JP2004510161A - 高分子ポリカチオンを用いることにより、特異的結合アッセイにおける血清または血漿含有アッセイ試料の干渉を減少させるための方法及びキット - Google Patents
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Abstract
特異的結合アッセイ中のアッセイ試料へのポリカチオンの添加により、特異的結合アッセイの血漿又は血清含有アッセイ試料の中の、最適でない血液試料の試料取り扱いによる干渉及び誤差を減少させるための方法及びキットが提供される。
Description
【０００１】
（発明の領域）
本発明は、アッセイ中に比較的高分子のポリカチオンがアッセイ試料に添加される、血漿又は血清試料を用いた特異的結合アッセイを実施するための改良された方法に関する。本発明は、キットの一成分として高分子ポリカチオン含有溶液を含む、血漿又は血清試料用の改良された特異的結合アッセイキットにも関する。
【０００２】
（発明の背景）
ポリカチオンとは、有機又は無機の、合成又は天然の、少なくとも二価の正の電荷を有する化合物である。比較的高分子のポリカチオンの例には、これらに制限されないが、ポリリシン、ポリエチレンイミン及びポリプロピレンイミン並びにポリブレンのようなそれらの低級アルキルアンモニウム塩、並びにＭＥＲＱＵＡＴが含まれる。
【０００３】
ポリリシン、ポリアルギニン、及びポリヒスチジンのようなポリカチオンは、酵素阻害剤として、原形質膜の単離、染色体調製、マイクロカプセル作製、徐放性送達装置における基質として、そして薬物送達装置として使用するため、市販されている。ポリＬ−リジンは、免疫原の合成における担体タンパク質としても使用され、ポリＤ−リジンは、固定化抗原酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）における担体タンパク質として使用されている。ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムのようなポリカチオンは、ポリ（メタクリレート）のようなポリアニオンと合わせて、ＥＬＩＳＡ（Ｙａｚｙｎｉｎａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９ ７１（１６）：３５３８−４３）及び視覚的酵素イムノアッセイ（Ｄｚａｎｔｉｅｖら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９４ ４１（２−３）：２０５−１１）の両方における反応体の担体としても使用されている。
【０００４】
磁性粒子への物質の非特異的結合の開始において使用するための、ポリカチオンを含むポリイオン試薬が、開示されている。例えば、米国特許第４，９３５，１４７号、第５，０７６，９５０号、第５，２７９，９３６号、及び第５，７７０，３８８号は、物質と磁性粒子との非特異的結合を形成させるための化学的手段として使用するための、ポリエチレンイミン及びポリプロピルエチレンイミン並びにポリブレン（Ｎ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）ｎ）のようなそれらの低級アルキルアンモニウム塩のようなポリアルキレンアミン、カルシウムイオン及びバリウムイオンのような金属イオン、アミノデキストラン、プロタミン、正の電荷を有するリポソーム、ポリリシン等を含む例示的なポリカチオン試薬のリストを開示している。
【０００５】
ポリカチオンは、全血試料のイムノアッセイのための分離技術においても有用であることが教示されている。ＷＯ９９３６７８１は、血清又は血漿をクロマトグラフィーカラムを通過させる前に、血清又は血漿に由来する試料の中の赤血球を分離するクロマトグラフィーアッセイ装置を開示している。この装置において使用される赤血球分離剤は、好ましくは、ポリＬ−リジン臭化水素酸塩、ポリＬ−アルギニン塩酸塩、ポリＬ−ヒスチジン、ポリ（リジン・アラニン）３：１臭化水素酸塩、ポリ（リジン・アルギニン）２：１臭化水素酸塩、ポリ（リジン・アラニン）１：１臭化水素酸塩、ポリ（リジン・トリプトファン）１：４臭化水素酸塩、又は具体的にはポリ（ジアリールジメチルアンモニウムクロリド）を含むポリカチオンである。しかしながら、ポリカチオンのような分離剤のアッセイ系への直接的な添加は、しばしば赤血球以外の試薬及び結合メンバーも凝集させることにより、系に干渉することが教示されている。
【０００６】
従って、本発明の目的は、特異的結合アッセイの血漿又は血清含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させるための方法を提供することである。その方法は、特異的結合アッセイ中に、血漿又は血清含有アッセイ試料に高分子ポリカチオンを添加することを含む。
【０００７】
本発明のもう一つの目的は、キットの一成分として高分子ポリカチオン含有溶液を含む、血漿及び血清含有アッセイ試料用の改良された特異的結合アッセイキットを提供することである。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、特異的結合アッセイ中に血清又は血漿含有アッセイ試料に有効量の高分子ポリカチオンを添加することを含む、特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させる方法を提供する。好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、３，０００ダルトン以上の分子量を有している。もう一つの好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである。より好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、５，２００から１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンを含む。もう一つのより好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンを含む。もう一つの好ましい実施形態において、特異的結合アッセイは、常磁性微粒子のような固相の上で実施される。他の実施形態において、特異的結合アッセイは、甲状腺刺激ホルモン、遊離型前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、アルファ胎児タンパク、Ｂ型肝炎コア抗体、Ｂ型肝炎表面抗体、又はヒト免疫不全ウイルスを測定するものである。
【０００９】
本発明は、甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイ中に血清又は血漿含有アッセイ試料に高分子ポリカチオンを添加することを含む、甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させるための方法も提供する。好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、３，０００ダルトン以上の分子量を有している。もう一つの好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである。より好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、５，２００から１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンを含む。もう一つのより好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンを含む。もう一つの好ましい実施形態において、特異的結合アッセイは、常磁性微粒子のような固相の上で実施される。最も好ましい実施形態において、甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイは、
ａ）試料中に存在する甲状腺刺激ホルモンが、抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた常磁性微粒子及び高分子ポリカチオンを含むアッセイ希釈剤と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を抗αＴＳＨ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；並びに
（ｄ）相対発光量として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の甲状腺刺激ホルモンの量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む。
【００１０】
本発明は、遊離型前立腺特異抗原又は総前立腺特異抗原の特異的結合アッセイ中に血清又は血漿含有アッセイ試料に高分子ポリカチオンを添加することを含む、遊離型前立腺特異抗原又は総前立腺特異抗原の特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させる方法も提供する。好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、ポリリシン又はポリオルニチンである。もう一つの好ましい実施形態において、遊離型前立腺特異抗原（ＰＳＡ）特異的結合アッセイは、
（ａ）試料中に存在する遊離型ＰＳＡが、抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、遊離型ＰＳＡに特異的な抗体でコーティングされた常磁性微粒子と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を、抗ＰＳＡ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；及び
（ｄ）相対発光量として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の前立腺特異抗原の量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む。
もう一つの好ましい実施形態において、総ＰＳＡ特異的結合アッセイは、
（ａ）試料中に存在するＰＳＡが、抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、遊離型ＰＳＡ及び結合型ＰＳＡの両方と結合する抗体でコーティングされた常磁性微粒子と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を、抗ＰＳＡ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；並びに
（ｄ）相対発光量として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の前立腺特異抗原の量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む。
【００１１】
本発明は、高分子ポリカチオン含有溶液を含む、血漿及び血清試料用の改良された特異的結合アッセイキットも提供する。好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、３，０００ダルトン以上の分子量を有している。もう一つの好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである。より好ましい実施形態において、改良された特異的結合アッセイキットは、甲状腺刺激ホルモン、遊離型前立腺特異抗原、アルファ胎児タンパク、Ｂ型肝炎コア抗体、Ｂ型肝炎表面抗体、又はヒト免疫不全ウイルスを測定する特異的結合アッセイを含む。
【００１２】
本発明は、
（ａ）マウスモノクローナル抗βＴＳＨでコーティングされた微粒子と；
（ｂ）マウスモノクローナル抗αＴＳＨアクリジニウム標識コンジュゲートと；
（ｃ）高分子ポリカチオンを含む修飾されたＴＳＨアッセイ希釈剤とを含む、甲状腺刺激ホルモンの検出用の改良されたキットも提供する。
【００１３】
本発明は、
（ａ）高分子ポリカチオンを含む希釈剤の中に存在する、遊離型ＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体を含む微粒子と；
（ｂ）マウスモノクローナル抗ＰＳＡアクリジニウム標識コンジュゲートとを含む、遊離型前立腺特異抗原の検出用の改良されたキットも提供する。好ましくは、高分子ポリカチオンは、ポリリシン又はポリオルニチンである。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
これらに限定はされないが、不適切な遠心分離、不完全な凝固時間、及び熱ストレスの曝露を含む、最適でない血清又は血漿試料の調製技術は、特異的結合アッセイにおける不正確な読み取りをもたらす血漿又は血清含有アッセイ試料中の干渉を引き起こすことが見い出されている。特異的結合アッセイ中の血漿又は血清含有アッセイ試料への高分子ポリカチオンの添加は、正確な読み取りが得られるよう、これらの干渉を減少させるか、又は排除することが、本発明において見出された。
【００１５】
本発明の目的のため、「高分子」ポリカチオンとは、およそ３，０００ダルトン以上の分子量を有するポリカチオンを意味する。本発明において有用な高分子ポリカチオンの例には、これらに限定はされないが、５，２００から１１，２００の範囲の分子量を有するポリリシン、５３００の分子量を有するポリオルニチン、およそ４，０００から６，０００ダルトンの範囲の分子量を有するポリブレン、及びおよそ４，０００，０００ダルトンの分子量を有するＭＥＲＱＵＡＴが含まれる。ポリカチオンは、別個の試薬としてイムノアッセイ中に添加されうる。または、ポリカチオンは、アッセイ特異的希釈剤に組み込まれうる。
【００１６】
アッセイにおいて使用されるポリカチオンの量は、型及びその分子量に依存して変動しうる。しかしながら、一般に、使用される量は、（感度、特異性等のような）他のアッセイパラメーターに有害な影響を与えることなく、所望の結果、即ち干渉の排除を達成するために有効な量である。例えば、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、及びポリヒスチジンのようなポリカチオンは、約０．００５から約１重量／容量（ｗｔ／ｖｏｌ）％の範囲の最終濃度で使用されうる。より好ましくは、約０．０１から約０．５ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲のポリリシンが使用される。さらに好ましくは、約０．１から約０．５ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲のポリリシンが使用される。８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンの場合、約０．２５％の濃度が好ましい。ポリブレンの場合、約０．２から１ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲の濃度が好ましい。ＭＥＲＱＵＡＴの場合、約０．１５から約０．３０％の範囲の濃度が好ましい。
【００１７】
より高濃度のポリカチオンも、試料中の干渉を減少させるために有効であるかもしれないが、いくつかのポリカチオンの添加に起因するより高い粘性は、特にハイスループット自動特異的結合アッセイ系において、キャリーオーバーを引き起こしうると考えられる。しかしながら、当業者であれば、特定のアッセイに適した適切な濃度を容易に決定することができよう。
【００１８】
本発明のポリカチオンは、これらに限定はされないが、サンドイッチ型及び競合型のイムノアッセイを含む、血清又は血漿試料中の（抗原又は抗体のような）分析物の存在を試験する任意の型の特異的結合アッセイにおいて使用されうる。そのようなイムノアッセイは、ポリクローナル又はモノクローナルの抗体、（Ｆａｂ’２断片のような）該抗体の断片、又はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗体断片の組み合わせを含む試薬を利用しうる。典型的には、そのようなアッセイにおいては、（標識された抗原又は抗体のような）標識された試薬が、目的の分析物の検出及び／又は定量のため使用される。そのような標識には、これらに限定はされないが、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、及び放射標識が含まれる。全ての型のイムノアッセイを作製し、使用する様式、並びにそのようなアッセイにおいて使用される試薬及び／又は標識された試薬は、当業者に周知である。
【００１９】
本発明の一つの実施形態は、血清又は血漿試料中のＴＳＨを測定するための改良された特異的結合アッセイに関する。好ましい実施形態において、ＴＳＨ特異的結合アッセイは、アッセイ中に、即ち試料の固相とのインキュベーションの前又は途中に、およそ３，０００ダルトン以上の分子量を有する高分子ポリカチオンがアッセイ試料に添加される、修飾されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＴＳＨアッセイフォーマット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００３５−６０５０）を含む。この実施形態において、ポリカチオンは、５，２００〜１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンであることが好ましく、およそ８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンが好ましい。血漿又は血清試料及びＴＳＨ抗体と組み合わされるＴＳＨアッセイ希釈剤にポリカチオンが組み込まれることも、好ましい。ＴＳＨアッセイにおけるポリリシンの好ましい濃度範囲は、約０．１から約１ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲であり、０．２５ｗｔ／ｖｏｌ％が最も好ましい。
【００２０】
本発明のもう一つの実施形態は、この修飾されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＴＳＨアッセイを実施するための改良されたキットに関する。本発明のキットは、緩衝液、好ましくはＴＲＩＳ緩衝液、さらに好ましくはタンパク質（ウシ）安定化剤及び保存剤としての抗微生物剤を含むものの中に存在する、抗βＴＳＨ（マウスモノクローナル）でコーティングされた微粒子、好ましくはタンパク質（ウシ）安定化剤及び保存剤としての抗微生物剤を含むＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液の中に存在する、抗αＴＳＨモノクローナル抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲート、並びにポリカチオン、好ましくは５，２００から１１，２００ダルトンの分子量範囲のポリリシンを約０．１から約０．５ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲の濃度で含有している緩衝液、好ましくはＴＲＩＳを含む、修飾されたＴＳＨアッセイ希釈剤を、少なくとも含む。この希釈剤は、保存剤として抗微生物剤を含んでいることが好ましい。または、ポリカチオンは、ＴＳＨアッセイ希釈剤と共にアッセイ試料へ添加するための、別個のキット成分として提供されてもよい。本発明のこの実施形態のキットは、保存剤として抗微生物剤を含むリン酸緩衝生理食塩溶液を含有しているマルチアッセイマニュアルディリューエント（Ｍｕｌｔｉ−Ａｓｓａｙ Ｍａｎｕａｌ Ｄｉｌｕｅｎｔ）；１．３２％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含有しているプレトリガー（Ｐｒｅ−Ｔｒｉｇｇｅｒ）溶液；０．３５Ｎ水酸化ナトリウムを含有しているトリガー（Ｔｒｉｇｇｅｒ）溶液；並びにリン酸緩衝生理食塩溶液及び抗微生物剤保存剤を含有している洗浄緩衝液を含みうる。
【００２１】
本発明の第二の好ましい実施形態は、血清又は血漿試料中の遊離型前立腺特異抗原（ＰＳＡ）又は総ＰＳＡの測定のための、改良された特異的結合アッセイに関する。最も好ましい実施形態において、ＰＳＡ特異的結合アッセイは、アッセイ試料と共に、即ち試料の固相とのインキュベーションの前又は途中に、およそ３，０００ダルトン以上の分子量を有する高分子ポリカチオンがアッセイに添加される、修飾されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ総ＰＳＡ又は遊離型ＰＳＡアッセイフォーマット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００３５−６０５０）を含む。
【００２２】
この実施形態において、ポリカチオンは、５，２００から１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンであることが好ましい。血漿又は血清試料と組み合わされる、抗ＰＳＡでコーティングされた微粒子の希釈剤（以後、「微粒子希釈剤」）に、ポリカチオンが組み込まれることも、好ましい。総ＰＳＡアッセイにおけるポリリシンの好ましい濃度範囲は、約０．００５から約１ｗｔ／ｖｏｌ％であり、０．００５ｗｔ／ｖｏｌ％が最も好ましい。遊離型ＰＳＡアッセイにおけるポリリシンの好ましい濃度範囲は、約０．０１から約１ｗｔ／ｖｏｌ％であり、０．０１ｗｔ／ｖｏｌ％が最も好ましい。
【００２３】
本発明のもう一つの実施形態は、修飾されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ総前立腺特異抗原（ＰＳＡ）又は遊離型ＰＳＡアッセイを実施するための、改良されたキットに関する。本発明のキットは、ポリカチオンも含有している希釈剤の中に存在する、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（遊離型ＰＳＡアッセイの場合には遊離型ＰＳＡに特異的なもの、総ＰＳＡアッセイの場合には、遊離型ＰＳＡ及び結合型ＰＳＡの両方と結合するもの）でコーティングされた微粒子を含む。キットは、抗ＰＳＡモノクローナル抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートも含む。好ましくは、ポリカチオンは、約０．００５から０．５ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲の濃度の、約５，２００から約１１，２００ダルトンの分子量範囲のポリリシンである。微粒子希釈剤の緩衝液は、好ましくはＴＲＩＳ緩衝液であり、さらに好ましくは、タンパク質（ウシ）安定化剤及び保存剤としての抗微生物剤を含有している。アクリジニウム標識コンジュゲートは、好ましくは、タンパク質（ウシ）安定化剤及び保存剤としての抗微生物剤を含有しているＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液の中に存在する。又は、ポリカチオンは、ＰＳＡ微粒子希釈剤と共にアッセイ試料へ添加するための別個のキット成分として提供されてもよい。本発明のこの実施形態のキットは、１．３２％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含有しているプレトリガー溶液、０．３５Ｎ水酸化ナトリウムを含有しているトリガー溶液、並びにリン酸緩衝生理食塩溶液及び抗微生物剤保存剤を含有している洗浄緩衝液も含みうる。
【００２４】
最適に取り扱われなかった血漿及び血清試料の再遠心分離は、アルファ胎児タンパク（ＡＦＰ）、Ｂ型肝炎コア抗体（ＨＢｃＡｂ）、Ｂ型肝炎表面抗体（ＨＢｓＡｂ）、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の特異的結合アッセイにおいても、干渉を減少させ、試料測定の感度及び精度を回復させるために有効であることが証明された。従って、これらの分析物の特異的結合アッセイの実施中の、血漿又は血清含有アッセイ試料への高分子ポリカチオンの添加も、最適でない試料調製による干渉を減少させるために有用であろうと考えられる。
【００２５】
以下の非制限的な実施例は、本発明をさらに例示するために提供される。
【００２６】
実施例
実施例１：汚染された血漿又は血清試料の調製
１人の有志者より、ＳＳＴヴァキュテイナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）チューブとも呼ばれる４本の血清分離チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｕｍｂｅｒ３６６５１０）及び６本のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ヴァキュテイナーチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｕｍｂｅｒ３６６４５７）へと血液を採取した。血液を３０分間凝固させ、次いで、３，５００ＲＰＭで１０分間、遠心分離機でスピンした。４本のＳＳＴチューブより血清を回収した。６本のＥＤＴＡチューブより血清を回収した。次いで、血漿の一部を、ＥＤＴＡチューブからのバフィーコート（赤血球を含む）６０マイクロリットルの添加によって汚染した。
【００２７】
実施例２：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＴＳＨアッセイにおけるポリカチオンの効果 ａ．一般的な手順：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＴＳＨアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００３５−６０５０）は、ＣＨＥＭＩＦＬＥＸと呼ばれる、フレキシブルなアッセイプロトコルを有する化学発光微粒子イムノアッセイ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐａｔｉｃｌｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＣＭＩＡ）技術を使用して、ヒトの血清及び血漿の中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の存在を決定する二段階イムノアッセイである。第一段階において、血清又は血漿試料と、抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた常磁性微粒子と、ＴＳＨアッセイディリューエント（Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）とが組み合わせられる（ＴＳＨアッセイディリューエントは、０．５Ｍ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、１．５Ｍ ＴＲＩＳ塩基、１．３Ｍ ＮａＣｌ、０．２％の抗微生物剤ＮＩＰＡＳＥＰＴ（Ｎｉｐａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）及び抗微生物剤Ａ５６６２０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）をｐＨ８．８で含有している）。試料中に存在するＴＳＨは、抗ＴＳＨ抗体でコーティングされた微粒子と結合する。洗浄後、第二段階として、抗αＴＳＨアクリジニウム標識コンジュゲートが添加される。次いで、それぞれ過酸化水素及び水酸化ナトリウムを含むプレトリガー溶液及びトリガー溶液と呼ばれる２つの溶液が、反応混合物に添加され、得られた化学発光反応が相対発光量（ＲＬＵ）として測定される。血漿又は血清試料中のＴＳＨの量と、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ／光学系によって検出されるＲＬＵとの間には直接的な関係が存在する。
【００２８】
ｂ．実験の設計：アッセイの感度に干渉する赤血球で故意に血清及び血漿試料を汚染する実験を設計した（実施例１を参照）。次いで、別々の実験において、ＴＳＨアッセイの第一段階において、ポリカチオン、即ちポリリシン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴをＴＳＨアッセイディリューエントに添加し、血清又は血漿試料（１５０μＬ）及び抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた常磁性微粒子（０．１％固体５０μＬ）と組み合わせた。次いで、前記の一般的な手順に記載されたようにして、アッセイを完了した。
【００２９】
ｃ．結果：表１が示すように、５，２００、８，８００、及び１１，２００の平均分子量を有するポリリシンは、０．２５％の濃度で、汚染された試料の中の干渉を排除するのに有効であることが見出された。
【００３０】
【表１】
【００３１】
４，０００から６，０００ダルトンの分子量を有するポリブレンを、様々な濃度で、調査した。０．２から１ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲の濃度のポリブレンは、ＴＳＨアッセイの機能的感度の干渉又は改変を示すことなく、汚染された血漿又は血清試料のアッセイ感度を回復させるのに有効であることが見出された。
約４，０００，０００ダルトンの分子量を有するポリカチオンＭＥＲＱＵＡＴ−１００も、ＴＳＨアッセイディリューエント中０．１５％又は０．３０％のいずれかの濃度で、アッセイの全体的な機能に干渉することなく、汚染された試料のアッセイ感度を回復させた。
【００３２】
実施例３：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ遊離型ＰＳＡアッセイにおけるポリカチオンの効果
アッセイ試料へのポリカチオンの添加は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ遊離型前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイにおいても、最適でない血漿又は血清試料の取り扱いに起因する干渉を減少させるのに有効であることが証明された。
【００３３】
ａ．一般的な手順：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ遊離型ＰＳＡアッセイは、化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）技術を使用して、ヒト血清中の遊離型ＰＳＡの存在を決定する二段階イムノアッセイである。第一段階において、被検試料と、遊離型ＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされた常磁性微粒子とが組み合わせられる。試料中に存在する遊離型ＰＳＡは、抗遊離型ＰＳＡでコーティングされた微粒子と結合する。洗浄後、第二段階として、抗ＰＳＡアクリジニウム標識コンジュゲートが添加される。次いで、プレトリガー溶液及びトリガー溶液が反応混合物に添加され；得られた化学発光反応がＲＬＵとして測定される。試料中の遊離型ＰＳＡの量と、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ／光学系によって検出されるＲＬＵとの間には、直接的な関係が存在する。ＴＳＨアッセイと同様に、血清試料の最適でない調製は、蛍光の測定の干渉をもたらし、結果的に試料中の遊離型ＰＳＡのレベルの不正確な読み取りをもたらす。
【００３４】
ｂ．実験の設計：これらの実験においては、微粒子希釈剤中のデキストラン硫酸を、ポリカチオン、特にポリアミノ酸へと置換した。次いで、前記の一般的な手順に記載されているようにして、アッセイを実施した。
ｃ．結果：表２に示されるように、ポリリシン（５，２００〜１１，２００ダルトンの範囲）及びポリオルニチン（５，３００ダルトン）の両方が、０．０２５％の濃度で、遊離型ＰＳＡアッセイの高い機能的感度の干渉又は改変を示すことなく、粗雑な試料調製によって引き起こされる遊離型ＰＳＡ測定における干渉を減少させるのに有効であった。
【００３５】
【表２】
【００３６】
実施例４：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ総ＰＳＡアッセイにおけるポリカチオンの効果 ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ総ＰＳＡアッセイの一般的な手順は、遊離型ＰＳＡ及び結合型ＰＳＡの両方と結合する抗体で常磁性微粒子をコーティングすることを除き、前記実施例３の遊離型ＰＳＡアッセイの場合と本質的に同様である。デキストラン硫酸（０．０５％の濃度）、又は０．００５％の濃度の平均分子量５２００もしくは１１，２００のポリＬ−リジン（デキストラン硫酸の代わり）を含有している微粒子希釈剤を利用した総ＰＳＡアッセイに、未スピン試料を供する実験を実施した。表３に示されている結果は、異なる平均分子量のポリＬ−リジンが、総ＰＳＡアッセイの高い機能的感度の干渉又は改変を示すことなく、未スピン試料における総ＰＳＡ測定の干渉を減少させるのに有効であることを証明している。
【００３７】
【表３】
（発明の領域）
本発明は、アッセイ中に比較的高分子のポリカチオンがアッセイ試料に添加される、血漿又は血清試料を用いた特異的結合アッセイを実施するための改良された方法に関する。本発明は、キットの一成分として高分子ポリカチオン含有溶液を含む、血漿又は血清試料用の改良された特異的結合アッセイキットにも関する。
【０００２】
（発明の背景）
ポリカチオンとは、有機又は無機の、合成又は天然の、少なくとも二価の正の電荷を有する化合物である。比較的高分子のポリカチオンの例には、これらに制限されないが、ポリリシン、ポリエチレンイミン及びポリプロピレンイミン並びにポリブレンのようなそれらの低級アルキルアンモニウム塩、並びにＭＥＲＱＵＡＴが含まれる。
【０００３】
ポリリシン、ポリアルギニン、及びポリヒスチジンのようなポリカチオンは、酵素阻害剤として、原形質膜の単離、染色体調製、マイクロカプセル作製、徐放性送達装置における基質として、そして薬物送達装置として使用するため、市販されている。ポリＬ−リジンは、免疫原の合成における担体タンパク質としても使用され、ポリＤ−リジンは、固定化抗原酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）における担体タンパク質として使用されている。ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムのようなポリカチオンは、ポリ（メタクリレート）のようなポリアニオンと合わせて、ＥＬＩＳＡ（Ｙａｚｙｎｉｎａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９ ７１（１６）：３５３８−４３）及び視覚的酵素イムノアッセイ（Ｄｚａｎｔｉｅｖら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９４ ４１（２−３）：２０５−１１）の両方における反応体の担体としても使用されている。
【０００４】
磁性粒子への物質の非特異的結合の開始において使用するための、ポリカチオンを含むポリイオン試薬が、開示されている。例えば、米国特許第４，９３５，１４７号、第５，０７６，９５０号、第５，２７９，９３６号、及び第５，７７０，３８８号は、物質と磁性粒子との非特異的結合を形成させるための化学的手段として使用するための、ポリエチレンイミン及びポリプロピルエチレンイミン並びにポリブレン（Ｎ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）ｎ）のようなそれらの低級アルキルアンモニウム塩のようなポリアルキレンアミン、カルシウムイオン及びバリウムイオンのような金属イオン、アミノデキストラン、プロタミン、正の電荷を有するリポソーム、ポリリシン等を含む例示的なポリカチオン試薬のリストを開示している。
【０００５】
ポリカチオンは、全血試料のイムノアッセイのための分離技術においても有用であることが教示されている。ＷＯ９９３６７８１は、血清又は血漿をクロマトグラフィーカラムを通過させる前に、血清又は血漿に由来する試料の中の赤血球を分離するクロマトグラフィーアッセイ装置を開示している。この装置において使用される赤血球分離剤は、好ましくは、ポリＬ−リジン臭化水素酸塩、ポリＬ−アルギニン塩酸塩、ポリＬ−ヒスチジン、ポリ（リジン・アラニン）３：１臭化水素酸塩、ポリ（リジン・アルギニン）２：１臭化水素酸塩、ポリ（リジン・アラニン）１：１臭化水素酸塩、ポリ（リジン・トリプトファン）１：４臭化水素酸塩、又は具体的にはポリ（ジアリールジメチルアンモニウムクロリド）を含むポリカチオンである。しかしながら、ポリカチオンのような分離剤のアッセイ系への直接的な添加は、しばしば赤血球以外の試薬及び結合メンバーも凝集させることにより、系に干渉することが教示されている。
【０００６】
従って、本発明の目的は、特異的結合アッセイの血漿又は血清含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させるための方法を提供することである。その方法は、特異的結合アッセイ中に、血漿又は血清含有アッセイ試料に高分子ポリカチオンを添加することを含む。
【０００７】
本発明のもう一つの目的は、キットの一成分として高分子ポリカチオン含有溶液を含む、血漿及び血清含有アッセイ試料用の改良された特異的結合アッセイキットを提供することである。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、特異的結合アッセイ中に血清又は血漿含有アッセイ試料に有効量の高分子ポリカチオンを添加することを含む、特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させる方法を提供する。好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、３，０００ダルトン以上の分子量を有している。もう一つの好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである。より好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、５，２００から１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンを含む。もう一つのより好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンを含む。もう一つの好ましい実施形態において、特異的結合アッセイは、常磁性微粒子のような固相の上で実施される。他の実施形態において、特異的結合アッセイは、甲状腺刺激ホルモン、遊離型前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、アルファ胎児タンパク、Ｂ型肝炎コア抗体、Ｂ型肝炎表面抗体、又はヒト免疫不全ウイルスを測定するものである。
【０００９】
本発明は、甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイ中に血清又は血漿含有アッセイ試料に高分子ポリカチオンを添加することを含む、甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させるための方法も提供する。好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、３，０００ダルトン以上の分子量を有している。もう一つの好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである。より好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、５，２００から１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンを含む。もう一つのより好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンを含む。もう一つの好ましい実施形態において、特異的結合アッセイは、常磁性微粒子のような固相の上で実施される。最も好ましい実施形態において、甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイは、
ａ）試料中に存在する甲状腺刺激ホルモンが、抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた常磁性微粒子及び高分子ポリカチオンを含むアッセイ希釈剤と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を抗αＴＳＨ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；並びに
（ｄ）相対発光量として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の甲状腺刺激ホルモンの量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む。
【００１０】
本発明は、遊離型前立腺特異抗原又は総前立腺特異抗原の特異的結合アッセイ中に血清又は血漿含有アッセイ試料に高分子ポリカチオンを添加することを含む、遊離型前立腺特異抗原又は総前立腺特異抗原の特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させる方法も提供する。好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、ポリリシン又はポリオルニチンである。もう一つの好ましい実施形態において、遊離型前立腺特異抗原（ＰＳＡ）特異的結合アッセイは、
（ａ）試料中に存在する遊離型ＰＳＡが、抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、遊離型ＰＳＡに特異的な抗体でコーティングされた常磁性微粒子と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を、抗ＰＳＡ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；及び
（ｄ）相対発光量として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の前立腺特異抗原の量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む。
もう一つの好ましい実施形態において、総ＰＳＡ特異的結合アッセイは、
（ａ）試料中に存在するＰＳＡが、抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、遊離型ＰＳＡ及び結合型ＰＳＡの両方と結合する抗体でコーティングされた常磁性微粒子と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を、抗ＰＳＡ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；並びに
（ｄ）相対発光量として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の前立腺特異抗原の量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む。
【００１１】
本発明は、高分子ポリカチオン含有溶液を含む、血漿及び血清試料用の改良された特異的結合アッセイキットも提供する。好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、３，０００ダルトン以上の分子量を有している。もう一つの好ましい実施形態において、高分子ポリカチオンは、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである。より好ましい実施形態において、改良された特異的結合アッセイキットは、甲状腺刺激ホルモン、遊離型前立腺特異抗原、アルファ胎児タンパク、Ｂ型肝炎コア抗体、Ｂ型肝炎表面抗体、又はヒト免疫不全ウイルスを測定する特異的結合アッセイを含む。
【００１２】
本発明は、
（ａ）マウスモノクローナル抗βＴＳＨでコーティングされた微粒子と；
（ｂ）マウスモノクローナル抗αＴＳＨアクリジニウム標識コンジュゲートと；
（ｃ）高分子ポリカチオンを含む修飾されたＴＳＨアッセイ希釈剤とを含む、甲状腺刺激ホルモンの検出用の改良されたキットも提供する。
【００１３】
本発明は、
（ａ）高分子ポリカチオンを含む希釈剤の中に存在する、遊離型ＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体を含む微粒子と；
（ｂ）マウスモノクローナル抗ＰＳＡアクリジニウム標識コンジュゲートとを含む、遊離型前立腺特異抗原の検出用の改良されたキットも提供する。好ましくは、高分子ポリカチオンは、ポリリシン又はポリオルニチンである。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
これらに限定はされないが、不適切な遠心分離、不完全な凝固時間、及び熱ストレスの曝露を含む、最適でない血清又は血漿試料の調製技術は、特異的結合アッセイにおける不正確な読み取りをもたらす血漿又は血清含有アッセイ試料中の干渉を引き起こすことが見い出されている。特異的結合アッセイ中の血漿又は血清含有アッセイ試料への高分子ポリカチオンの添加は、正確な読み取りが得られるよう、これらの干渉を減少させるか、又は排除することが、本発明において見出された。
【００１５】
本発明の目的のため、「高分子」ポリカチオンとは、およそ３，０００ダルトン以上の分子量を有するポリカチオンを意味する。本発明において有用な高分子ポリカチオンの例には、これらに限定はされないが、５，２００から１１，２００の範囲の分子量を有するポリリシン、５３００の分子量を有するポリオルニチン、およそ４，０００から６，０００ダルトンの範囲の分子量を有するポリブレン、及びおよそ４，０００，０００ダルトンの分子量を有するＭＥＲＱＵＡＴが含まれる。ポリカチオンは、別個の試薬としてイムノアッセイ中に添加されうる。または、ポリカチオンは、アッセイ特異的希釈剤に組み込まれうる。
【００１６】
アッセイにおいて使用されるポリカチオンの量は、型及びその分子量に依存して変動しうる。しかしながら、一般に、使用される量は、（感度、特異性等のような）他のアッセイパラメーターに有害な影響を与えることなく、所望の結果、即ち干渉の排除を達成するために有効な量である。例えば、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、及びポリヒスチジンのようなポリカチオンは、約０．００５から約１重量／容量（ｗｔ／ｖｏｌ）％の範囲の最終濃度で使用されうる。より好ましくは、約０．０１から約０．５ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲のポリリシンが使用される。さらに好ましくは、約０．１から約０．５ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲のポリリシンが使用される。８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンの場合、約０．２５％の濃度が好ましい。ポリブレンの場合、約０．２から１ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲の濃度が好ましい。ＭＥＲＱＵＡＴの場合、約０．１５から約０．３０％の範囲の濃度が好ましい。
【００１７】
より高濃度のポリカチオンも、試料中の干渉を減少させるために有効であるかもしれないが、いくつかのポリカチオンの添加に起因するより高い粘性は、特にハイスループット自動特異的結合アッセイ系において、キャリーオーバーを引き起こしうると考えられる。しかしながら、当業者であれば、特定のアッセイに適した適切な濃度を容易に決定することができよう。
【００１８】
本発明のポリカチオンは、これらに限定はされないが、サンドイッチ型及び競合型のイムノアッセイを含む、血清又は血漿試料中の（抗原又は抗体のような）分析物の存在を試験する任意の型の特異的結合アッセイにおいて使用されうる。そのようなイムノアッセイは、ポリクローナル又はモノクローナルの抗体、（Ｆａｂ’２断片のような）該抗体の断片、又はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗体断片の組み合わせを含む試薬を利用しうる。典型的には、そのようなアッセイにおいては、（標識された抗原又は抗体のような）標識された試薬が、目的の分析物の検出及び／又は定量のため使用される。そのような標識には、これらに限定はされないが、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、及び放射標識が含まれる。全ての型のイムノアッセイを作製し、使用する様式、並びにそのようなアッセイにおいて使用される試薬及び／又は標識された試薬は、当業者に周知である。
【００１９】
本発明の一つの実施形態は、血清又は血漿試料中のＴＳＨを測定するための改良された特異的結合アッセイに関する。好ましい実施形態において、ＴＳＨ特異的結合アッセイは、アッセイ中に、即ち試料の固相とのインキュベーションの前又は途中に、およそ３，０００ダルトン以上の分子量を有する高分子ポリカチオンがアッセイ試料に添加される、修飾されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＴＳＨアッセイフォーマット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００３５−６０５０）を含む。この実施形態において、ポリカチオンは、５，２００〜１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンであることが好ましく、およそ８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンが好ましい。血漿又は血清試料及びＴＳＨ抗体と組み合わされるＴＳＨアッセイ希釈剤にポリカチオンが組み込まれることも、好ましい。ＴＳＨアッセイにおけるポリリシンの好ましい濃度範囲は、約０．１から約１ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲であり、０．２５ｗｔ／ｖｏｌ％が最も好ましい。
【００２０】
本発明のもう一つの実施形態は、この修飾されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＴＳＨアッセイを実施するための改良されたキットに関する。本発明のキットは、緩衝液、好ましくはＴＲＩＳ緩衝液、さらに好ましくはタンパク質（ウシ）安定化剤及び保存剤としての抗微生物剤を含むものの中に存在する、抗βＴＳＨ（マウスモノクローナル）でコーティングされた微粒子、好ましくはタンパク質（ウシ）安定化剤及び保存剤としての抗微生物剤を含むＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液の中に存在する、抗αＴＳＨモノクローナル抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲート、並びにポリカチオン、好ましくは５，２００から１１，２００ダルトンの分子量範囲のポリリシンを約０．１から約０．５ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲の濃度で含有している緩衝液、好ましくはＴＲＩＳを含む、修飾されたＴＳＨアッセイ希釈剤を、少なくとも含む。この希釈剤は、保存剤として抗微生物剤を含んでいることが好ましい。または、ポリカチオンは、ＴＳＨアッセイ希釈剤と共にアッセイ試料へ添加するための、別個のキット成分として提供されてもよい。本発明のこの実施形態のキットは、保存剤として抗微生物剤を含むリン酸緩衝生理食塩溶液を含有しているマルチアッセイマニュアルディリューエント（Ｍｕｌｔｉ−Ａｓｓａｙ Ｍａｎｕａｌ Ｄｉｌｕｅｎｔ）；１．３２％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含有しているプレトリガー（Ｐｒｅ−Ｔｒｉｇｇｅｒ）溶液；０．３５Ｎ水酸化ナトリウムを含有しているトリガー（Ｔｒｉｇｇｅｒ）溶液；並びにリン酸緩衝生理食塩溶液及び抗微生物剤保存剤を含有している洗浄緩衝液を含みうる。
【００２１】
本発明の第二の好ましい実施形態は、血清又は血漿試料中の遊離型前立腺特異抗原（ＰＳＡ）又は総ＰＳＡの測定のための、改良された特異的結合アッセイに関する。最も好ましい実施形態において、ＰＳＡ特異的結合アッセイは、アッセイ試料と共に、即ち試料の固相とのインキュベーションの前又は途中に、およそ３，０００ダルトン以上の分子量を有する高分子ポリカチオンがアッセイに添加される、修飾されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ総ＰＳＡ又は遊離型ＰＳＡアッセイフォーマット（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００３５−６０５０）を含む。
【００２２】
この実施形態において、ポリカチオンは、５，２００から１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンであることが好ましい。血漿又は血清試料と組み合わされる、抗ＰＳＡでコーティングされた微粒子の希釈剤（以後、「微粒子希釈剤」）に、ポリカチオンが組み込まれることも、好ましい。総ＰＳＡアッセイにおけるポリリシンの好ましい濃度範囲は、約０．００５から約１ｗｔ／ｖｏｌ％であり、０．００５ｗｔ／ｖｏｌ％が最も好ましい。遊離型ＰＳＡアッセイにおけるポリリシンの好ましい濃度範囲は、約０．０１から約１ｗｔ／ｖｏｌ％であり、０．０１ｗｔ／ｖｏｌ％が最も好ましい。
【００２３】
本発明のもう一つの実施形態は、修飾されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴ総前立腺特異抗原（ＰＳＡ）又は遊離型ＰＳＡアッセイを実施するための、改良されたキットに関する。本発明のキットは、ポリカチオンも含有している希釈剤の中に存在する、抗ＰＳＡモノクローナル抗体（遊離型ＰＳＡアッセイの場合には遊離型ＰＳＡに特異的なもの、総ＰＳＡアッセイの場合には、遊離型ＰＳＡ及び結合型ＰＳＡの両方と結合するもの）でコーティングされた微粒子を含む。キットは、抗ＰＳＡモノクローナル抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートも含む。好ましくは、ポリカチオンは、約０．００５から０．５ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲の濃度の、約５，２００から約１１，２００ダルトンの分子量範囲のポリリシンである。微粒子希釈剤の緩衝液は、好ましくはＴＲＩＳ緩衝液であり、さらに好ましくは、タンパク質（ウシ）安定化剤及び保存剤としての抗微生物剤を含有している。アクリジニウム標識コンジュゲートは、好ましくは、タンパク質（ウシ）安定化剤及び保存剤としての抗微生物剤を含有しているＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液の中に存在する。又は、ポリカチオンは、ＰＳＡ微粒子希釈剤と共にアッセイ試料へ添加するための別個のキット成分として提供されてもよい。本発明のこの実施形態のキットは、１．３２％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含有しているプレトリガー溶液、０．３５Ｎ水酸化ナトリウムを含有しているトリガー溶液、並びにリン酸緩衝生理食塩溶液及び抗微生物剤保存剤を含有している洗浄緩衝液も含みうる。
【００２４】
最適に取り扱われなかった血漿及び血清試料の再遠心分離は、アルファ胎児タンパク（ＡＦＰ）、Ｂ型肝炎コア抗体（ＨＢｃＡｂ）、Ｂ型肝炎表面抗体（ＨＢｓＡｂ）、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の特異的結合アッセイにおいても、干渉を減少させ、試料測定の感度及び精度を回復させるために有効であることが証明された。従って、これらの分析物の特異的結合アッセイの実施中の、血漿又は血清含有アッセイ試料への高分子ポリカチオンの添加も、最適でない試料調製による干渉を減少させるために有用であろうと考えられる。
【００２５】
以下の非制限的な実施例は、本発明をさらに例示するために提供される。
【００２６】
実施例
実施例１：汚染された血漿又は血清試料の調製
１人の有志者より、ＳＳＴヴァキュテイナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）チューブとも呼ばれる４本の血清分離チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｕｍｂｅｒ３６６５１０）及び６本のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ヴァキュテイナーチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｕｍｂｅｒ３６６４５７）へと血液を採取した。血液を３０分間凝固させ、次いで、３，５００ＲＰＭで１０分間、遠心分離機でスピンした。４本のＳＳＴチューブより血清を回収した。６本のＥＤＴＡチューブより血清を回収した。次いで、血漿の一部を、ＥＤＴＡチューブからのバフィーコート（赤血球を含む）６０マイクロリットルの添加によって汚染した。
【００２７】
実施例２：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＴＳＨアッセイにおけるポリカチオンの効果 ａ．一般的な手順：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＴＳＨアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００３５−６０５０）は、ＣＨＥＭＩＦＬＥＸと呼ばれる、フレキシブルなアッセイプロトコルを有する化学発光微粒子イムノアッセイ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐａｔｉｃｌｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＣＭＩＡ）技術を使用して、ヒトの血清及び血漿の中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の存在を決定する二段階イムノアッセイである。第一段階において、血清又は血漿試料と、抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた常磁性微粒子と、ＴＳＨアッセイディリューエント（Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）とが組み合わせられる（ＴＳＨアッセイディリューエントは、０．５Ｍ ＴＲＩＳ ＨＣｌ、１．５Ｍ ＴＲＩＳ塩基、１．３Ｍ ＮａＣｌ、０．２％の抗微生物剤ＮＩＰＡＳＥＰＴ（Ｎｉｐａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）及び抗微生物剤Ａ５６６２０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）をｐＨ８．８で含有している）。試料中に存在するＴＳＨは、抗ＴＳＨ抗体でコーティングされた微粒子と結合する。洗浄後、第二段階として、抗αＴＳＨアクリジニウム標識コンジュゲートが添加される。次いで、それぞれ過酸化水素及び水酸化ナトリウムを含むプレトリガー溶液及びトリガー溶液と呼ばれる２つの溶液が、反応混合物に添加され、得られた化学発光反応が相対発光量（ＲＬＵ）として測定される。血漿又は血清試料中のＴＳＨの量と、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ／光学系によって検出されるＲＬＵとの間には直接的な関係が存在する。
【００２８】
ｂ．実験の設計：アッセイの感度に干渉する赤血球で故意に血清及び血漿試料を汚染する実験を設計した（実施例１を参照）。次いで、別々の実験において、ＴＳＨアッセイの第一段階において、ポリカチオン、即ちポリリシン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴをＴＳＨアッセイディリューエントに添加し、血清又は血漿試料（１５０μＬ）及び抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた常磁性微粒子（０．１％固体５０μＬ）と組み合わせた。次いで、前記の一般的な手順に記載されたようにして、アッセイを完了した。
【００２９】
ｃ．結果：表１が示すように、５，２００、８，８００、及び１１，２００の平均分子量を有するポリリシンは、０．２５％の濃度で、汚染された試料の中の干渉を排除するのに有効であることが見出された。
【００３０】
【表１】
４，０００から６，０００ダルトンの分子量を有するポリブレンを、様々な濃度で、調査した。０．２から１ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲の濃度のポリブレンは、ＴＳＨアッセイの機能的感度の干渉又は改変を示すことなく、汚染された血漿又は血清試料のアッセイ感度を回復させるのに有効であることが見出された。
約４，０００，０００ダルトンの分子量を有するポリカチオンＭＥＲＱＵＡＴ−１００も、ＴＳＨアッセイディリューエント中０．１５％又は０．３０％のいずれかの濃度で、アッセイの全体的な機能に干渉することなく、汚染された試料のアッセイ感度を回復させた。
【００３２】
実施例３：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ遊離型ＰＳＡアッセイにおけるポリカチオンの効果
アッセイ試料へのポリカチオンの添加は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ遊離型前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイにおいても、最適でない血漿又は血清試料の取り扱いに起因する干渉を減少させるのに有効であることが証明された。
【００３３】
ａ．一般的な手順：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ遊離型ＰＳＡアッセイは、化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）技術を使用して、ヒト血清中の遊離型ＰＳＡの存在を決定する二段階イムノアッセイである。第一段階において、被検試料と、遊離型ＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体でコーティングされた常磁性微粒子とが組み合わせられる。試料中に存在する遊離型ＰＳＡは、抗遊離型ＰＳＡでコーティングされた微粒子と結合する。洗浄後、第二段階として、抗ＰＳＡアクリジニウム標識コンジュゲートが添加される。次いで、プレトリガー溶液及びトリガー溶液が反応混合物に添加され；得られた化学発光反応がＲＬＵとして測定される。試料中の遊離型ＰＳＡの量と、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ／光学系によって検出されるＲＬＵとの間には、直接的な関係が存在する。ＴＳＨアッセイと同様に、血清試料の最適でない調製は、蛍光の測定の干渉をもたらし、結果的に試料中の遊離型ＰＳＡのレベルの不正確な読み取りをもたらす。
【００３４】
ｂ．実験の設計：これらの実験においては、微粒子希釈剤中のデキストラン硫酸を、ポリカチオン、特にポリアミノ酸へと置換した。次いで、前記の一般的な手順に記載されているようにして、アッセイを実施した。
ｃ．結果：表２に示されるように、ポリリシン（５，２００〜１１，２００ダルトンの範囲）及びポリオルニチン（５，３００ダルトン）の両方が、０．０２５％の濃度で、遊離型ＰＳＡアッセイの高い機能的感度の干渉又は改変を示すことなく、粗雑な試料調製によって引き起こされる遊離型ＰＳＡ測定における干渉を減少させるのに有効であった。
【００３５】
【表２】
実施例４：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ総ＰＳＡアッセイにおけるポリカチオンの効果 ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ総ＰＳＡアッセイの一般的な手順は、遊離型ＰＳＡ及び結合型ＰＳＡの両方と結合する抗体で常磁性微粒子をコーティングすることを除き、前記実施例３の遊離型ＰＳＡアッセイの場合と本質的に同様である。デキストラン硫酸（０．０５％の濃度）、又は０．００５％の濃度の平均分子量５２００もしくは１１，２００のポリＬ−リジン（デキストラン硫酸の代わり）を含有している微粒子希釈剤を利用した総ＰＳＡアッセイに、未スピン試料を供する実験を実施した。表３に示されている結果は、異なる平均分子量のポリＬ−リジンが、総ＰＳＡアッセイの高い機能的感度の干渉又は改変を示すことなく、未スピン試料における総ＰＳＡ測定の干渉を減少させるのに有効であることを証明している。
【００３７】
【表３】
Claims (26)
- 特異的結合アッセイ中に、血清又は血漿含有アッセイ試料に有効量の高分子ポリカチオンを添加することを含む、特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させる方法。
- 高分子ポリカチオンが３，０００ダルトン以上の分子量を有している、請求項１の方法。
- 高分子ポリカチオンが、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである、請求項１の方法。
- 高分子ポリカチオンが、５，２００から１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンを含む、請求項３の方法。
- 高分子ポリカチオンが、８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンを含む、請求項４の方法。
- 特異的結合アッセイが、甲状腺刺激ホルモン、遊離前立腺特異抗原、アルファ胎児タンパク、Ｂ型肝炎コア抗体、Ｂ型肝炎表面抗体、又はヒト免疫不全ウイルスを測定するものである、請求項１の方法。
- 特異的結合アッセイが固相上で実施される、請求項１の方法。
- 固相が常磁性微粒子を含む、請求項７の方法。
- 甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイ中に、血清又は血漿含有アッセイ試料に高分子ポリカチオンを添加することを含む、甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させるための方法。
- 高分子ポリカチオンが３，０００ダルトン以上の分子量を有している、請求項９の方法。
- 高分子ポリカチオンが、ポリリシン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである、請求項９の方法。
- 高分子ポリカチオンが、５，２００から１１，２００ダルトンの範囲の分子量を有するポリリシンを含む、請求項１１の方法。
- 高分子ポリカチオンが、８，８００ダルトンの分子量を有するポリリシンを含む、請求項１２の方法。
- 甲状腺刺激ホルモン特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させるための方法であって、
ａ）試料中に存在する甲状腺刺激ホルモンが、抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、抗βＴＳＨ抗体でコーティングされた常磁性微粒子及び高分子ポリカチオンを含むアッセイ希釈剤と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を、抗αＴＳＨ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；並びに
（ｄ）相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の甲状腺刺激ホルモンの量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む方法。 - 遊離型前立腺特異抗原特異的結合アッセイ中に、血清又は血漿含有アッセイ試料に高分子ポリカチオンを添加することを含む、遊離型前立腺特異抗原特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させるための方法。
- 高分子ポリカチオンがポリリシン又はポリオルニチンである、請求項１５の方法。
- 遊離型前立腺特異抗原特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させる方法であって、
（ａ）試料中に存在する遊離型ＰＳＡが、抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、遊離型ＰＳＡに特異的な抗体でコーティングされた常磁性微粒子と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を、抗ＰＳＡ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；及び
（ｄ）相対発光量として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の前立腺特異抗原の量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む方法。 - 高分子ポリカチオンを含有している溶液を含む、血漿及び血清試料用の改良された特異的結合アッセイキット。
- 高分子ポリカチオンが３，０００ダルトン以上の分子量を有している、請求項１８の改良された特異的結合アッセイキット。
- 高分子ポリカチオンが、ポリリシン、ポリブレン、又はＭＥＲＱＵＡＴである、請求項１５の改良された特異的結合アッセイキット。
- 特異的結合アッセイが、甲状腺刺激ホルモン、遊離型前立腺特異抗原、アルファ胎児タンパク、Ｂ型肝炎コア抗体、Ｂ型肝炎表面抗体、又はヒト免疫不全ウイルスを測定するものである、請求項１８の改良された特異的結合アッセイキット。
- （ａ）マウスモノクローナル抗βＴＳＨでコーティングされた微粒子と；
（ｂ）マウスモノクローナル抗αＴＳＨアクリジニウム標識コンジュゲートと；
（ｃ）高分子ポリカチオンを含む修飾されたＴＳＨアッセイ希釈剤とを含む、甲状腺刺激ホルモンの検出用の改良されたキット。 - 高分子ポリカチオンが５，２００〜１１，２００ダルトンの分子量を有するポリリシンである、請求項１９のキット。
- （ａ）高分子ポリカチオンを含む希釈剤の中に存在する、マウスモノクローナル抗遊離型ＰＳＡでコーティングされた微粒子と；
（ｂ）マウスモノクローナル抗ＰＳＡアクリジニウム標識コンジュゲートとを含む、遊離型前立腺特異抗原の検出用の改良されたキット。 - 高分子ポリカチオンがポリリシン又はポリオルニチンである、請求項２４のキット。
- 総前立腺特異抗原特異的結合アッセイの血清又は血漿含有アッセイ試料の中の不正確な読み取りをもたらす干渉を減少させる方法であって、
（ａ）試料中に存在するＰＳＡが、抗体でコーティングされた微粒子と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、血清又は血漿試料を、遊離型ＰＳＡ及び結合型ＰＳＡの両方と結合する抗体でコーティングされた常磁性微粒子と共にインキュベートすることにより、第一の複合体を形成させること；
（ｂ）コンジュゲートが第一の複合体と結合することを可能にする時間、そのような条件の下で、第一の複合体を、抗ＰＳＡ抗体を含むアクリジニウム標識コンジュゲートと共にインキュベートすることにより、第二の複合体を形成させること；
（ｃ）第二の複合体において化学発光反応を発生させること；並びに
（ｄ）相対発光量として化学発光反応を測定すること［ここで、血漿又は血清試料中の前立腺特異抗原の量は、測定された相対発光量と直接関係している］を含む方法。
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