CN101438163B - 利用磁场检测样品中的靶分子 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于检测可疑含有靶物的样品中的靶物的方法。该方法包括将样品和附着于磁性颗粒上的第一结合分子与附着于固体支持物上的第二结合分子接触。所述第一结合分子能够结合第二结合分子，靶物能够干扰这种结合。施加磁力使得磁性颗粒与固体支持物紧密接近。检测出于固体支持物结合的磁性颗粒的数目。

Description

利用磁场检测样品中的靶分子
本发明涉及用于检测样品中的靶物的方法。本发明具体的涉及用于检测靶分子，特别是具有单一表位的靶物的竞争性检测方案，其中溶液中的靶物与附着于磁性颗粒或者固体表面的分子竞争。 
卫生健康研究涉及开发用于确定是否存在特殊化合物例如DNA、RNA、激素、代谢物、药物等的诊断性方法。 
WO 03/031977 A2、WO 01/14591 A1和WO 96/07101阐述了采用可磁化颗粒的检测法和方法，其中在磁场存在下实施检测，以便提高检测动力学。US 5,981,297阐述了用于检测液相中的靶分子的方法和装置。所述装置通过监视感受器输出来监测靶分子是否已经选择性结合磁场感受器表面上的识别剂。选择性结合靶分子的识别剂或者选择性结合感受器所结合的识别剂的识别剂与可磁化颗粒共价结合。磁场感受器输出的变化表明存在与感受器结合的磁性颗粒，并据此表明样品中存在靶分子及其浓度。WO97/07243阐述了用于确定液体中存在靶物质和/或其浓度的方法。在此所述的方法组合了免疫检测法、涂覆杯检测法(coated cup assay)和磁性颗粒分离的元件，以便实现对溶液中的分析物的定量和回收。方法也通过经特异结合对连接磁性颗粒和收集表面来确保经磁收集的材料的无再定向作用(non-reorientation)。 
免疫检测法常常被用于确定出体液中的特异蛋白的量，以便有助于进一步的诊断和治疗。最熟知的检测理论是夹心检测法。样品液体中的相关分子被夹裹(“夹心化”)在生物学活性传感器表面和生物学活性标记(例如磁性颗粒)之间。因此，夹心检测法要求靶物具有至少两个表位。但是，更小的分子例如滥用药物通常只具有一个表位，因此不能被常规的夹心检测法检测到。 
竞争性或抑制性检测法是检测这些分子的方法。公知的竞争性检测方案是将相关的靶分子连接到表面之上，并将抗体和检测标记(酶/荧光团/磁珠)相连接。利用所标记的抗体，该系统被用于实施样品中的靶分子和表面上的靶分子之间的竞争性检测(见例如GB 2404022A和GB2404023A)。 
因为在溶液中的游离靶分子和结合于表面或标记上的靶分子的移动性(mobility)方面存在着不同，因此竞争并非公平的，剂量效应曲线也不是线性的。这可能使得难以用这个检测法进行定量测定。此外，结合于表面或标记的靶物的有限移动性造成了相当缓慢的反应时间。 
本发明的目的是克服这些缺点中的至少一个缺点。 
本发明的另一个目的是提供用于检测样品中的靶分子的竞争性检测法，其适用于单室模式实施。 
发现通过本发明的方法可以满足这些目的中的至少一个目的。 
因此，在一个部分，本发明涉及用于检测可疑含有靶物的样品中的所述靶物的方法，包括： 
a)使得样品以及附着于磁性颗粒的第一结合分子同时或在不同时间与附着于固体支持物的第二结合分子接触，其中所述第一结合分子能结合第二结合分子，并且其中所述靶物能干扰所述的结合；以及施加磁力使得所述磁性颗粒与固体支持物紧密接近；和 
b)通过所述第一结合分子与第二结合分子的结合检测与固体支持物结合的磁性颗粒的数目。 
在所述方法的步骤b)中检测到的颗粒数目与样品中的靶物浓度相关。数目的减少例如与参照值相比的数目减少说明所分析的样品中含有靶物。参照值可以是已知的数值。或者，参照值可以是在同时或分开进行的利用不含任何靶物的样品的对照检测法中获得的数值。 
还公开了磁铁用于向附着有第一结合分子的磁性颗粒应用磁力使得所述颗粒与附着有第二结合分子的固体支持物紧密接近的用途，其中第一结合分子能够结合第二结合分子，并且其中存在能够干扰这种结合的靶分子。 
通过参照下面所述的具体实施方式，本发明的这些和其他方面都是显而易见的。 
图1显示了本发明的单室竞争性检测方案的示意图，其中目的靶分子(a)与附着于磁性颗粒的靶分子或靶分子类似物(d)竞争与附着于固体支持物表面的抗体的结合。 
图2显示了关于吗啡的竞争性结合检测法的剂量反应曲线，所述检测法使用磁激动将经抗OPI抗体涂覆的磁珠浓聚到经BSA-OPI涂覆的表面或没有进行上述浓聚处理。 
图3显示了经吗啡-HRP和鲁米诺/发光检测到的抗吗啡抗体涂覆金表面的效率。 
图4显示了通过MP-吗啡与附着于表面上的抗吗啡抗体的结合所检测到的吗啡所结合的微粒(MP)的功能性。 
图5显示了竞争性检测法的结果，其中在存在不同量的吗啡的溶液中检测MP-吗啡与附着于表面的抗吗啡抗体的结合。 
“靶物”可以其浓度或存在等待确定的任意分子。本发明的合适靶物的实例是分子靶物例如小分子、药物、蛋白、酶、激素、肽和核酸。分子靶物常常能够确定出更大成分例如细胞、病毒或细胞或病毒的部分、组织提取物等的浓度和/或存在。 
特别优选的靶物是那些只具有单一表位的靶物，包括单一表位的小分子、药物、激素、和肽。特别优选的靶物是成瘾药物。优选作为靶物的成瘾药物的实例是吗啡。优选作为靶物的其他成瘾药物是可卡因、THC、促合成药物或苯丙胺/甲基苯丙胺族的药物。靶物可以存在于所分析的样品内或者可以原位形成，例如在接触步骤期间如通过在该步骤期间发生的反应形成所述靶物。如果用传感器监测反应，靶物例如可以是反应的原材料或反应产物。 
要明白本发明的方法所检测的靶物是以竞争方式干扰第一结合分子和第二结合分子之间的结合的靶物。还要明白可以选择第一和第二结合分子，使得所检测的靶物可以以竞争方式干扰它们彼此之间的结合。可以用感受法直接检测反应产物。同样，还可以在检测之前进一步加工处理反应产物。进一步加工处理的实例是加入材料或者修饰靶物的(生物)化学或物理性能，以便促进检测。 
如上所提及的那样，本发明的方法包括使得样品以及附着于磁性颗粒的第一结合分子与附着于固体支持物的第二结合分子接触。在溶液中实施所述接触。 
术语“在溶液中”在此表示在液体环境中实施上下文中所指的步骤、(结合)反应或检测。优选地，液体环境是水性液体环境。所涉及的试剂不必一定要溶解于液体环境内，也可以是悬浮的或分散的状态。 
样品以及附着于磁性颗粒的第一结合分子与附着于固体支持物的第二结合分子的接触可以同时或者在不同的时间发生。例如，可以首先使样品与固体支持物的第二结合分子接触，此后不久可以加入附着于磁性颗粒上的第一结合分子。或者，可以首先使附着于磁性颗粒的第一结合分子与结合于固体支持物的第二结合分子接触，此后不久可以加入样品。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，所述样品和附着于磁性颗粒的第一结合分子将同时与结合于固体支持物的第二结合分子接触。这一点可以通过例如混合样品和附着于磁性颗粒的第一结合分子以及随后接触结合于固体支持物的第二结合分子来实现。或者，可以向结合于固体支持物的第二结合分子中分开但同时地加入样品和附着于磁性颗粒上的第一结合分子。 
本发明的方法还包括在步骤a)中施加磁力，使得磁性颗粒与固体支持物紧密接近。换句话说，颗粒被用力推到固体支持物上。这个磁激动步骤一般会造成就参与检测的竞争性结合事件的组分的结合而言反应时间缩短。此外，已经吃惊的发现，在本发明的某些实施方式中，可以通过这种方式影响检测的敏感性。优选地以这种方式在激动步骤期间应用磁力，以便减少或消除靶物和附着于磁性标记的第一结合分子的移动性差异对结合的影响。因此，施加磁力将磁性颗粒浓聚于固体支持物例如传感器表面，以便补偿附着于磁性颗粒上的第一结合分子的降低了的移动性。 
可以用电磁铁施加磁力。但是，空心线圈或永久磁铁也是合适的。 
在本发明的一个实施方式中，第一结合分子能够选择性地结合样品中的靶物和第二结合分子。接触步骤还包括允许第二结合分子与靶物竞争与第一结合分子的所述的选择性结合。 
合适的第一结合分子的实例是AffibodiesTM、抗体、受体分子、适体和螯合剂。 
当靶物是核酸时，第一结合分子包括具有与靶物序列的一部分序列互补的碱基序列的核酸。 
特别优选的第一结合分子是特异性结合靶物的抗体。 
当第一结合分子能够选择性结合样品中的靶物和第二结合分子时，第二结合分子与靶物相同，或者是靶物类似物。“靶物类似物”在此用于表示含有至少部分靶物(优选的是使其与其他相关分子区分开的部分)的构建体或与第一结合分子结合的强度与靶物相似的构建体。相似的强结合被定义为具有这样的Ka差异，优选其系数是103，更优选该系数是102，最优选该系数是10，或更小。不受任何理论的限制，相信靶物和靶物类似物常常共享有相同的用于结合结合位点的表位。 
在本发明的方法中，第一结合分子附着于磁性颗粒上。用于本发明方法的合适的磁性颗粒是那些可以被磁力所激动的颗粒。磁性颗粒可以是任何形状或形式。它们可以是抗磁性的、顺磁性的、超顺磁的、亚铁磁性的、或铁磁性的，即能够在电场中永久或临时生成磁偶极子的任何形式的磁性。
在本发明的另一个实施方式中，第二结合分子能够选择性结合样品中的靶物和第一结合分子。接触步骤还包括允许第一结合分子和靶物竞争与第二结合分子的所述选择性结合。 
图1以举例说明的方式描述了这个实施方式。图显示出了竞争性检测方案，所述方案可以被用于定量检测具有单一表位的分子(尽管也可以检测具有两个或多个表位的分子)。步骤不需要预选混合分离的试剂，即其适合于以单室竞争测定模式操作。这个方案允许靶物(a)在溶液中与附着于磁性颗粒上的第一结合分子(d)的竞争。具体的，靶分子(a)与直接或间接附着于磁性颗粒上的靶分子或靶物类似物(d)竞争固体支持物(c)上的第二结合分子(b)。通过施加磁力(磁激动)可以克服游离靶分子(a)和结合于磁性颗粒的靶分子或类似物(d)之间的移动性差异。通过这种方式，剂量反应曲线可以令人吃惊的提高为线性曲线。这个检测方案特别适用于定量检测样品中的靶分子。 
合适的第二结合分子的实例还是AffibodiesTM、抗体、受体分子、适体和螯合剂。 
当靶物是核酸时，第二结合分子包括具有与靶物序列的一部分序列互补的碱基序列的核酸。 
特别优选的第二结合分子是特异性结合靶物的抗体。 
当第二结合分子能够选择性结合样品中的靶物和第一结合分子时，第一结合分子与靶物相同，或者是靶物类似物。术语“靶物类似物”具有如上定义的含义。 
用于本发明的方法的合适的磁性颗粒的大小可以为约10nm到数微米，更优选的是从约50nm到约1μm。也优选的是从约100nm到约500nm大小的颗粒，例如约300nm的颗粒或者约200nm的颗粒。在优选的实施方式中，磁性颗粒要比在本发明的检测法所分析的样品中的单个靶分子更大。 
通过用第一结合分子涂覆颗粒可以实现第一结合分子与磁性颗粒的附 着。也可以通过共价键直接地或者在间隔分子的辅助下实现所述附着。合适的间隔分子是烷撑二胺或乙二胺。 
在一个优选的实施方式中，通过强结合对实现所述附着。在这个实施方式中，强结合对中的一个结合配偶体可以附着于磁性颗粒上，而强结合对中的另一个结合配偶体可以附着于第一结合分子或者其本身就是第一结合分子。 
优选的强结合对的实例是抗生物素蛋白/生物素、半抗原/抗体、蛋白或肽/抗体、蛋白/碳水化合物、蛋白/蛋白、核酸/核酸、蛋白/核酸以及半抗原/核酸。 
抗生物素蛋白和生物素分子之间的相互作用被广泛地应用于连接生物分子和其他部分。抗生物素蛋白和生物素的亲和常数(Ka)是具有最高数值之一的亲和常数，其近似为1015L/mol，因此所述结合被认为在正常检测条件是不可逆的。除了高亲和力外，在每个抗生物素蛋白分子上有四个可用的生物素结合位点。用生物素对蛋白的生物素化或者化学标记是温和的，并不会降低生物学活性。通过包括碳二亚胺的连接剂也可以将抗生物素蛋白与其他蛋白化学偶联。可以商购获得多种抗生物素蛋白的变体，包括链霉抗生物素和neutravidin，它们在糖基化程度、等电点和非特异性结合表征方面都有所不同。另一个实例是strep-标记II/strep-tactin对。 
可以获得半抗原或小分子包括染料、药物、激素和维生素的高亲和抗体。一般而言，可以生成几乎所有半抗原的抗体，以及可以存在对分子例如地高辛、2，4-二硝基苯基(DNP)和荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)的Ka大于1011L/mol的多种高亲和力抗体。对于用半抗原化学标记分子而言，可以具有一些已知的简单的半抗原化方法。也可以用与针对抗生物素蛋白所述技术类似的化学技术或者用偶联蛋白的重组技术完成抗体的附着。 
蛋白或肽与它们的抗体的特异性以及高结合亲和力是许多免疫检测法的基础。这些相互作用的亲和常数可以高达1013L/mol，并且可以有着多个数量级的不同，这取决于所用的具体肽或蛋白。 
在具体的蛋白类型之间会发生蛋白-蛋白结合。例如，已知蛋白A和蛋白G具有与免疫球蛋白Fc部分的高亲和力。同样，伴刀豆球蛋白A是一种植物凝集素，其结合糖蛋白的糖部分，尽管所述结合不如蛋白A和G结合免疫球蛋白那么强烈。这些相互作用是较不特异的，因此只能用于其中样品不含Fc区或者其中样品不是糖蛋白的检测法中。为了获得所需的特异性并降低交叉反应性，可以修饰检测法中其相互作用并非需要的抗体和蛋白。例如，可以合成其中去除了Fc或糖基化区域的重组抗体。 
在另一个优选的实施方式中，通过将连接有结合分子的蛋白(例如牛血清白蛋白，BSA)涂覆到颗粒上可以实现第一结合分子与微粒的附着。例如，如果第一结合分子是吗啡或吗啡类似物，或者是另一种成瘾药物，BSA是一种可以用于连接这些药物的蛋白。然后用BSA-吗啡、BSA-吗啡类似物或BSA-成瘾药物缀合物涂覆颗粒。 
本发明的方法通常包括洗涤步骤，所述洗涤步骤常常在检测步骤之前进行。在洗涤步骤期间，去除了在步骤a)中没有与第二结合分子结合的第一结合分子。去除未结合的第一结合分子的优选方法是通过应用例如电磁铁、空心线圈或永久磁铁生成的磁力。但是，洗涤溶液的漂洗也是可以的。 
如先前提及的那样，第二结合分子附着于固体支持物上。在一个优选的实施方式中，固体支持物是传感器装置的表面。传感器装置可以含有任何适用于检测标记的检测器。合适的检测器是磁检测器、光检测器、声检测器、放射性检测器或电检测器。所述检测器可以是任何适用于依据颗粒的任何性能检测出磁性颗粒是否位于传感器表面上或邻近于传感器表面的传感器，例如可以通过磁学方法(例如抗磁性、Hall、线圈)、光学检测法(例如显像、荧光、化学发光、吸收、散射、消逝场技术、表面等离子共振、Raman等)、声学检测法(例如表面声波、体声波、悬臂(cantilever)、石英晶体等)、电学检测法(例如导电性、阻抗、安培计、氧化还原循环)等进行检测。 
在本发明中特别优选的是磁检测器。 
检测器可以是基于对位于传感器表面上或邻近于传感器表面的颗粒的磁性能的检测的任一合适传感器，例如线圈、金属线、抗磁性传感器、限磁传感器、Hall传感器、平板Hall传感器、磁通门传感器、SQUID、磁共振传感器等。但是，其他传感器例如光传感器同样也是优选的。 
在特别优选的实施方式中，表面是金、玻璃或透明塑料表面，特别是经结合有第二结合分子的蛋白涂覆的金、玻璃或透明塑料表面。
用上面所述的使得第一结合分子附着于磁性颗粒的方法可以实现第二结合分子对固体支持物例如传感器表面的附着。例如，可以通过用第二结合分子涂覆固体支持物来实现所述附着。也可以通过共价键直接地或者在间隔分子的辅助下实现所述附着。合适的间隔分子是烷撑二胺或乙二胺。 
在一个优选的实施方式中，通过强结合对实现所述附着。在这个实施方式中，强结合对中的一个结合配偶体可以附着于固体支持物上，而强结合对中的另一个结合配偶体可以附着于第二结合分子或者其本身就是第二结合分子。 
与第一结合分子对磁性颗粒的附着一样，优选的用于将第二结合分子附着于固体支持物上的强结合对的实例是抗生物素蛋白/生物素、半抗原/抗体、蛋白或肽/抗体、蛋白/碳水化合物、蛋白/蛋白、核酸/核酸、蛋白/核酸以及半抗原/核酸。 
也如上面提及的那样，适用于此的抗生物素蛋白的变体包括链霉抗生物素和neutravidin。另一个实例是strep-标记II/strep-tactin对。 
合适的高亲和力抗体是针对那些抗半抗原或小分子包括染料、药物、激素和维生素激发的抗体。如上提及的那样，这些抗体包括抗地高辛、2，4-二硝基苯基(DNP)和荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)的抗体。 
蛋白-蛋白结合同样是合适的，例如蛋白A或蛋白G经免疫球蛋白的Fc段与免疫球蛋白的结合。植物凝集素例如结合糖蛋白的糖部分的伴刀豆球蛋白A同样是合适的。 
在另一个优选的实施方式中，通过用连接有结合分子的蛋白(例如牛血清白蛋白，BSA)涂覆固体支持物可以实现第二结合分子对固体支持物的附着。例如，如果第二结合分子是吗啡或吗啡类似物，或者是另一种成瘾药物，那么BSA就是一种可以用于连接这些药物的蛋白。然后用BSA-吗啡、BSA-吗啡类似物或BSA-成瘾药物缀合物涂覆固体支持物。 
用多种方法都可以实现根据本发明方法步骤b)的结合反应的检测。例如，通过磁传感器装置可以实现经由第一结合分子与第二结合分子的结合来检测结合于固体支持物的磁性颗粒的数目。 
另外，所述传感器可以是任何适用于依据颗粒的任何性能检测出磁性颗粒是否位于传感器表面上或邻近于传感器表面的传感器，例如可以通过  磁学方法(例如抗磁性、Hall、线圈)、光学检测法(例如显像、荧光、化学发光、吸收、散射、消逝场技术、表面等离子共振、Raman等)、声学检测法(例如表面声波、体声波、悬臂(cantilever)、石英晶体等)、电学检测法(例如导电性、阻抗、安培计、氧化还原循环)等进行检测。所述传感器可以是基于位于传感器表面上或邻近于传感器表面的颗粒的磁性能的检测的任一合适传感器，例如线圈、金属线、抗磁性传感器、限磁传感器、Hall传感器、平板Hall传感器、磁通门传感器、SQUID、磁共振传感器等。 
就生物传感器表面而言，有或没有扫描传感器都可以进行检测。 
用于本发明所述的检测的传感器和方法可以被用作小体积样品的快速、稳定并容易使用的即时检测型(point-of-care)生物传感器。反应室可以是与小型读取器一同使用的一次性物品，其含有一个或多个磁场生成工具以及一个或多个检测工具。用于本发明检测的传感器和方法可以被用于自动化的高通量测定。在这种情况中，反应室是被安装到自动化装置中的例如孔板或比色杯。测量数据可以作为终点测量值并通过动态或间断地记录信号获得。 
可以用检测方法直接检测靶物。颗粒在检测之前还能被进一步处理。进一步处理的实例是加入材料或者修饰靶物的(生物)化学或物理性能以促进检测。 
此外，用于本发明检测的检测法、装置、传感器和/或方法都适用作多路传感器(即平行使用不同的传感器和传感器表面)、多路标记(即平行使用不同类型的标记或靶物)以及多路室(即平行使用不同的反应室)。 
或者，通过第一和第二结合分子的结合来检测结合到固体支持物上的磁性颗粒可通过如下方法实现：使得第三结合分子与附着于这些颗粒上的第一结合分子结合，随后对所述的结合进行检测。所述第三结合分子是能够选择性结合第一结合分子的分子。在一个实施方式中，在这个步骤检测磁性颗粒上这样的第一结合分子，其不参与与固体支持物上的任一第二结合分子的结合。 
通过可检测标记实现对上面提及的实施方式中的第三结合分子与第一结合分子的结合。该标记可以与第三结合分子直接相连。或者，通过允许与可检测标记相连并能够选择性地结合第三结合分子的试剂与第三结合分 子的结合可以使得可检测标记附着于第三结合分子。 
可以用感受方法直接检测出标记。同样，颗粒在检测之前还能被进一步处理。进一步处理的实例是加入材料或者修饰靶物的(生物)化学或物理性能以促进检测。此外，用于本发明检测的检测法、装置、传感器和/或方法都适用作多路标记(即平行使用不同类型的标记或靶物)。 
在这方面合适的标记是选自荧光标记、比色标记、化学发光标记、酶标记(例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP))、放射性标记、带静电的标记、以及供给(donating)/接受(accepting)型标记组成的组的标记。优选的标记是HRP。另一优选的标记是AP。 
本发明的方法适用于不同类型的样品。例如，它可以被应用于尿液样品、血液样品、汗液样品、泪液样品、口腔液体(唾液)样品或毛发样品。也可使用通过加工体液、组织或细胞使得它们成为适用于本发明的检测法所使用的状态获得的源自上述样品的样品。这些加工可以包括混合样品和合适的缓冲液或盐溶液、促溶剂、去污剂、或溶剂、搅拌、经化学或机械方法提取等等。 
在另一个部分，本发明涉及第一结合分子、附着于磁性颗粒的第一结合分子、第二结合分子、或附着于固体支持物的第二结合分子在本文所述的和/或所要求的任意方法中的用途，其中第一结合分子、磁性颗粒、第二结合分子、和固体支持物可以是在说明书和权利要求书中定义的任意第一结合分子、磁性颗粒、第二结合分子、和固体支持物。 
下面给出的图和实例应当可以举例说明本发明的原理，且不限制本发明的范围。 
实施例1：定量样品中的吗啡 
A：制备附着于抗吗啡抗体(Ab)的磁性颗粒(MP) 
在磁性颗粒收集器(MPC)中，从100μl磁性颗粒溶液中收集MP(Ademtech，200nm的蛋白G涂覆的MPs，编号0433)，并将其溶解于100μl PBS+0.65％Tween20。在加入10μl单克隆小鼠抗体(1mg/ml母液)之后，室温下混合混合物1h，随后用加有100μl PBS+0.65％Tween20的MPC洗涤两次以及加有三乙胺醇(0.2M，pH8)的MPC洗涤1次。将MP溶解在1ml DMP(20mM)三乙胺醇(0.2M，pH8)溶液内，室温下混合溶液30分钟。通过加入50μl Tris(1M，pH7.5，终浓度＝50 mM)并在室温下持续混合15分钟来终止交叉反应。分离出MP，并用加有100μl Tris(50mM，pH7.5)的MPC洗涤1次，以及在加入MPC的储存缓冲液洗涤1次，最终将MP溶解在100μl储存缓冲液中。 
A.检测 
金盘经侵蚀并用BSA或BSA-OPI(3μg/ml)的涂覆缓冲液(15mM碳酸钠、35mM碳酸氢钠、0.05％叠氮化钠，pH为9.6)涂覆。用洗涤缓冲液(0.05％Tween PBS溶液)洗涤经涂覆的盘3次。在反应管内，用稀释缓冲液(PBS+0.65％Tween20+10mg/ml BSA；2x测试浓度)制备出吗啡的连续稀释液。向试管内的每种稀释液内加入预混合的MP溶液(0.1％w/v＝1mg/ml MP缓冲液)(MP溶液：吗啡溶液＝1：1)。将50μl每种溶液分别倒入到孔内，并通过施加磁力30秒(6-24fN)来激动MP或允许MP沉淀30分钟。随后，通过施加磁力(70fN)30秒来去除未结合的MP，并向每个孔内加入100μl抗小鼠IgG-HRP(稀释缓冲液中母液的1:3000稀释液)，随后在室温下保温60分钟。用每孔200μl缓冲液洗涤盘4次，并将其转移到白色的微量滴定板上含有洗涤缓冲液的孔内。去除洗涤缓冲液，加入100μl AB混合物(ECL；按1:1混合A+B)，并在室温下保温5分钟。读取发光值。 
利用这个检测方案，与作为载体的BSA相连的吗啡被涂覆到金表面(物理吸附)。抗吗啡抗体(单克隆)被结合到经蛋白G涂覆的磁性颗粒(MP)上。通过有孔板利用游离吗啡与表面上的吗啡竞争珠上的抗体结合位点制备出剂量效应曲线(如图2所示)。如上解释的那样，珠被金表面下的永久磁铁吸引到生物活性表面，或者允许其沉淀到表面上。通过将永久磁铁放入到金表面上方的溶液内，可以从溶液中钓(fish)出未结合的珠。为了测定与表面结合的MP的量，进行与连接有HRP(辣根过氧化物酶酶)的第二抗体(山羊看小鼠抗体)的保温，随后洗涤掉未结合的第二抗体。然后，利用鲁米诺(HRP的底物)以及测定到的发光值确定出结合HRP的量。 
如图2所示，磁激动使得剂量效应曲线更陡，因此使得检测更为敏感。 
实施例2 
A.抗体对金表面的涂覆
在本发明方法的另一个实施方式中，首先需要将抗体放到金表面。如图3所示，但我们首先将蛋白G(pG)放在表面时，上述工作进行得最好。用50μg/ml蛋白G涂覆金表面。然后，洗涤并用不同量的抗体与所述的表面保温。此后，我们用吗啡-HRP保温表面，然后洗涤。在此之后，利用鲁米诺/发光确定出结合吗啡的量。所获得的信号反映出表面上的功能性抗体的量。图3中的暗灰色的条(抗体)代表没有蛋白G时直接结合在金表面上的抗体(物理吸附)。白色的条代表经BSA(无抗体，无蛋白G)涂覆的金表面，其用于检查非特异结合。 
B.吗啡对磁性颗粒(MP)的涂覆 
对于这个测定模式，我们也需要与MP结合的吗啡。在此我们使用购自Ademtech的COOH MP(使用200nm和300nm珠)。首先通过用EDC/NHS激活COOH基团使得吗啡-3-葡糖苷酸(glucoronide)与COOH颗粒结合。然后，活化基团与乙二胺反应(以获得游离的NH2结合位点)。反过来用EDC/NHC激活吗啡-3-葡糖苷酸，并使其与经处理过的MP反应。图4显示出了这些珠的功能性检测。如上所述将抗吗啡抗体放置在表面上(经蛋白G)，然后与吗啡结合的珠被金表面下的永久磁铁吸引到表面。通过将永久磁铁放入到金表面上方的溶液内，可以从溶液中钓出未结合的珠。此后，进行与生物素化的第二抗体的保温(可能是因为高水平生物素化的原因，我们观察到该抗体没有与蛋白G结合)，在洗涤步骤之后，实施与抗生物素链菌素-HRP的保温。之后，进行鲁米诺/发光以便定量出与表面结合的HRP的量。 
图4显示出了结果，前两个条代表不同的MP稀释液，第三个条代表没有抗体结合到表面的平行检测(用于检查MP-吗啡与表面的非特异结合)，第四个条代表用没有连接吗啡的MP平行实施的相同的检测。 
利用这个检测方案，我们观察到的一个优点是经吗啡涂覆的珠不会出现聚簇(这与经抗体涂覆的MP不同，那些MP容易出现聚簇)。进行单个珠的检测时，珠的聚簇常常是个问题。 
C.竞争性检测 
利用上述的MP和表面在有孔板内进行竞争性检测。图5显示出了结果。

Claims (24)

1.用于检测可疑含有靶物的样品中的所述靶物的方法，其中所述靶物只具有单一表位，所述方法包括：
a)使得样品以及附着于磁性颗粒的第一结合分子同时或在不同时间与附着于固体支持物的第二结合分子接触，其中所述第一结合分子能结合第二结合分子，并且其中所述靶物能干扰所述的结合；以及施加磁力使得所述磁性颗粒与固体支持物紧密接近；和
b)通过所述第一结合分子与第二结合分子的结合检测与固体支持物结合的磁性颗粒的数目，其中所述磁性颗粒的数目通过以下方法确定：允许能够选择性结合第一结合分子的第三结合分子结合附着于所述磁性颗粒的第一结合分子并检测与所述第一结合分子结合的第三结合分子，其中允许所述第三结合分子与之结合的第一结合分子是不参与结合第二结合分子的第一结合分子。
2.权利要求1的方法，其中所述第一结合分子能选择性结合样品中的靶物和第二结合分子，并且其中的结合步骤a)包括允许第二结合分子与靶物竞争与第一结合分子的所述选择性结合。
3.权利要求2的方法，其中所述第二结合分子与靶物相同或者是靶物类似物。
4.权利要求1的方法，其中所述第二结合分子能够选择性结合样品中的靶物以及第一结合分子，其中接触步骤a)包括允许第一结合分子与靶物竞争与第二结合分子的所述选择性结合。
5.权利要求4的方法，其中第一结合分子与靶物相同或者是靶物类似物。
6.权利要求1到5中的任一方法，其中靶物选自由小分子、药物、蛋白、肽、激素和核酸组成的组。
7.权利要求6的方法，其中所述靶物是成瘾药物。
8.权利要求7的方法，其中所述成瘾药物是吗啡、可卡因、THC、促合成药物、或苯丙胺/甲基苯丙胺族的药物。
9.权利要求1到5、7或8中的任一方法，其中施加磁力以便减少或消除靶物和附着于磁性颗粒的第一结合分子之间的移动性差异对结合第二结合分子的影响。
10.权利要求9的方法，其中通过电磁铁、空心线圈或永久磁铁施加磁力。
11.权利要求1到5、7、8或10中的任一方法，还包括在检测步骤b)之前去除在步骤a)期间没有与第二结合分子结合的第一结合分子的步骤。
12.权利要求11的方法，其中通过施加磁力去除没有与第二结合分子结合的第一结合分子。
13.权利要求1到5、7、8、10或12中的任一方法，其中所述第一结合分子经间隔分子、蛋白、或强结合对附着于所述的磁性颗粒，所述间隔分子是烷撑二胺或乙二胺。
14.权利要求1到5、7、8、10或12中的任一方法，其中所述固体支持物是传感器装置的表面。
15.权利要求14的方法，其中所述传感器表面是金表面。
16.权利要求15的方法，其中所述金表面用与第二结合分子结合的蛋白涂覆。
17.权利要求16的方法，其中所述蛋白是蛋白A或蛋白G，其中第二结合分子是能够分别被蛋白A或蛋白G结合的抗体。
18.权利要求1到5、7、8、10、12或15到17中的任一方法，其中在步骤b)中用磁传感器装置确定出磁性颗粒的数目。
19.权利要求1的方法，其中用可检测标记进行所述检测，所述标记与第三结合分子相连。
20.权利要求1的方法，其中所述检测通过如下方法进行：允许与可检测标记相连并能选择性结合第三结合分子的试剂与结合于所述第一结合分子的第三结合分子之间的结合，然后检测所述可检测标记。
21.权利要求19或20的方法，其中所述可检测标记选自荧光标记、比色标记、化学发光标记、酶标记、放射性标记、带静电的标记和供给/接受型标记组成的组。
22.权利要求1到5、7、8、10、12或15到17、19或20中的任一方法，其中所述样品包括或源自尿液、血液、汗液、泪液、唾液或毛发。
23.权利要求1的方法，其中所述磁性颗粒选自抗磁性颗粒、顺磁性颗粒、超顺磁性颗粒、亚铁磁性颗粒和铁磁性颗粒组成的组。
24.权利要求1的方法，其中所述磁性颗粒的大小是10nm到10μm。
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