CN101313217A - 通过形成强结合偶联体进行敏感磁性捕获测定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测疑似包含靶的样品中的靶的传感器装置，所述装置适合在如夹心测定的测定中使用。本发明进一步涉及一种用于检测样品中的靶的方法。所述装置包含传感器表面，该表面通过强结合偶联体的一个部分进行官能化，优选所述部分对靶分子显示很小的交叉反应性或没有交叉反应性。

Description

通过形成强结合偶联体进行敏感磁性捕获测定

发明领域

本发明涉及一种用于检测疑似包含靶的样品中的靶的装置。本发明进一步涉及一种检测样品中的靶的方法。

发明背景

卫生保健研究的一部分涉及研发诊断措施以确定存在或不存在特异性蛋白质和其它生物学化合物，如DNA、RNA、激素、代谢物、药物等，以及确定活性和催化性生物分子如蛋白质、肽、朊病毒、酶、适体、核酶和脱氧核酶的活性和功能。免疫测定已经用于确定体液中特异性蛋白质的量以帮助进一步的诊断和治疗。

一种公知的免疫测定为双抗体“夹心”ELISA。这种测定用于确定未知样品中的抗原浓度。夹心ELISA需要两种抗体，所述抗体结合在抗原上不重叠的单独的表位。这可通过用两种识别离散位点的单克隆抗体或针对抗原上不同表位的亲和纯化的多克隆抗体实现。

为利用这种测定，将一种抗体(捕获抗体)纯化并结合一般附着在孔板底部的固相上。然后加入抗原并使其与结合抗体复合。然后洗涤除去未结合的产物，使用酶标记的第二抗体(检测抗体)结合抗原，从而完成“夹心”。然后该测定通过测定由酶转化的结合在基质上的第二抗体的显色底物进行定量。也常常应用包括使用荧光或化学发光标记的其他标记技术。

图1示出了夹心形式。在这个实例中，靶3通过结合部分2与传感器表面3结合。靶与传感器表面的结合速率dN/dt大约以下式给出(单位s^-1)：

(1) $\frac{\mathrm{dN}}{\mathrm{dt}}=A{k}_{\mathrm{on}}\left[\mathrm{Cap}\right]\left[T\right],$

A为传感器表面的面积(单位m²)，k_on为结合过程的结合常数(单位m³/s)，[Cap]为传感器表面上捕获位点的浓度(单位m^-2)，以及[T]为直接传感器表面上方的溶液中靶的浓度(单位m^-3)。在非常低的靶浓度的情况下，图1中的测定可表现下述缺点。

第一，由于制造成本，特别是当传感器表面为硅芯片时，因此传感器表面A受到限制。

第二，需要液体的活动(例如，混合、剪切流)以避免在传感器表面上方出现靶消耗(target-depletion)。这使适合用于该方法的装置的设计复杂。可通过增加捕获面积A，例如，通过将靶分子捕获在溶液中悬浮的颗粒表面上促进第一捕获过程。这称为捕获测定。图2示出了一个实例。由于颗粒直径小，总表面积可非常大，因此结合速率可非常高。然而，这种测定的缺点在于：最终检测步骤需要使含有靶复合物的纳米颗粒结合到传感器表面1上。由于空间位阻，即由于需要通过小得多的生物分子偶联，即通过靶3与部分2和5偶联两个大表面(颗粒表面4和传感器表面1)，因此这个过程会非常缓慢和低效。

另一标准测定形式为竞争测定。这种测定适合用于仅含有一个表位、因此不能用夹心测定来检测的小靶分子。在竞争测定中，靶分子与靶同源物竞争一般位于标记上或位于传感器表面上的结合位点。然后检测由靶同源物占据的结合位点，这随靶浓度的降低而增加。图7中描述一个实例，其中靶分子3与靶同源物9竞争结合部分5。在高浓度靶分子3时，部分4上的大部分结合位点由靶3占据。然而，如在图7的第二排所示，在低浓度的靶3时，部分4上的大部分结合位点由靶同源物9占据。与夹心测定不同，竞争测定间接测定靶的浓度。对于图7中示出的实例，对于靶同源物的捕获过程，公式(2)是有效的：

(2) $\frac{\mathrm{dN}}{\mathrm{dt}}=A{k}_{\mathrm{on}}\left[\mathrm{Cap}\right]\left[\mathrm{TH}\right],$

其中[TH]为靶同源物(单位m^-2)，A为传感器表面的面积(单位m²)，k_on为结合过程的结合常数(单位m³/s)，以及[Cap]为溶液中捕获位点的浓度(单位m^-3)。

与夹心测定相似，通过将靶同源物置于在溶液中分散的颗粒上可以加速靶同源物的捕获过程(图8的顶排示出高靶浓度而底排示出低靶浓度)。然而，遇到了与夹心测定相同的困难，即纳米颗粒结合传感器表面的困难。

US2003/0215825提出了一种检测或鉴定痕量分子靶的方法。这个方法基于如互补核酸之间的沃森-克里克结合和抗原-抗体结合的大分子彼此的特异性亲和力。根据这个方法，合成对特异性分子靶显示高亲和力和特异性的一对探针。所述探针对中的一个与感知装置的表面结合，而另一个附着于可以为磁性标记的颗粒。在所述方法中，分子靶被夹在官能化标记和官能化固体表面之间。

这个方法没有解决上述缺陷。另一个缺点在于：需要提供以高亲和力特异结合靶的探针和需要通过将其中之一结合到传感器表面而对传感器表面进行改性。这是对待确定的各新靶不得不进行的复杂过程。

本发明的目的是克服这些缺陷中的至少一种。又一目的是提供适合用于多种测定和不仅适用于确定一种特异性靶组合物的传感器装置。

又一个目的是在标记和传感器表面之间建立分子夹心形式，特定的问题在于靶捕获速率以及传感器表面上夹心形成的过程应当快速并优选在溶液中进行。

另一个目的是提供一种竞争测定形式，其中靶和靶同源物捕获速率快速，而且标记快速结合于传感器表面。

发明概述

我们惊奇地发现通过磁性传感器装置达到这些目的中的至少一个，所述磁性传感器装置具有用强结合偶联体的一个部分官能化的一个表面，所述部分优选与靶或靶同源物分子显示很小的交叉反应性或无交叉反应性。

因此，本发明的第一方面涉及用于检测疑似包含靶的样品中的靶的磁性传感器装置，该装置包括用强结合偶联体的至少一个部分(A)官能化的传感器表面，所述部分(A)优选与靶分子或靶同源物显示很小的亲和力或无亲和力。

本发明的又一方面涉及使用要求保护的装置用于检测疑似包含靶的样品中的靶的方法。

本发明的另一方面涉及适合用于检测疑似包含靶的样品中的靶的试剂盒。

附图说明

图1示出夹心测定。

图2示出捕获测定。

图3示出使用强结合偶联体6、7的夹心测定。

图4示出图3中应用具有多个部分(6)的颗粒的测定。

图5示出存在2个表面，一个用于结合非结合部分(6)和一个用于结合标记(4)的实施方式。

图6示出使用要求保护的测定方法用于检测不同的靶。

图7和8示出竞争测定的多种实施方式。

图9示出竞争测定中使用强结合偶联体。在上排靶浓度高，下排靶浓度低。

图10示出其中靶同源物直接结合强结合偶联体的部分(B)的竞争测定的实施方式。

图11/12示出其中使用具有多个部分(6)的颗粒的竞争测定。

图13/14示出竞争测定的实施方式，其中存在两个表面，一个用于结合未结合部分(6)，一个用于结合标记(4)。

发明详述

“靶分子”为待确定其浓度或存在的任何分子。靶分子的实例为如蛋白质、酶、激素、肽、核酸的分子靶和如病原体细胞、细菌细胞和真菌细胞的细胞靶。靶分子可存在于被分析的样品中或在传感器装置中，例如通过在装置中发生的反应原位形成。如果该传感器用于监测反应，所述靶可以例如为反应原料或反应产物。

提到“在溶液中”指的是反应或测定是在液体环境中进行。参与的试剂不需要被溶解在液体介质中，但是也可以悬浮或分散状态存在。

强结合偶联体为在两个部分之间特异结合的两个部分(分子)A和B的组合，其中部分A以比其它分子更强或更优先结合部分B，并对其它分子显示很小的交叉反应性或无交叉反应性。一般而言，用于部分A和B之间特异结合的亲和常数(Ka)为至少10⁶l/mol，更优选至少10¹⁰l/mol，甚至更优选至少10¹¹l/mol，甚至更优选至少10¹²l/mol，甚至更优选10¹³-10¹⁷l/mol。

为强结合偶联体(BC)的一部分的部分(A)和(B)对靶分子显示很小的亲和力或无亲和力。在本发明中，将“很小的亲和力或无亲和力”限定为具有小于10³L/mol的亲和常数(Ka)。

互补结合偶联体部分是指包含部分(B)和以下i)和ii)之一的组合物：

i)能结合靶的一部分或靶同源物的一部分的结合探针，或

ii)靶同源物。在一些类型的测定中，互补结合部分的结合探针将结合靶本身。例如，对于其中直接确定靶的量的标准夹心测定就是这样。

在竞争测定中，确定靶同源物的量而不是靶的量。对于这些类型的测定，互补结合偶联体的结合探针优选与靶和靶同源物两者结合。应该理解这种结合优选在一个分子中不同时发生。

将靶同源物限定为包含靶的至少一部分(优选所述部分区别于其它相关分子)的构建体，或结合探针与靶结合类似强度的构建体。将类似强度结合限定为具有Ka优选10³系数，优选10²系数，最优选10或更小的系数的差异。希望不受任何理论限制，认为靶和靶同源物常常共有用于结合探针的相同的表位。

标记结合探针是指包含可检测标记和能够结合靶或靶同源物部分的结合探针的组合物。

本发明的一方面涉及一种磁性传感器装置。所述传感器装置包含用至少一个为强结合偶联体的一部分的部分(A)官能化的传感器表面。该结合偶联体由部分(A)和(B)形成。本发明优选部分(A)和(B)对靶分子或靶同源物显示很小的亲和力。

图3说明了本发明的一个实施方式。在这个实施方式中，通过第一结合探针(5)将靶(3)捕获到可检测标记(4)上。具有附着于其上的探针的标记优选在溶液中悬浮。在溶液中，加入包含部分(B)(标记6)和能够结合靶的第二部分的结合探针(2)的复合物(绘制为2结合6)，以完成夹心形式。这个复合物也称为互补结合偶联体部分。在标记和部分(B)之间结合后，得到的标记-靶-互补结合偶联部分复合物通过由部分6和7组成强结合偶联体与传感器表面1结合。

本发明的另一实施方式涉及竞争测定。这在图9中描述。图9的顶排上示出具有高靶浓度的实施方式，下排示出具有低靶浓度的实施方式。在这个实施方式中，靶(3)和附着在可检测标记4上的靶同源物(9)，通过包含结合探针5和部分(B)(标记6)的复合物竞争捕获。5、6结合靶同源物后，得到的包含靶-同源物-互补结合偶联体的标记通过由部分6和7组成的强结合偶联体与传感器表面1结合。

图10示出对于高浓度(顶排)和低浓度(底排)靶的情况涉及竞争测定的又一实施方式。在这个实施方式中，靶同源物9与部分B(标记6)复合，且这个复合物与靶(3)竞争结合附着于可检测标记的互补结合偶联体(5)。在靶或靶同源物结合可检测标记后，该标记通过强结合偶联体，部分(6)和(7)结合传感器表面(1)。

这种溶液的优点在于：(i)由于溶液中靶和靶同源物捕获到可检测标记的表面上，因此靶和靶同源物的结合速率高；和(ii)由于使用强结合偶联体，因此标记结合到传感器表面快速而高效。

在强结合偶联体中，由于A通过B的存在而限定，因此可将任何化学种类选为A以及任何种类可为B。然而优选在选择哪种为A和哪种为B时，选择B使得在将其与互补结合探针/或靶同源物偶联时，互补结合探针/或靶同源物的功能性不会显著降低或改变。例如，如果强结合偶联体为半抗原-抗体，优选认为A为抗体和B为半抗原，因为半抗原通常小并且可容易地与其它生物分子偶联。优选强结合偶联体的实例为抗生物素蛋白/生物素、半抗原/抗体、蛋白质或肽/抗体、蛋白质/碳水化合物、蛋白质/蛋白质、核酸/核酸、蛋白质/核酸和半抗原/核酸。

蛋白质抗生物素蛋白和分子生物素之间的相互作用广泛用于连接生物分子与其它部分。抗生物素蛋白与生物素的亲和常数(K_a)在已知最高的大约为10¹⁵L/mol，因此在正常测定条件下该结合认为是不可逆的。除了高亲和力外，在各抗生物素蛋白分子上可获得4个结合位点。生物素化或用生物素化学标记蛋白质是容易的并且不会降低生物学活性。通过包括碳二亚胺的标准连接剂也可将抗生物素蛋白化学偶联于其它蛋白质。有许多种类的市售抗生物素蛋白，包括链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(neutravidin)，其糖基化程度、等电点和非特异性结合特性不同。另一选择为strep-tag II/streptactin偶联体。

针对包括染料、药物、激素和维生素的半抗原或小分子可产生高亲和力抗体。一般而言，可产生针对几乎任何半抗原的抗体，存在对于如洋地黄毒苷、2，4-二硝基苯(DNP)和荧光素-5-异硫氰酸盐(FITC)的分子K_a大于10¹¹L/mol的许多高亲和力抗体。有数种已知的简单半抗原化方法，用于用半抗原化学标记分子。抗体的附着也可以用与用于抗生物素蛋白的描述的相似的化学技术或用于偶联蛋白质的重组技术完成。

蛋白质或肽对其抗体的特异性和高结合亲和力是许多免疫测定的基础。这种相互作用的亲和常数可高达10¹³L/mol，并且可根据使用的特定肽或蛋白质变化许多数量级。

在特定类型的蛋白质之间发生蛋白质-蛋白质结合。例如，已知A蛋白和G蛋白对免疫球蛋白的Fc部分具有高亲和力。相似地，伴刀豆凝集素A是结合糖蛋白的碳水化合物部分的凝集素，虽然其与免疫球蛋白的结合不如A蛋白和G蛋白强。这些相互作用特异性较低，仅可用于样品不包含Fc区或样品不是糖蛋白的测定。为了达到需要的特异性并降低交叉反应性，可将在测定中不针对的这些结合相互作用的抗体和蛋白质进行修饰。例如，人们可合成去除Fc或糖基化区域的重组抗体。

核酸链、DNA、RNA或PNA与具有互补序列的链的结合基于沃森-克里克碱基配对。链与其互补物的结合强度由链中碱基数目、其特异性碱基含量和核酸类型决定，PNA结合比RNA强，而RNA又比DNA结合强。如果其是互补的，不同类型的核酸也可能杂交。

折叠成二级结构的核酸具有以与抗体相似的亲和力结合蛋白质和半抗原靶的能力。这些称为适体的核酸通常为可使用常规技术合成的短单链RNA和DNA单元。使用基于其与靶的结合亲和力的进化选择技术(evolutionary selection technique)(SELEX)从链文库选择特异性靶的适体的碱基序列。

传感器装置优选包含用于引入样品的工具。

任选地，所述装置可适合进行多个靶的平行测定。在这个实施方式中，传感器表面用属于不同结合偶联体的至少2个不同部分(A)和(A’)进行官能化。在这个实施方式中，选择特异性结合偶联体用于分析不同的靶。任选地，所述装置包含多个传感器，优选至少一个用于各个靶，其中在为装置的一部分并且对应于特异性靶的各传感器的表面设置了不同的结合部分(A)、(A’)、(A”)等。在使用时，各结合部分(A)、(A’)等将与对应的结合部分(B)、(B’)互补，所述对应的结合部分是特异性靶的互补结合偶联体部分的一部分。

图6中说明了用于夹心测定的这种多个靶平行分析。

在这种测定中，多个靶(3)被夹在结合探针(2)和(5)之间，其中探针(5)与纳米颗粒标记(4)偶联。与连接到表面相反，探针(2)和(5)在溶液中游离存在。在优选的实施方式中，探针(2)与包含部分(6)(强结合偶联体的部分(B))的纳米颗粒(8)以高密度偶联。

在这个实施方式中，部分(6)结合部分(7)(强结合偶联体的部分(A))，部分(7)与传感器表面(1)偶联。部分2、5、6和7与各靶3不同。对于使用多个强结合偶联体使具有多种不同的靶同源物-互补结合探针复合物与传感器表面结合的竞争测定存在相似方案。

根据另一实施方式，所述装置包含单一传感器。在使用中，多种第一结合探针各与具有不同性质的探针结合，从而能检测到样品中的不同靶。

应该理解如果在竞争测定中标记结合的探针、靶和互补结合偶联体部分形成夹心前，或者在互补结合探针捕获靶或靶同源物之前，结合部分(A)和(B)相遇并有效地结合，对于测定是不希望的和潜在烦扰的。这种初步结合可阻断传感器表面的一部分。尤其是，这种情况在有相对高浓度的结合部分(B)存在时出现。为避免这种情况，优选所述传感器装置包含一个用于夹心形成或靶/靶同源物捕获的区室和另一个用于将互补部分(B)结合于强结合偶联体的部分(A)的区室。

强结合偶联体的部分(A)可以任何合适的方式与传感器表面连接。这种附着(也称为连接、包被或键合)可以通过如共价连接或非共价连接的任何合适的方法。优选所述附着通过直接相互作用而不是通过随机结合。连接的实例为在部分A的末端存在半胱氨酸残基时通过硫桥或硫键连接。

传感器装置可包含用于检测标记的任何合适的检测器。合适的检测器为磁性检测器、光学检测器、放射活性检测器或电检测器。在本发明中高度优选所述检测器为磁性检测器。

本发明的又一方面涉及一种用于检测疑似包含靶的样品中的靶的方法，该方法包括：

a)将能够结合靶的第一部分或与靶同源物的第一部分的第一结合探针附着于可检测标记，以形成标记结合探针；

b)将强结合偶联体(BC)的至少一个部分(A)附着于支持物，所述部分(A)对靶分子显示很小的亲和力或无亲和力。

c)提供一种复合物，其包含至少一个部分(B)和以下(i)或(ii)之一，所述部分(B)是所述强结合偶联体(BC)中的部分(A)的结合配偶体：

i)能够结合靶的一部分或靶同源物的一部分的结合探针，或

ii)靶同源物，以形成互补结合配偶体部分；

d)使标记-结合探针、疑似包含靶的样品、支持物和互补结合偶联体部分接触；

e)检测与支持物结合的标记，其中所述标记为磁性标记或与磁性颗粒连接。

本发明的优选方面涉及一种检测疑似包含靶的样品中的靶的方法，该方法包括：

a)将可检测标记与能够结合靶的第一部分或与靶同源物的第一部分的第一结合探针附着于可检测标记，以形成标记结合探针；

b)将强结合偶联体(BC)的至少一个部分(A)附着于支持物，所述部分(A)对靶分子显示很小的亲和力或无亲和力。

c)提供一种复合物，其包含至少一个部分(B)和至少一个第二结合探针，所述部分(B)是所述强结合偶联体(BC)中的部分(A)的结合配偶体，所述第二结合探针能够结合靶的第二部分或靶同源物的第二部分，以形成互补结合偶联体部分；

d)使标记结合探针、疑似包含靶的样品、支持物和互补结合偶联体部分接触；

e)检测与支持物结合的标记。

这个方法也称为“夹心”法。

本发明的另一方面涉及一种用于检测疑似包含靶的样品中的靶的方法，该方法包括：

a)将至少一个靶同源物附着于可检测标记；

b)将强结合偶联体(BC)的至少一个部分(A)附着于支持物，所述部分(A)对靶或靶同源物分子显示很小的亲和力或无亲和力。

c)提供一种复合物，其包含至少一个部分(B)和至少一个结合探针，所述部分(B)是强结合偶联体(BC)中的部分(A)的结合配偶体，所述结合探针能够结合但不是同时结合靶和靶同源物；

d)使标记结合靶同源物、疑似包含靶的样品、支持物和互补结合探针接触；

e)检测与支持物结合的标记。

本发明的又一部分为用于检测疑似包含靶的样品中的靶的另外的“竞争”方法，该方法包括：

a)将能够结合但不是同时结合靶和靶同源物的结合探针附着于可检测标记，以形成标记结合探针；

b)将强结合偶联体(BC)的至少一个部分(A)附着于支持物，所述部分(A)对靶分子或靶同源物显示很小的亲和力或无亲和力。

c)提供包含强结合偶联体(BC)中的部分(A)的结合配偶体的至少一个部分(B)和至少一个靶同源物的复合物；

d)使标记结合探针、疑似包含靶的样品、支持物和靶同源物和强结合偶联体部分的复合物接触；

e)检测与支持物结合的标记。

上述两种方法也称为“竞争”法。

鉴于在部分(A)和(B)之间初步结合的上述风险，优选步骤(d)中包含两个分开的步骤，包括：

(d1)

i)对于夹心法，使标记结合探针、样品和互补结合偶联体部分接触使得形成标记-靶第二结合探针复合物，

ii)对于如上所述的第一竞争方法，使标记结合靶同源物、样品和包含探针和结合部分B的复合物接触，

iii)对于如上所述的第二竞争方法，使标记结合探针、样品和包含靶同源物和结合部分B的复合物接触；

(d2)使生成的包含标记的复合物与至少附着于部分(A)的支持物接触。

优选进行分析的样品和所有其它组分在分析过程中以液体形式存在于装置中。然而，一些进行分析的组分最初可以以干燥形式存在。

为了在检测过程中避免高本底信号，有益地是去除没有与靶或靶同源物结合的过量的标记和结合部分B。因此，在优选的实施方式中，在步骤(d2)之前，将在夹心法中没有与靶结合的或在竞争法中没有与靶同源物结合的过量的互补结合偶联体部分和过量的标记-结合探针去除。下面在优选的实施方式中描述了这如何在磁性传感器中实现。

在另一方面本发明涉及一种用于检测疑似包含靶的样品中的靶的方法，包括向本发明的传感器装置中引入样品，和进一步向所述装置中引入

a)附着了能够与靶的第一部分或靶同源物的第一部分结合的第一结合探针的可检测标记，

b)一种复合物，其包含作为强结合偶联体(BC)中的部分(A)中的结合配偶体的部分(B)和以下i)或ii)之一：

i)能够与靶的第二部分或靶同源物的第二部分结合的结合探针，或

ii)靶同源物。

靶或靶同源物的检测基于检测存在或不存在可检测标记。可检测标记可以为如荧光标记、比色标记、化学发光标记、具有对应的转化产物(例如，化学发光、荧光、静电荷电类和电子供体/受体类)的酶标记、磁性标记、放射活性标记、静电荷电标记、供体/受体标记的任何标记。最优选，所述标记为磁性标记或与磁性颗粒连接的标记。

对于磁性传感器，所述分析基于检测与传感器表面结合的标记。本测定的装置涉及与表面连接，因此使用磁性标记是非常优选的。

如果所述标记是磁性标记，通常使用粒度可为10nm至数微米之间、更优选30nm至300nm之间的磁性颗粒。在优选的方法中，所述磁性颗粒大于测定中涉及的单独的生物分子。

磁性颗粒可通过磁场而引发。当以这种方式施力而将磁性颗粒带到传感器表面时，可增强生物学结合速率。同样，可以施加磁力以区分弱结合和强结合，称为磁性严格性。

所述磁性标记可以为任何形状或形式。所述标记包括例如在电场中永久或暂时产生磁偶极子的任何形式磁性的磁性、反磁性、顺磁性、超顺磁性、铁磁性、铁磁性的一种或多种磁性颗粒的任何形式。

由于上述特定原因，优选所述方法包括将包含不与靶或靶同源物结合的部分(B)，或不附着于标记的具有部分B的靶同源物的互补结合复合物去除的步骤。在标记为磁性标记的情况下，洗去不与靶或靶同源物结合的部分(B)，或不与标记结合的具有部分B的靶同源物分别在夹心和竞争测定形式中通过图5、13和14说明的方法容易实现。在这个实施方式中，传感器包含第二表面(10)，所述第二表面(10)具有其上附着结合部分(A)的其上附着生物传感器表面(1)上游的结合部分(A)(7)。表面(10)被磁性驱动以排斥磁性标记(4)从而仅允许游离的、未结合部分(B)(6)与其结合。

优选地在相同时间磁性表面1被磁性驱动，使得通过朝向生物传感器表面1的介质吸引磁性标记(4)。这种不同传感器表面驱动的组合有助于结合包含磁性标记的复合物和除去未结合的包含部分(B)的复合物结合偶联体部分。

所述标记和第一结合探针或靶同源物可在有或没有接头时彼此附着。任选地，所述附着通过如附着至少一个标记和至少一个第一结合探针或至少一个靶同源物的纳米颗粒的核心分子进行。在可选择的实施方式中，所述标记和结合探针或靶同源物通过接头连接。

在实施例中，所述标记为磁性标记且其与结合探针缀合。为了形成磁性标记与结合探针的缀合物，可将改性磁性标记的表面。这种改性可以例如通过用葡聚糖、具有合适端基的烷硫醇、某些肽等覆盖磁性标记的表面而进行。葡聚糖分子可通过氰基溴化物活化或羧酸活化与如抗体的结合探针共价结合。

第一和第二结合探针为优选与靶或靶同源物分子的不同部分(表位)结合的探针。合适的结合探针的实例为Affibodies^TM、抗体、受体分子、适体和螯合剂。

在靶为核酸的情况下，第一和第二结合探针包含具有与靶序列的部分互补的碱基序列的核酸。在竞争测定的一些实施方式中，希望结合探针对靶和靶同源物可均具有亲和力(但是如前所述，优选在一个分子中不是相同时间)。

优选所述结合探针为特异结合靶的抗体。

强结合偶联体的第二或互补部分为结合部分(B)。在本发明的方法中提供了一种复合物，其包含作为强结合偶联体(BC)的部分(A)的结合配偶体的部分(B)和以下i)或ii)之一：

i)能够与靶的部分或靶同源物的部分结合的结合探针或

ii)靶同源物，以形成互补结合探针偶联体部分。该复合物可包含部分B和第二结合探针或靶同源物的缀合物。在本发明中，所述缀合物为其中在部分B和第二结合探针之间有连接、优选为共价连接的化合物。

为了增加部分(A)和(B)相遇的可能性以及将标记有效地结合到传感器表面，高浓度的(A)和(B)是令人希望的。在优选的实施方式中，通过包含附着了多个结合部分(B)的核心的复合物实现强结合偶联体的密度的增加。

在优选的实施方式中，所述复合物包含核心，所述核心附着了至少2个结合部分(B)和至少1个i)能够与靶的部分或靶同源物的部分结合的结合探针或ii)靶同源物。

在更优选的实施方式中，至少3个、更优选至少4个、甚至更优选至少5个、甚至更优选至少6个结合部分(B)与核心结合。

图4示出了在核心结构表面存在大量结合部分(B)的方法的实例。在这个测定中，靶3被夹在结合探针2和5之间，其中部分5与纳米颗粒标记4偶联，而部分2与以高密度包含部分(B)6的纳米颗粒8偶联。因此，部分6结合部分7，部分7与传感器表面1偶联。图11和12描述了用于竞争形式的相似方案。

为了在部分(A)和(B)的结合过程中降低空间位阻，优选所述复合物的核心具有2至200nm的小直径。

所述核心可以由任何合适的材料制成。合适的核心材料的实例包括聚苯乙烯、二氧化硅和磁性颗粒。

在优选的实施方式中，复合物的核心和标记均具有磁性。这有助于(A)和(B)之间的强结合，并进一步有助于去除不与靶结合的部分(B)，或用于不与标记结合的竞争测定。

在一个实施方式中，将部分(B)附着于具有磁性的核心。在该实施方式中，磁场可用于增加部分(A)和(B)之间的结合速率。因此优选选择与标记具有对磁性不同频率依赖性的纳米颗粒作为核心材料。优选地，所述纳米颗粒仅对低频场感应，而标记对低频以及高频感应。那么，在远离传感器表面，通过低频场在颗粒吸引下可形成夹心。通过高频场在吸引下可与表面结合。结果，非夹心纳米颗粒或未附着于标记的纳米颗粒不结合到传感器表面，从而可容易地去除。

另一方面，本发明涉及一种适合用于检测疑似包含靶的样品中的靶的试剂盒，其包含

a)一种装置，其包含用强结合偶联体的至少一个部分(A)官能化的表面

b)包含强结合偶联体部分(B)的试剂。

这种装置的主要优点之一在于其允许分开结合和检测步骤。所述结合步骤可在溶液中进行，由于结合组分的较高移动性和用于结合的较大表面积，结合可更有效，而检测可在所述装置中的表面进行。在一个装置中这两个事件的物理分隔降低了在装置中进行的测定(包括检测步骤)需要的总时间。

包含强结合偶联体部分(B)的试剂在以上描述更详细。

在进一步优选的方面，本发明涉及一种适合用于检测疑似含有靶的样品中的靶的试剂盒，其包含

a)本发明的传感器装置

b)包含一种复合物的区室，所述复合物包含作为强结合偶联体(BC)的部分(A)的结合配偶体部分(B)，和以下i)或ii)之一

i)能够结合靶的第二部分或靶同源物的第二部分的结合探针，或

ii)靶同源物。

可选择地，部分B和第二结合探针或靶同源物的复合物不存在于分开的区室中，但是以结合靶、靶同源物或标记被隐蔽的方式包括在装置中。这种装置允许发生最初反应或过程，接着暴露复合物以可能结合靶、靶同源物或标记。可以多种方式、例如通过胶囊化或防止结合的物理手段进行隐蔽。

这种试剂盒优选以具有合适的标记类型的说明书、分析中也应当使用与能够结合靶的第一部分的第一结合探针连接的标记的说明书出售。

任选地所述试剂盒额外包含可检测标记化合物，并且优选说明这个标记可怎样与合适的结合探针连接。在优选的实施方式中，将可检测标记官能化以有助于其上附着合适的结合探针。

在进一步优选的实施方式中，所述试剂盒额外包括一个区室，所述区室包含附着于第一结合探针的可检测标记，以形成标记-结合探针，所述第一结合探针能够结合靶的第一部分。

通过下述非限制性实施例说明本发明。

实施例1使用强结合偶联体中性抗生物素蛋白/生物素检测人甲状旁腺素(PTH)

1.材料

-中性抗生物素蛋白

-生物素化-BSA(牛血清白蛋白)

-人PTH

-300nm用α-PTH捕获抗体包被的磁性颗粒

-PTH生物素化α-PTH示踪物抗体

2.方法

A.用中性抗生物素蛋白包被GMR表面

-用BSA-生物素(1mg/mL；1小时)包被GMR Au表面并用PBS(磷酸缓冲盐水)中的3％ BSA封闭

-用PBS中0.05％ Tween20洗涤表面

-然后用100g/mL的中性抗生物素蛋白在室温将表面温育30分钟，然后洗涤

B.用捕获Ab包被的磁性颗粒与PTH和生物素化示踪物Ab的结合

-将磁性颗粒与PTH在测定缓冲液中在室温和300rpm温育30分钟。其后，加入生物素化α-PTH示踪物Ab并将该混合物进一步温育60分钟。

-将该悬浮液洗涤3次并在测定缓冲液中重悬浮。

C.磁性颗粒标记的PTH与中性抗生物素蛋白-GMR表面的结合

-表面上具有中性抗生物素蛋白的GMR传感器暴露于来自B的100L反应后的测定溶液。

-使用大约8e5A/m的场，使用外部电磁线圈，将磁性颗粒标记吸引到传感器表面总共15分钟，然后，在所述传感器上方用线圈以相反方向施加相同强度的磁力。这种磁性洗涤进行10分钟。

-用GMR传感器检测结合的磁性标记的数量。

确定来自附着于GMR-中性抗生物素蛋白表面的磁性标记的GMR信号作为PTH分析物浓度的函数。值如下所示：

Claims (15)

1.用于检测疑似包含靶的样品中的靶的磁性传感器装置，该装置包括用强结合偶联体的至少一个部分(A)官能化的传感器表面，所述部分(A)对所述靶分子显示很小的亲和力或无亲和力。

2.根据权利要求1所述的传感器装置，其中，所述强结合偶联体选自包括抗生物素蛋白/生物素、半抗原/抗体、蛋白质或肽/抗体、蛋白质/碳水化合物、蛋白质/蛋白质、核酸/核酸、半抗原/核酸和蛋白质/核酸的组。

3.根据权利要求1所述的传感器装置，其进一步包括用于引入样品的工具。

4.根据权利要求1所述的传感器装置，其中，所述表面用属于不同结合偶联体的至少2个不同部分(A)和(A’)官能化。

5.根据权利要求1所述的传感器装置，其适合用于夹心测定，所述装置包含一个用于形成夹心的区室和用于将互补部分(B)与强结合偶联体的部分(A)结合的另一区室。

6.根据权利要求1所述的传感器装置，其包含隐蔽的复合物，所述复合物包含

i)部分(B)，其是所述强结合偶联体(BC)的部分(A)的结合配偶体，

ii)和至少一个第二结合探针，其能够结合靶或靶同源物的第二部分；

这种隐蔽防止复合物与靶或靶同源物结合。

7.用于检测疑似包含靶的样品中的靶的方法，该方法包括：

a)将能够结合靶(3)的第一部分或靶同源物(9)的第一部分的第一结合探针(5)附着于可检测标记(4)，以形成标记-结合探针；

b)将强结合偶联体(BC)的至少一个部分(A)附着于支持物，所述部分(A)优选对靶分子显示很小的亲和力或无亲和力；

c)提供一种复合物，其包含至少一个部分(B)和以下i)或ii)之一，所述部分(B)是所述强结合偶联体(BC)中的部分(A)的结合配偶体：

i)能够结合靶的第二部分或靶同源物的第二部分的结合探针，或

ii)靶同源物，以形成互补结合配偶体部分；

d)使标记-结合探针、疑似包含靶的样品、支持物和互补结合偶联体部分接触；

e)检测与支持物结合的标记，其中所述标记为磁性标记或与磁性颗粒连接。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤(d)包含两个单独的步骤，所述步骤包括：

a)(d1)使标记结合探针、样品和互补结合偶联体部分接触，以允许形成标记-靶或靶同源物-第二结合探针复合物，

b)(d2)使形成的复合物与至少附着于部分(A)的支持物接触。

9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括步骤：其中在步骤(d2)之前，将没有与靶或靶同源物结合的过量的互补结合偶联体部分和过量的标记-结合探针去除。

10.根据权利要求7-8中任一项所述的方法，其中在(c)中，提供一种包含核心的复合物，所述核心附着了

i)至少2个结合部分(B)和

ii)至少一个能够结合靶的第二部分或靶同源物的第二部分的结合探针。

11.根据权利要求7-8中任一项所述的方法，其中所述复合物包含附着了至少2个能够结合靶的第二部分或靶同源物的第二部分的结合探针的核心。

12.一种用于检测疑似包含靶的样品中的靶的方法，其包括向根据权利要求1所述的传感器装置中引入所述样品，并且进一步向所述装置中引入

a)附着了能够结合靶的第一部分的第一结合探针的可检测标记，

b)一种复合物，其包含作为强结合偶联体(BC)的部分(A)的结合配偶体的部分(B)和以下(i)或(ii)之一

i)能够结合靶的第二部分或靶同源物的第二部分的结合探针，或

ii)靶同源物。

13.适合用于检测疑似包含靶的样品中的靶的试剂盒，其包含

a)一种装置，其包含用强结合偶联体的至少一个部分(A)官能化的表面

b)包含强结合偶联体的部分(B)的试剂。

14.适合用于检测疑似包含靶的样品中的靶的试剂盒，其包含

a)权利要求1所述的传感器装置

b)包含一种复合物的区室，所述复合物包含作为强结合偶联体(BC)中的部分(A)的结合配偶体的部分(B)和以下i)或ii)之一

i)能够结合靶的第二部分或靶同源物的第二部分的结合探针，或

ii)靶同源物。

15、根据权利要求14所述的试剂盒，其进一步包括一个区室，所述区室包含附着于第一结合探针的可检测标记，以形成标记-结合探针，所述第一结合探针能够结合靶的第一部分或靶同源物的第一部分。

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