７．１）４ｍｇ中に溶
かす。この溶液に、ジメチルスルホ牛シト中のＳ−アセ
チルチオアセチルスクシンイミデートの０．ＩＭＩＷ液
２０μｔ（２μモル）ｔ−ピペット導入する。反応混合
換金２５℃で１時間イン中ユベートし、次いで、０　〜
４　”Ｃで１　０　ｍＭ燐ｅ堰援衝液（ｐＨ６．１）／
ＮａＣ１　５　［１　ｍＭに対して透析させる。ＭＡＫ
　５　５　−ＩｇＧ　−　５ＡＴＡ　２　２　ｍ９／ｍ
ｌ　ｔ−含有する溶液４・４５ｍ１が得られる。

Ｃ）チオアセチ＃　−　ＭＡＫ　３　５　ＩｇＣ）と牛
−ＩｇＧ−ＭＨとの網状化 ＭＡＫ　３　５　−　ＩｇＣ）　−　５ＡＴＡ　５　Ｑ
■を、エチレンシアミン四酢＃　２ｍＭ　’＜含有する
２５ｍＭ燐ｆ！！［緩衝液（　ｐｆ４　６．５　）で１
　５’ｎ９／ｍｅ（７）ｉｌＵｌｌ　テＮｌ釈する。こ
の溶液に、１下４ヒドロキシルアミン溶液７５μｔｙｔ
ピペツト導入し、２５’Ｃで２０分イン中エベートする
。

チオアセチル−ＭＡＫ　３　３　−　ＩｇＣ　４　４〜
９に含有するコノ溶液５　ｒｎｌに、牛−ＩｇＯ　−　
ＭＴＪ　８　８Ｍ９に含有する溶液４ｍ１ｆ加え、２５
−Ｃで２５分間イン中ユベートする。網状化の浮止のｔ
めに、システィン２　ｍＭまでを加え、２５’Ｏで６０
分インキュベーションの後に、ヨーｆアセタミ２５ｍＭ
までを添加する。更に２５℃で史に１時間インキュベー
ションの後に、０〜４℃１”ｌＯｍＭｍｖｔｘｕ衝液（
　ｐ［（　７−５　）　／　５　０　ｍＭ　ＮａＣｔに
対して１６時間透析させる。透析液の遠心の後に、蛋白
質ａｌｖ　１　３　〜９　／　ｍｔ．のＭＡＫ　３　３
　−　ＩｇＣ）−牛一ＩｇＧ　−　６％　集体８．９ｍ
ｌが得られる。

例　　５ ）ａＫ　５　３　−　Ｆａｂ　ｆ介して網状化されたＭ
ＡＫａ）　ＭＡＫ　５　３　−　Ｆａｂ　−　５ＡＴＡ
の製造）、４ＡＫ　５５　−　ｒｇＧ　２　０　０＊ｖ
’ｌパパイ７　Ｔ　Ｆａｂ／Ｆｃに分解し、この混合物
からＤＥ５２セルロース（　ｗｈａｔｍａｎ　）でのク
ロマトグラフィにＬす、ＭＡＫ　５　３　−　Ｆａｂ　
ｔ−単離する（方法ａＡ。

Ｊｏｈｎｓｔｏａｅ　ｕｎｄ　Ｒ．　ＴｈｏｒｐｅのＩ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ
．　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕ
ｂｌｉ−ｃａｔｉｏｎｓ　１　９　８　２、５　２〜５
５参照）。収量ｌ：塩不含の凍結乾燥物としてのＭＡＫ
　５　３　−　Ｆａｂ９５ｍ９。

ＭＡＫ　３　３　−　Ｆａｂ　５　０　ｒｒｙｆｒ：　
３　０　ｍＭｍ酸ｔ３［ｌｆｉ液（ｐＨ７．１）２Ｉｄ
中に溶かす。この溶液に、ジメチルスルホキシド中のＳ
−アセチルチオアセチルスクシンイミデートの０．１Ｍ
Ｍ！３０μｔ（３μモル）をピペット導入する。この反
応混合物を２５℃で１時間インキユベートシ、次いで、
０〜４℃で、１０ｍＭ燐１［ｉ緩衝液（Ｐ）（６、０　
）１５０ｍＭＮａＣ２／２　ｍＭエチレｙ７７？ン四酢
酸に対して１６時間透析させる。ＭＡＫ３　５　−　ｔ
ａｂ　−　５ＡＴＡ　Ｉ　８．５　ｍ９／　’ｎｌ　’
ｔ”含有する溶液２．６ｒｎｌが得られる。

１））　　ＭＡＫ　３　５　−　ＩｇＣ　−　Ｍ　Ｈと
チオアセチル−ＭＡＫ　３　５　−　Ｆａｂとの網状化
ＭＡＫ　５　５　−　Ｆａｂ　−　５ＡＴＡ　３　０　
〜９　全２　５　ｍＭ燐酸塩緩衝液（　ｐＨ　６．５　
＞で１５’ダ／Ｍの濃度まで吟釈する。この溶液に１Ｍ
ヒトａキシルアミン溶ｇ．５０μｍ１ピペット導入し、
２５℃で２０分イン中ユペートする。

ｆ２ＦＴセチル−　ＭＡＫ　５　３　−　Ｆａｂ　２　
２　Ｗ　ｋ含有するこの溶液１．５ｍＪにＭＡＫ　３　
３　−　ＩｇＣ　−　Ｍ　Ｈ（例２ａと同様にして製造
）５５〜を加え、再環溜水で全ｆｆ１１（ＥＩＺになる
まで吟釈する。このバッチｋ　２　５　’０で６５分間
インキエベートし、久いて゛、網状化の停止の友めに、
システィン２附までを加える。２５℃で６０分後に、Ｎ
−メチルマレインイミド５　ｍＭまでを加え１改めて１
２５℃で１時間インキュベートする。引続き、反応溶液
’ｔ　Ｏ〜４　’Ｃで、１０　ｍＭＬＭＩＷｔ！［液（
ｐＨ７，５）　／　０．１　Ｍ　ＮａＣ１）に対して１
６時間透析する。遠心の後に、ＭＡＫ　５３−　Ｉｇ（
）　−Ｆａｂ−凝集体５．６叩／ａを含有する登明溶液
１２・８ＨＩが得られる。

例　　６ ビオチン／ストレプトアビシンを介する網状ａ）ビオチ
ニル化ＭＡＫ　５５−　ＩｇＣの製造０．１Ｍ燐酸カリ
ウム緩ｉｇ（ｐＨ８，５”）　２．５なｊ中のＭＡＫ　
３５−　ＩｇＧ　５０■に、ジメチルスルホキシド５０
μを中のビオチニル−Ｃ−アミノカグロｙ酸−Ｎ−とド
ロキシスクシンイミげ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｙ
ｌｎｈｅｉｍ　Ｇｍｂ）Ｔ　）　１．１５〜９　ｆ加え
（ＩｇＧ　：ビオチンのモル比−１：　７．５　）、混
盆後に２５゛Ｃで９０分間インキュベートする。

ビオチニル化ＩｇＣ）　’ｆｔ　４℃で、２ｍＭｇ４酸
カリウム緩衝ｆｆ（ｐＨ八へ）に対して１晩透析させｆ
ｔ−。

収ｔ：６．４’！Ｌｔ中のＭＡＫ　３５−　ｒ！ｊＧ−
ビオチン５ｒＲ９ ｂ）ストレプトアビシンの網状化 ＭＡＫ　５５−　Ｉｔ＜Ｇ−ビオチン−溶ｇ４プに５分
間隔で、５０ｍＭｍ酸カリウム緩衝液／［）、１Ｍ塩化
ナトリウム中のストレプトアビシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）各１．５１１ｇ’
に３回加え、２５℃で２０分間インキュベートする。

ＩｇＧ：ストレプトアビシンのモル比−２，５：　１゜
このバッチ全限外濾過にエリ２Ｍまで濃縮し、例１にお
けると同様に、ＡＣＡ２２カラムクロマトグラフィにか
ける。分子！＞３２００００の丁べてのフラクション全
−罐にし九。

収１　：　ＩｇＧ−を分１７ｆｆ！９（７）溶液１’１
ｔｎｌ中のＭＡＫ５５−　ＩｇＧ−ストレプトアビジン
凝集体２１１Ｉｔ９゜ 例　　７ ＭＡＫ−抗−ヒト−アルジミンとヒト−アルブミンどの
網状結合 ５３　ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ＤＨ７，０）ｌｌ中の
ヒト−アルブミン（Ｂｅｈｒｉｎｇｖｒｅｒｋｅ　ｌ　
ｍｒｂｕｒｇ）４０ηを６時間７０゛Ｃに加熱すること
に工０凝集させる。２５゛Ｃまで冷却の後に、ヒト−ア
ルデミ／−１暉集体２５〜を含有する分を５　Ｑ　ｍＭ
燐酸カリウム緩衝液／　０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣｔ（ｐＨ７
−０）で２．５ｍ９７Ｉｔまで稀釈し、５分間隔で、５
　ＱｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐ）Ｉ　７．０　）　０
．２酊中のＭＡＫＭＩ−抗−ヒトーアルプミ／（ｒ”、
Ｋ）各２．５■の４分虻（Ａｎｔｅｉｌ　）を加える。

２５℃で２０分間インキュベーションの後に、限外濾過
にエリ、２ＨＩまで濃縮し、前記のＬうにＡＣＡ　ｒル
ーカラムでのりａマドグラフィにかける。分子ｆｉｔ＞
３２００００の蛋白質含有フラクション七−緒にする◎ 収量：ｒｇｏ−含分８．８６〜を含有する７、１３ｖｔ
ｌ中のＭＡＫ　ＭＩ　−ＩｇＣ−アルブミン−凝集体１
２．４Ｉｎ９ 例　　８ ２種の特異的ＭＡＫ反心体を用いるＣＥＡ　エフデイ４
″″免疫検定法における天然ＭＡＫ　５５−　ＩｇＧ及
び種々のＭＡＫ　５５−ＩｇＣ−凝集体の障害除去の比
較 テストパッキングエンライム、（η’２Ａ　（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）からの試薬
ヲ使用しｔｏこのテストに包含されている試験管は、モ
ノクｏ　−ナルなＣｇＡ−特異性マウス−ＩｇＣ）　（
Ｉｇ（）　１　、Ｋ）で塗被されている。この酵素標識
されｔ反応取分は七ツクａ−ナルな（ＪＡ−特異性マウ
ス−Ｆａｂ−ペルオ命シダーゼ接合体であり、このＦａ
ｂのサブクラス組成はに１　γ１）である。

、１■々のＭＡＫ　５５−　ＩｇＧ　−調ｍ物（ＰｒＫ
ｐａｒａｔｅ）を上昇性濃度でそれぞれインキエベーシ
ョン緩衝液に添加し、ヒト血／′Ｗ（Ｐ４５）ｔ−用い
て試験を実砲し、この際、極めて有効な障害因子（！ξ
；シ仕）が確認されｆｊｏ第１表は１適切な分析質含分
が正常範囲（１〜５．５　ｎ　ｇ　／嶋）内に認められ
るまで充分障害を阻止し次イン命ユベーションａ　（Ｉ
　Ｅｌ　中（７）　ＭＡＫ　５３−　Ｉｇ（）　−調製
物のｆ！＃Ｋ（蛋白質μ９／ｍｌ）金子している。

第１表 種々のＭＡＫ　３５−　ｒｇＧ−調ＩＭ物の相対的怪値
は測定点にＬｆ）限定され７？、較正曲線の範囲外の値
である。

例　　９ における、非共有性で生体親和性の結合を介して網状化
され７ｔＭＡＫ　−ＩｇＧ　−Ｊ凝集体の障害除去試薬
及び試験実施な例８参照。参照法で測定しｔ使用ヒト血
清試料の実際のＣＥＡ−含分は、２．８〜４．２　ｎ９
／　ｍｌであつｔ００？表は、較正曲線で読み取った、
インキュベーション緩衝液への穐々のＩｇＧ−凝集体−
添加物における障害因子 ｉ―≠≠−を有するヒト血清試料（Ｎｒ、１［］８）に
関する見かけのＣｇＡ−濃度を示している。

第　　２　　表 生体親和性網状化によるＩｇＣ）　−＠集体この表から
、沢方の生体親和性に網状化されｆｉＩｇＧ−凝集体は
、工ｇＧ重檜で計算して、非網状化ＩｇＧＬりも著るし
く有効に障害除去することが明らかである：倍率＞ＳＯ
Ｏもしくは〉６０゜使用ｔｅ部分的にのみ障害除去作用
すＬうに選択すると、この工つな条件下でに、種々の調
製物の相対的４害除去作用は最良に評価できる。

例１０ 障害除去作用とＭＡＫ　５５−　ＩｇＧ−凝集体の分こ
の試験の試薬及び実ｐＩＩ／ｆ４は、例日に記載されて
いる。ＭＡＫ　３５−１ｇｏ−肖製物は例２に工り製造
しｔ０ １）＃照性で測定し７？：ＣＥＡの真の含滑ハ、１〜３
．５　ｎ、！ｉ’　／ゴの範囲内、２）見かけの（ＪＡ
−含分は、吸光度及びエンツイムンＣＥＡに関する操作
に従がうＣＥＡ　−標準試料による較正曲線から確認、 ６）較正点にエリ限定され比較上曲線範囲外の値１ 例１１ 種々のモノクローナル抗体から製造されｔＭＡＫ　−Ｉ
ｇＧ−凝集体の障害除去作用の比較モノクローナル抗−
ＴＳ）Ｔマウス−ＩｇＧ（ＩｇＧ　ｊ、Ｋ）で塗被され
ている工ンツイムン■ＴＳＨ−パツΦングからの試験ｆ
Ｊ　（ｇｎｚｙｍｕｎｏＴ８Ｈ−Ｐａｃｋｕｎｇ；Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＴ（）　
ｆ使用する◎残りの試薬く例８におけるエンツイムン（
ＪＡ−バッキングと同じもの全採用しｔ０試験は、この
バッキングの操作指示に従がう。この試験実権の際に、
双方の特異的反応体は鴨なる特異性を有するので、血清
試料の１分析質分による信号は得られない。従って、こ
れは、血清試料で障害ファクターを有する場合にのみ９
値に関する信号を与えるモデルテストのみに関する。比
較のｔめに記載しｆｔ：、　ＭＡＫ　−ＩｇＧ　−Ｊｌ
集体は、例２Ｃと同様にしてＭＡＫ　３３から製造し九
〇第４表 モデル試呻における種々のモノクロー ナル抗体のＩｇＧ−凝集体の１章害除去作ＣＥＡ不含及
び障害ファクター不含の血清試料に関する吸光度：　０
．１６２ 結果二種々のモノクローナルＭＡＫ　−ＩｇＣ）　−４
％体の障害除去作用は、誤差範囲内で同じである。

例１２ ビオチニル化ＭＡＫ　３３−　ＩｇＧ−反応成分を用い
る試験でのＭＡＫ　３５−　ＩｇＧ−凝集体及びモノこ
の試験では、２種のモノクローナルへパチチスー表面抗
原（ＨＢｓＡｇ）−特質性ＭＡＫ　−ＩｇＧをビオチニ
ル化されｔ形で使用する（ビオチニル化ｄ、Ｔ、Ｖ、　
Ｕｐｄｙｋｅ及びＧ、Ｌ、　Ｎ１ｃｏｌｓｏｎ　（７）
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１２１
、（１９８６）７１７〜７２５に依り実１）ｆｍ）。そ
の１つＭＡＫ　６ｇ　７−　Ｉｇ（）は、テデ型ｒｇｃ
）　１　／　Ｋからのものであり、他のＭＡＫ　５　Ａ
　１０−　ＩｇＧに、サブ型ＩｇＧ２　ａ　＋　Ｋから
のものである。酵素標識されｔ反応体として、ＭＡＫ　
５　Ａ　１０−　Ｆａｂ　−ＰＯＤ　−接合体を使用し
ｔ０ インキュベーション緩衝液の組成： 燐０塩１％液（ｐＨ７，０）　　　　　４０ｍＭと４５
酸ナトリウム　　　　　　　　０．２Ｍ牛血ｌｋアルブ
ミン　　　　　　　０　、５　（ｗ／ｖ）壬午−塊Ｃ）
　　　　　　　　　　　Ｏ、ｊ　（ｖｒ／ｖ）％プルロ
ニックＦ　６８　　　　　　　０．５（ｗ／ｖ）壬フェ
ノール　　　　　　　　　　　０．０１（≠）憾ＭＡＫ
　６Ｅ７−　Ｉｇ（）　（ビオチニル化）　　２００　
ｎｌ！／ｍ１ＭＡＫ　５Ａ１０−Ｉｇ（）　（ビオチニ
ル化）　　　２５　ｎ、ｐ　／ｍ１ＭＡＫ　５Ａ１０−
Ｆａｂ−ＰＯＤ　−ｍ合体　　２００　ｍＵ／ｍｌ障害
除去蛋白質添加物は第５表参照。

ＭＡＫ　５５−　ＩｇＧ−凝集体粗製混合物は例２Ｃに
工す製造しｔｏ この試験のｔめに、血膚試料各０．２ｍｌ及びインキュ
ベーション緩衝液１”？、ストレプトアビジンで塗被さ
れｔポリスチロール小管中にピペット導入しｆｔｏ久い
で、室温で４時間インキュベートレｔ０引続き、各小ｆ
ｔ−水道水６Ｘ１．５Ｎで洗浄し、エンツイムンＣＢＡ
−テストバッキングからの基質溶液（ＡＢＴＳ　／ペル
オ命シト）各１ゴを添加しｔ。更に、室諷で１時間イン
キュベーションの後に、反応した基質溶液ノ吸光ｒ￥ｔ
”　４０５　ｎｍで測定しｅ。

第５表 ビオチニル化ＭＡＫ　−ＩｇＧ−反応成分を甲いるサン
げイツチーエンツイムンー テストでのＭＡＫ　３３−　工ｇＧ−稠型物の１）血清
試料層１００及びぢ４８９は、血液銀行から入手し、Ｈ
ＢｓＡｇ不含として申告されてい友。

２）健１才供血者の血清、こｆｉはＨＢ８Ａｇも障害％
　−Ｑ’％Ａ　％も含有していなかつｔ。

血屑渣１００そのものに関して、０．１２５の信号まで
の障害除去がＭＡＫ　５５−　ＩｇＧモノマー２００４
　／　ｍｔ、で又はＭＡＫ　３５−　ＩｇＧ−１１７１
集体１μｇ／ｌで達成されることの頃察から、この試験
に関してＩｇＣ）−凝集体に２００倍の障害除去活性で
あることが判る。

例１６ 乾燥化学−試薬キャリア（Ｔｒｏｃｈｅｎｃｈｅｍｉｅ
−Ｒｅａｇｅｎｚｔｒｉｉｇｅｒ　）　’Ｆｃ用いる試
、嗅でのＭＡＫ　５５−このυ１１１定ば、西Ｙイツ特
許出願公開（Ｄｇ−ｏｓ）第３４２５　ＣＪ　ＣＪ　８
．５号に記載の分析袈置金用い、遠心分析装置を有する
回転挿入素子中での二重−抗体固相−サンドイツチ原理
による１工程試験で、乾燥化学試薬キャリアを用いて実
施する。

１、　試薬溶液の製造 ａ）緩衝液■ ｓｏ！＋１モル／を燐酸カリウム緩衝液（Ｐ）（６，０
）は、Ｋ２ＨＰＯ４−溶液５０　ｍ　％　／’　／　ｔ
（！：　ＫＨ２ＰＯ４−溶液５０ｍモルをｐＨ６，０に
達するまで混合することにエフ製造する＠ ｂ）緩衝液■ 緩衝液ＩＩは、緩１１１ｉ１と同様であるが、廓値し を７．５に調節％礼、この緩衝液に付加的に生血清アル
ブミン１０９／ｌ、１１びＮａＣ６１５０ｍ　モル／ｌ
を含有する点で異なる。

ｃ）　　ＴＳｉ（と結合可能である反応体Ｒ１−溶液反
応体Ｒ１として、モノクローナルマウス−抗−ＴＳＨ−
抗体を使用する。この抗体を含有する腹水に硫酸アンモ
ニウムｅ１．８Ｍまで加える。

沈殿を、１５　ｍＭ燐酸ナトリウム（Ｊ　７．０　）及
び５　Ｑ　ｍＭ塩化ナトリウムＬりなる緩Ｓｇ中に入れ
る。こうして得九溶液ｉ　ＤＥＡＥ−セルロースに通す
。こうして得−＆　ＴＳＨ−結合性流体ｔビオチニル化
しくビオチン５　／　ＩｇＧ　）　、緩衝液層で蛋白′
ｌＩ瀬度１　ｒｎｌ　／　ｒｎｌまで稀釈する。

ｄ）酵素ｖＡ識されｔ反応体Ｒ２−溶液反応体Ｒ２とし
て、同様に、反応体Ｒ１とは異なる抗原決定子と認識さ
れるモノクローナルマウス−ｆｔ’ｆ、　−Ｔ８）１−
抗体を使用する。この抗体を含有する腹水ｔ−Ｌ３に記
載のｊ５に９１Ｍする。

完全な抗体は公知方法で、Ｒ，Ｒ，Ｐｏｒｔｅｒの方法
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　７３　（１９５９）、１１
９頁）に工り分解されてＦａｂ−フラグメントになる。

得られるＦａ、ｂ−フラグメント忙イシカワ（Ｉｓｈｉ
ｋａｗａ　）等によるＪ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ　４　　（１９８６）、２０９〜６２７頁の記載に従
って、β−がラクトシダーゼと結合させる。反応体Ｒ２
−＃液上緩衝液■中に５００ｍＵ／ｍｇ（３７’Ｏで０
−二トロフェニルーβ−がラクトシトを用いてｉ＄ｉｌ
Ｊ　定）の濃度まで稀釈する。

ｅ）障害除去蛋白質 例２におけると同様にして製造したＭＡＫ　３３−　Ｉ
ｇＧ　−；ｔ’リマ−ヲ緩衝液■中に１ｍ９／１１１６
の濃度になるまで溶か丁。

ｆ）アビジン−溶液 アビジンを緩衝液■中に蛋白質濃度５０μｇ／ｍｌまで
稀釈する。

ｇ）基質溶液 クロルフェノールレツーーβ −！　’）　シトシト５ｍ−ＥＩＬ２／ｌ（５，０５９
／ｌ’＞（西ドイツ特許出願公開第５５４５７４８号に
エリ製造） ＨＥＰｇｓ　　　　　　　　　　　　　　７０ｍ−ＥＮ
Ｚ（１６，７ＦりＮａＣ２１５４曝／Ｚ（９，９／Ｚ） 牛血清アルブミン　　　　０．３壬（５９／ｌ”）ツイ
ーン２０　　　　　　　０．２幅（２ｇ／ｌ）ｐ！（（
ＮａＯＨで）　　　　　　７．２５２、試薬キャリアの
製造 ａ）試薬キャリア１（障害除去蛋白質不含）１６当り燐
酸ナトリウムＣｐＨ７，５，５７℃）１００ｍモル、塩
化マグネシウム２Ｉ！１モル、塩化ナトリウム？ｆＩ、
牛血清アルデミン５１Ｉ、マウスからのビオチニル化抗
−ＴＳＨモノクローナル抗体（反応体ＲＬ　）　［１，
５雫、抗−Ｔ８Ｈ−抗体〜（マウス）　−Ｆａｂ−フラ
グメント−β−カラクトシｌ−ゼー接合体（反応体Ｒ２
−１液）（活性ｌ”！、５７’０でオルト−ニドａフェ
ニル−β−り一がラクトシトを用いて測定）１０００σ
を含有する溶液４０μｔを、重版のポリエステル紙工り
成るフリース上に滴加する。引続き、室温で乾燥させる
。このフリースを、使用するまで、４°Ｃ及び相対湿度
２０憾で保持する。

ｂ）試薬キャリア１′（障害除去蛋白質含有）この製造
は、試薬キャリア１と同様であるが、付加的に含浸溶液
１６当り例２ＣからのＭＡＫ５５−　ＩｇＧ−凝集体（
粗製混合物）　０．０１　ｇを含有する点で異なる。

Ｃ）試薬Φヤリア２ セルロースフリース上ニ、フロムシアン−活性化法（西
ドイツ特許出願公開第１７６８５１２号）に工Ｏアビシ
ン（アビジン溶液）を固定させ、この際、繊維材料１ｙ
当りアビジン１０μｓを固定のｔめに提供する。洗浄に
Ｌ　Ｑ　、結合されなかつｔ抗体ｙｆ！：除去し、この
フリースを室温で注意深く乾燥させる。こうして得九フ
リースの貯蔵は、試薬キャリア１と同様に行なう・６、
　測定の実施 この２つの試薬キャリア１及び２もしくは１′及び２を
用いる測定は、西ドイツ特許出願公開第５４２５００８
．５号明細書に記載の分析測定の実権用装置を用いて行
なう。

これは、それぞれ１種の特定の試薬で含浸され九吸着性
中ヤリア材料を有する試薬区分多数と連結している試料
装入室、少なくとも１個の混合弁室及び測定室（これら
に−緒になって、この挿入素子がローター上に固定され
る際に放射状に内から外に通じる試料液体搬送路を形成
し、更に測定実施のｔめの少なくとももう１個の呈に導
ひき、試料液体搬送路と少なくとも部分的に同じである
）を有する成形体製の自動遠心分析用の回転挿入素子（
Ｒｏｔｏｒｅｉｎｓａｔｚｅｌｅｍｅｎｔ）である。

この場合、試料液体搬送路は、試料装入室ｔＰ）から、
吸収性材料の充填され次緩衝液含有室（ａ）、室（ｂ）
及び室（ａ）と（Ｃ）の間に配ＷＬされ７を第１弁室（
ＶＫＩ）ｋ経て、第２弁室（ＶＫ２）　ｆｃ至り、ここ
から、室（ｄ）及び収容室（ＡＫ）を経て、測定室（Ｋ
）に至る。もう１種の液体を収容するｔめに、ポンプ室
として構成されている基質室（ＰＫ）が備えられており
、これは、配量室（ＤＫ）及び毛細管（ｋａｐ）　Ｌり
成っている配量装置及び溢流室（ｔｊＫ）　全経て第２
弁室（ＶＫ２）と連結している（第２因参照）。

吸光度ａ（妨害信号を含む測定信号）全測定する定め、
試薬キャリア１及び試薬キャリア２を用い、吸光度ｂ（
妨害信号を有し々い特異的な測定信号）の測定のｔめに
、試薬キャリア１′及び２金用いる。

試薬Φヤリア１もしくに１′を回転挿入素子の区分Ｃに
配置し、試２＃Ｉ！中ヤリア２を区分ｄに配置する。こ
の際、濃縮試料４０μｔｃ上機部の開口から直接、区分
ａにピペット導入する。基質溶液２７０μｔｋ、室ＰＫ
にピペット導入する。扁い回転数が静止を序なって交代
する適当な遠心プログラムにＬり、試料及び基質溶液は
分離マトリックス及びキュベツトの方向へ送られる。

このプログラムの経過で障害除去蛋白質不含Ω 及び含有反応体Ｒ１及びＲ２は試料液体で区分Ｃからｔ
Ｉｔ離され、引続き均質混合物は反応に供される。区分
ｄで、生じｔ錯体がＲｌｔ−介してアビジンと結合され
る。区分Ｃからｄへの試料の搬送は非常に短時間内で行
なわれる。

基質溶液に配量室ＤＫＫより少肴宛に分けられ、このう
ちの第１のものは、過剰の錯体化されていない接合体の
洗浄のために役立つ。Ｒ２を網状化することのできる障
害因子は、障害除去蛋白質１０μ９／試験溶液ｄの使用
の際に中和され、同様に洗浄除去され５る（試薬キャリ
ア１′の使用）。

錯結合を介してｄに結合しｔβ−がラクトンダーゼ活性
は、試料中に含有されるＴＳＨｌもしくは試料９値に比
例する。この活性を、他の基質公金用いて測定し、この
際、この基質は５分間の反応で着色生成物に変えられる
。生じる色及び液相中での他の呈色／ｍｉｎをキュベツ
ト中、５７６　ｎｍで測定する。

この条件下で、次の結果が得られｔ０ 第６表 丁べての測定は、層厚０．３−で、λ−５７６ｎｍで実
施し、層１１ｄ＝１ｃｍに換算しｔｏのＭＡＫ　３３−
　ＩＧＧ−ポリマーを有する試薬キャリア１′を用いる
’ｒ８Ｔ（−測定ｃ）　　ＴＳＨ−標準１に２．ＩＲＰ
８０１５８８で較正 ヒト血清４６中のＴ８）Ｔの含分セ、ペーリンが一マン
ハイム社のエンツイムンＴｅ１（テストヲ用いて１．４
μσ／１であつｔｏこのテストは特典性反応体として小
管に塗被され７’ｊ　ＭＡＫ−抗一直及びボリクａ−ナ
ル羊−抗−ＴＳＨ−Ｆａｂ　−ＰＯＤ

【図面の簡単な説明】

第１図は％ｌｋＫ　５５−　ＩｇＣ）−凝集体の分子量
分布を示す図であり、第２図は実施例１３による測定を
実施する装置金子す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１動物種又は人間の体液中の免疫的に結合可能の
   物質を、第２動物種の免疫的に結合可能の物質に対する
   特異性反応体少なくとも２種の存在でまた障害因子を補
   償する阻害剤の存在で測定する方法において、障害因子
   を補償するため反応混合物を第２及び／又は第３動物種
   の免疫的に結合可能の物質に対する非特異性で、モノク
   ローナル又はポリクローナル抗体から誘導された凝集体
   ０．１〜５０ｕｇ／ｍｌと接触させることを特徴とする
   、免疫的に結合可能の物質の測定法。 ２、免疫的に結合可能の物質が多価抗原であり、特異性
   反応体はその少なくとも１つがＦａｂ−又はＦ（ａｂ′
   ）＿２−フラグメントである抗体であり、非特異性凝集
   体は凝集したＩｇＧｓである、請求項１記載の方法。 ３、非特異性ＩｇＧ−凝集体がＩｇＧ及び第２巨大分子
   からなる、請求項２記載の方法。 ４、非特異性凝集体が３２０，０００ダルトン及びそれ
   以上の分子量を有する、請求項１から３までのいずれか
   １項記載の方法。 ５、第１動物種又は人間の体液中の免疫的に結合可能の
   物質を測定するための、第２動物種の免疫的に結合可能
   の物質に対する特異性反応体少なくとも２種と、障害因
   子を補償する阻害剤と、適当な緩衝物質と、場合によっ
   てはその他の通常使用される助剤とを含む診断剤におい
   て、障害因子を補償するため、第２及び／又は第３動物
   種の、免疫的に結合可能の物質に対する非特異性で、モ
   ノクローナル又はポリクローナル抗体から誘導される、
   分子量３２０，０００ダルトン以上の凝集体０．１〜５
   ０ｕｇ／ｍｌを使用することを特徴とする、免疫的に結
   合可能の物質を測定する診断剤。 ６、非特異性ＩｇＧ−凝集体として、ＩｇＧ及び第２巨
   大分子からなるＩｇＧ−凝集体を使用する、請求項５記
   載の診断剤。 ７、２種又はそれ以上の特異性マウス−又はラット−Ｍ
   ＡＫ−反応体と、ホモポリマー又はヘテロポリマーの非
   特異性で、分子量が３２０，０００ダルトン以上である
   ＩｇＧ凝集体又はＩｇＧ／Ｆａｂ−又はＦ（ａｂ′）＿
   ２−凝集体とが付加されており、反応体の少なくとも１
   つはＦａｂ−又はＦ（ａｂ′）＿２−フラグメントであ
   りまた他の反応体の少なくとも１つはＦｃ−含有ＩｇＧ
   であり、非特異性凝集体中に含まれるＩｇＧｓ及びＦａ
   ｂ−又はＦ（ａｂ′）＿２−フラグメントがモノクロー
   ナルでありまた特異性反応体の少なくとも１つと同じ種
   及びサブクラスに由来する、請求項５又は６記載の診断
   剤。 ８、付加的な助剤として反応促進剤、清浄剤及び／又は
   安定剤を使用する、請求項６又は７記載の診断剤。