HU212322B - Method for preparation of polymer igg derivatives to compensate interfering factors in immunoassays - Google Patents
Method for preparation of polymer igg derivatives to compensate interfering factors in immunoassays Download PDFInfo
- Publication number
- HU212322B HU212322B HU891015A HU101589A HU212322B HU 212322 B HU212322 B HU 212322B HU 891015 A HU891015 A HU 891015A HU 101589 A HU101589 A HU 101589A HU 212322 B HU212322 B HU 212322B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- specific
- igg
- aggregate
- fab
- mak33
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/6857—Antibody fragments
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
Description
A találmány egy immunológiailag kötődni képes polivalens anyag meghatározásának a javított eljárására vonatkozik. A meghatározást az immunológiailag kötődni képes anyaggal szemben specifikus legalább két reagáló anyag és egy, az emberi szérum mintákban jelenlévő zavaró faktorok kompenzációját szolgáló inhibitor jelenlétében végezzük. A találmány további tárgya a meghatározásra alkalmas diagnosztikai szer.
Az immunológiailag kötődni képes anyagoknak, mint például polivalens antigéneknek (peptidek, fehérjék, poliszacharidok, vírusok, baktériumok, specifikus sejtek) érzékeny meghatározására ismert eljárások az immunradiometriás, illetve immun-enziometriás szendvics vizsgálatok (two-site-immunassy = két réteges immunvizsgálat), amelyekben a különböző térbeli elhelyezkedésű antigéndeterminánsokkal szembeni két, vagy adott esetben több antitestet alkalmaznak. Ezeknek az ismert meghatározási eljárásoknak leginkább az a módja használatos, amely szerint a meghatározandó antigén (minta) egy antitesttel, amely vagy egy megfelelő hordozóhoz, mint például Sepharosehoz, agarózhoz, műanyag csövecskékhez vagy hasonlóhoz szilárd fázisban kötődik vagy homogénen, például biotinilezett formában oldatban van, és egy meghatározott mennyiségű második vagy több jelzett antitesttel folyékony fázisban inkubálódik. A második és adott esetben a további antitestek specifitását előnyösen úgy választják meg, hogy az a meghatározandó antigénnek az első antitesttől eltérő determinánsaira hassanak, hogy kizárható legyen az antitestek közötti versengés a meghatározandó antigén ugyanazon kötőhelyéhez, amely a teszt érzékenységét károsítaná. Úgy az első, szilárd fázishoz kötött, ill. a biotinilezett, mint a második, ill. a további oldatban levő jelzett antitesteket feleslegben alkalmazzák. A mindenkori antigén meghatározható akár az első antitesthez kötött formában, akár az oldatban maradó nem immunológiailag kötött aktivitásként. Az utóbbi esetben egy meghatározott menynyiségű jelzett második antitest hozzáadása szükséges.
A szükséges specifitás alapján az immunológiai szendvics vizsgálat céljára különösen a monoklonális antitestekből (Monoklonale Antikörper, a továbbiakban MÁK) származó teljes IgG-ket, illetve ezek immunológiailag reaktív fragmentumait [Fab, F(ab')2] alkalmazzák. Ezen kívül még lehetséges ezekben a vizsgálatokban immunreaktív részeket is beépíteni, amelyek a poliklonális antitestekből (Polyklonale Antikörper, továbbiakban PÁK) származnak.
Bár a leírt kétrétegű immunvizsgálatokban a meghatározandó anyagokhoz specifikus antitesteket alkalmaznak, szignifikáns gyakorisággal fordulnak elő olyan humán szérum minták, amelyek nem-specifikus reakciókat váltanak ki. Ezek hibás vizsgálati eredményekhez vezetnek, amelyeknek ennek megfelelően következményei vannak és befolyásolják a terápiás kezelést is. A nem-specifikus reakciók jelentkezése a mintában jelenlevő olyan anyagokra vezethetők vissza, amelyek, bár más támadási pontokon, de a meghatározandó anyaghoz hasonlóan (polivalens antigén) szintén kötődnek a specifikus immunglobulin reagensekhez (zavaró faktorok).
Ilyen immunvizsgálatok esetében szokásos módon preventív nem-specifikus immunglobulinokat vagy immunglobulin fragmentumokat, rendszerint egy immunglobulin G-t (IgG-t) adnak feleslegben a vizsgálandó elegyhez, amely ugyanabból az állatfajból származik, amelyből a specifikus antitestek származnak (G. M. Addison: Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine, 1. kötet, 131-147. oldalak (1974); EP-A 0174 026). A specifikus monoklonális antitestek alkalmazása óta, amelyek rendszerint egérből származnak, a fenti zavaró hatások kiküszöbölésére az immunvizsgálatokban nagy mennyiségű nem-specifikus egér IgG hozzáadása szükséges egér szérum, egér aszcitesz vagy izolált egér immunglobulin formájában [kb. 300-500 pg/ml; Clin. Chem. 32, 1491-1495, (1986)]. Például az EP-A 0174 026 szerint a leírt módon végzett immunvizsgálathoz kb. 30 pg/ml releváns, nem-specifikus egér, ill. patkány IgG hozzáadásával csak bizonyos szérumoknál és bizonyos esetekben (negatív próbák) érik el a zavaró hatások teljes kompenzálását. Az egér IgG előállítása a szükséges kilós mennyiségben a jelenleg rendelkezésre álló módszerekkel gazdaságosan még nem oldható meg, és ezenkívül az etikai szempontból is kritikus.
Az immunvizsgálatokban fellépő említett zavaró hatások kiküszöbölésére lényeges módszer az immunvizsgálatokban alkalmazott specifikus antitestek legalább egyikének az esetében a Fab, ill. F(ab')2-fragmentumok alkalmazása. Ezzel a mintában levő minden, az IgG Fc-re irányuló zavaró faktort (reumafaktorok, anti-Fc-immunglobulinok, mint pl. IgM) megfosztják az egyik specifikus immunreagensre irányuló támadáspontjától és így nem szükséges azokat kompenzálni.
Azonban az alkalmazott Fc-mentes specifikus antitest-reagensek alkalmazása ellenére néhány humán szérum immunvizsgálata esetében további zavaró hatások lépnek fel. Ezek a szérumban lévő anyagokra vezethetők vissza, amelyek a Fab, ill. F(ab')2-re hatnak. Az EP-B 0083 869 szerint a Fab csoportba tartozó ilyen zavaró faktorok csak abban az esetben ismerhetők fel, ha azokat az Fc-résztől elkülönítjük. Ezek a megfelelő immunvizsgálatokban úgy küszöbölhetők ki, hogy a vizsgálat során a meghatározandó antigénre nem specifikus, natív vagy térhálósított Fab-, ill. F(ab')2-fragmentumokat alkalmazunk (EP-B 0083 869). Emellett az aggregált Fab-, ill. F(ab')2 fragmentumok a natív anyagokkal összehasonlítva 2-3szorosan nagyobb mértékben küszöbölik ki a zavaró hatást. Az EP-B 0083 869 szerint ezzel szemben a teljes mértékben nem-specifikus IgG-k, úgy natív, mint aggregált formában nem rendelkeznek zavarást kiküszöbölő hatással a nevezett immunvizsgálatokban. Az eljárásnak ezen kívül az a jelentős hátránya, hogy a meghatározandó antigénre specifikus immunglobulin reagensek mellett jelentős mennyiségű értékes nemspecifikus immunglobulin reagenst igényel, amely jelentős gazdasági és etikai problémát vet fel. Eszerint például a zavaró hatás teljes mértékű kiküszöbölésére legalább 100 pg/ml hatásosnak bizonyult aggregált
HU 212 322 Β nem-specifikus Fc-mentes immunglobulin fragmentumot alkalmaznak.
A találmány alapjául az a feladat szolgál, hogy új lehetőséget teremtsen az Fc-tartalmú és Fc-mentes specifikus antitest reagensekkel, mint specifikusan reagáló anyagokkal végzett immunvizsgálatok nem-specifikus reakcióinak a kompenzálására, amelyek által a humán szérumban lévő, a teljes IgG-kre, és a Fab-, illetve F(ab')2-fragmentumokra irányuló zavaró faktorok megbízhatóan kiküszöbölődnek és az etikai szempontok tekintetbevétele mellett a javított teszt-rendszernek gazdaságossági haszna is van.
Ezt a feladatot a találmány szerint olyan eljárással oldjuk meg, amelynél egy állatfaj vagy ember biológiai folyadékában egy immunológiailag kötődni képes anyag meghatározását legalább két, egy másik állatfajtából származó és az immunológiailag kötődni képes anyagra specifikusan reagáló anyag és egy, a zavaró hatású faktorokat kompenzáló inhibitor jelenlétében végezzük; az eljárást az jellemzi, hogy inhibitorként a reakcióelegyhez az immunológiailag kötődni képes anyagra nem-specifikus, a másik és/vagy egy harmadik állatfaj monoklonális vagy poliklonális antitestjeiből és kívánt esetben egy további makromolekulából származtatott agglomerátumának 0,1-50 pg/ml mennyiséget adjuk a zavaró faktorok kompenzációja céljából.
Immunológiailag kötődni képes anyagként különösen polivalens antigének, mint peptidek, fehérjék, poliszacharidok, vírusok, baktériumok és más specifikus sejtek, illetve ezek alkotórészei jönnek számításba. A meghatározandó immunológiailag kötődni képes anyag meghatározására mindig specifikusan reagáló anyagokat alkalmazunk, amelyek mind poliklonális, mind monoklonális antitestek lehetnek, emellett előnyös IgG-eknek és ezek immun-reaktív alkotórészeinek, mint Fab, ill. F(ab')2-fragmentumoknak a kombinált alkalmazása. Különösen előnyös két vagy adott esetben több specifikusan reagáló anyag hozzáadása, amelyek közül legalább egy Fab, ill. F(ab')2-fragmentum és a többi specifikusan reagáló anyag teljes IgG.
A zavaró hatások kompenzálására szolgáló, az immunológiailag kötődni képes anyagra nem-specifikus antitest-aggregátumként előnyösen az immunológiailag kötődni képes anyagra nem-specifikus IgG-ket alkalmazunk, különösen előnyösen egy nem-specifikus IgG-ből és egy további makromolekulából álló IgGaggregátumot. Előnyösek itt nem-specifikus IgG-k, amelyek ugyanabból az állatfajból származnak, mint a specifikusan reagáló anyagoknak legalább az egyike, makromolekulaként itt például Fab-, ill. F(ab')2-fragmentumok, azaz Fc-mentes IgG-fragmentumok alkalmazhatók, amelyek egérből vagy egy másik fajból levezethető MÁK- vagy PAK-ból származnak, valamint fehérjék (pl. albumin), poliszacharidok (pl. dextrán) vagy más vízben oldódó polimerek, ezenkívül a zavaró hatások kompenzációjára alkalmazhatóak olyan heteropolimerek, amelyeket például egér-IgG és marha IgG összekapcsolásával képezünk. Különösen előnyösen alkalmazhatóak olyan aggregátumok, amelyek egy IgG-molekulából és egy Fc-mentes IgG-fragmentumból állnak, amely esetben mind az IgG-k, mind az Fc-mentes és IgG-fragmentumok abból az állatfajból származnak, mint a specifikusan reagáló anyagok egyike. Ilyen IgG/Fab-, illetve F(ab')2-polimerek mintegy háromszor erősebb zavaró hatást kiküszöbölő aktivitással rendelkeznek, mint a tiszta IgG-aggregátumok. Az egyéni szérum mintáktól függően 0,10-50 pg/ml IgG-vegyes-poIimer elegendő a zavaró hatásoknak az eredményes kiküszöbölésére, azonban előnyös 525 pg/ml koncentrációval és különösen előnyös 5, max. 10 pg/ml koncentrációval dolgozni, minthogy a legtöbb esetben a nem-specifikus IgG-aggregátumnak már jóval csekélyebb mennyiségének a hozzáadása is teljes mértékben hatásos.
A találmánynak egy előnyös kivitelezési módja szerint a humán szérumban levő zavaró faktorok kompenzációjára nem-specifikus homopolimer vagy heteropolimer IgG-aggregátumokat vagy IgG/Fab-, illetve F(ab')2-fragmentumokat alkalmazunk, amelyeknek a molekulatömege 320 000 Dalton vagy annál több. Emellett az IgG-aggregátumok olyan fajokból származó IgG-t tartalmaznak, amelyek közül a specifikusan reagáló anyagoknak legalább az egyike származik és előnyösen ugyanahhoz az alosztályhoz tartoznak, mint a specifikusan reagáló anyagoknak legalább az egyike. Itt előnyösen alkalmazhatóak olyan polimer IgG-készítmények, amelyeknek a molekulatömege 320 000 és 10 millió Dalton között van, amely esetben a szérum zavaró faktoraival szembeni kompenzációs hatás mértéke a molekulatömeg növekedtével fokozódik. Különösen előnyös kivitelezési módjai a találmánynak a szendvics immunvizsgálatok, amelyekben két vagy több specifikus egér, illetve patkány-MAK-reagenst alkalmazunk, amelyek közül legalább az egyik reagáló anyag egy Fab- vagy F(ab')2-fragmentum és a többi reagáló anyag közül legalább egy egy Fc-tartalmú IgG és amely esetben a zavaró faktorok kompenzálására homopolimer vagy heteropolimer nem-specifikus IgGaggregátumokat vagy IgG/Fab-, illetve F(ab')2-aggregátumot alkalmazunk, amelyek molekulatömege nagyobb 320 000 Daltonnál és a nem-specifikus aggregátumban levő IgG-k és Fab-, illetve F(ab')2-fragmentumok monoklonálisak és a specifikusan reagáló anyagok legalább egyikének a fajából és alosztályából származnak. Emellett közömbös, hogy a nem-specifikus IgG-t, ill. Fab-fragmentumot aszciteszből, fermentációval vagy génsebészet segítségével történő mikroorganizmusban végbemenő expresszióval állítjuk elő.
A találmány szerinti eljárásban a zavaró hatások kompenzációjára alkalmas polimerizált nem-specifikus IgG molekulának, illetve a nem-specifikus IgG/Fab, illetve F(ab')2-aggregátumoknak más fajból kell származni, mint amelyből az analizálandó minta származik. Rendszerint a humán szérum analízisét szolgáló immunológiai meghatározási eljárásokban specifikus, egérből származó monoklonális antitesteket, illetve ezek immunreaktív fragmentumait alkalmazzuk. A specifikus antitest reagensek azonban egy másik állat fajból is származhatnak. A zavaró hatás kiküszöbölése céljából alkalmazott nem-specifikus antitest-aggregá3
HU 212 322 Β tumok lehetnek egérből vagy egérből és az előzőtől eltérő állatfajból származó IgG-k, illetve ezek Fabfragmentumainak a kombinációi. Például a specifikus antitest reagensként egér-MAK-okat, illetve egér IgGket alkalmazó immunvizsgálatokban a zavaró hatás kiküszöbölésére lehet egér IgG/marha IgG heteropolimereket alkalmazni.
A nem-specifikus lgG-aggregátumok, illetve IgG/Fab-, illetve F(ab')2-aggregátum immunológiai vizsgálatokban, amelyeket a meghatározandó immunogénnel specifikusan reagáló legalább két anyaggal végeznek és, amely anyagok közül legalább egy egy Fab-, illetve egy F(ab')2-fragmentumból származik, a nem-specifikus reakciók kompenzálásában a natív IgG-kel összehasonlítva 20-1000-szeres, és a natív vagy aggregált Fc-mentes IgG-fragmentumokkal öszszehasonlítva 20-1500, illetve 3-szoros hatás érhető el. Ez meglepő, minthogy nem volt előre látható, hogy azon immunvizsgálatokban, amelyekben monoklonális vagy poliklonális antitestekből származó FC-mentes specifikus immunglobulin reagenseket alkalmazunk, az IgG-tartalmú nem-specifikus reagáló anyagok egyáltalán hatást gyakorolnak a Fab-, illetve F(ab')2fragmentumokra irányuló zavaró hatásokra. Továbbá az EP-8 0083 869 szerint a technika legújabb állása a szakembert ellentétes feltételezéshez vezeti. Ebben a szabadalmi leírásban kifejezetten hangsúlyozzák, hogy mind a natív, mind az aggregált IgG-k semmi zavaró hatást kiküszöbölő aktivitással nem rendelkeznek az ott leírt immunológiai agglutinációs vizsgálatban, és a zavaró hatás kiküszöbölésére, valamint a specifikus agglutináció elérésére hozzáadott hatóanyagoknak IgG-menteseknek kell lenniük.
A nem-specifikus IgG önmagával vagy antitest fragmentumokkal, továbbá fehérjékkel, poliszacharidokkal vagy más vízben oldódó makromolekulákkal, hőbehatással, kémiai vagy nem-kovalens bioaffinitás kölcsönhatással térhálósítható az irodalomból ismert módszerekkel. Minden esetben a vizes puffer oldatban oldódó, aggregátumok keletkeznek. A térhálós szerkezet kémiai kialakítása történhet például homo- és heterofunkcionális kémiai kapcsoló-karokkal (linkerekkel), fehérjéken vagy aktivált dextránon keresztül vagy csak maguknak az IgG molekuláknak, illetve azok és/vagy más Fc-mentes fragmentumainak karbodiimiddel való térhálósításával. Ezen kívül lehetséges az antitest monomereket diszulfid-redukcióval és reoxidációval vagy szénhidrát részük oxidációjával önmagukkal vagy egy megfelelő makromolekulával térhálósítani. Kémiai linkerként például a következők jöhetnek számításba:
bisz(maleinimino)-metilészter, diemtil-szuberimidát, diszukcinimidil-szuberát, glutárdialdehid, N-szukcinimidil-3-(2-piridil-ditio)-propionát, N-5-azido-2nitrobenzoil-szukcinimid, N-szukcinimidil-(4-jód-acetil)-aminobenzoát vagy maleinimido-hexanoil-szukcinimidát és S-acetil-merkapto-borostyánkősavanhidrid kombinációja, illetve analóg vegyületek. Az aktivált dextrán előállítása történhet például egy meghatározott molekulasúlyú aminodesztránból maleinimido-hexanoil-szukcinimidáttal, amelyet végül egy nem-specifikus IgG molekula merkapto-acetil származékával térhálósítanak. Bioaffinitású kölcsönhatás alatt általában olyan kötéseket értünk, mint például a biotin-avidin pár (illetve streptavidin), haptén-, antihaptén antitestek, antigén - antigén antitestek, ligandum - kötőfehérje (például tiroxin - tiroxint kötő fehérje), hormon - receptor. Egy megfelelő kivitelezési módnak találtuk a legalább kétszeresen biotinilezett nem-specifikus IgG-nek és sztreptavidinnek az alkalmazását vagy az IgG-nek legalább két digoxigenin molekulával való derivatizálását és egy monoklonális vagy poliklonális anti-digoxin-antítesttel való térhálósított származékának az alkalmazását. Ugyanígy alkalmasak azon aggregátumok, amelyek poli-humán albuminnak egy monoklonális antitesttel való reagáltatásával keletkeznek.
A fenti esetekben kapott aggregátumot tartalmazó nyers keverékeket dialízis után közvetlenül lehet alkalmazni, vagy például gélszűréssel a növekvő molekulatömeg szerint lehet frakcionáltan szétválasztani és végül közvetlenül lehet alkalmazni az immunvizsgálatokban a zavaró hatások kompenzálására.
A teszt-elegyhez hozzáadott specifikusan reagáló anyagok egyike, különösen az Fc-tartalmú IgG-antitestek egyike a szakemberek által ismert módon, például agarózhoz vagy műanyagcsövecskékhez lehet kötve szilárd fázisban vagy például folyadékfázisban lehet biotinilezett formában. Ha egy biotinilezett antitestet alkalmazunk, először a komplexet képezzük az antigénből és egy jelzett másik specifikusan reagáló anyagból, amely azután in situ egy biotint kötő fehérjére, mint például egy avidin vagy streptavidin réteggel bevont vivőanyagra kötődik. Emellett azonban lehetnek más vizsgálati módszerek is, amelyeket az első biotinilezett antitesttel végzünk: az antigén reagál a biotinilezett MAK-al és in situ vagy egy meghatározott előinkubációs periódus után egy biotint kötő szilárd fázisra kötődik és csak ezután hozzuk össze a második specifikusan reagáló anyaggal. De az is lehetséges, hogy előbb az antigént a második specifikusan reagáló anyaggal reagáltatjuk és csak azután a biotinilezett antitesttel. A második és adott esetben a további specifikusan reagáló anyagoknak a jelzését, amelyek előnyösen Fc-mentes IgG fragmentumok, egy enzimmel, egy fluoreszkáló, kemolumineszkáló vagy radioaktív anyaggal való kapcsolással végezzük. Az ilyen antitest származékok jelzése a szakemberek előtt ismeretes, például a következő közleményből: E. Ischikawa és mtsai: J. of Immunoassay. 4, 209-327, (1983), és így nem igényelnek itt további magyarázatot.
Mint említettük a találmány egy további tárgya immunológiailag kötődni képes polivalens anyagok kétrétegű immunvizsgálatban való meghatározására szolgáló diagnosztikai szer, amely az ismertetett nemspecifikus antitest-aggregátumot tartalmazza. A diagnosztikus szer két, vagy adott esetben több specifikus antitest mellett, amelyek közül az egyik egy IgG molekula és legalább egyike az Fc-mentes IgG-fragmentum, egy megfelelő puffer rendszert és a leírt nem-specifikus antitest-aggregátumot, valamint adott esetben további szokásosan alkalmazott segédanyagokat, mint
HU 212 322 Β például reakciót gyorsító anyagokat, detergenseket vagy stabilizátorokat tartalmaz. Megfelelő puffer rendszerként például 20-60 mmólos foszfátpuffert (pH = 7,0) vagy egy 50 mmólos HEPES/100 mmólos NaCl puffer rendszert (pH = 7,4) lehet alkalmazni. Reakció gyorsítóként itt alkalmazni lehet például dextrán-szulfátot, vagy polietilénglikölt (6000-40 000), detergensként például Triton Χ-100-at, Tween 20-at vagy Pluronic F68-at és megfelelő stabilizátorként pedig fenolt, oxipiront, klóracetamidot, mertiolátot és másokat.
A diagnosztikai szer tartalmazza a nem-specifikus antitest aggregátumot, amelynek molekulatömege 320 000 Dalton vagy több, előnyösen 10 millió Dalton, koncentrációja 0,1-50 pg/ml, előnyösen 5-25 pg/ml. különösen előnyös 5-10 μg/ml koncentrációban.
A diagnosztikai szert oldat formájában vagy száraz kémiai reagensként, egy annak felszívására alkalmas vivőanyagra vagy egy filmre felvive lehet alkalmazni.
A találmány szerinti oldott formában levő diagnosztikai szer, adott esetben a kívánt pH értékre pufferolva, tartalmazza az összes, a vizsgálathoz szükséges reagenst. Az eltarthatóság szempontjából előnyös lehet a vizsgálathoz szükséges reagenseket két vagy több oldatra osztani, amelyeket csak a vizsgálat előtt egyesítünk. Ebben az esetben nincs jelentősége, hogy a nemspecifikus antitest aggregátumot külön egy megfelelő puffer-rendszerben és/vagy egy és/vagy mindkét, illetve további specifikus antitestekkel együtt tároljuk.
A diagnosztikai szer tesztcsík alakjában való előállításához egy szívóképes hordozót, előnyösen szűrőpapírt, cellulózt vagy műszál-vliest a szükséges és a tesztcsíkok előállítására rendszerint alkalmazott reagensek kismértékben illó oldószeres, mint például vizes, metanolos, etanolos vagy acetonos oldatával impregnáljuk. Ez egy impregnálási lépéssel elérhető. Gyakran célszerű azonban az impregnálást több lépésben elvégezni, amikor is olyan oldatokat alkalmazunk, amelyek mindegyike a diagnosztikai szer alkotórészeinek egy részét tartalmazza.
A diagnosztikai szer tesztcsík alakjában való előállítására egy film-lap is szolgálhat, amelyben a film kötőanyagok és pigmentek mellett specifikus antitest, illetve antitest-fragmentumok, a leírt nem-specifikus antitest/ fragmentum)-aggregátumok, egy megfelelő pufferrendszer és egyéb, a diagnosztikai szerek esetében rendszerint alkalmazott adalékanyagok vannak.
A kész-papírok és teszt-filmek, mint olyanok, alkalmazhatók vagy ismert módon felragaszthatok egy hordozó fóliára, vagy előnyösen műanyagok és a DE-PS 2 228 455 szerint finomszövésű hálók közé préselhetők és a vizsgálandó testnedvekkel (például vér, plazma, szérum) érintkezésbe hozhatók.
A találmány alkalmas minden, legalább két antigén-determinánssal rendelkező antigén meghatározására. Éne példaként szolgál a tireotropin (TSH) karcinoembrionális antigén (CEA), hepatitis vírus (Hepatitis B felületi antigén, HBs), 1-fetoprotein (AFP), humán choriogonadotropin (HCG), luteinizáló hormon (LH), follikulusstimuláló hormon (FSH), p2-mikroglobulin, savanyú-prosztata-foszfatáz, prolaktin, ferritin és inzulin.
A következő példák a találmány további magyarázatát adják:
1. példa
Monoklonális egér IgG-aggregátam előállítása, azt egy homobifunkcionális reagenssel térhálósává Monoklonális MAK133-IgG-t (>95%-os tisztaságú; alosztály összetétel K, γΐ; specifitás: antikreatinkináz) ammóniumszulfátos kicsapással és DEAE-ioncserélőn történő kromatografálással aszcites folyadékból izoláltunk (lásd: A. Johnstone és mtsai: Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications 1982, 44-45. old.).
mg IgG-t oldottunk 3 ml 0,025 mólos bikarbónát - karbonát pufferben (pH = 9,5). Ebbe az oldatban 17 μΐ 12,5%-os glutáraldehid oldatot pipettáztunk és két órán át 25 °C-on inkubáltuk. Végül az oldatot jeges vízben lehűtöttük és 50 mM trietanolamin pufferrel pH = 8,2-re állítottuk. Ehhez az oldathoz 0,6 ml frissen készített nátrium-bórhidrid oldathoz (8 mg nátrium-bórhidrid 1 ml kétszer desztillált vízben) adtunk és tovább inkubáljuk 2,5 órán át 0 ’Con. A reagens felesleget 16 órán át 0-4 ’C-on 0,2 M CaCl-t tartalmazó 10 mM foszfát pufferrel (pH = 7,5) szemben való dializálással távolítottuk el. A dializátumot ultraszűréssel 1,25 ml térfogatra koncentráltuk. Ennek a koncentrátumnak (nyers elegy) egy részét közvetlenül alkalmaztuk a zavaró hatás kiküszöbölésére; 1,0 ml-ét pedig AcA22 töltésű (LKB) gélszűréses oszlopon kromatografáltuk. Az oszlop mérete 2x40 cm; az alkalmazott puffer 10 mM foszfát/100 mM NaCl (pH = 7,5). Az oszlop eluátumának fehérje tartalmát egy UV monitorral 280 nm-en vizsgáltuk és frakcionáltuk. A teljes fehérje-tartalmú eluátumot négy azonos térfogatú részben egyesítettük. A kromatográfiás oszlop kalibrálását ismert molekulasúlyú fehérjékkel elvégezve megállapítottuk a négy összegyűjtött anyag molekulatömegének a tartományát: 160 000-400 000, 400 000-1 000 000, 1-2 millió és 2-10 millió. Az összegyűjtött oldatokat kb. 2 mg/ml fehérjekoncentrációig betöményítettük és a különböző molekulatömeg tartományba tartozó IgGaggregátum oldatokat alkalmaztuk a zavaró hatás kiküszöbölésére.
2. példa
Monoklonális egér-IgG-aggregátum előállítása egy heterobifunkcionális reagenssel térhálósítva
a) A MAK33-IgG-MH előállítása (maleinimidohexanoil-MAK33-IgG)
100 mg MAK33-IgG-t 4 ml 30 mM foszfát pufferben (pH = 7,1) oldottuk. Ehhez az oldathoz 20 μΐ (4 pmól), dimetil-szulfoxidban oldott 0,2 M maleinimido-hexanoil-szukcinimidátot pipettáztunk. A reakcióelegyet 1 órán át 25 ’C-on inkubáltuk, majd 16 órán át dializáltuk 50 mM NaCl tartalmú 10 mM foszfát pufferrel (pH = 6,1) szemben 0-4 ’C-on. így 4,45 ml oldatot nyertünk, amely 22 mg MAK33-IgG-MH/ml koncentrációjú volt.
HU 212 322 Β
b) A MÁK 33-IgG-SAMS előállítása (S-acetil-merkapto-szukcinil-MAK33-IgG) mg MAK33-IgG-t oldottunk 4 ml 0,1 M (pH = 8,0) foszfát pufferben. Ehhez az oldathoz 40 μΐ dimetilszulfoxidban oldott 0,25 M S-acetil-merkapto-borostyánkősavanhidridet pipettáztunk. A reakcióelegyet 1 órán át 25 ’C-on inkubáltuk, majd 50 mM NaCl-tartalmú 10 mM foszfát pufferrel (pH = 6,1) szemben dializáltuk 0-4 °C-on. így 4,45 ml oldatot nyertünk, amely 21,8 mg MAK33-IgG-SAMS/ml koncentrációjú volt.
c) A MAK33-IgG-MH térhálósítása MAK33-IgGMS-el (merkapto-szukcinil-MAK33-IgG) mg MAK33-IgG-SAMS tartalmú oldatot 15 mg/ml koncentrációjúra hígítottunk 2 mM etiléndiamin-tetraacetát tartalmú 25 mM foszfát pufferrel (pH = 6,5) (A puffer). Ehhez az oldathoz 75 μΐ 1 M-os hidroxil-amin-oldatot pipettáztunk és 20 percen át inkubáltuk 25 °C-on.
Ennek az oldatnak 3 ml-ét, amely 44 mg MAK33IgG-MS-t tartalmaz, A pufferrel 6 ml-re hígítottuk. Ezt az oldatot 4 ml olyan oldathoz adtuk, amely 88 mg MAK33-IgG-MH-t tartalmazott. Az elegyet 40 percig 25 ’C-on inkubáltuk, majd a térhálósítási reakció megszakítása céljából 2 mM koncentrációig ciszteint adtunk hozzá. További 30 perces 25 ’C-on történő inkubálás után 5 mM koncentrációig N-metil-maleinimidet adtunk hozzá és további 1 órán át 25 °C-on tartottuk. A reakcióelegyet 0,2 M NaCl tartalmú 10 mM foszfát pufferrel (pH = 7,5) szemben dializáltuk. A dializátumot ultraszűréssel 35 mg/ml fehérje koncentrációig betöményítettük és centrifugálással elkülönítettük a csekély mennyiségű zavarosságot okozó anyagot. Egy ilyen dializátum (nyers elegy) molekulatömeg szerint megoszlását az 1. ábra szemlélteti. Az aggregátelegy közvetlenül vagy molekulatömeg-frakciókra való felbontás után (az 1. példában megadott AcA22-kromatográfiával nyert frakciók) a zavaró hatás kiküszöbölésére alkalmazható.
3. példa
A MAK33-/gG-aggregátitm előállítása amino-dextrános térhálósítással
a) Az S-acetil-tio-acetil-aminodextrán előállítása
100 mg amino-dextránt (Dextrán T40, Pharmacia;
aminocsoport/40 000 molekulatömeg) 4 ml 30 mM foszfát pufferben (pH = 7,1) oldottunk. Ehhez az oldathoz 0,25 ml dimetil-szulfoxidban oldott 0,2 M S-acetiltioacetil-szukcin-imidátot pipettáztunk. A reakcióelegyet 1 órán át 25 °C-on inkubáltuk, majd 50 mM NaClt tartalmazó 10 mM foszfát pufferrel (pH = 6,1) szemben dializáltuk. A kitermelés 90 mg S-acetil-tio-acetilamino-dextrán 4,5 ml oldatban.
b) A MAK33-lgG-MH térhálósítása tio-acetil-amino-dextránnal mg/ml S-acetil-tio-acetil-amino-dextrán tartalmú 2 ml oldatot 0,1 M NaOH-val óvatosan pH 6,5-re állítottunk és 2 mM koncentrációig etilén-diamin-tetraacetátot adtunk hozzá. Ehhez az oldathoz 40 μΐ 1 mólos hidroxilamin-oldatot pipettáztunk és 20 percen át inkubáltuk °C-on. Végül az oldatot 25 mM foszfát pufferrel (pH = 6,5) 6,8 ml-re felhígítottuk és 7,2 ml 158,4 mg MAK33-IgG-MH oldatot adtunk hozzá (előállítása azonos a 2. példa a) pontjában leírttal). 30 percig 25 °C-on történő inkubálás után a reakcióelegyhez 2 mM koncentrációig ciszteint adtunk és 30 perc után 5 mM koncentrációig N-metil-malein-imidet adtunk hozzá. További 1 órás 25 °C-on történő inkubálás után a polimerizátumot 50 mM NaCl tartalmú 10 mM foszfát pufferrel (pH = 7,5) szemben dializáltuk. A gyenge zavarosságot okozó anyag lecentrifugálása után 19,5 ml MAK33-IgG-dextrán-aggregátum oldatot kaptunk, amelynek fehérje-tartalma 7,1 mg/ml volt.
4. példa
MAK33-IgG-aggregátum előállítása marha-IgGvel történő térhálósítással
a) Marha-lgG-MH előállítása
100 mg poliklonális marha-IgG-hez a 2. példa a) pontjával analóg módon 4 pmól malein-imido-hexanoil-szukcinimidátot adunk. A termelés 4,45 ml 22 mg marha-IgG-MH/ml koncentrációjú oldat volt.
b) MAK33-SATA előállítása (S-acetil-tioacetilMAK33-IgG)
100 mg MAK33-IgG-t oldottunk 4 ml 30 mM foszfát pufferben (pH = 7,1). Ehhez az oldathoz 200 μΐ (2 pmól) dimetil-szulfoxidban oldott 0,1 M S-acetiltio-acetil-szukcinimidet pipettáztunk. A reakcióelegyet órán át 25 °C-on inkubáltuk, majd 16 órán át 0-4 ’Con dializáltuk 50 mM NaCl tartalmú 10 mM foszfát pufferrel (pH = 6,1) szemben. 4,45 ml 22 mg MAK33IgG-SATA/ml koncentrációjú oldatot kaptunk.
c) Tio-acetil-MAK33-IgG térhálósítása marhaIgG-MH-val mg MAK33-IgG-SATA-t oldottunk 2 mM etiléndiamin-tetraacetát tartalmú 25 mmólos foszfát pufferben (pH = 6,5) (A puffer) 15 mg/ml koncentrációra hígítva. Ehhez az oldathoz 75 μΐ 1 M hidroxilamin oldatot pipettáztunk és 20 percig 25 °C-on inkubáltuk.
Ennek az oldatnak 3 ml -éhez, amely 44 mg tioacetilMAK33-IgG-t tartalmaz, 4 ml olyan oldatot adtunk, amely 88 mg marha-IgG-MH tartalmú és 25 percen át inkubáltuk 25 ’C-on. A térhálósítás megszakítása céljából mM koncentrációig ciszteint adtunk hozzá és 25 ’C-on történő 30 perces inkubálás után jódacetamidot adunk hozzá 5 mM koncentrációig, további 1 órás 25 ’C-on történő inkubálás után 16 órán át 0-4 ’C-on dializáltuk 50 mM NaCl tartalmú 10 mM foszfát pufferrel (pH = 7,5) szemben. A dializátum centrifugálása után 8,9 ml MAK33-IgG-marha-IgG aggregátumot nyertünk, az oldat fehérje koncentrációja 13 mg/ml volt.
5. példa
MAK33-IgG-aggregátum előállítása MAK33-Fabal történő térhálósítással
a) MAK33-Fab-SATA előállítása
200 mg MAK33-IgG-t papainnal Fab/Fc-re hasítottunk és az elegyből a MAK33-Fab-ot DE52 cellulózon
HU 212 322 Β (Whatman) kromatografálva izoláltuk (a módszert lásd: A. Johnstone és mtsai: Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications 1982, 52-53. old.). A kitermelés 95 mg sómentes, liofilizált MAK33-Fab volt.
mg MAK33-Fab-ot oldottunk 2 ml 30 mM foszfát pufferben (pH = 7,1). Ehhez az oldathoz 30 μΐ (3 μιηόΐ) dimetil-szulfoxidban oldott 0,1 M S-acetiltioacetil-szukcin-imidátot pipettáztunk. A reakcióelegyet 1 órán át 25 °C-on inkubáltuk, majd 16 órán át 0-4 °C-on dializáltuk 10 mM foszfát puffer - (pH = 6,1) - 50 mM NaCl - 2 mM etiléndiamintetraacetát oldattal szemben. így 2,6 ml oldatot kaptunk, amely
18,5 mg MAK33-Fab-SATA/ml koncentrációjú volt.
b) MAK33-IgG-MH térhálósítása tioacetilMAK33-Fab-al mg MAK33-Fab-SATA-ból 25 mM foszfát pufferrel (pH = 6,5) 15 mg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk. Ehhez az oldathoz 50 μΐ 1 M hidroxil-amin oldatot pipettáztunk és 20 percig inkubáltuk 25 °C-on.
Ennek az oldatnak 1,5 ml-éhez, amely 22 mg tioacetil-MAK33-Fab tartalmú, 55 mg MAK33-IgG-MHt adtunk (amelyet a 2. példa a) pontja szerint állítottunk elő) és kétszer desztillált vízzel 10 ml-re hígítottuk. Ezt az elegyet 35 percig inkubáltuk 25 °C-on, majd a térhálósítás megszakítása céljából 2 mM koncentrációig ciszteint adtunk hozzá. Miután 30 percig 25 °C-on tartottuk, 5 mM koncentrációig N-metil-maleinimidet adtunk hozzá és további 1 órán át inkubáltuk 25 °C-on. Végezetül a reakcióelegyet 16 órán át 0-4 °C-on dializáltuk 0,1 M NaCl tartalmú 10 mM foszfát pufferrel (pH = 7,5) szemben. Centrifugálás után 12,8 ml tiszta oldatot kaptunk, amely 5,3 mg MAK33-IgG-Fab-aggregátumot tartalmazott ml-enként.
6. példa
MAK33-IgG-aggregátum előállítása biotin-sztreptavidinnel történő térhálósítással
a) Biotinilezett MAK33-lgG előállítása mg MAK33-IgG 2,5 ml 0,1 M kálium-foszfát pufferes (pH = 8,5) oldatához 50 μΐ dimetil-szulfoxidban oldott 1,13 mg biotinil-e-amino-kapronsav-N-hidroxi-szukcinimet adtunk (Boehringer Mannheim GmbH az IgG-biotin mólaránya 1:7,5) és összekeverés után 90 percig 25 °C-on inkubáltuk. Abiotinilizett IgGt éjjelen ál 4 °C-on 2 mM-os kálium-foszfát pufferrel (pH = 7,0) szemben dializáltuk. Kitermelés 45 mg (MAK33-IgG-biotin 6,4 ml-ben).
b) Térhálósítás sztreptavidinnel ml MAK33-IgG-biotin oldathoz 5 percenként 3 részletben esetenként 1,5 mg sztreptavidin (Boehringer Mannheim GmbH, 50 mM kálium-foszfát puffer - 0,1 M Nacl-oldatát adtuk és 20 percen át 25 °C-on inkubáltuk. Az IgG-sztreptavidin mólaránya 2,5:1. Az elegyet ultraszűréssel 2 ml-re koncentráltuk és az 1.
példában megadott módon egy AcA22 oszlopon kromatografáltuk. Minden frakciót, amelynek molekulatömege 320 000 Daltonnál nagyobb volt, összegyűjtöttünk. Kitermelés 21 mg MAK33-IgG-sztreptavidin-aggregátum 12 ml oldatban, amely 17 mg IgG-t tartalmaz.
7. példa
MAK-anti-humán-albumin térhálósítása humán albuminnal
40 mg humán-albumint (Behringwerke, Marburg) ml 50 mM kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) oldottunk és 3 órán át 70 °C-on való melegítéssel aggregáltuk. 25 °C-ra történő lehűtés után egy 25 mg humán albuminaggregátum tartalmú részt 50 mM kálium-foszfát puffer
- 0,1 M-os NaCl (pH = 7,0) oldattal 2,5 mg/ml koncentrációjúra hígítottunk és 5 perces időközönként 4 részletben egyenként 2,5 mg MAK-anti-humán-albumin (gamma 1, kappa) 0,2 ml 50 mM kálium-foszfát pufferes (pH = 7,0) oldatát adtuk hozzá. Miután 20 percen át 25 °C-on inkubáltuk, ultraszűréssel 2 ml-re koncentráltuk és a fentiekben már leírt módon AcA22 gél oszlopon kromatografáltuk. A 320 000 Daltonnál nagyobb molekulatömegű frakciókat egyesítettük. Kitermelés: 12,4 mg MÁK MIIgG-albumin-aggregátum 7,8 ml oldatban, amely
8,86 mg IgG-t tartalmaz.
8. példa
A natív MAK33-IgG és a különbözőMAK33-IgGaggregátumok zavaró hatást kiküszöbölőaktivitá35 sának az összehasonlítása két specifikus MÁK reagenssel CEA enzim-immunvizsgálatban Enzymun® CEA (Boehringer Mannheim GmbH) teszt-csomag reagenseit alkalmaztuk. Az ebben a tesztben levő reagens csövecskék egy monoklonális, CEA40 specifikus egér-IgG (IgG 1, K) réteggel vannak bevonva. Az enzimmel jelzett reagens egy monoklonális, CEA-specifikus egér-FAb-peroxidáz konjugátum aFab alosztály összetétele K, gamma 1.
A különböző MAK33-IgG készítményeket növekvő koncentrációban mindig az inkubációs pufferben adtuk és a vizsgálatot egy olyan humán szérummal (P43 = 43. minta) végeztük, amelyben levő zavaró faktorok kiemelkedően hatásosak. Az 1. táblázat bemutatja az inkubációs pufferben levő MAK33-IgG készítmény azon koncentrá50 cióját ^g fehérje/ml), amely a zavaró hatást oly mértékben visszaszorította, hogy az analizált mennyiséget a normál tartományban mértük (1-3,5 ng/ml).
I. táblázat
KülönbözőMAK33-IgG-készítmények zavaró hatást kiküszöbölő relatív aktivitása
| Az inkubációs pufferhez adott anyag | pg/ml | Zavaró hatást kiküszöbölő faktor | Extinkció | A 43. szérum mintában levő látszólagos CEA-tartalom ng/ml |
| Nincs | 0 | - | 1,636 | >58* |
HU 212 322 Β
| Az inkubációs pufferhez adott anyag | pg/ml | Zavaró hatást kiküszöbölő faktor | Extinkció | A 43. szérum mintában levő látszólagos CEA-tartalom ng/ml |
| MAK33-lgG monomer | 9600 | 0,0026 | 0,132 | 3,4 |
| MAK33-IgG-aggregát/GDA (nyers elegy 1) | 34 | 0,74 | 0,126 | 3,1 |
| MAK33-IgG-aggregátum (nyers elegy 2c) | 25 | 1 | 0,125 | 3,1 |
| MAK33-IgG-dextrán (3) | 43 | 0,58 | 0,129 | 3,3 |
| MAK33-IgG-marha-IgG-aggregátum (4) | 82 | 0,3 | 0,130 | 3,3 |
| MAK33-IgG-Fab-aggregátum (5) | 3 | 8,33 | 0,122 | 2,9 |
*Az érték kívül esik a hitelesítő pontok által meghatározott kalibrációs görbe tartományán.
9. példa
Nem-kovalens, bioaffiinitású kötésekkel térhálósított MAK-IgG-aggregátumok zavaró hatást kiküszöbölő aktivitása CEA Enzymun tesztben A reagensek és a vizsgálat módja azonos a 8. példában leírtakkal. 20
Az alkalmazott humán szérum minta tényleges
CEA tartalmát egy referencia módszer segítségével határoztuk meg, amely 2,8-4,2 ng/ml tartalmúnak adódott. A 2. táblázat a kalibrációs görbéből leolvasott, egy zavaró faktorokat tartalmazó humán szérum mintában (108. számú minta) mért CEA látszólagos koncentrációját adja meg különböző IgG-aggregátumokat adva az inkubációs pufferhez.
2. táblázat
Bioaffinitáson alapuló térhálósítással előállított IgG-aggregátumok zavaró hatást kiküszöbölő aktivitása
| Az inkubációs pufferhez adott anyag | pg IgG/ml | 108. számú humán szérum minta ng CEA/ml |
| Nincs | - | 40 |
| MAK33-IgG monomer | 200 500 | 33.4 31.4 |
| MAK33-IgG-Sztreptavidin | 1 | 28,5 |
| aggregátum (6. példa) | 10 | 8,8 |
| MÁK MI-IgG-humán albumin | 2,5 | 36,7 |
| aggregátum (7. példa) | 7,5 | 25,1 |
A táblázatból látható, hogy mindkét bioaffinitású térhálósítással előállított IgG-aggregátum, az IgG tömeget alapul véve, jelentősen nagyobb mértékben 40 hárítja el a zavaró hatást, mint a nem térhálósított IgG: a faktor >500, illetve >60. A hozzáadott mennyiségeket úgy választottuk meg, hogy azok csak részben küszöböljék ki a zavaró hatást, ilyen körülmények között ugyanis a különböző készítmények zava- 45 ró hatást kiküszöbölő aktivitásának az értékelése jobban becsülhető.
10. példa
A zavaró hatást kiküszöbölő aktivitás függése a MAK33-ígG-aggregátumok molekulatömegétől Ennek a kísérletnek a reagensei és kivitelezése azonos a 8. példában leírtakkal. A MAK33-IgG készítményeket a 2. példa szerint állítottuk elő.
3. táblázat
A MAK33-IgG-aggregátumok zavaró hatást kiküszöbölő aktivitásának a függése a molekulatömegtől
| Az inkubációs pufferhez adott anyag | 18. sz. beteg széruma1 | 43. sz. beteg széruma1 | ||
| extinkció | ngCEA/ml2 | extinkció | ngCEA/ml2 | |
| Nincs | 1,567 | >583 | 1,636 | >58’ |
| 125 pg/ml monomer MAK33-IgG | 0,148 | 3,9 | 1,703 | >58 |
| 10 pg/ml MAK33-IgG-aggregátum nyers elegy | 0,115 | 2,7 | 0,179 | 6,2 |
| 30 pg/ml MAK33-IgG-aggregátum, nyers elegy | - | - | 0,125 | 3,1 |
HU 212 322 Β
| Az inkubációs pufferhez adott anyag | 18. sz. beteg széruma1 | 43. sz. beteg széruma1 | ||
| extinkció | ngCEA/ml2 | extinkció | ngCEA/ml2 | |
| 5 pg/ml MAK33-IgG-aggregátum, m. s. 2-10 mii. | 0,105 | 2,1 | 0,137 | 3,9 |
| 5 pg/ml MAK33-IgG-aggregátum, m. s. 1-2 mii. | 0,109 | 2,4 | 0,285 | 11,0 |
| 5 pg/ml MAK33-IgG-aggregátum, m. s. 400 000-1 mii. | 0,155 | 4,8 | 1,051 | 53,7 |
| 5 pg/ml MAK33-IgG-aggregátum, m. s. 160 000-400 000 mii. | 0,364 | 16,3 | 1,239 | >58 |
1. A valóságos, referencia módszerrel meghatározott CEA tartalom 1-3,5 ng/ml tartományban van.
2. A látszólagos CEA tartalmat az extinkció alapján CEA standard mintákkal készült kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg az Enzymun® CEA előírása alapján.
3. Kívül esik a kalibrációs mintákkal készített görbe tartományán.
77. példa
A különböző monoklonális antitestekkel előállított
MAK-IgG-aggregátumok zavaró hatást kiküszöbölő aktivitásának az összehasonlítása Egy Enzymun® TSH csomag tesztcsövecskéit (Boehringer Mannheim GmH alkalmaztuk, amelyek egy monoklonális anti-TSH egér-IgG (IgGl, K) réteggel vannak bevonva. Az egyéb reagenseket a 8. példában leírttal azonos módon az Enzymun® CEA tesztcsomagból vettük. A vizsgálatot a tesztcsomag útmutatása szerint végeztük. Ennél a vizsgálati módnál egy szérumminta vizsgálandó anyag tartalma nem adhat jelet, minthogy mindkét specifikus reagens különböző specifitású. így csak egy modell-tesztről van szó, amely egy szérummintával csak akkor ad a vak érték feletti jelet, ha az zavaró faktorokat tartalmaz. Az összehasonlításhoz alkalmazott MAK-IgG-aggregátumokat a 2. példa
c) pontja szerint állítottuk elő MAK33-ból.
4. táblázat
Különböző monoklonális antitestekkel készült IgG-aggregátumok zavaró hatást kiküszöbölő aktivitásának az összehasonlítása modell vizsgálatban 4Q
| Az inkubációs pufferhez adott anyag | Mg/ml | A 43. szérumminta extinkciója | 45 50 |
| MAK33-lgG-aggregátum (2c) nyers elegy | 0 1,25 2,5 5 10 20 | 0,900 0,506 0,366 0,238 0,195 0,152 | |
| MÁK MS43,10-IgG- | 0 | 0,900 | |
| aggregátum, nyers elegy | 1,25 | 0,554 | 55 |
| 2,5 | 0,406 | ||
| 5 | 0,286 | ||
| 10 | 0,202 | ||
| 20 | 0,180 | 60 |
A CEA és zavaró faktor nélküli szérum minta extinkciója 0,162. Eredmény: a különböző monoklonális MAK-IgG-aggregátumok zavaró hatást kiküszöbölő aktivitásának a mértéke a hibahatáron belül azonos.
72. példa
MAK33-IgG-aggregátum és monomer MAK33IgG zavaró hatást kiküszöbölő aktivitása biotinilezett MAK-IgG-reagenst alkalmazó tesztben Ebben a tesztben, két, biotinilezett formában levő monoklonális hepatitis felületi antigén (HBsAg)-specifikus MAK-IgG-t alkalmaztunk (a biotinilezést T.
V. Updyke és mtsa, Methods in Enzymology, 121, (1986), 717-725, szerint végeztük). Ezek egyike, a MAK6E7-IgG az IgGl/K altípus, a másik, a MAKSAlO-IgG az IgG2a/K altípusú. Enzimmel jelzett reagensként MAK5A10-Fab-POD-konjugátumot alkalmaztunk.
Az inkubációs puffer összetétele:
mM foszfát puffer pH = 7,0
0,2 M nátriumtartarát
0,5% (s/t) marha-szérumalbumin
0,1% (s/t) marha-IgG
0,5% (s/t) Pluronic F68
0,01% (s/t) fenol
200 ng/ml MAK6E7-IgG (biotinilezett) ng/ml MAK5A10-IgG (biotinilezett)
200 mE/ml MAK5A10-Fab-POD-konjugátum.
Az alkalmazott zavaró hatást kiküszöbölő fehérjéket az 5. táblázat tartalmazza. A MAK33-IgG-aggregátum nyers elegy előállítása a 2. példa c) pontja szerint történt.
A vizsgálatban egyenként 0,2 ml szérum mintát és 1 ml inkubációs puffért pipettáztunk egy-egy sztreptavidin réteggel bevont polisztirol csövecskébe. Ezután 4 órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. Végül minden csövecskét 3x1,5 ml csapvízzel átmostunk és mindegyikhez 1 ml, az Enzymun CEA tesztcsomagban levő szubsztrát oldatot (ABTS/peroxid) adtunk. További egy órás szobahőmérsékleten való inkubálás után mértük az átalakult szubsztrát oldat extinckióját 405 nm hullámhosszon.
HU 212 322 Β
5. táblázat
MAK33-IgG készítmények zavaró hatást kiküszöbölő aktivitásának az összehasonlítása egy szendvics-immun-teszten biotinilezett MAK-IgG-reagensek alkalmazásával
| Az inkubációs pufferhez adott anyag | pg/ml | Szérum minták extinkciói | ||
| 100. sz.1 | 489. sz.1 | NS2 | ||
| Nincs | 0 | 1,390 | 0,262 | 0,042 |
| MAK33-IgG monomer | 1 | - | - | 0,042 |
| 5 | 1,070 | 0,102 | 0,045 | |
| 10 | 0,884 | 0,068 | 0,048 | |
| 200 | 0,125 | 0,042 | 0,046 | |
| 400 | 0,080 | 0,048 | 0,049 | |
| MAK33-lgG- aggregátum | 0 | 1,044 | 0,378 | 0,047 |
| 1 | 0,125 | 0,034 | 0,043 | |
| (2c), nyers elegy | c5 | 0,043 | 0,045 | 0,048 |
| 10 | 0,048 | 0,035 | 0,054 |
ad 1; A 100-as és a 489-es számú szérum minták egy vérbankból származnak és HBsAg mentesnek voltak deklarálva.
ad 2; Egy egészséges véradó széruma, amely nem tartalmazott sem HBsAg-t, sem zavaró faktort.
Abból az eredményből, hogy a 100-as számú szérum esetében ugyanaz a zavaró hatást kiküszöbölő aktivitás (0,125) 20 gg/ml monomer MAK33-IgG-vel, illetve 1 pg/ml MAK33-IgG-aggregátummal érhető el az következik, hogy ebben a tesztben az IgG-aggregátum 200-szor hatásosabb a zavaró hatás kiküszöbölésében.
73. példa
MAK33-IgG-aggregátum zavaró hatást kiküszöbölő aktivitása szilárd fázisban hordozóhoz kötött reagenst alkalmazó tesztben
A meghatározást teszt-pálcikákkal, egy egylépéses tesztben végeztük kettős antitest szilárd fázisú szendvics eljárás alapelvei szerint, rotor adagoló segítségével centrifugális analizátorral a DE-OS 3425 008.5ben leírt analizátor készülékkel.
7. A reagens oldatok előállítása
a) 7. puffer mmól/liter kálium-foszfát puffer (pH = 6,0), amelyet 50 mmól/liter K2HPO4 oldat és 50 mmólos KH2PO4 oldat olyan mértékű elegyítésével állítunk elő, hogy a pH = 6,0 értékű legyen.
b) II. puffer
AII. puffért az I. pufferhez hasonló módon készítettük azzal az eltéréssel, hogy a pH-t 7,5 értékre állítottuk és a puffer ezen kívül 10 g/liter marhaszérum-albumint és 150 mmól/liter NaCl-t tartalmazott.
c) A TSH-val kötődni képes R\ reagáló anyag oldata
R, reagáló anyagként egy monoklonális egér-antiTSH-antitestet alkalmaztunk. Az ezeket az antitesteket tartalmazó aszcitesz folyadékhoz 1,8 M koncentrációig ammónium-szulfátot adtunk. A csapadékot egy 15 mM nátriumfoszfátot (pH = 7,0) és 50 mM NaCl-t tartalmazó pufferben oldottuk fel. Az így kapott oldatot egy DEAE-cellulóz oszlopon engedtük át. Az így előállított, TSH-t kötni képes antitestet biotinileztük (5 biotin/IgG) és II. pufferrel 1 mg/ml fehérje koncentrációjúra hígítottuk.
d) Enzimmel jelzett R2 reagáló oldat
R2 reagáló anyagként ugyancsak egy monoklonális egér-anti-TSH-antitestet alkalmaztunk, amely azonban az R, reagáló anyagtól eltérő, más antigén determinánst ismer fel. Az ezeket az antitesteket tartalmazó aszcitesz folyadékot az 1/c pontban leírt módon tisztítottuk. A teljes antitestből R. R. Porter [Biochem. 3.73. (1959) 119. old.] szerint Fab-fragmentumot hasítottunk le. A kapott Fab-fragmentumokat Ischikawa és mtsai módszerével β-galaktozidázzal kapcsoltuk össze [J. of Immunassay 4, (1983), 209-326. old.]. Az R2 reagens oldatot II. pufferrel 500 m egység/ml koncentrációra hígítottuk (a mérést o-nitrofenil-béta-galaktoziddal végeztük 37 °C-on).
e) Zavaró hatást kiküszöbölő fehérje
MAK33-IgG-polimert, amelyet a 2. példa szerint állítottuk elő, II. pufferben 1 mg/ml koncentrációban oldottuk.
Jj Avidin oldat
Avidint I. pufferben oldottuk és 50 pg/ml fehérje koncentrációra hígítottuk.
g) Szubsztrát oldat
Klórfenolvörös^-galatozid (előállítása a DE7OS
345 748 szerint) 5 mmól/1 (3,05 g/1)
HEPES 70 mmól/1 (16,7 g/1)
NaCl 154 mmól/1 (9 g/1)
Marha szérumalbumin 0,3% (3 g/1)
Tween 20 0,2% (2 g/1) pH (NaOH-val) 7,25
2. A reagens hordozóanyagok előállítása a) I. reagenshordozó (zavaró fehérje nélkül) μΐ olyan oldatot, amely lOOmM nátrium-foszfátot (pH = 7,3), 2 mM magnézium-kloridot, 9 g nátriumkloridot, 5 g marha-szérumalbumint, 0,5 mg biotinilezett egér anti-TSH monoklonális antitestet (R, reagáló anyag), 1000 E anti-TSH-(egér)-Fab-fragmentum^-galaktozidáz konjugátumot (R2 reagáló anyag), (az aktivitást ortonitrofenil^-O-galaktoziddal határoztuk meg 37 °C-on) tartalmaz, egy kereskedelemben kapható poliészter papírból álló vliesre cseppentettük. Végül szobahőmérsékleten megszárítottuk. Ezt a vliest alkalmazásig 4 °C-on taroltuk 20% relatív nedvesség tartalom mellett.
HU 212 322 Β
b) 1'. reagenshordozó (zavaró fehérjével)
Az előállítás úgy történt, mint az 1. reagenshordozó anyagé, azzal az eltéréssel, hogy ez átitató oldatban literenként még 0,1 g MAK33-IgG-aggregátumot tartalmaz, amelyet a 2. példa c) pontja szerint állítottunk elő (nyers elegy).
c) 2. Reagenshordozó
Egy cellulóz vliesre bróm-ciános aktiválási eljárás szerint (DE-OS 1 768 512) avidint (avidin-oldat) fixáltunk, amikor is a fixáláshoz 10 gg avidint alkalmaztunk szálanyag grammonként. A meg nem kötött antitestet mosással eltávolítottuk és a vliest szobahőmérsékleten óvatosan megszárítottuk. Az így kapott vlies tárolása hasonló körülmények között történt, mint az 1. reagenshordozó esetében.
3. A meghatározás elvégzésének a módja
A meghatározás az 1. és 2. reagens hordozóval, illetve az 1' és 2 reagens hordozóval történt a DE-OS 3 425 008.5-ben leírt berendezéssel az analitikai meghatározásokra előírtak szerint.
Ez a berendezés egy centrifugál-analizátor automata számára szolgáló olyan forgórész elemet tartalmaz, amely egy minta felvivő kamrát tartalmazó formatestből áll, amely több reagenstérrel van összekötve, amelyek mindegyike egy meghatározott reagenssel impregnált szívóképes hordozó anyaggal van megtöltve, és legalább egy keverőszelepes kamrát és egy mérőkamrát tartalmaz, amelyet együttesen képezik a mintafolyadék útját, amely sugarasan belülről kifelé vezet, ha a forgórészen a betét elemet rögzítik és továbbá, legalább még egy további kamra a mérésirányba vezet, és mindezek legalább részben azonosak a mintafolyadék továbbításának útjával.
Ebben az esetben a mintafolyadék továbbítási útja egy minlafelvivő kamrából (P) a szívóképes anyaggal megtöltött, puffer tartalmú kamrán (a), egy másik kamrán (b) és egy, az a és c kamrák között lévő 1. szelepkamrából (1. Ventilkammer = VKL), a 2. szelepkamrába (2. Ventillkammer = VK2) és ebből a d kamrán és egy felfogó kamrán (Affangkammer = AK) keresztül a mérőkamrába (Kammer = K) vezet. A további folyadék befogadására egy szivattyúkamraként kiképezett szubsztrátkamrával (Pumpenkammer = PK) rendelkezik, amely egy adagoló kamrából (Dosierkammer = DK) és egy kapillárisból (Kap) álló adagoló berendezésen és egy túlfolyó kamrán (Überlaufkammer = ÜK) keresztül össze van kötve a 2. szelepkamrával (VK2) (lásd, a 2. ábrát).
Az a extinkció meghatározására (zavaró jelet is tartalmazó mérési jel) az 1. és 2. reagenshordozókat alkalmaztuk, a b extrinkció meghatározására (zavaró jel nélküli specifikus mérésijei) az 1' reagenshordozót és a 2. reagenshordozót alkalmaztuk.
Az 1. reagenshordozót, illetve az 1' reagenshordozót a forgórész behelyezhető elemének c területére és a
2. reagenshordozót a d területre helyeztük. Ennek során 40 μΐ koncentrált mintát a felső perem felnyitásával közvetlenül az a területre pipettáztuk. 270 μΐ szubsztrát oldatot pipettáztunk a PK kamrába. Egy megfelelő centrifugálási programmal, amelynél a nagy fordulatszám és a nyugalmi állapot váltakozik, a berendezés a mintát és a szubsztrát oldatot az elválasztó anyag és a küvetta irányába szállítja.
A program lefutása során az 1. R. és 2. R. reagáló anyagok, amelyek tartalmazzák, illetve nem tartalmazzák a zavaró hatást kiküszöbölő fehérjét, a mintafolyadékon keresztül a c területről eluálhatóak és végül a homogén elegyet reagáltatjuk. A d területen a képződött komplexet 1. R-en keresztül avidinhez kapcsoltuk. A minta átvitele a c területről a d területre igen rövid idő alatt történik.
A szubsztrát oldatot a DK adagoló kamrával adagokra osztottuk, amelyek közül az első a feleslegben levő, komplexbe nem vitt konjugátum kimosását szolgálja. A zavaró faktorokat, amelyek a 2. R-el térhálósíthatják l(^g zavaró hatást kiküszöbölő fehérje/ml teszt oldat mennyiségben való hozzáadásával semlegesítjük és ugyancsak kimossuk (1' reagenshordozó hozzáadása).
A komplex képzésen keresztül rf-re kötött béta-galaktozidáz aktivitás arányos a mintában lévő TSH mennyiséggel, illetve a minta vak-értékével. Ezt az aktivitást egy további szubsztrát adaggal határoztuk meg, amikor is a szubsztrát 5 perces reakcióidő alatt egy színes termékké alakul. A keletkezett színt és a további percenkénti színképződést a folyadék-fázisban a küvettában 576 nm hullámhosszon mértük. Ilyen körülmények között a következő eredményeket kaptuk:
6. táblázat
| Minta | ext. (mE)a | konc. (μΕ/ml) | ext. (mE)b | konc. (μΕ/ml) |
| TSH kalibráló anyag 0 pE/m!c | 451 | 0 | 457 | 0 |
| TSH kalibráló anyag 19,6 pE/mlc | 3331 | 19,6 | 3311 | 19,5 |
| Humán szérum 1 | 669 | 1,5 | 725 | 1,8 |
| Humán szérum 43 zavaró faktorokkal | 6790 | 38 | 662 | 1,5 |
Minden mérést 576 nm hullámhosszon végeztünk
0,3 cm rétegvastagságnál és 1 cm rétegvastagságra átszámoltuk (d = 1).
a) TSH meghatározása 1. reagenshordozó alkalmazásával
b) TSH meghatározás 1'reagenshordozó alkalmazásával, az M-Fab-specifikus zavaró faktorok semlegesítése céljából MAK33-IgG-polimerrel történt.
c) A TSH standardokat a 2. IRP/588-ra kalibrálták.
A 43. számú humán szérum TSH tartalmát egy
Enzymun TSH teszttel (Boehringer Mannheim GmbH) 1,4 μΕ/ml értékűnek mértük. Ez a teszt specifikus reagensként egy MAK-anti-TSH-val és egy poliklonális birka-anti-TSH-Fab-POD-konjugátum réteggel bevont csövet tartalmaz. Az utóbbi inért a 43. sz. humán szérum zavaró faktoraival szemben.
Claims (17)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás egy immunológiailag kötődni képes anyagnak egy állatfajból vagy emberből származó biológiai folyadékban való meghatározására az immunológiailag kötődni képes anyagra specifikus, más állatfajból származó legalább két reagáló anyag és a zavaró faktorok kompenzációját szolgáló inhibitor jelenlétében, azzal jellemezve, hogy inhibitorként a reakcióelegyhez az immunológiailag kötődni képes anyagra nem-specifikus, a másik és/vagy egy harmadik állatfaj monoklonális vagy poliklonális antitestjeiből származtatott aggregátumának 0,1-50 pg/ml mennyiségét adjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunológiailag kötődni képes polivalens antigénre, specifikus reagáló anyagok legalább egyikeként Fab-, illetve F(ab')2-fragmentumot és nem-specifikus aggregátumként aggregált IgG-ket alkalmazunk.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegyet 5-25 pg/ml nem-specifikus IgG-aggregátummal hozzuk össze.
- 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegyet 5-10 gg/ml nem-specifikus IgG-aggregátummal hozzuk össze.
- 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem-specifikus IgG-ből és egy második makromolekulából álló IgG aggregátumot alkalmazunk.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második makromolekulaként egy harmadik állatfaj nem-specifikus IgG-jét vagy nem-specifikus Fc-mentes IgG-fragmentumát vagy fehérjét vagy poliszacharidot vagy más vízben oldódó polimert alkalmazunk.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 320 000 Dalton vagy annál nagyobb molekulatömegű nem-specifikus aggregátumot alkalmazunk.
- 8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hogy 32 000 és 10 millió Dalton közötti molekulatömegű nem-specifikus aggregátumot alkalmazunk.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nem-specifikus aggregátumot hőhatással vagy kémiai vagy nem-kovalens térhálósítással képezzük.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a specifikus reagáló anyagok legalább egyikéhez egy jelző anyag kapcsolt és a másik reagáló anyag egy mátrixhoz fixált vagy biotinilezett és a fixált, és/vagy egy bitoint kötő fehérjével asszociált immunológiailag kötött vagy immunológiailag nem kötött aktivitást határozunk meg és a nem-specifikus IgG-aggregátumokat a reakcióelegyben a vizsgálat során oldatban tartjuk.
- 11. Diagnosztikai szer egy immunológiailag kötődni képes anyag meghatározására állat vagy ember biológiai nedvében, amely szer más állatfajból származó legalább két, az immunológiailag kötődni képes anyagra specifikus reagenst, egy inhibitort a zavaró faktorok kompenzálására, egy megfelelő puffer anyagot, valamint adott esetben további, szokásosan alkalmazott segédanyagot tartalmaz, azzal jellemezve, hogy egy második és/vagy harmadik állatfajból származó, 320 000 Daltonnál nagyobb molekulatömegű monoklonális vagy poliklonális antitestekből származó, az immunológiailag kötődni képes anyagra nem-specifikus 0,150 pg/ml mennyiségű aggregátumot tartalmaz.
- 12. A 11. igénypont szerinti diagnosztikai szer, azzal jellemezve, hogy az immunológiailag kötődni képes anyag egy polivalens antigén, a specifikus reagensek antitestek, amelyek közül legalább egy Fab-, illetve F(ab')2-fragmentum és a nem-specifikus aggregátumok aggregált IgG-k.
- 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti diagnosztikaiszer, azzal jellemezve, hogy a nem-specifikus IgG-aggregátum IgG-ből és egy másik makromolekulából áll.
- 14. A 13. igénypont szerinti diagnosztikai szer, azzal jellemezve, hogy a második makromolekula egy harmadik állatfaj nem-specifikus IgG-je vagy nem-specifikus Fc-mentes IgG-fragmentum, vagy fehérje vagy poliszacharid vagy egy másik vízben oldódó polimer.
- 15. A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti diagnosztikai szer, azzal jellemezve, hogy két vagy több specifikus egér vagy patkány monoklonális antitest reagenst tartalmaz, amelyek közül legalább az egyik reagens egy Fab- vagy F(ab')2-fragmentum és a többi reagens közül legalább az egyik egy Fc-tartalmú IgG és a nem-specifikus homopolimer vagy heteropolimer aggregátum 320 000 Daltonnál nagyobb molekulatömegű nem-specifikus IgG-aggregátumot vagy IgG/Fab-, illetve F(ab')2-fragmentumot tartalmaz, mimellett a nem-specifikus aggregátumban lévő IgG-k és Fab-, illetve F(ab')2-fragmentumok monoklonálisak és olyan fajból és alosztályból származnak, mint a specifikus reagenseknek legalább egyike.
- 16. A 12-15. igénypontok bármelyike szerinti diagnosztikai szer, azzal jellemezve, hogy a nem-specifikus IgG-aggregátum molekulatömege 320 000 és 10 millió Dalton között van.
- 17. A 12-16. igénypontok bármelyike szerinti diagnosztikai szer, azzal jellemezve, hogy a segédanyag reakciót gyorsító hatású szer, detergens és/vagy stabilizátor.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/164,054 US4914040A (en) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | Reagent and method for determination of a polyvalent substance using an immunoaggregate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT50988A HUT50988A (en) | 1990-03-28 |
| HU212322B true HU212322B (en) | 1996-05-28 |
Family
ID=22592781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU891015A HU212322B (en) | 1988-03-03 | 1989-03-02 | Method for preparation of polymer igg derivatives to compensate interfering factors in immunoassays |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4914040A (hu) |
| EP (1) | EP0331068B1 (hu) |
| JP (1) | JPH0823560B2 (hu) |
| AT (1) | ATE82072T1 (hu) |
| AU (1) | AU616484B2 (hu) |
| CA (1) | CA1340572C (hu) |
| DD (1) | DD280396A5 (hu) |
| DE (2) | DE3905505A1 (hu) |
| DK (1) | DK175429B1 (hu) |
| ES (1) | ES2045216T3 (hu) |
| FI (1) | FI92879C (hu) |
| GR (1) | GR3006991T3 (hu) |
| HU (1) | HU212322B (hu) |
| IE (1) | IE62974B1 (hu) |
| LV (1) | LV10538B (hu) |
| PT (1) | PT89889B (hu) |
| RU (1) | RU2032906C1 (hu) |
| ZA (1) | ZA891568B (hu) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3730059A1 (de) * | 1987-09-08 | 1989-03-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin |
| US5141853A (en) * | 1988-07-22 | 1992-08-25 | Abbott Laboratories | Determination of ammonia levels in a sample |
| DE3829245A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| WO1991006559A1 (en) * | 1989-10-24 | 1991-05-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Use of polymerized immunoglobulin to reduce the incidence of false-positive responses in immunoassays |
| US6274325B1 (en) | 1990-06-25 | 2001-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for carrying out a homogeneous-immunoassay based on agglutination |
| DE4020204A1 (de) * | 1990-06-25 | 1992-01-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Durchfuehrung eines homogenen immunoassays nach dem agglutinationsprinzip |
| JPH04350559A (ja) * | 1991-05-28 | 1992-12-04 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 特異抗体の測定法 |
| DE69217957T2 (de) * | 1991-07-26 | 1997-08-07 | Dade Chemistry Systems Inc | Verfahren zur beseitigung von falschen ergebnissen in einem immunoassay |
| US5460944A (en) * | 1991-10-28 | 1995-10-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Storable protein solution |
| DE4202923A1 (de) * | 1992-02-01 | 1993-08-05 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von antigenen oder antikoerpern in gegenwart eines immunkomplexes |
| IL102495A (en) * | 1992-07-14 | 1998-06-15 | Patchornik Avraham | Universal standard reagents, method of preparing same and use thereof |
| IL106887A (en) * | 1993-09-02 | 1997-02-18 | Yissum Res Dev Co | Pharmaceutical and diagnostic compositions and a method for drug targeting |
| GB9403215D0 (en) * | 1994-02-19 | 1994-04-13 | Kodak Ltd | Chemical modification of antibodies and antigens |
| DE4407423A1 (de) * | 1994-03-05 | 1995-09-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Entstörmittel zum Einsatz bei Immunoassays |
| CA2184386C (en) * | 1994-03-05 | 2005-10-18 | Rosemarie Kientsch-Engel | Interference eliminating agent for application in immunoassays |
| DE4439452A1 (de) * | 1994-11-04 | 1996-05-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Antikörperklassenspezifisches Entstörungsreagenz |
| DE19621133A1 (de) * | 1996-05-24 | 1997-11-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Bestimmungsverfahren mit oligomerisierten Rezeptoren |
| DE19731465A1 (de) * | 1997-07-22 | 1999-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von Kontrollflächen zur Detektion von Störproben in einem Nachweisverfahren |
| ATE225511T1 (de) * | 1997-12-11 | 2002-10-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Entstörung von diagnostischen verfahren durch peptide aus d-aminosäuren |
| DE19828466A1 (de) * | 1998-06-26 | 1999-12-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Entstörung von Immunoassays durch Substanzen, die aus den Framework-Regionen von Antikörpern abgeleitet sind |
| US6406858B1 (en) * | 1998-11-27 | 2002-06-18 | Bayer Corporation | System for the reduction of interferences in immunoassays |
| JP2004510161A (ja) * | 2000-09-25 | 2004-04-02 | アボット・ラボラトリーズ | 高分子ポリカチオンを用いることにより、特異的結合アッセイにおける血清または血漿含有アッセイ試料の干渉を減少させるための方法及びキット |
| DE10059720A1 (de) | 2000-11-30 | 2002-06-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Verwendung intramolekular kovalent vernetzter Proteine als Bindepartner in Immunoassays |
| DE10064827A1 (de) | 2000-12-22 | 2002-06-27 | Dade Behring Marburg Gmbh | Nachweisverfahren |
| US20040091952A1 (en) * | 2002-07-25 | 2004-05-13 | Sysmex Corporation | Reagent kit for detecting lupus anticoagulant |
| US20040018556A1 (en) * | 2002-07-29 | 2004-01-29 | Cantor Thomas L. | Reagent and method for determination of a substance using an immunoaggregator |
| DE602004016906D1 (de) * | 2003-03-28 | 2008-11-20 | Sysmex Corp | Reagenz zum Nachweis von anti-Phospholipid Antikörper |
| CN1849514A (zh) * | 2003-07-08 | 2006-10-18 | 因韦尔尼斯医药瑞士股份有限公司 | 颗粒凝集的检测方法和装置 |
| US20050112586A1 (en) * | 2003-11-24 | 2005-05-26 | Roland Janzen | Method and composition for stabilizing liquid reagents |
| DE602005006633D1 (de) * | 2004-02-06 | 2008-06-26 | Sysmex Corp | Reagenziensatz zum Nachweis von Lupus-Antikoagulant. |
| CN1969189B (zh) * | 2004-06-14 | 2012-03-21 | 协和梅迪克斯株式会社 | 非特异性反应被抑制的可溶性白介素-2受体免疫学测定方法和试剂 |
| AU2005303388A1 (en) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | Inverness Medical Switzerland Gmbh | Blood type method system and device |
| US7172906B2 (en) * | 2004-11-16 | 2007-02-06 | Dade Behring Inc. | Reduction of non-specific binding in assays |
| EP2184608B1 (en) * | 2007-08-23 | 2016-10-05 | LSI Medience Corporation | Non-specific reaction inhibitor |
| US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
| WO2019207115A1 (en) * | 2018-04-26 | 2019-10-31 | Statens Serum Institut | Improved immunoassays |
| CN109342743B (zh) * | 2018-12-05 | 2022-02-18 | 菲鹏生物股份有限公司 | 一种能够与类风湿因子高效结合的变性IgG的制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3266967D1 (en) * | 1982-01-05 | 1985-11-21 | Int Inst Cellular Molecul Path | Method of immunoassay |
| DE3206729A1 (de) * | 1982-02-25 | 1983-09-01 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Immunologisches agglutinationsverfahren |
| DE3225027A1 (de) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren |
| US4659678A (en) * | 1982-09-29 | 1987-04-21 | Serono Diagnostics Limited | Immunoassay of antigens |
| US4474892A (en) * | 1983-02-16 | 1984-10-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Two-site immunoassays using monoclonal antibodies of different classes or subclasses and test kits for performing same |
| US4582810A (en) * | 1983-09-30 | 1986-04-15 | Becton, Dickinson And Company | Immuno-agglutination particle suspensions |
| JPS60256057A (ja) * | 1984-06-01 | 1985-12-17 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 免疫学的測定法 |
| JPS6165162A (ja) * | 1984-09-05 | 1986-04-03 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | モノクロ−ナル抗体を用いた免疫学的測定方法における非特異反応吸収剤 |
| JPH0799372B2 (ja) * | 1985-07-13 | 1995-10-25 | 富士レビオ株式会社 | 逆受身凝集反応用非特異反応吸収剤 |
-
1988
- 1988-03-03 US US07/164,054 patent/US4914040A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-02-23 DE DE3905505A patent/DE3905505A1/de not_active Withdrawn
- 1989-02-27 DE DE8989103388T patent/DE58902586D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-27 ES ES89103388T patent/ES2045216T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-27 AT AT89103388T patent/ATE82072T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-02-27 EP EP89103388A patent/EP0331068B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-28 DD DD89326088A patent/DD280396A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-02-28 DK DK198900966A patent/DK175429B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-03-01 ZA ZA891568A patent/ZA891568B/xx unknown
- 1989-03-01 AU AU30908/89A patent/AU616484B2/en not_active Expired
- 1989-03-02 HU HU891015A patent/HU212322B/hu unknown
- 1989-03-02 RU SU894613606A patent/RU2032906C1/ru active
- 1989-03-02 IE IE68389A patent/IE62974B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-03-02 FI FI891012A patent/FI92879C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-03-02 PT PT89889A patent/PT89889B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-03-03 CA CA000592675A patent/CA1340572C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-03 JP JP1050230A patent/JPH0823560B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-02-05 GR GR920402739T patent/GR3006991T3/el unknown
- 1993-06-02 LV LVP-93-465A patent/LV10538B/lv unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI891012A0 (fi) | 1989-03-02 |
| FI92879C (fi) | 1995-01-10 |
| JPH0823560B2 (ja) | 1996-03-06 |
| PT89889A (pt) | 1989-11-10 |
| AU3090889A (en) | 1989-09-07 |
| IE62974B1 (en) | 1995-03-08 |
| IE890683L (en) | 1989-09-03 |
| DE3905505A1 (de) | 1989-09-14 |
| DD280396A5 (de) | 1990-07-04 |
| EP0331068A1 (de) | 1989-09-06 |
| CA1340572C (en) | 1999-06-01 |
| LV10538A (lv) | 1995-02-20 |
| ATE82072T1 (de) | 1992-11-15 |
| RU2032906C1 (ru) | 1995-04-10 |
| DE58902586D1 (de) | 1992-12-10 |
| PT89889B (pt) | 1994-05-31 |
| FI891012A (fi) | 1989-09-04 |
| AU616484B2 (en) | 1991-10-31 |
| ZA891568B (en) | 1989-11-29 |
| DK175429B1 (da) | 2004-10-18 |
| GR3006991T3 (hu) | 1993-06-30 |
| LV10538B (en) | 1995-12-20 |
| HUT50988A (en) | 1990-03-28 |
| FI92879B (fi) | 1994-09-30 |
| DK96689A (da) | 1989-09-04 |
| DK96689D0 (da) | 1989-02-28 |
| EP0331068B1 (de) | 1992-11-04 |
| ES2045216T3 (es) | 1994-01-16 |
| US4914040A (en) | 1990-04-03 |
| JPH01254869A (ja) | 1989-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU212322B (en) | Method for preparation of polymer igg derivatives to compensate interfering factors in immunoassays | |
| US4624930A (en) | Immunochemical process | |
| Kato et al. | Enzyme-linked immunoassay: Conjugation of the Fab′ fragment of rabbit IgG with β-d-galactosidase from E. coli and its use for immunoassay | |
| Self et al. | High-performance assays of small molecules: enhanced sensitivity, rapidity, and convenience demonstrated with a noncompetitive immunometric anti-immune complex assay system for digoxin | |
| JPH07117536B2 (ja) | 体液中の特異的に結合可能の物質の検出方法及びリガンド受容体 | |
| US4621048A (en) | Reagents containing an anti-ligand bound to an anti-enzyme and methods for employing said reagents in an immunoassy | |
| JPH0467914B2 (hu) | ||
| US4929543A (en) | Process for the determination of an antibody in human body fluids | |
| EP0124366B1 (en) | Method of measuring biological ligands | |
| CA1335265C (en) | Solid phase matrices and a process for the production thereof | |
| US4885255A (en) | Immunochemical process and reagent for the determination of a polyvalent antigen in a liquid sample | |
| US5856106A (en) | Determination of antibody production against administered therapeutic glycoproteins, especially monoclonal antibodies | |
| JPH0224559A (ja) | 免疫学的に検出可能な物質の測定法、反応容器及びイムノアツセイ原理による方法における種々のパラメーターの測定法 | |
| US4816390A (en) | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor | |
| Ishikawa et al. | Methods for enzyme-labeling of antigens antibodies and their fragments | |
| US5278081A (en) | Method for the determination of an immunologically bindable substance | |
| JPH0521428B2 (hu) | ||
| JPH09288108A (ja) | 免疫測定に用いる非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法および測定キット | |
| JPH063446B2 (ja) | 不均一系免疫分析用の免疫反応性多孔性担体材料及びその製法 | |
| JPS607362A (ja) | 酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定法 | |
| AU601674B2 (en) | A method for determining a ligand | |
| KR910004228B1 (ko) | 면역집합물을 사용한 다가성분의 측정방법 | |
| JP3000239B2 (ja) | 凝集原理による均一イムノアッセイ実施法 | |
| JP2613107B2 (ja) | 抗体を測定する方法および試薬 | |
| Weiss et al. | Use of rabbit Fab'-peroxidase conjugates prepared by the maleimide method for detecting plant viruses by ELISA |