JP2011501194A - 超高感度免疫アッセイを実施する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)複数の容器を用意する工程、
(b)第一の特異的結合メンバーを有する分析物を含有すると思われる生体試料と第二の特異的結合メンバーで被覆された磁気微小粒子とを複数の容器のうち少なくとも1つの容器に入れる工程、
(c)第一の特異的結合メンバーを第二の特異的結合メンバーと反応させて磁気微小粒子含有複合体を形成する工程、
(d)逆磁気粒子処理により、工程(c)で形成した複合体を集める工程、
(e)逆磁気粒子処理により、工程(d)で集めた複合体を複数の容器のうち洗浄緩衝液の入った容器に放出する工程、
(f)逆磁気粒子処理により、工程(e)で放出した複合体を洗って、結合していない第一の特異的結合メンバーと非特異的に結合した要素とを洗い落とす工程、
(g)逆磁気粒子処理により、工程(f)で洗った複合体を集める工程、
(h)複合体を自動免疫アッセイ分析機に導入する工程、および
(i)自動免疫アッセイ分析機により、試料中の分析物濃度を求めること。
(a)複数の容器を用意する工程、
(b)第一の特異的結合メンバーを有する分析物を含有すると思われる生体試料と第二の特異的結合メンバーで被覆された磁気微小粒子とを複数の容器のうち少なくとも1つの容器に入れる工程、
(c)第一の特異的結合メンバーを第二の特異的結合メンバーと反応させて磁気微小粒子含有複合体を形成する工程、
(d)逆磁気粒子処理により、工程(c)で形成した複合体を集める工程、
(e)工程(d)で集めた複合体を複数の容器のうちの1つの容器に放出し、前記容器は(i)洗浄緩衝液を含むが第三の特異的結合メンバーを含まない、または(ii)第三の特異的結合メンバーを含むいずれかであり、前記放出は逆磁気粒子処理により行われる工程、
(f)工程(e)の容器が洗浄緩衝液を含むが第三の特異的結合メンバーを含まない場合、工程(e)の容器に第三の特異的結合メンバーを加える工程、
(g)第三の特異的結合メンバーを、工程(e)で放出された複合体と反応させてサンドイッチ型複合体を形成する工程、
(h)逆磁気粒子処理により、工程(g)で形成したサンドイッチ型複合体を集める工程、
(i)工程(h)で集めたサンドイッチ型複合体を複数の容器のうちの1つの容器に放出し、容器は(i)結合していない第三の特異的結合メンバーを洗い落とすための洗浄緩衝液、または(ii)結合していない第三の特異的結合メンバーを洗い落とすための試料のいずれかを含有し、前記放出は逆磁気粒子処理により行われる工程、
(j)逆磁気粒子処理により、工程(i)で放出したサンドイッチ型複合体を集める工程、
(k)逆磁気粒子処理により、工程(j)で集めたサンドイッチ型複合体を複数の容器のうちの1つの容器に放出し、この容器はプレトリガー溶液を含有し、それにより特異的に結合した第三の結合メンバーを放出する工程、
(I)逆磁気粒子処理により、プレトリガー溶液から磁気粒子を集めて複数の容器のうちの1つの容器に放出し、この容器は洗浄緩衝液を含有する工程、および
(m)トリガー溶液をプレトリガー溶液に注入して発生した信号を読むことにより、試料中の分析物濃度を求めること。
以下の実施例において、「SPSP−Acr−115B−151−423」という用語は、抗−HIV−1p24モノクローナル抗体115B−151−423とN10−(3−スルホプロピル)−N−(3−スルホプロピル)−アクリジニウム−9−カルボキサミドとを含む接合体を意味する。モノクローナル抗体115B−151−423は、HIV−1p24抗原に特異的なモノクローナル抗体である。「CPSP−Acr−115B−151−423」という用語は、抗−HIV−1p24モノクローナル抗体115B−151−423とN10−(3−スルホプロピル)−N−(3−カルボキシプロピル)−アクリジニウム−9−カルボキサミドとを含む接合体を意味する。「抗−HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068」という用語は、HIV−1p24抗原に特異的なモノクローナル抗体を意味する。「抗−HIV−1p24モノクローナル抗体108−394−470」という用語は、HIV−1p24抗原に特異的なモノクローナル抗体を意味する。
以下の材料を用いて、抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068含有磁気粒子を調製した。
1.磁気微小粒子(磁気CMLアゾ吉草酸、4.7マイクロメートル、固体濃度5.1%、Polymer Science)
2.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068(3.4mg/mL)
3.被覆緩衝液(MES緩衝液、50mM、pH6.1、0.2マイクロメートルフィルター処理)
4.EDAC(50mMMES緩衝液中2.5mg/mL、pH6.1)
5.スルホ−NHS(50mMMES緩衝液中2.5mg/mL、pH6.1、分子量217.14、Pierce Chemical)
6.リン酸緩衝食塩水(10mMホスフェート緩衝液、0.15M塩化ナトリウムを加えてpH7.2)
7.上塗り緩衝液(0.1M Tris緩衝液+1%ウシ血清アルブミン、pH7.2)
8.ポリエチレングリコール(分子量8000、10%w/vの蒸留水液)
1.MES緩衝液(20.1mL)をポリプロピレン管(50mL)に加えた。
2.磁気微小粒子(4.9mL)を管に加えて微小粒子含有溶液とした(25mL、固体濃度1%)。
3.管をこの軸で回転させて微小粒子を洗った。
4.微小粒子を、3300rpmで10分間、遠沈して、上清液を吸引した。
5.微小粒子にMES緩衝液(25mL)を加えて再懸濁させることによる洗浄を2回以上行い、微小粒子を3300rpmで10分間、遠沈して、上清液を吸引した。
6.微小粒子をMES緩衝液(23mL)に再懸濁させた。
7.EDAC(1mL)およびスルホ−NHS(1mL)を管に加えて室温で30分間かけて微小粒子を前もって活性化した。転倒型回転器(Roto−Torque(Cole Parmer)、高速に設定し、1から10の範囲の速度ダイヤルを「6」に合わせた。)で、混合を行った。
8.微小粒子を、3300rpmで10分間、遠沈して、上清液を吸引した。
9.MES緩衝液(25mL)を加えて微小粒子を1回洗い、微小粒子を、3300rpmで10分間、遠沈して、上清液を吸引した。
10.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068(濃度100μg/mLで25mL)を、前もって活性化した微小粒子を含有するペレットに加えた。
11.管を転倒型回転器(Roto−Torque(Cole Parmer)、高速に設定し、1から10の範囲の速度ダイヤルを「6」に合わせた。)に設置し、室温で90分間回転させた。
12.微小粒子を、3300rpmで10分間、遠沈して、上清液を吸引した。
13.リン酸緩衝食塩水(25mL)を加えて微小粒子を洗い、微小粒子を再懸濁させた。微小粒子を3300rpmで10分間、遠沈して、上清液を吸引した。この洗浄工程を3回行った。洗浄工程ごとに、リン酸緩衝食塩水25mLを用いた。
14.上塗り緩衝液(22.5mL)およびポリエチレングリコール(2.5mL、10%ポリエチレングリコール溶液)を微小粒子に加えた。
15.管を転倒型回転器(Roto−Torque(Cole Parmer)、高速に設定し、1から10の範囲の速度ダイヤルを「5」に合わせた。)で、室温で16時間回転させた。
16.微小粒子を、3300rpmで10分間、遠沈して、上清液を吸引した。
17.上塗り緩衝液(22.5mL)およびポリエチレングリコール(2.5mL、10%ポリエチレングリコール溶液)を加えて微小粒子を再懸濁させた。
18.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆された微小粒子を4℃で貯蔵した。
以下の材料を用いて、抗HIV−1p24モノクローナル抗体115B−151−423とアクリジニウム標識とを含むSPSP−Acr−115B−151−423接合体を調製した。
1.抗HIV−1p24モノクローナル抗体115B−151−423の貯蔵液(10mMリン酸緩衝食塩水中9.7mg/mL、pH7.25)
2.N10−(3−スルホプロピル)−N−(3−スルホプロピル)−アクリジニウム−9−カルボキサミド由来のペンタフルオロフェニルエステルのジメチルホルムアミド(ジメチルホルムアミド溶媒中活性エステル46.6mM)
3.HPLC純度の水
4.緩衝液、pH4.0
5.緩衝液、pH7.0
6.緩衝液、pH10.0
7.NaCI(1.0M)
8.NaOH(1.0N)
9.NaOH(6.0N)
10.Na2HPO4・7H2O
11.NaH2PO4・H2O
12.NaCI
13.3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホナート(CHAPS)
14.CHAPS(リン酸緩衝食塩水中0.1%CHAPS、pH6.3)
15.リン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、150mM NaCI、pH8.0)
16.リン酸ナトリウム緩衝液(1M、150mM NaCI、pH8.0)
1.抗HIV−1p24モノクローナル抗体115B−151−423貯蔵液に、リン酸ナトリウム緩衝液(0.10mL、1M)、およびNaCI(150mM、pH8.0)を加えた。得られた混合物をMillex−GVフィルター(0.22μm)を用いて濾過した。NaOH(約20μL、0.1N)で最終pHを8.0に調整した。抗体(20μL)をリン酸緩衝食塩水(480μL、100mM、pH8.0緩衝液)で希釈した。280nmの吸光度を測定して抗体濃度を求めた。リン酸緩衝食塩水(100mM、pH8.0緩衝液)をブランクとして用いた。測定のため、抗体貯蔵液の濃度を25倍に希釈(即ち、20μL/500μL)した。抗HIV−1p24モノクローナル抗体115B−151−423貯蔵液濃度は9.0mg/mLであった。
2.ポリプロピレンマイクロ遠心管(1.5mL)4本それぞれに、抗HIV−1p24モノクローナル抗体115B−151−423貯蔵液(0.222mL、2.0mg)、リン酸ナトリウム(0.178mL、100mM)、NaCI(150mM)、接合緩衝液(pH8.0)を加えて、溶液(5mg/mL)とした。回転子(1インチ×5/16インチ)を毎分800回転させて溶液を撹拌した。次いで、N10−(3−スルホプロピル)−N−(3−スルホプロピル)−アクリジニウム−9−カルボキサミド由来のペンタフルオロフェニルエステル(40mg/mL貯蔵液)を、溶液を撹拌しながら加えた。暗中で3時間、周辺温度で反応を進行させた。
4.接合反応後、Precision Glide 18G1シリンジ針を取り付けた1ccツベルクリンシリンジ(B−D Rec.No.309602、Lot No.2124269)でそれぞれの接合体を直ちにSlide−A−Lyzer10K透析カセット(0.5から3.0mL)に注入した。4つのカセットを全て透析緩衝液(1.6L)を入れたビーカーに入れた。毎分350回転の撹拌速度で、周辺温度で透析を行った。透析を1.0時間行った後、さらに2時間透析を繰り返したが、毎回新しいリン酸緩衝食塩水(10mM、pH8.0緩衝液)を用い、それから新しいCHAPS(0.1%)/リン酸緩衝食塩水(10mM)pH8.0で一晩透析した。
5.HPLC精製手順に用いたHPLC精製緩衝液はCHAPS(0.1%)/10mMリン酸緩衝食塩水(pH6.3)であった。それぞれの接合体をTosoHaas G3000SWカラム(21.5mm×60cm)に一回で注入した。接合体は、HPLC精製緩衝液を用いて、流速5.0mL/minで60分間、溶出させた。18分の時点から30分の時点の画分を集めたが、それぞれの画分は30秒間隔で集めた。10番目から20番目まで(これらも含める。)の画分を一つにした。
この実施例は、CPSP−Acr−115B−151−423接合体と抗HIV−1p24モノクローナル抗体108−394−470で被覆した磁気粒子とを用いて磁気粒子処理により検査した場合に、1pg/mL未満のHIV−1p24抗原濃度(0.2pg/mLおよび0.5pg/mL)を有する比較的量の多い試料(1mL)がどのようにして2pg/mL濃度および5pg/mL濃度を有する比較的量の少ない試料(0.1mL)で生じる信号と同様な信号を発生させ得るかを例示する。
1.抗HIV−1p24モノクローナル抗体108−394−470で被覆した磁気微小粒子。磁気微小粒子は微小粒子希釈剤で固体濃度0.2%に希釈した。
2.CPSP−Acr−115B−151−423接合体
3.PRISM(登録商標)HIVAG移送洗浄緩衝液
4.PRISM(登録商標)HIVAG接合体洗浄緩衝液
5.陰性対照としての正常ヒト血漿
6.HIV−1p24抗原貯蔵液(526pg/mL)、正常ヒト血漿で希釈して濃度0.2、0.5、2、および5pg/mLのHIV−1p24抗原希釈試料を作成
7.Nunc−lmmuno(商標)一列型8丸底ウェル
8.ARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液
9.ARCHITECT(登録商標)トリガー溶液
1.発光測定装置(EG&G Berthold)
2.マイクロウェルプレート震盪機(Lab−Line Instruments)
3.磁気マイクロウェルプレート分離器
4.真空機に接続した8ウェルマイクロウェルプレート吸引ヘッド
5.複数ウェルピペット
6.Clay Adams Brand Nutator Rotator
1.ピペットを用いて、抗HIV−1p24モノクローナル抗体108−394−470で被覆した磁気微小粒子(20μL、固体濃度0.2%)を、0.1mLの試料検査用マイクロウェルプレートのマイクロウェルに導入した。ピペットを用いて、抗HIV−1p24モノクローナル抗体108−394−470で被覆した磁気微小粒子(20μL、固体濃度0.2%)を、0.1mLの試料検査用試験管(12×75mm、5mLポリプロピレン管)に導入した。
2.ピペットを用いて、HIV−1p24抗原を濃度2pg/mLおよび5pg/mLで含有する試料(0.1mL)をマイクロウェルプレートの各マイクロウェルにそれぞれ2つ組で導入した。毎回新しいピペットチップを用いた。HIV−1p24抗原を濃度0.2pg/mLおよび0.5pg/mLで含有する試料(1mL)を各試験管にそれぞれ2つ組で導入した。試験管を試験管立てに設置した。
3.マイクロウェルプレートおよび試験管立ての試験管の内容物を、室温で1時間、マイクロウェルプレート震盪機上で温置した。
4.透明な液体が見られるまで2分間マイクロウェルプレートをNutator Rotatorに乗せた磁気マイクロウェルプレート分離機に置いた。捕獲された微小粒子をかく乱しないようにしながら8ウェル吸引ヘッドで液体をマイクロウェルから除去した。透明な液体が見られるまで2分間試験管を磁気分離機に置いた。捕獲された微小粒子をかく乱しないようにしながら吸引ヘッドで液体を試験管から手作業で除去した。
5.多連ピペットを用いて、マイクロウェルプレートの各マイクロウェルに移送洗浄緩衝液(100μL)を入れた。ピペットを用いて各試験管に移送洗浄緩衝液(100μL)を入れた。
6.マイクロウェルプレートおよび試験管立ての試験管をマイクロウェルプレート震盪機に1分間置いて、磁気微小粒子を分散させて非特異的に結合した物質を洗い落とした。
7.工程4、5、および6を3回繰り返して非特異的に結合した物質を洗い除去した。
8.最後の洗浄工程後、CPSP−Acr−115B−151−423接合体(50μL、60ng/mL)をマイクロウェルプレートの各マイクロウェルおよび各試験管に導入した。マイクロウェルプレートおよび試験管立ての試験管の内容物を室温で1時間、プレート震盪機上で温置した。
9.工程4、5、6、および7を3回繰り返して結合していないCPSP−Acr−115B−151−423接合体を接合体洗浄緩衝液で洗い除去した。
10.3回目の洗浄の後、磁気微小粒子含有液をマイクロウェルプレートの各マイクロウェルから白色平底型Dynex microlite2プレートの各マイクロウェルへ移送し、透明な液体が見られるまで2分間プレートをNutator rotatorに乗せた磁気マイクロウェルプレート分離機上に置いた。捕獲された微小粒子をかく乱しないようにしながら8ウェル吸引ヘッドで液体を除去した。3回目の洗浄の後、磁気微小粒子含有液を各試験管から白色平底型Dynex microlite2プレートの各マイクロウェルへ移送し、透明な液体が見られるまで2分間プレートをNutator rotatorに乗せた磁気マイクロウェルプレート分離機上に置いた。捕獲された微小粒子をかく乱しないようにしながら8ウェル吸引ヘッドで液体を試験管から手作業で除去した。
11.ARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液(40μL)をDynex microlite2プレートの各マイクロウェルに導入し、プレートの内容物を、室温で10分間、マイクロウェルプレート震盪機上で温置して、CPSP−Acr−115B−151−423接合体を磁気粒子からプレトリガー溶液中に放出した。
12.ARCHITECT(登録商標)トリガー溶液(120μL)をDynex microlite2プレートの各マイクロウェルに注入して、マイクロウェルプレート化学発光読取り機(発光測定装置)で化学発光信号を読取った。読取り結果は相対光単位(RLU)で与えられる。
この実施例は、抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気粒子を用いてKingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサで試料(2mL)からHIV−1p24抗原を捕獲することによって、試料中0から1.6pg/mLの範囲で含有されるHIV−1p24抗原の濃度を決定する方法を例示する。CPSP−Acr−115B−151−423接合体を用いて標識とした。
1.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆された磁気微小粒子。磁気微小粒子を微小粒子希釈剤中固体濃度0.25%に希釈した。
2.CPSP−Acr−115B−151−423接合体。接合体の濃度は接合体希釈剤中50ng/mLであった。接合体はフィルターディスク(0.1マイクロメートル)で濾過した。
3.微小粒子希釈剤
4.HIV−1p24抗原貯蔵液(27.5pg/mL)、正常ヒト血漿で希釈して抗原濃度(a)0.1pg/mL(b)0.2pg/mL、(c)(d)0.4pg/mL、(d)0.8pg/mL、および(e)1.6pg/mLのHIV−1p24抗原希釈試料シリーズを作成
5.正常ヒト血漿(陰性対照として)
6.ARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液
7.ARCHITECT(登録商標)トリガー溶液
8.PRISM(登録商標)HIVAG移送洗浄緩衝液
9.検体10倍希釈緩衝液
P5000、P1000、P200、P20、P2
「P」の文字に続く数字は、このピペットにより移送可能なマイクロリットルでの最大容量である。最大容量の値が小さいほど、ピペットにより送達される量の精度を上げることができる。
1.KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサ
2.マイクロウェルプレート発光測定装置(EG&G Berthold)
1.検体10倍希釈緩衝液(0.11mL)を、KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Aおよび管Bに入れた。
2.試料(1mL)を、KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Aおよび管Bに加えた。試料は、正常ヒト血漿または正常ヒト血漿で希釈したHIV−1p24抗原であった。
3.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気粒子(20μL)を固体濃度0.25%に希釈して、KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Aに入れた。
4.CPSP−Acr−115B−151−423接合体(0.1mL、50ng/mL)をKingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Cに入れた。
5.洗浄緩衝液(1mL)をKingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Dに入れた。
7.ARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液(60μL)をKingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Eに入れた。
1.KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管A中、抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気粒子を試料とともに、室温で20分間、振盪しながら温置した。
2.HIV−1p24抗原を捕獲した磁気粒子をKingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Aから管Bに移送し、室温で20分間、振盪しながら温置した。
3.磁気粒子を、KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Bから管Cに移送し、室温で20分間、振盪しながら温置した。
4.磁気微小粒子を、KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Cから管Bに戻し、2分間洗浄して遊離のアクリジニウム標識化接合体を除去した。
5.磁気粒子を、KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Bから管Dに移送し、さらに2分間洗浄して遊離のアクリジニウム標識化接合体を除去した。
6.磁気粒子に捕獲されたHIV−1p24抗原特異的結合CPSP−Acr−115B−151−423接合体を、KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Eに入れたARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液(60μL、pH2.6)中に溶出させた。溶出後、磁気粒子を取り出して洗浄管D中に放出した。
7.プレトリガー溶液(50μL)を、KingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの管Eから不透明マイクロウェルプレートのマイクロウェルに移送した。
8.不透明マイクロウェルプレートの各マイクロウェルにARCHITECT(登録商標)トリガー溶液(150μL)を注入して、発光測定装置で、適切な波長で化学発光信号を読取った。
この実施例は、抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気粒子を用いてKingFisher(商標)磁気粒子プロセッサで試料(0.89mL)からHIV−1p24抗原を捕獲することによって、試料中0から1.6pg/mLの範囲で含有されるHIV−1p24抗原の濃度を決定する方法を例示する。CPSP−Acr−115B−151−423接合体を用いて標識とした。
1.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆された磁気微小粒子。磁気微小粒子を微小粒子希釈剤中固体濃度0.25%に希釈した。
2.CPSP−Acr−115B−151−423接合体。接合体の濃度は接合体希釈剤中50ng/mLであった。接合体はフィルターディスク(0.1マイクロメートル)で濾過した。
3.ARCHITECT(登録商標)微小粒子希釈剤
4.HIV−1p24抗原貯蔵液(77pg/mL)、正常ヒト血漿で希釈して抗原濃度(a)0.1pg/mL、(b)0.2pg/mL、(c)(d)0.4pg/mL、(d)0.8pg/mL、および(e)1.6pg/mLの希釈試料シリーズを作成。
5.陰性対照として正常ヒト血漿
6.ARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液
7.ARCHITECT(登録商標)トリガー溶液
8.PRISM(登録商標)HIVAG移送洗浄緩衝液
9.検体10倍希釈緩衝液
P5000、P1000、P200、P20、P2
「P」の文字に続く数字は、このピペットにより移送可能なマイクロリットルでの最大容量である。最大容量の値が小さいほど、ピペットにより送達される量の精度を上げることができる。
1.8個のウェルを備えたKingFisher(商標)磁気粒子プロセッサ
2.マイクロウェルプレート発光測定装置(EG&G Berthold)
1.検体10倍希釈緩衝液(20μL)を、KingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルA、B、C、D、E、およびFに入れた。
2.KingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルAには試料(170μL)を加え、ウェルB、C、D、およびEには試料(180μL)を加えた。試料は、正常ヒト血漿または正常ヒト血漿で希釈したHIV−1p24抗原で、2つ組で検査した。
3.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気粒子(10μL)を固体濃度0.25%に希釈して、KingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルAに入れた。
4.CPSP−Acr−115B−151−423接合体(50μL、50ng/mL)をKingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルFに入れた。
5.洗浄緩衝液(200μL)をKingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルGに入れた。
6.ARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液(60μL)をKingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルHに入れた。
1.KingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルA、B、C、D、およびE中、連続して、抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気粒子を試料とともに、室温で10分間、振盪しながら温置した。
2.HIV−1p24抗原を捕獲した磁気粒子をKingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルEからウェルFに移送し、室温で10分間、振盪しながら温置した。
3.磁気粒子を、KingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルFからウェルC、D、およびEに連続して移送し、2分間振盪しながら洗浄して結合していないアクリジニウム標識化接合体を除去した。
4.磁気微小粒子を、KingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルEからウェルGに移送し、さらに2分間振盪しながら洗浄して結合していないアクリジニウム標識化接合体を除去した。
5.磁気粒子を、KingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルHに入れたARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液(60μL、pH2.6)に溶出させた。
6.検査した各試料の2つ組の1つ目について、ARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液(50μL)に溶出した磁気粒子をKingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルHから不透明マイクロウェルプレートのマイクロウェルに移送した。微小粒子が分散したら、不透明マイクロウェルプレートの各ウェルにARCHITECT(登録商標)トリガー溶液(150μL)を注入して、発光測定装置で、化学発光信号を読取った。
7.検査した各試料の2つ組の2つ目について、ARCHITECT(登録商標)プレトリガー溶液(50μL)に溶出した磁気粒子を、KingFisher(商標)磁気粒子プロセッサのウェルHから不透明マイクロウェルプレートのマイクロウェルに移送した。マイクロウェルプレートをマイクロウェルプレートホルダーに乗せて、磁気棒で磁気粒子を集めて不透明マイクロウェルプレートの各マイクロウェルの底にペレットを形成した。微小粒子がペレット化したら、不透明マイクロウェルプレートの各マイクロウェルにARCHITECT(登録商標)トリガー溶液(150μL)を注入して、発光測定装置で、化学発光信号を読取った。
この実施例は、抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気微小粒子の使用を通じて、試料1.6mLからHIV−1p24抗原を捕獲するための試料プロセッサとしてKingFisher(商標)mL磁気粒子プロセッサの組合せを用いて、試料中1pg/mL未満で含まれるHIV−1p24抗原の濃度決定の実行可能性を例示する。CPSP−Acr−115B−151−423接合体を用いて標識とした。ARCHITECT(登録商標)自動免疫アッセイ分析機を用いて濃度を求めた。結合工程には4本のKingFisher(商標)管を用い、洗浄工程で、粒子を5本目のKingFisher(商標)管(粒子希釈剤(200μL)入り)に放出した。
1.HIV−1p24抗原貯蔵液(77pg/ml)、陰性ヒト血漿で希釈して抗原濃度(a)1.8pg/mL、(b)0.6pg/mL、(c)0.2pg/mL、および(d)0.1pg/mLの希釈試料シリーズを作成
2.KingFisher(商標)希釈剤
3.PRISM(登録商標)移送洗浄緩衝液
4.13.5%スクロース入り50mM Tris−HCI緩衝液(pH8.0)、100mM NaCI、0.1%Proclin(登録商標)抗生剤、0.1%Nipasept(登録商標)抗生剤、および0.0005%Quinolone(登録商標)抗生剤を含有するARCHITECT(登録商標)混合微小粒子希釈剤。
5.抗HIV−1p24モノクローナル抗体115B−151−423含有接合体、抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気微小粒子、およびPRISM(登録商標)検体希釈剤緩衝液からなるARCHITECT(登録商標)アッセイ用試薬パック
1.KingFisher(商標)プロセスの結合工程の間に、管Aの試料中のHIV−1p24抗原は抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆された磁気粒子により捕獲された。結合工程は20分かかった。
2.管Aの磁気粒子を集めて管Bに放出し、工程1に記載したのと同じ結合工程を繰り返して試料からさらにHIV−1p24抗原を捕獲した。
3.洗浄工程の間に、管Bの磁気粒子を集めて管C(PRISM(登録商標)移送洗浄緩衝液(0.5mL)入り)に放出し、非特異的に結合した材料を粒子から洗い落とした。洗浄工程は40秒かかった。
4.管Cの磁気粒子を集めて管Dに放出し、さらに40秒間洗浄工程を繰り返した。
5.管Dの磁気粒子を集めて管E(ARCHITECT(登録商標)粒子希釈剤(0.16mL)入り)に放出した。
この実施例は、KingFisher(商標)mL磁気微小粒子プロセッサを用いて量の多い試料を処理した後、超高感度免疫アッセイをどのようにしてPRISM(登録商標)自動免疫アッセイ分析機で実行するかを例示する。PRISM(登録商標)自動免疫アッセイ分析機は、ラテックス微小粒子と化学発光検出技術を用いて血液をスクリーニングする用にAbbott Laboratoriesから販売されている。この実施例では、以下の材料を用いた。
1.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆した磁気微小粒子。磁気微小粒子を微小粒子希釈剤中固体濃度0.5%に希釈した。
2.SPSP−Acr−115B−151−423接合体
3.ARCHITECT(登録商標)磁気希釈剤
4.HIV−1p24抗原貯蔵液(77pg/ml)、KingFisher(商標)mL磁気微小粒子処理用に正常ヒト血漿で濃度0.2pg/mLに希釈;HIV−1p24抗原貯蔵液(77pg/ml)、アッセイの通常PRISM(登録商標)対照用に濃度4.2pg/mLに希釈
5.陰性対照としての正常ヒト血漿
6.PRISM(登録商標)活性剤希釈剤
7.PRISM(登録商標)活性剤濃縮剤
8.PRISM(登録商標)HIVAG移送洗浄液
9.最終洗浄緩衝液7G56D
10.検体10倍希釈緩衝液
11.抗HIV−1モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆したCMLラテックス微小粒子(Abbott Laboratories(Abbott Park,IL)から入手可能)
P2、P20、P200、P1000、P5000
「P」の文字に続く数字は、このピペットにより移送可能なマイクロリットルでの最大容量である。最大容量の値が小さいほど、ピペットにより送達される量の精度を上げることができる。
1.グリシン−HCIで溶出したHIV−1p24抗原(150μL)をPRISM(登録商標)自動分析機の試料ウェルに移送した。
2.抗HIV−1p24モノクローナル抗体120A−270−1068で被覆したラテックス微小粒子(50μL、0.2M Tris緩衝液(13.6%スクロース)で0.033%に希釈)を加えて、37℃で18分間、HIV−1p24抗原を再捕獲した。
3.HIVAG移送洗浄緩衝液を分配して、反応混合物をPRISM(登録商標)試料トレイのガラス繊維タブウェルに流し込み、ラテックス微小粒子から結合していない材料を洗い落とした。
4.SPSP−Acr−115B−151−423接合体(50μL、7G46J希釈剤で25ng/mLに希釈)を、接合体ステーションで手動で加え、ラテックス微小粒子に捕獲されているHIV−1p24抗原と、37℃で22分間、反応させた。
5.最終洗浄緩衝液(7G56D)をPRISM(登録商標)試料トレイのガラス繊維タブウェルに分配して、ラテックス微小粒子から遊離の接合体を洗い落とした。
6.PRISM(登録商標)トリガー溶液をガラス繊維タブウェルに加えて化学発光信号を発生させた。
Claims (21)
- 特異的結合対の第一のメンバーを有する分析物を含有すると思われる生体試料中の分析物濃度を求める方法であって、
(a)複数の容器を用意する工程、
(b)第一の特異的結合メンバーを有する分析物を含有すると思われる生体試料と第二の特異的結合メンバーで被覆された磁気微小粒子とを複数の容器のうち少なくとも1つの容器に入れる工程、
(c)第一の特異的結合メンバーを第二の特異的結合メンバーと反応させて磁気微小粒子含有複合体を形成する工程、
(d)逆磁気粒子処理により、工程(c)で形成した複合体を集める工程、
(e)逆磁気粒子処理により、工程(d)で集めた複合体を複数の容器のうち洗浄緩衝液の入った容器に放出する工程、
(f)逆磁気粒子処理により、工程(e)で放出した複合体を洗って、結合していない第一の特異的結合メンバーと非特異的に結合した要素とを洗い落とす工程、
(g)逆磁気粒子処理により、工程(f)で洗った複合体を集める工程、
(h)複合体を自動免疫アッセイ分析機に導入する工程、
(i)自動免疫アッセイ分析機により、試料中の分析物濃度を求める工程を含む、方法。 - 第一の特異的結合メンバーは抗原である、請求項1の方法。
- 抗原はHIV抗原である、請求項2の方法。
- 第二の特異的結合メンバーは、抗原に特異的な抗体である、請求項2の方法。
- 抗体はHIV抗原に特異的である、請求項4の方法。
- 発光標識を用いて分析物の濃度を求める、請求項1の方法。
- 発光標識は接合体の一部分である、請求項6の方法。
- 接合体は、第一の特異的結合メンバーまたは第二の特異的結合メンバーの1つと特異的に結合する部分を含む、請求項7の方法。
- 接合体は自動免疫アッセイ分析機に導入される、請求項6の方法。
- 発光標識は化学発光標識である、請求項6の方法。
- 複数の容器は複数の管を含む、請求項1の方法。
- 複数の容器は複数のマイクロウェルを含む、請求項1の方法。
- 特異的結合対の第一のメンバーを有する分析物を含有すると思われる生体試料中の分析物濃度を求める方法であって、
(a)複数の容器を用意する工程、
(b)第一の特異的結合メンバーを有する分析物を含有すると思われる生体試料と第二の特異的結合メンバーで被覆された磁気微小粒子とを複数の容器のうち少なくとも1つの容器に入れる工程、
(c)第一の特異的結合メンバーを第二の特異的結合メンバーと反応させて磁気微小粒子含有複合体を形成する工程、
(d)逆磁気粒子処理により、工程(c)で形成した複合体を集める工程、
(e)工程(d)で集めた複合体を複数の容器のうちの1つの容器に放出し、前記容器は(i)洗浄緩衝液を含むが第三の特異的結合メンバーを含まない、または(ii)第三の特異的結合メンバーを含むいずれかであり、前記放出は逆磁気粒子処理により行われる工程、
(f)工程(e)の容器が洗浄緩衝液を含むが第三の特異的結合メンバーを含まない場合、工程(e)の容器に第三の特異的結合メンバーを加える工程、
(g)第三の特異的結合メンバーを、工程(e)で放出された複合体と反応させてサンドイッチ型複合体を形成する工程、
(h)逆磁気粒子処理により、工程(g)で形成したサンドイッチ型複合体を集める工程、
(i)工程(h)で集めたサンドイッチ型複合体を複数の容器のうちの1つの容器に放出し、この容器は(i)結合していない第三の特異的結合メンバーを洗い落とすための洗浄緩衝液、または(ii)結合していない第三の特異的結合メンバーを洗い落とすための試料のいずれかを含有し、前記放出は逆磁気粒子処理により行われる工程、
(j)逆磁気粒子処理により、工程(i)で放出したサンドイッチ型複合体を集める工程、
(k)逆磁気粒子処理により、工程(j)で集めたサンドイッチ型複合体を複数の容器のうちの1つの容器に放出し、この容器はプレトリガー溶液を含有し、それにより特異的に結合した第三の結合メンバーを放出する工程、
(I)逆磁気粒子処理により、プレトリガー溶液から磁気粒子を集めて複数の容器のうちの1つの容器に放出し、この容器は洗浄緩衝液を含有する工程、
(m)トリガー溶液をプレトリガー溶液に注入して発生した信号を読むことにより、試料中の分析物濃度を求めることを含む、方法。 - 第一の特異的結合メンバーは抗原である、請求項13の方法。
- 抗原はHIV抗原である、請求項14の方法。
- 第二の特異的結合メンバーは、抗原に特異的な抗体である、請求項14の方法。
- 抗体はHIV抗原に特異的である、請求項16の方法。
- 発光標識を用いて分析物の濃度を求める、請求項13の方法。
- 発光標識は接合体の一部分である、請求項18の方法。
- 接合体は、第一の特異的結合メンバーまたは第二の特異的結合メンバーの1つと特異的に結合する部分を含む、請求項19の方法。
- 発光標識は化学発光標識である、請求項19の方法。
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