JPH04506113A

JPH04506113A - 生物体の副集団の定量方法，試薬及びテストキット

Info

Publication number: JPH04506113A
Application number: JP2508139A
Authority: JP
Inventors: メルニコフ，メリル・ジェイ; ミュアヘッド，カサリン・エイ; ホラン，パウル，ケイ
Original assignee: ザイナクシス・テクノロジーズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1989-05-01
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 1992-10-22
Also published as: AU5675590A; DE69032854T2; ATE175025T1; US5256532A; FI915150A0; IL94087A0; EP0471792B1; CA2051373A1; EP0471792A4; DE69032854D1; WO1990014435A1; EP0471792A1; AU645014B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称：生物体の副集団の定量方法、試薬及びテストキ・ソト本発明は、同時係属米国出願、出願番号１８９，１９２；出願臼１９８８年５月２日：名称＝「生物影響物質を表面膜に結合する化合物１組成物及び方法」の部分継続出願である。

発明の分野本発明は生物学的検査法に関し、ことに被分析物（ａｎａｌｙｔｅｓ）を含む集合内において、少なくとも一つの特徴的なデイターミナント（ｄｅｔｅｒａ＋１ｎａｎｔ）を有する被分析物の副集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の存在又は量を定量する方法、及び該方法を実行するのに用いられる試薬及び試験キ・ソトに関する。本発明の方法。

試薬及び試験キットは、生物膜の脂質成分にたいして、検出可能なりボーク物質（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）を安定に結合し、固相に結合した特異的結合物質を介して注目する被分析物を分離し、該リポータ物質を検出することにより、細胞。

ウィルス等のスクリーニングを容易にする。

先行技術の説明血液又は骨髄の成分、例えば、白血球の副集団の定量は、一般的な臨床的診断検査になって来ており、それは異なった成分のデイターミナントと選択的−反応するモノクローナル抗体が一般的に入手可能になったことに起因してＬ）る。

これらの定量方法は免疫不全性疾患（ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、リンパｌ！ｌ（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、移植患者（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　ｐａｔｉｅｎｔｓ）における変化を監視するのに有用であることが証明されている。＾、　Ｌａｎｄａｙ及びＫ。

Ｍｕｉｒｈｅａｄ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｔｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）参照。免疫蛍光標識法（ｉｍ−ｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）に続いてフローサイトメトリー分析法（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を行うことは、かかる定量を行うための確立した方法である。

−フローサイトメトリーは、免疫蛍光顕微鏡法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍ１ｃｒｏ−ｓｃｏｐｙ）　、免疫細胞化学法（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、及び酵素免疫分析法（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの他の一般的に用いられている細胞マーカー分析技術（ｃｅｌｌ　ｍａｒｋｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を越えた決定的な利点を有する。バルク法（ｂｕｌｋ　ｍｅｔｈｏｄｓ）例えば、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）または酵素免疫分析法（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を越えた一つの重要な利点は、単一のサンプルにおける複数の細胞副集団を同時に定量することが可能であることである。フローサイトメトリーは手動的な蛍光顕微鏡を越えた幾つかの注目すべき利点を有する。

それらの中には、次のものがある。（ｉ）陽性又は陰性の免疫蛍光に関して数十個の細胞を迅速に計数する装置性能、（ｉｆ）結果の良好な再現性、（伍）データの恒久的な記録、及び（ｔｖ）弱い蛍光を持つ細胞を検出する強力な感度、が含まれる。

しかしフローサイトメトリーの一つの際立った欠点は、各副集団について個別的に操作し、分析しなければならないことである。この欠点は、とりわけ臨床試験室において重大であり、そこでは毎日多数の患者の試料を処理しなければならない。同時に多数のサンプルから細胞副集団を定量する能力は、臨床試験室又は研究室におけるこの操作の処理時間を大幅に減少させる。

多数のサンプルを分析する一つの提案方法は、酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）である。Ｊ、Ｅｎｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　１０２ニア７−８３　（１９８７）参照。この分析法は、９６穴マイクロプレート・リーダーを用いて一度に多数のサンプルの吸光を測定する。この分析法におけるリポーターシステはβ−ガラクトシダーゼと言う酵素を用い、それは血中の単球及び好中球に存在する。従って、血液標品は、この分析を行う前に妨害になる細胞又は細胞性物質を分離して除去しなければならない。その結果、この技術は全血液（ｗｈｏｌｅ　ｂｌｏｏｄ）中の細胞副集団の定量には適していない。さらに、この分析法はリポータ−分子の吸光を測定するので、蛍光検出法システムよりも感度が弱い。

免疫蛍光標識及び免疫分析技術の実施においては、抗体を蛍光リポータ−３酵素リポータ−又は放射性同位体リポータ−で直接に標識するのが一般である。

しかし、免疫反応性を変化させることなしに抗体分子に結合し得るリポータ−の数は極めて限られている。その上、抗体に対するフルオロクローム又は放射性同位体リポータ−の共有結合は、各反応物に適合する反応性基が存在することを必要とし、このことがこの種の標識に関して実施上の更なる制限を与える。

フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡法に用いるにあたり、抗体に蛍光リポータ −を直接に標識することを避けるために、染料分子を液相でリポソーム内に拘束し、そのリポソームに抗体を結合させた試薬を用いることが提案された。

抗体当たりのリポータ−分子の数が増大するので、信号増幅を高めることが判った。さらに、リポソーム内にリポータ−を収納するので用いられるべきリポータ −分子の範囲を拡大することができ、抗体に直接結合できないリポータ−分子をも収納することができる。＾、　Ｔｒｕｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉ＋ｎ＋ｎｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１００：５９−７１　（１９８７）及びそれに引用された文献、並びにＲ９Ｍａｎｄｌｅ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許４．３７２．７４５参照。

同様の試薬が他の診断の応用にかんして用いることが提案された。特許文献は試薬を用いる免疫分析法を開示しており、その方法では注目する免疫反応物質に関して特異的に結合する物質が脂質膜を含有するマイクロカプセルに固定されており、そのマイクロカプセル内には疎水性マーカーが封入されている。

かかる免疫分析法を行うに当たり、注目する免疫反応性物質を含む試験サンプルがその試薬及び補体源と混合され、そのマーカーをマイクロカプセルから釈放させ、しかる後その存在または量が適切な分析によって決定される。例えば日本特許文献６０１５９６５２−Ａ、及び６００１７３５９−Ａ参照。これらの文献に開示された特定の実施例によれば、このマイクロカプセルはリポソームであって、それは共有結合によりその特異的結合物質に固定されている。日本特許文献６０１３８４６４−Ａ、６０１３８４６５−Ａ、及び６０１３８４６６−Ａをも参照されたい。この方法の更なる利点は、結合していない試薬の存在下において、結合している試薬を測定することができることである。しかしながら、この方法は幾つかの欠点をもっている。第１に、補体が不安定な試薬であり、この方法では偽陰性となる場合があり、それは補体がリポソームを適切に溶解してリポータ −を釈放することに失敗した結果として起こる。第２に、開示された試薬が細胞表面関連構造を定量するのに用いられた場合には、補体が細胞並びにリポソームを溶解させて種々の物質を釈放させ、それらが幾つかのリポータ−分子の測定と抵触する。第３に、ある種の試験サンプル内における微視的環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｊｒｏｎｍｅｎｔｓ）　（例えば低ｐＨ値）が重大な漏洩及びある種のリポータ−分子、例えばカルボキシフルオセイン（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｓ−ｃｅｉｎ）の非特異的釈放をもたらすことがある。Ｐ、　Ｍａｃｈｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９：４８１８　（１９８２）参照。

リポソーム試薬はまた、例えば米国特許４，７１７，６７６及び４．　６９８゜２６３に記載されているように溶解性被分析物の定量に用いることが提案されている。

蛍光免疫分析法における蛍光リポータ−を抗体に直接結合させることについての上述の制約を克服する他の方法が、Ｓ、　Ｙａｖｅｒｂａｕｍ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許４゜５２７６．９１２に記載されている。これに記載された免疫分析技術は、密に詰め込まれた複数の発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）をもったキャリアを含む試薬の使用が必須であり、既知の量の相補的に結合する物質と結合するために、その試薬は競合関係にある肝心の免疫反応物に結合している。複数の発蛍光団は自己消光（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）を起こすのに充分に密に封入されており、したがってその試薬は化学的処理を行って発蛍光団を釈放させることができる。試験サンプル及び試薬は、注目する免疫反応物と相補的に結合する物質をもった固相と混合される。競合的結合反応が起こった後に、結合した免疫反応物と結合していない免疫反応物とが分離される。分離された部分の一方又は両方のキャリアは化学的に処理され、又は溶解されて、消光され、密に詰め込まれた発蛍光団を解放して測定される蛍光を大幅に増加させる。発蛍光団の蛍光強度は既知の濃度の標準と比較されてサンプル中の免疫反応物の量を定量する。しかし、この免疫分析技術は欠点がないとは言えず、定量に先立ってリポータ−の釈放を行わせるのに用いられる化学反応が、典型的には時間がかかる酵素反応である。

細胞表面抗原またはその抗体の定量の他の方法では、フルオロクローム（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）で標識された赤血球の凝集を測定する。Ｖ、　Ｇｈａｚａｒｏｓｓｉａｎ　ｅｔａｌ、、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　３４：１７２０− ２５　（１９８８）、及び米国特許４．７４８．１２９参照。この方法は血液型判定（ｂｌｏｏｄ　ｔｙｐｉｎｇ）又は血液型抗原（ｂｌｏｏｄ　ｇｒｏｕｐａｎｔｉｇｅｎｓ）に対する抗体の定量にとりわけ適用性がある。フルオロクロームは赤血球膜を標識するのに用いられ、抗体または抗原の存在が、赤血球の凝集による蛍光信号（光学繊維プローブによって検出される）における変動（ｆｌｕｃ−ｔｕａｔｉｏｎｓ）から決定される。このシステムは定性的な測定結果しかもたらさず、よくでも注目する抗原または抗体の存否に関する準定量的測定結果をもたらすのがせいぜいである。赤血球は全血液に有機溶媒中に溶解した色素を加えることによって染色され、色素は細胞と血漿とを分離する。この分析に用いる色素（例えば、１，３．−ビス［４−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシフェニル］−２，４−ジヒドロキシシクロブテン−ｄｉｙｌｉｕｍ−ジハイドロオキサイド）は、分析中に赤血球から血漿に移行し、細胞は３７°Ｃ１１０分間の培養の間に４０％もの色素を失う。血漿中の抗体の存在を測定するのに、この分析が用いられるとき、血液サンプル中の赤血球はコロイド状の磁性粒子の添加とサンプルを磁界にさらすこととによって除去される。

診断試験にあたって、更なる分析のために、注目する一種類の副集団又はその部分集合を、混合した細胞集団から選別し分離することがしばしば望まれる。

一つの細胞の分別技術では磁性粒子と磁気親和性分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ａｆｆｉ−ｎｉｔｙ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）を用いる。磁気親和性分離法によって生物集団（ｂｉｏｌｏｇｉ−ｃａｌ　ｐｏｐｕｒａｔｉｏｎｓ）を選別する多くの方法が特許文献および多くの科学定期刊行物に記載されている。例えば、米国特許３．９７０．５１８．４，７１０゜４７２．４，６７７．０６７、＝Ｌ　６６６．５９５．４，２３０，６８５．４゜２］、９．４１１．４．．１５７，３２３、及びＥ、　Ｔ、　Ｍｅｎｚ、ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ、　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ、　Ｌａｂ、　（１９８６）、Ｊ、Ｓ、　Ｋｅｍｓｃｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６V：１１− １８　（１９８５）、Ｔ、　Ｌｅｉｖｅｓｔａｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｊｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、　２８：４６−５２　（１９８６）AおよびＪ、　Ｓ、　Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３８：２１００−０３　（１９８７）参照。かかる方法の実施に当たり、受容体分子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　；例えば、モノクローナル抗体）は、典型的には磁性粒子に抱合させ、注目する分析物上の特徴的なデイターミナントに結合させる条件下て試験サンプルに加え、しかる後サンプルは磁界に暴露される。例えば、Ｌｅｉｖｅｓｔａｄ　ｅｔ　ａｌ、によって書かれた免疫磁気分離技術（前掲）を参照。磁性粒子及びそれに固定された分析物はその集団の残余の部分から分離され得る。

磁気親和性分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）の使用が可溶性分析物についての臨床的診断の免疫分析に関して報告されており、そこでは放射性同位元素（例えばＲａｔｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　３０：１４５７−６１　（１９８４）参照）又は蛍光性分子（例えば、Ｍｏ５ｃｏｓｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ］ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、、　３４：９０２−０５　（１９８８）；　Ｒ，Ｄ。

Ｎａｒｇｅｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　７１：１７−２４　（１９８４）；及びＫａｍａｌ　ｅｔ　≠戟B 、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　２６：１２８１−８４　（１９８０）参照）をリポータ−物質として用いている。

移植術に先立つ骨髄細胞から白血球のある種の副集団の分離のため、移植後の移植片・宿主反応を排除するために、この技術が使用されたことも報告されている。＾、　Ｂｕｔｔｕｒｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｇ、　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　ｔｒａｎｓｐｌ、　４１３−２２　（１９８７j参照。この技術の利用の他の報告としては、腫瘍細胞の分離（Ｋａｍｐｓｈｅｄ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｂ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５４ニア７１−７８　（１９８６）参照）及び白血球の機能を評価するための白血球の副集団の分離（Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、前掲）がある。

血液中の白血球の部分集合の定量に磁気親和性分離法を適用したことが報告されている。Ｊ、　Ｂｒｉｎｃｈｍａｎｎ、　Ｃ１１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　７１：１８２−８６　（１９８８）参照。

この事例においては、異なった白血球の副集団に関して特異的なモノクローナル抗体で被覆された超常磁性ポリマー・マイクロスフェアと共に血液サンプルが培養された。このマイクロスフェアに結合した細胞は、それらのサンプルに磁界を与えることにより、それ以外の集団から単離された。単離された細胞は溶解（ｌｙｓｅｄ）されて、マイクロスフェアから分離され、そのマイクロスフェアと結合した細胞膜が磁気的に除去され、得られた細胞核が染色され、蛍光顕微鏡とへマドサイトメーターで手動的に計数された。計数された核の数が、注目する副集団におけるサンプル中の細胞数に対応する。この手順は注目する副集団中の細胞を計数するのに用い得るけれども、細胞核の手動的係数は、ヘマトサイトメーターのサンプル装填及び計数に極めて時間がかかり、また技術的な過ちを生じ易い。かかる手順は臨床的な場において用いるのには適していない。

従って、分析物ことに細胞側集団を定量する改良方法に対する需要が存在する。

そのような改良方法は、次の特徴を持たねばならない。すなわち、従来利用可能であった方法に匹敵するか更に良好な感度をもつこと、比較的短時間のうちに多数のサンプルを分析する能力があること、及びその方法を実施するに当たり高価な装置を必要とせず、また高度に熟練した技術者を必要としないことである。

発明の概要本発明の一局面においては、被分析物を含む疑いのある試験サンプル中の特徴的なディターミナント（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）の少なくともひとつを有する被分析物の定量が、注目する被分析物を検出可能なリポータ−物質に最初に結合させることによって行われる。この試験サンプルは、ついで注目する被分析物の特徴的なディターミナントの少なくともひとつに選択的に相互作用し得る特異的結合物質と接触させられ、それが当該被分析物と特異的結合物質の間で複合体を形成する条件下で行われる。次いで、形成された複合体がフリーの被分析物から分離されて二つの両分を形成する。次いで分離された画分の一つの中にリポータ− 物質の存在が確認される。通常は、検出されたリポータ−物質のレベルは、試験サンプル中の注目する被分析物の存在または量を決定すべく、予め定められた標準と相関する。この手法は、生体膜含有体（ｂｉｏｍｅｍｂｒａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｅｎｔｉｔｉｅｓ）であって、リポータ−物質が生体膜の脂質成分と安定に結合しているような被分析物を定量するのに特に有用である。本発明の好適な実施例においては、たった今説明した手法を用いて、細胞集団が分析されて、その集団内での注目する細胞の副集団の存在または量が決定される。

本発明の他の局面においては、試験サンプルに由来する被分析物と脂質含有成分、該被分析物の特徴的ディターミナントと選択的に相互作用することができる特異的結合成分、及び該脂質含有成分と安定に結合している検出可能なリポータ− 成分を含む試薬とを、該試薬と該被分析物とを結合させる条件下で接触させることによって、少なくとも一つの特徴的なデイターミナントを有する被分析物が一つの試験サンプル中において定量される。しかる後、該被分析物と結合した検出可能なリポータ−物質の存在が検出または定量される。

上述の先行技術における分析技術とは異なって、本発明の方法は選択の問題としてリポータ−物質と特異的結合物質との共有結合を用いていない。むしろ、リポータ−物質は好ましくは被分析物の脂質成分又は特異的結合物質を含む試薬の脂質成分に安定に結合させるようにする。このようにすることによって、。

上述の脂質成分の一体性が維持されている限りリポータ−物質の感知され得るほどの漏出はおこらず、しかも、リポータ−物質は適切な抽出剤（ｅｘｔｒａｃｔａｎｔ）の処理によって、必要に応じて被分析物または試薬から容易に分離され得る。

本発明の方法における抽出可能なリポータ−物質の使用は、リポータ−が抽出できない関連先行技術の手法を越えた明確な利点を構成している。抽出可能な蛍光色素はリポータ−物質として用いられた場合にとりわけ有利であり、それは蛍光測定に先立って蛍光リポータ−の抽出及び濃縮によって蛍光効率が増大するからである。リポータ−物質が抽出可能であることは、さらに一つの利点を与える。

すなわち、抽出可能なリポータ−の検出が比較的簡単で経済的な分析装置及び技術、例えばフローサイトメトリーの代わりに蛍光分析法を用いて達成することができることである。

本発明の更なる局面においては、上述の方法を実施するための試薬及び試験キットが提供されることである。その試薬については以上に簡単に説明されている。

試薬キットは定量されるべき被分析物の性質に応じたさまざまな成分を含み得る。試験キットは特徴的なディターミナントを持った注目する被分析物に結合する検出可能なリポータ−物質及びかかる被分析物１例えば細胞の定量に関して、特徴的なディターミナントと選択的に相互作用する特異的結合物質を含む。試験キット中の他の構成要素としては、リポータ−物質を被分析物に結合させるためのひとつ以上のメディア、リポータ−物質の抽出剤、試験サンプル中の注目する被分析物の存在または量を確定するためのひとつ以上の標準、又はかかる標準の作成に関するインストラクション、及び、任意的には、本発明の方法を実施するのに有用な補助機器（Ａｃｃｅｓｓｏｒｉｅｓ）がある。

アレルゲン若しくはオートローガス細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｅｌｌｓ）などの特徴的なディターミナントを有する、注目する他の被分析物を定量する試験キットは、脂質含有成分を含む上述の試薬、該被分析物のディターミナントと相互作用する特異的結合成分、及び該脂質含有成分と安定に結合するリポータ− 成分を含んでいて良い。

本発明の方法は、例えばフローサイトメトリーのように細胞頻度の変化に関して、ふるい分けを行うことが目的の臨床的研究室に現在用いられている上述の分析技術の補助として、あるいは場合によってはそれらの代わりとして用いることができる。本明細書に記載した方法は比較的迅速に、多数の生物サンプルの同時的分析を先行技術に匹敵する感度で行うことを可能にしている。更に、本発明の方法は、かかる先行技術において必要とされる複雑で高価な装置及び高度に熟練した作業員を不要にする。

本発明の他の利点は、添付図面並びに以下の詳細な説明を検討することにより当該技術の熟達者には明らかとなろう。

図面の簡単な説明図１は、リポータ−物質としてのフルオロクローム、３−ｎ−プロピル−３’　 −ｎ−ドコサニルオキサカーポジアニン・イオダイド（ＰＤＣＩ）の既知の濃度を含む一連の溶液について、リポータ−物質の濃度の関数としての蛍光強度を示す標準曲線である。

図２は、３−ｎ−プロピル−３°　−〇−ドコサニルオキサカーポジアニンと結合したヒト単核白血球（ｍｏｎａｎｕｃｌｅａｒ　１ｙｃｏｃｙｔｅｓ）の数の変化と、同細胞から抽出されたリポータ−物質の蛍光強度との相関関係を示すグラフである。図２における点線は、リポータ−と結合しなかった細胞集団の抽出物の平均蛍光強度を示す。

発明の詳細な説明本発明は、広汎な被分析物を効率的に定量する方法を提供しており、その被分析物は試験サンプルまたは標品のあらゆる構成要素であってよく、その被分析物の存在又は量は特異的結合物質との選択的相互作用によって決定される。

かくてここで用いる「被分析物」なる用語は、個別的に又はグループとして測定可能な生物学的又は医学的に注目する広汎な素材を言う。その例としては、真核細胞（例えば、白血球、赤血球、又は菌類（ｆｕｎｇｉ）　）及び原核細胞（ｐｒｏｃａｒｉｏｔｉｃ　ｃｅｌｌ）　（例えば、細菌、プロトシア又はマイコプラズマ）を含む細胞、ウィルス、細胞構成要素、分子（例えば蛋白質）、及び巨大分子（例えば、核酸ＲＮＡ、ＤＮＡ）などがある。これらの被分析物は異なった生物体として、あるいは複合体又は集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）としても定量され得る。生体膜含有体、すなわち天然に存在する脂質膜またはリン脂質膜を含む被分析物の副集団又は部分集合の存在又は量を一つの集団内で確定することがしばしば望まれる。例えば、血液細胞の集団内で白血球を定量すること、白血球の集団内でヘルパーＴ白血球を定量すること、母体血行（ｍａｔｅｒｎａｌ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）内での胎児細胞（ｆｅｔａｌ　ｃｅｌｌｓ）を定量すること、非感染細胞と感染細胞の集団内でのウィルス感染細胞を定量すること、正常細胞及び新生物細胞の集団内での、新生物細胞を定量すること、多数の異なった蛋白質の集団内での注目する蛋白質を定量することなどがある。かかる定量は本発明の方法を用いて達成され、それは特異的結合物質と注目する副集団又は部分集合の特徴的ディターミナントの少なくとも一つとの選択的相互作用に依存している。

ここで用いられている「ディターミナント」なる用語は、何物かの性質を同定しあるいは決定する要素を指す広義の意味である。上述の被分析物の何れかに関して用いる場合に、「ディターミナント」は、特異的結合物質に選択的に結合することが必須であり、関与する当該被分析物の部分を意味し、その存在が選択的結合を生ずるのに必要な部分を意味する。細胞に関係する若しくは結合するディターミナントには、例えば、細胞膜の構成要素、細胞質（ｃｙｔｏ−ｐｌａｓｍ）　、又は核がある。かかる細胞関連構造に含まれるものとしては、膜結合蛋白質または糖蛋白質などがあり、宿主細胞またはウィルス由来の細胞表面抗原、組織適合性抗原（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｔｉｇｅｎ）　、又は膜受容体がある。

これらのディターミナントと選択的に相互作用するために用いられる特異的結合物質の一つの類型は、そのディターミナントを免疫特異的に認識することができる抗体である。ここで用いる「抗体」なる用語は、免疫グロブリン類、モノクローナル免疫グロブリン断片、またはポリクローナル免疫グロブリン断片及び免疫反応性免疫グロブリン断片が含まれる。

特徴的ディターミナント及びそれらの特異的結合物質の更なる例としては、受容体とホルモン、受容体とリガンド、アゴニストとアンタゴニスト、ＲＮＡ又はＤＮＡのオリゴマーと相補的配列、マウスＩｇＧのＦｃ受容体と蛋白質Ａ１アビジンとビオチン、及びウィルスと受容体などがある。本発明の方法を用いて定量できる更に他のディターミナント・特異的結合の組み合わせは、当該技術の熟達者には明らかであろう。

注目する被分析物は、生物の体液１例えば全血液、血清、血漿、尿、髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ　ｆｌｕｉｄ）　、羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ）　、洗浄液（ｌａｖａｇｅ　ｆｌｕｉｄｓ）　。

及び組織抽出液を含む異なった由来をもつ試験サンプル又は標品中に存在し得る。本発明のある適用例においては、被分析物は適切な固体支持体上に吸着又は免疫的に捕捉されていて良い。したがって、とりわけ生体の体液中の抗原。

エピトープ、抗体、ハプテン又は抗原・抗体複合物、懸濁液及びウィルス感染における自己の細胞に結合した自己抗体の検出は本発明の範囲内にある。

本発明の好適な実施例によれば、特徴的な一体化した膜ディターミナントを発現している副集団及び／又は部分集合を含む細胞懸濁液又は集団について分析を行い、サンプル細胞懸濁液中での注目する細胞の総数を確定し、あるいは細胞の副集団内での細胞部分集合の比率を確定する。注目するかかる細胞には、ヒト又は動物由来の細胞、培養細胞並びにある種の単細胞生物及びウィルスが含まれる。

本発明においてとりわけ注目する細胞には、ヒト及び動物の造血細胞が含まれ、その造血細胞には幹細胞、異なった系列の前駆細胞、一つの系列の分化の異なった段階にある細胞、及び多数の系列の成熟形を含む。診断、治療及び研究的応用においてとりわけ関心があるのは、哺乳類の白血球であり。

それにはＢ細胞、Ｔ細胞及び、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞などの識別可能なＴ細胞の部分集合が含まれる。異なった系列の細胞は、特徴的な抗原又はリガンドの発現によって特徴づけられている。例えば、哺乳類の血液サンプル由来のＢ細胞は、同一のサンプル中のＴ細胞によって発現されているものとは異なった表面リガンドを発現してる。サンプルからの単一の細胞部分集合を定量することは、ある種の病状の評価にとって重要である。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）に感染した患者は、病気の進行段階及び治療をモニタリングする目的で、ＣＤ４糖蛋白質をもったＴヘルパー細胞をテストされる。

他の例としては、患者の血液中の単−Ｂ細胞クローンの異常に大きな集団は白血病の状態を示す。分化の異なった段階における同一の系列の細胞もまた、特徴的な抗原又はリガンドの発現によって識別可能である。例えば、Ｂ白血球は幹細胞から前駆Ｂ細胞に、そして最後に成熟Ｂ細胞に発育するとき、細胞膜マーカーは細胞の成熟に連れて予想可能な態様で変化する。成熟Ｂ細胞はリガンドとして免疫グロブリンを細胞表面に発現しており、前駆Ｂ細胞は細胞質免疫グロブリンのＨ鎖のみを発現しており、これがこれらの細胞の部分集合の反応性の差を与え、引き続く定量を可能にする。リガンドの発現の差異はウィルス感染などの発病（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）の評価の基礎を更に与える。

ウィルスが感染した細胞はウィルス・マーカーを発現し、そのマーカーは細胞集団内の未感染細胞には欠如している。これらのウィルス・マーカーは細胞間または細胞表面膜上に見いだされる。

上述の好適な実施例により、注目する副集団又は部分集合に関して細胞集団を分析するに当たり、適切な生物学的培地または合成培地に響濁された細胞集団は最初に検出可能なリポータ−物質と結合させられる。ここで用いられる「リポータ −」なる文言は、直接にせよ間接にせよ物理的又は化学的方法でその物質の検出または定量によって、試験サンプル中に注目する被分析物の存在を示すことができるようなあらゆる物質を意味する。有用なリポータ−物質を例示すれば、吸光、蛍光、リン光、またはルミネッセンスなどの特性に基づいて、直接または間接に検出可能な分子又はイオン、及びそれらの核磁気共鳴特性または常磁性特性によって検出可能な分子又はイオンが含まれるが、それらに限定されるものではない。吸光又は蛍光に基づいて間接的に検出可能な分子の仲間には、例えば様々な酵素があり、それらは適切な物質を転換する。例えば非吸光性分子を吸光性分子に転換し、或は非蛍光性分子を蛍光分子に転換する。

フルオロクローム即ち標品に蛍光を生ぜしめるために生物学的に染色するのに用いられる多くの蛍光物質の全てが、本発明を実施する際のリポータ−物質として特に有用である。代表的なフルオロクロームとしては、シアニン、アクリジン、ピリジン、アントラキノン、クマリン、キノリン、キサンチン、フェノキサジン、フェノチアジン及びヘキサトリエン並びにそれらの誘導体がある。

本発明の際立った局面の一つは、前述の生体膜含有体（ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ −ｃｏｎ−ｔａｉｎｉｎｇ　ｅｎｔｉｔｉｅｓ）　（特異的結合物質と結合した生体膜含有体を含む）の脂質成分が、かかる脂質成分と安定に結合することができるリポータ−物質の固有の種類と結合することである。ここで「安定な結合」とは、リポータ−物質が生体膜の脂質成分とリンクしている態様を言い、該生体膜の脂質成分に対するリポータ−物質の親和性が環境媒体に対する親和性よりも強いことを意味する。

細胞膜に対する下記のリポータ−物質の親和性は十分に強く、膜含有マイクロカプセルから物質が漏えいし又は失わせる傾向を有する条件又は試薬にさらされても、リポータ−物質が脂質成分と結合した状対を維持することを意味する。

Ｐ、　Ｍａｃｈｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、　７９：４１４８　（１９８２）G及びＭｏｎｒｏｅ、　Ａｍｅｒ、　Ｒｉｏｔ、　Ｌａｂ、　５：１０−１９　（１９８７）参照。従来の細胞標識法とは異なり（Ｖ、　Ｇｈａｚａｒｏｓｓｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　３４：１７２０−２５　（１９８８）及びＵ、　Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４．７４８．１２９参照）、該脂質成分を溶解させ、または分散させる洗浄剤または脂質溶媒との接触などによって、膜脂質成分の一体性を崩壊し、または破壊する条件または試薬にさらされたときにのみ、リポータ −物質と細胞膜の脂質成分との安定な結合が失われる。

定量の基礎として、「安定に結合している」なる表現は、細胞膜の脂質成分に最初に結合したリポータ−物質の９０％以上が分析（細胞を結合が解かれたリポータ−物質から物理的に細胞を分離することにより検出）の全工程を通じて細胞集団または他の生体膜含有体と結合したままに止まることを意味し、その分析は一般に３時間程度である。

生体膜の脂質成分と安定な結合ができるリポータ−物質は、全く疎水性の物質か、少なくとも一つの疎水性部分又は領域を有する物質を含み、その疎水性部分はリポータ−分子をかかる脂質成分につなぎ泊めるのに役立つ。後者の場合に、たとえ溶液または崩壊した細胞懸濁液を撹拌しても、リポータ−分子を該脂質に安定に結合し続けるように充分に該疎水性部分に該分子を結合させねばならない。

リポータ−物質の特に適切な仲間は、次の式で示される物質である。

ここで、Ｒ及びＲ３は同一でも異なっていても良（、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル又はアラルキルからなる群から独立に選択された置換体を示し、それらの炭化水素鎖の炭素数は１〜３０であり、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、上記置換体はひとつ以上の非極性官能基で置換されていてもされていな（でも良（、ＲとＲ５との一方は少な（とも１２個の直鎖状炭素原子を有し、ＲとＲ１における直鎖状炭素原子の合計は少な（とも２３であり：Ｘ及びＸｌは同一でも異なっていても良く、Ｏ，Ｓ、　Ｃ（ＣＨ３）　２又はＳｅを示し、Ｙは−ＣＨ＝、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝。

又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝からなる群から選択されたリンク結合基であり、Ｚ及びＺｌは同一でも異なっていても良く、Ｈ，アルキル、　ＯＨ，ＮＨ２，Ｃ００Ｈ，Ｃ０ＮＨｚ、５ＯｓＨ，５ＯｚＮＨ２，ＮＨＮＨ２，ＮＣ３，ＮＣＯ，Ｃ０ＮＨ−アルキル（ＳＯＮＨ−アルキル）、Ｃ０Ｎ−（アルキル）、、ＮＨ− アシル、０−アルキル、ＮＨ−アルキル、からなる群、又はＮ（アルキル）２゜ＳＨ，Ｓ−アルキル、Ｎｏ２又はハロゲンからなる群から選択された置換体を表し、上記Ｚ置換体を構成するアルキル基は１〜３の炭素原子を有し、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。

上述の群の中で有用なリポータ−物質のサブグループは次式化合物を含むここで、Ｒ及びＲｏは同一でも異なっていても良く、炭素数１〜３０のアルキル置換体であり、直鎖状でも分岐鎖状でも良く、ハロゲンで置換されていてもされていなくても良（、Ｒ１とＲ１の一方は少なくとも１２個の直鎖状の炭素を有し、ＲとＲ１における直鎖状の炭素原子の合計が少なくとも２３であり、Ｚ及びＺｌは同一でも異なっていても良く、Ｈ又は炭素数１〜３の低級アルキルであり、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。

式■で示された化合物の中で、好適なリンク物質は３−ｎ−ペンチル−３′、− ｎ−オクタデシルオキサカーポジアニン・イオダイド、３−ｎ−オクチル−３′ −ｎ−オクタデシルオキサルカーポジアニン・イオダイド、３−ｎ−プロピル− ３゛−ｎ−エイコサニルオキサカーポジアニン・イオダイド、及び３−ｎ−プロピル−３゛−ｎ−ドコサニルオキサカーポジアニン・イオダイドである。

上述の群に含まれる有用なリポータ−物質のたのサブグループは、下記の式の化合物を含むここで、Ｒ及びＲ１は同一でも異なっていても良く、炭素数１〜３０のアルキル置換体であり、直鎖状でも分岐鎖状でも良く、ハロゲンで置換されていてもされていなくても良く、ＲとＲ１の一方は少なくとも１２個の直鎖状の炭素原子を有し、ＲとＲ１における直鎖状の炭素原子の合計が少なくとも２３であり、Ｚ及びＺｌは同一でも異なっていても良く、Ｈ又は炭素数１〜３の低級アルキルであり、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。

式■で示された化合物の中で、好適なリポータ−物質は１，１°　−ンーｎ　− オクタデシル−３，３，３’　、３’　−テトラメチルインドカーポジアニン・バークロレート、１−ｎ−オクタデシル−１°　−ｎ−ペンチル−３，３，３’ 　。

３゛−テトラメチルインドカーポジアニン・バークロレート、及び１−ｎ−ドコサニル−１°−ｎ−プロピル−３，３，３’　、３’　−テトラメチルインドカーポジアニン・イオダイドである。

リポータ−物質の有用な更なるグループは下記の式の化合物を含むここで、Ｒはアルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、又はアラルキルからなる群から選択された置換体であり、その炭化水素鎖は直鎖状でも分岐鎮状でも良く、上記置換体はひとつ以上の非極性官能基で置換されていなくてもいても良く、少なくとも２３個の炭素原子を含み、２、　２．及びＺ２は同一でも異なっていても良く、Ｈ，アルキル、　、　ＯＨ，ＮＨ２，Ｃ０ＯＨ，ＣＯＮＨ２，５ＯｓＨ，ＳＯ２ＮＨ２，ＮＨＮＨ２，ＮＣ３，ＮＣＯ，Ｃ０ＮＨ−フルキル、Ｃ０Ｎ−（アルキル）２．ＮＨ７シｈ、０　フルキル、ＮＨ−アルキル、からなる群、又はＮ（アルキル＞　２＋　ＳＨ，Ｓ−アルキル、Ｎｏ２．ハロゲンからなる群から選択された置換体を表し、上記Ｚ置換体を構成するアルキル基は１〜３の炭素原子を有し、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。

式■で表される化合物の中で、一つの好適なリポータ−物質は、３．６−ビス（ジメチルアミノ）−１０−ｎ−へキサコサニル・アクリジニウム・イオダイドである。他の好適なフルオロクローム化合物としては、４−［４−ジデシルアミノスチリル］−Ｎ−メチル−ピリジニウム・イオダイド、Ｎ−３［３−スルホプロピル］　−４−［ｐ−ジデシルアミノスチリル］ピリジニウム分子内塩、及び２［３−（１−ｎ−ドコサニル−ベンゾキサゾール−２−イリデン）−１−プロペニル］−６−イオダイドー１−ｎ−テトラデシル−ベンゾチアジンウム・イオダイドがある。

リポータ−物質の先の記述において用いたように、「非極性官能基」なる用語は、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ハロゲン、Ｎ（アルキル）２．Ｓｅ−アルキル、Ｎｏ、ＣＮ、Ｃｏ−フルキル、Ｃ＝Ｎ７／ｌ、キル、−３ｉＭｅ３．Ｏ−３０ −３ｉ、等の置換体を言う。

あるいは、リポータ−物質は実質的に疎水性のキレート金属錯化合物であっても良く、好ましくはそのキレート金属錯化合物は、元素番号が２１〜２９の遷移金属列１元素番号が５９〜６６のランタニド列及び元素番号が９１のアクチニド列から選択された金属イオンを含み、核磁気共鳴またはルミネッセンス（Ｉｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって検出可能である錯化合物である。このキレート金属錯化合物は、Ｇｄ、Ｃｒ、Ｄｙ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｆｅ及びＣｏからなる群から選択された常磁性金属イオンを含んでいても良い。

リポータ−物質はまた、検出可能な放射性同位元素を取り込んだ実質的に疎水性の物質をも含む。リポータ−物質に取り込まれた放射性同位元素は好ましくは放射性の炭素、水素、窒素、リン、フッ素、塩素、ヨウ素、硫黄、セレン。

コバルト、及びクロムからなる群から選択される。

疎水性のリポータ−物質の上述の種類は、本件出願と共に譲渡された第１８９．１９２号の同時係属米国特許出願において、特定の化合物の製造方法と共に更に詳細に記載されている。その１８９，１９２号の開示の全てがそれに言及することによってあたかも充分に記載されているかのように本明細書に取り込まれる。

インドカーポジアニン色素は、１８９，１９２号に記載されているように、オキサカーポジアニン色素から下記の一般的反応スキームにしたがって、適切なインドール誘導体を記載された反応における出発物質として用いられたベンゾキサゾール誘導体について１換することにより、容易に製造され得る。

たった全記載したリポータ−物質は、比較的長い鎖状炭化水素置換体若しくは「テイル」を有することが特徴であるが、そのテイルは不可欠な疎水性／親油性を与えて脂質含有被分析物又は試薬との安定な結合がもたらされる。これらの化合物が一旦脂質に結合すると、それらは容易には解離できない。したがって、このリポータ−物質は被分析物又は試薬から漏出せず、他の生体分子または細胞関連構造に転移することはほとんど無い。

上述のリポータ−物質の生体膜含有体への結合に関する詳細は、Ｈｏｒａｎ　ｅｔａｌ、の米国特許４．７８３．４０１に記載されており、それに言及することにより、あたかもその全体の記載が本明細書に充分に記載されているかの如くに取り込まれる。一般に、リポータ−物質の細胞への結合は、適切な媒体中に細胞を懸濁させることを必要とし、例えば、３００ｍＯｓ蔗糖１リットルあたり、１０７〜１０９ｍ１の濃度で懸濁し、次いでその細胞懸濁液にリポータ−物質を１〜２０ｕＭの世で添加し、その懸濁液を５分間２０〜３０℃で保温する。

本発明による被分析物の検出は、注目する被分析物と特異的結合物質との選択的な相互作用によって達成される。この方法に用いられる特異的結合物質は、その被分析物の特徴的なディターミナントに対して選択的な認識を示さなければならない。特定の分析に関して選択される特徴的な結合物質は、定量されるべき被分析物の性質に依存する。特徴的な細胞表面抗原を有する細胞の副集団及び／又は部分集合を細胞集団について分析するに当たり、例えば特異的結合物質は相補的な抗体であって良く、その抗体は注目する抗原を免疫特異的に認識する。かかる選択的な認識に基づいて、特異的結合物質は選択的に相互作用でき、注目する被分析物と結合して複合体もしくは凝集を形成し、それらは試験媒体及びそれに含まれている注目の対象でない他の成分から物理的又は化学的に分離できる。

特異的結合物質は固相に便宜的に固定されて、試験媒体からの分離を助ける。

抗体を例えばポリスチレン、ナイロン又はアガロース・ビーズなどの固体支持体に固定する技術は、当該技術の熟達者には周知である。適当な技術としては、クロス・リンキング、共有結合又は物理的吸着などがある。あるいは、固相でない主要な特異的結合物質は、第２のまたは補助的な特異的結合物質と共に用いられることができ、その補助的結合物質は主要な特異的結合物質と選択的に相互作用することができ、そしてそれは固相に固定されることができる。この目的のために有用である主要な特異的結合物質なおよび補助的特異的結合物質の代表例は、可溶性マウス抗体／固相に結合したＡ蛋白質：可溶性マウス抗体／他の種の動物において産生され（ｒａｉｓｅｄ）　、固相に固定された抗マウス免疫グロブリン；ビオチン化された抗体（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　／固相に固定されたアビジンである。

本発明の特に好適な実施例においては、特異的結合物質は、強磁性体、常磁性体または反磁性体などを含む磁性をもった固相に固定され、それにより注目する被分析物と複合体もしくは凝集物を形成し、それらは試験媒体から磁気的に分離可能である。特異的結合物質を例えば磁気粒子のような磁性固相に結合させる適切な手順が文献に記載されている。例えば、Ｅ、　Ｍｅｎｚ　ｅｔ　ａｔ、、＾Ｉ。

Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｌａｂ、　（１９８６）参照。

その被分析物を試験媒体から分離した後に、そのリポータ−物質の検出が、該被分析物と該特異的結合物質間の相互作用がおきたことを決定する基礎を与える。

このリポータ−物質は分離された注目する被分析物、すなわち該被分析物／特異的結合物質複合体中に、あるいは注目する被分析物の分離後の試験媒体残渣中に検出することができ、それはかかる複合体を実質的に含まない。前者の手順が好ましい。分離された被分析物中に又は残余の試験媒体中に検出されるリポータ− 物質のレベルは、予め定められた標準と相関させられ得る。標準との相関は、被分析物の検出が定性的にも定量的にも用いられ得る。定性的分析においては、予め定められた標準は、注目する被分析物を含まないことが判っているネガティブ・コントロールである。このネガティブ・コントロールのバラフグラドレベルよりも高いと認められる量のリポータ−物質の検出は、注目する被分析物の存在を示す。定量的分析においては、検出されたリポータ−物質のレベルが、例えばひとつ以上の計量された量の被分析物において検出されたレベルと比較され、それにより試験媒体中の注目する被分析物の相対的又は絶対的量を確定する。定量分析は通常は増大する既知量のリポータ−物質用されたリポータ−物質のレベルにたいしてプロットされる。本発明を実施するのに用いられる典型的な標準曲線が図１に示されている。この標準曲線に基づいて、試験媒体中の被分析物の量は、その曲線における検出されたりポークー物質のレベルから読み取れる。

被分析物の定性分析用の予め定められた標準は、さまざまな形式であり得る。

代表的な実施例としては、検出可能なリポータ−物質の計量された量に結合した膜囲繞体（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄｅｄ　ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の計量された量またはががる膜囲繞体から抽出されたリポータ−物質の計量された量を含む組成物を含み、それは図２に示されている。その標準を含む膜囲繞体は、決定されつつある囲繞体と同一のもの、異なった種類の天然に存在する生体膜含有体１例えば動物細胞。

細胞器官（オルガネラ）等、あるいはリポソームまたはミセル（ｍｉｃｅｌｌｅｓ）などの脂質またはリン脂質でできた合成膜を有する天然には存在しない膜囲繞体であって良い。この合成膜囲繞体は、膜脂質と安定に結合したリポータ−物質で、例えば、１９８８年８月３１日出願の同時係属米国特許出願筒２３８．　９５８号に記載された手順にしたがって調製され得る。その出願の全記載は、それに言及することによってあたかもここに記載されたかのように本願明細書に取り込まれる。あるいは、リポソームの場合には、例えばリポータ−物質が液相で含まれていて良（、脂質二重層によって封入され、それは当該技術において知られているように適切な溶解剤（ｌｙｓｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）の作用で後に抽出される。

例えば、５ｚｏｋａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　９：４６７　（１９８６）参照。

このリポータ−物質は幾つかの方法で検出できる。試験媒体の上記の分離された部分の何れかに細胞と結合したリポータ−物質が存在していることは、自動化された方法を用いて、異なった細胞と溶液とを測定することにより直接に分析できる。あるいは、リポータ−物質（、マ溶媒抽出によって細胞複合体の他の成分から除去できる。リポータ−物質の抽出は正確な分析を行うためにリポータ−物質の均質な分布を得るのに望ましい。多（の場合に、リポータ−物質の単位となる吸光（ｕｎｉｔ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）　（例えば、吸光係数）又は蛍光（例えば、量子収量）は抽出後は太き（なり、それによりリポータ−物質の検出感度は増大する。リポータ−物質の抽出はまた、細胞物質に起因する測定の潜在的な干渉を排除するのにも望ましい。生体膜から上記リポータ−物質を分離するのに用いられ得る適切な抽出剤には、ブタノール、エタノール又は水性洗浄剤１例えばＴｒ　ｉ　ｔｏｎＸ−１００（商標）がある。

本発明の上記方法は、一つの細胞集団内に存在する、細胞の副集団の分析に適用して、少なくとも注目する一つの細胞部分集合の存在比率（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｏｃｃｕｒｅｎｃｅ）を決定することができる。この方法は、例えば下記の分析に用いることができるが、それのみに限定されない。全血細胞集団内におけるリンパ球、単球及び白血球の副集団、白血球集団内におけるリンパ球副集団のＴ細胞。

Ｂ細胞、あるいは全リンパ球集団内におけるＴリンパ球副集団のヘルパーＴ細胞、及びサプレッサーＴ細胞。このようにして細胞の部分集合の存在比率を分析するためには注目する異なった部分集合における相対的細胞数、並びに同一サンプル又は同量のサンプル７及び同一細胞濃度における注目する異なったサンプルの相対的数を決定することが必要である。

この決定を行うに当たり、注目する副集団を含むことが予想される集団を含む実質的に全ての細胞が、検出可能なリポータ−物質に結合され、そのリポータ−物質がそれらの細胞の膜と安定に結合する。第１の試薬が提供されて、それは細胞側集団の特徴的なディターミナントと選択的に相互作用することができる少なくとも一つの特異的結合物質と一体化されている。この第１の試薬は、複数の特異的結合物質の混合物であっても良く、その各々が細胞の副集団内の注目する異なった部分集合の特徴的ディターミナントに結合し、その副集団の実質的に全ての細胞がその第１の試薬と結合する。例えば、多数のモノクローナル抗体があって、それらが決まった数の細胞部分集合の特徴的抗原と選択的に相互作用する場合には、それらのモノクローナル抗体は第１の試薬内に一体化されても良い。この第１の試薬は副集団の細胞に第１の試薬を結合させるような条件下で、その集団の第１の部分集合と接触させられ、それによってそのサンプル中に第１の複合体を形成する。次いで、形成された複合体は第１のサンプル中で結合しなかった細胞から分離され、分離された複合体中のリポータ−物質の存在が検出される。この方法は、注目する細胞側集団内の相対的または絶対的細胞数を確定する。

その後、その細胞集団の第１のサンプルと同量、及び同一細胞濃度の第２のサンプルに、上述と同様に検出可能なリポータ−物質が結合させられて、注目する細胞部分集合の特徴的ディグ・−ミナントと選択的に相互作用するひとつ以上の特異的結合物質を含む第２の試薬と、その第２の試薬をそのディターミナントに結合させる条件下で接触させられ、それにより第２のサンプル中に第２の複合体を形成する。この第２の複合体は、第２のサンプル中の結合しなかった細胞から分離されて、第２の複合体中のリポータ−物質の存在が決定される。

細胞副集団中の注目する部分集合の比率は、第１の複合体に関連するリポータ− 物質の量に関して第２の複合体に関連するリポータ−物質の量を定量することにより決定される。一般に、各副集団及び／又は注目する異なった細胞部分集合における検出されたリポータ−物質のレベルは、先に説明した態様で予め定められた標準と関連づけられて、分析中のサンプルにおける細胞副集団及び／又は注目する細胞部分集合の存在又は量を決定する。注目する部分集合の比率の決定は、固相に固定された試薬を用いて好都合に行うことができ、その固相は好ましくは磁性材料であり、試験媒体及び抽出可能なリポータ−物質からの分離を容易にさせる。

集団がさらに注目する細胞部分集合を含んでいるならば、更なる試薬が調製され、各試薬がひとつ以上の結合物質を含み、注目するさらなる部分集合のひとつの特徴的ディターミナントと選択的に相互作用する。さらなる試薬は、更なるサンプル中の注目する細胞部分集合とさらなる試薬との間に付加的な複合体を形成させる条件下で、上述の細胞集団の更なるサンプルと接触させられるが、ここでも各サンプルは第１のサンプルと同−容量及び同一細胞濃度である。

更なるサンプルの各々から分離された複合体中のリポータ−物質の検出は、各サンプル内で注目する異なった部分集合の存在比率を示す。かくて、更なるサンプルにおける部分集合の存在比率の決定が、上述の第２のサンプル中の注目する細胞部分集合の決定と同様の態様で行われる。

先に述べたように、本発明においては、ディテクター物質が被分析物に結合するのではなく、特異的結合物質に結合する方法によって被分析物を決定できる。詳述すれば、試薬が用いれら、それは脂質含有成分、被分析物の特徴的なディターミナントにと選択的に相互作用し得る特異的結合成分、及び該脂質含有成分と安定に結合する検出可能なリポータ−成分を含んでいる。この方法は、被分析物とその特異的結合物質との間の非競合的結合相互作用又は競合的結合相互作用に基づいて行うことができる。非競合的結合は、被分析物を試験サンプルに固定し、被分析物に試薬を結合させる条件下で固定された被分析物を試薬と接触させ、固定された被分析物に結合された検出可能なリポータ−物質の存在を検出することにより好都合に行われる。この方法を実施するためのパラメータは、リポータ− 物質が被分析物に結合される先に説明した方法に関して述べたのと同様である。

競合的結合方法では、試験サンプルを特異的結合物質と接触させる工程が検出されるべき被分析物の既知の量を試験サンプルに加えることを含み、それによって試験サンプル中に最初から存在していた被分析物と特異的結合物質との複合体形成のために加えられた被分析物との間で競合させる。試験サンプル中における注目する被分析物の存在または量は在来の競合的結合分析技術にしたがって決定される。

この方法は、例えばウィルス感染の早期発見に好都合に用いられ得る。この発見を行うに当たり、ウィルスのディターミナントまたは宿主細胞においてウィルスに誘導されたディターミナントの天然又は誘導されたレセプターをもった生体膜含有体から試薬が調製される。これらの生体膜含有体の膜は上述のリポータ−物質の一つと安定に結合される。得られた試薬は、感染細胞と一緒に培養される。

リポータ−物質をもった感染細胞は顕微鏡によって同定され、あるいは望まれるならば、感染の種度がリポータ−物質の抽出と定量とによって決定される。同様に、例えば患者の血清のような生体由来のサンプルから得られた被分析物は固相に固定され、その存在又は量は、上述のリポータ−物質の一つと結合されている被分析物のレセプターをもった細胞を含む試薬との相互作用、及び固相に結合したレセプター物質のレベルを決定することによって決定される。この技術は、リポータ−物質と結合しているＩｇＥレセプター発現細胞または抗ヒトＩｇＥに結合した赤血球細胞を用いて、例えばアレルゲン検査に用いられる。アレルゲン検査において典型的に用いられる放射線標識された抗体の、検出可能なフルオロクロームに結合した本発明の試薬との置換は、例えば、放射性試薬を使用することについての臨床家の多くの作業を軽減させる。それに加えて、自己由来の細胞に結合した自己抗体が、自己抗体をもった自己由来の細胞を適切なリポータ−物質と結合したＩｇＥ＋ノセブターをもった細胞を含む試薬とともに培養し、得られた複合体をアフィニティー分離法により分別し、リポータ−物質を検出することによって、この方法を用いて同定できる。この方法は、また例えば、抗体特異的又はエピトープ特異的Ｔ細胞又はＢ細胞クローンを用いて、注目する抗体又はエピトープを同定し及び／又は定量するのに用いられ得る。

本発明のこの実施例の変形においては、一つの試験サンプル中の多数の被分析物の存在又は量を決定できるが、勿論各被分析物が特徴的なディターミナントをもつことを条件とする。例えば、同一集団内のひとつ以上の細胞副集団及び／又は細胞部分集合の同定又は定量がこの方法によって達成できる。かかる細胞集団は他の部分集合の外に、２種以上の細胞部分集合を含んでいるか、含むことが予測されるが、それをこの説明の目的のために、細胞部分集合Ａ及び細胞部分集合Ｂと呼び、それらは特異的マーカーとしてディターミナントＸ及びディターミナントＹをそれぞれ発現していることにする。臨床又は実験分析における部分集合中の細胞部分集合Ａ及び細胞部分集合Ｂの細胞の存在及び／又は量の決定は、多数の関連するプロトコールに引き続き本発明の後者の方法に従って効率的に行うことができる。基本的に、この方法は一つの特異的結合物質の調製が必須であり、その特異的結合物質はディターミナントＸとの選択的結合反応を介して細胞部分集合Ａと選択的に相互作用し、それによって細胞部分集合Ａと一つの特異的結合物質との間に複合体を形成する。だの特異的結合物質が調製され、それは選択的に細胞部分集合Ｂによって発現されているディターミ、ナンドＹと相互作用する。

一つのプロトコールにおいて、同一の容積と細胞濃度とを有する細胞集団の異なったサンプルは一つの特異的結合物質と、次いで他の特異的結合物質と直列的に反応さゼられる。反応と各反応混合物から複合体を分別に引き続いて、リポータ −物質が各サンプルから定量されて、該集団中の細胞部分集合Ａの量と細胞部分集合Ｂの量との表示を与える。このプロトコールでは、各試薬に用いられるリポータ−物質は同一でも異なっていてもよい。勿論、更なる特異的結合物質が調製され、他の異なった細胞部分集合の検出に必要に応じて用いられ得る。

他の代替プロトコールでは、二つの特異的結合物質が、集団の同一のサンプル中で反応させられ、その際、それら特異的結合物質を一緒に添加し、培養して、そのサンプル内に分離した複合体を形成する。得られた複合体は、それぞれの異なった細胞部分集合のディターミナントに対する特異的結合物質の各々の選択的親和性に基づいて区別される。反応混合物からそれらの複合体を分別するとき、全複合体は、選択的反応の各々によって形成された細胞複合体を含んでいる。このプロトコールでは、一つの特異的結合物質に結合したリポータ−物質は他方の特異的結合物質に結合したリポータ−物質と識別可能又は分離可能であり、二つのリポータ−物質の検出により二つの細胞部分集合の異なった読み取りを許すことが必要である。この点については、リポータ−物質が識別可能なスペクトル特性を有する物質を含み、それによって十分に異なった励起波長、放射波長、又は蛍光寿命（ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ　ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ）をもち、それゆえ一つのリポータ−物質の存在の検出が、他方のリポータ−物質の存在によって影響されない。すなわち一方について検出された値が他方の存在によって太き（影響されない。かかるリポータ−物質の使用は、複合体中に存在するひとつ以上の他のリポータ−物質から独立して各リポータ−物質の個別的測定を可能にする。あるいは、例えばその溶解度の理由によって、ひとつのリポータ−物質は他のリポータ−物質から物理的に分離できる。

たった今説明した方法に用いる試薬もまた、本発明の範囲内に含まれる。本発明の試薬は、特異的結合物質を含み、それはホルモンレセプターのように特定の細胞の表面に天然に存在し、Ｂリンパ球の表面の抗体、あるいは感染しやすい細胞の表面のウィルスレセプターを含み、例えば、表面糖蛋白質ＣＤ４を有するヘルパーＴ細胞または単球はＨＩＶ感染を受けやすい。これらの試薬に用い得る他の特異的結合物質は、細胞を変化させる特異的な生物学的事件の後に細胞表面に発現される物質であり。例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプターは活性化されたＴリンパ球の表面に高レベルで発現されるが、残余のリンパ球の表面には低レベルで発現される。同様にウィルス抗原は、感染細胞のみの表面に発現される。これらは生理学的な活性化を介して誘導されたレセプター発現の数ある例の中の２例に過ぎない。その他多数の例が当該技術の熟達者には思い当たるであろう。細胞はまたＤＮＡ組換え技術によって形質変換され、あるいは感染させて、それらの表面に特異的結合物質を発現させることができる。これらの例の各々において、脂質含有成分及び特異的結合成分は単一の脂質膜含有体に天然に生じあるいは誘導され、そのリポータ−物質は脂質成分すなわち細胞膜の脂質成分と安定に結合している。

本発明の試薬は細胞を含むことができ、その細胞は抗体又は抗体断片などの特異的結合物質を一体化するよう修飾されており、その特異的結合物質は、注目する被分析物の特徴的ディターミナントと選択的に相互作用する。かかる修飾を受けた細胞は、細胞表面に対して、少なくとも一つの親油性炭化水素置換基を有するデリヴアタイズされた（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）抗体又は抗体断片をリンクさせることにより調製できる。この炭化水素置換基は、表面膜停滞係数が１０％血清を含む食塩水中で２４時間にわたり少なくとも約９０となり、その係数のパーセントで示した変化がその期間に１０％未満となるよう、デリヴアクイズされた抗体又は抗体断片が充分に非極性化させるような適切な長さのものでなければならない。このようなデリヴアクイズされた抗体又は抗体断片の調製方法の詳細は、上記米国特許出願１８９．１９２に記載されている。それに加えて、適切な長さと機能とをもった炭化水素基は、細胞の原形質膜内に埋め込まれて、しかる後当該技術において知られている手順によって抗体又は抗体断片と結合され得る。

得られたデリヴアタイズされた抗体又は抗体断片の細胞への結合は、上述の米国特許４．７８３．４０１に記載された態様で行われる。

試薬のリポータ−成分は、本発明の被分析物の定量法に関して先に記載したリポータ−物質の何れであってもよい。

本発明の方法は、試験管、多穴プレート等、在来の容器を用いて実施することができる。試験サンプル中のリポータ−物質のレベルを精密に測定する検出機は市販されており、比色計０分光光度計、蛍光分光光度計、液体シンチレーシコンカウンター、又はガンマ線カウンターなどである。

本発明の他の局面においては、希釈剤、抽出剤、被分析物を固定する固体支持体を含めて、予め計量された種々の試薬を、本発明の方法を実施するのに用いるさまざまなアクセサリ−とともに試験キットとして便利なようにパックされることができる。試験キットの試薬は種々の形を取り得る。リポータ−物質は、細胞にリポータ−物質を結合させるための適切な希釈剤と共に、溶液の形で提供できる。リポータ−溶液は、本発明の方法を実施するのに適した容器に入れて供給できる。あるいは、リポータ−物質は包装された乾燥物としてもよく、そのリポータ −物質及び／又は方法を実施する間に用いる他の試薬に加えるための希釈剤又は溶媒を入れたバイアルを添える。特異的結合物質は固体支持体に固定された状態て提供されるのが好ましく、それは適切な緩衝液に懸濁されるか、凍結乾燥されるかあるいは乾燥されていてよい。

次の実施例は本発明をさらに詳細に記載するために提供されている。これらの実施例は、本発明の方法を特定の応用を説明することを意図しており、本発明を限定するものと理解すべきではない。特に記載していない限り、全ての溶媒比率は容積で示されており、温度は０Ｃで示されている。

実施例１　抽出されたフルオロクローム物質の蛍光強度と細胞数との関係抹消血単核細胞は、健康な提供者の全血から濃度勾配遠心により調製された。

この調製物は主としてリンパ球と単球とを含んでいる。これらの細胞は、１０μ Ｍの３−ｎ−プロピル−３゛−〇−ドコサニルオキサカーポジアニン・イオダイド（ＰＤＣＩ）と１×１０７細胞／ｍｌと希釈剤として１リツトル当たり３００ｍＯｓの蔗糖とを用いて、そのリポータ−物質と結合された。得られた細胞は、ポリプロピレン・チューブ内でリポータ−物質と共に５分間寥温で培養された。

結合反応は、５％（Ｗ／Ｖ）のウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加して停止された。細胞を３５０ｘｇで遠心分離し、得られたペレットを１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄した。リポータ−物質と結合した後の回収細胞は、７３％であり、その９４％が生存していた。

生存率は、Ｃ，Ｙｅｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　４３：２６４−７５　（１９８１）に記載された手順に従って、プロピジウム・イオダイド・エクスクル−ジョン（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　１ｏｄｉｄｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）によって決定された。

細胞懸濁液の希釈物（希釈系列）が調製され、５００〜１００，０００細胞に相当する各希釈液を９６穴培養プレートの穴に入れた。このプレートは３５０Ｘｇで遠心し、上澄液を捨てた。各ペレットは１％のトリトンＸ−１００を含むＰＢＳ２５０μｌに再び懸濁し、室温で５分間培養した。その細胞抽出液の一部（２００μｌ）を各穴から取り出して黒いプラスチックでできた平底の９６穴リーデイングプレートに入れた。

更ニ、）’Ｊ）：／Ｘ−１００１：よるＰＤ（ｊ希釈液（０，００５μＭ　〜１００９６μＭのＰＤＣＩ）を他のリーディングプレートに入れた。このプレートは標準カーブを作るのに用いた。

リーディングプレート中における各サンプルの蛍光強度は、４８５ｎｍの励起フィルタ及び５３８ｎｍの放射フィルタを用いてフルオロスカン■マイクロプレート・リーダー（商標、フロラ・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド）で測定した。

図１に見られるように、フルオロスカン■マイクロプレートリーダーにより分析されたＰＤＣＩの蛍光強度は、ＰＤＣＩの濃度に比例している。図２は、細胞から抽出されたＰＤＣＩの蛍光強度が細胞数に比例していることを示している。図２に現れているデータは、更にこの分析技術が抽出後のＰＤＣＩを結合した細胞が１０００個以下でも検出し得ることを示している。

実施例　２：免疫親和性分離法及びフルオロクロームリポータ−物質と結合した細胞からの該フルオロクロームの抽出による白血球の副集団における細胞の比率の決定実施例１に記載したように、抹消血単核細胞が健康なドナーから採取され、ＰＤＣＴ　（２μＭ濃度）で染色された。得られた細胞は１％のＢＳＡ及び４０μＭＥＤＴＡ　（エチレンジアミン４酢酸、ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａ＋ａｉｎｅ−ｔｅｔｒａａｃｅｔｊｃ　ａｃｉｄ）を含むＰＢＳからなる洗浄緩衝液中にＩ　Ｘ　１０　’／ｍｌの最終濃度で懸濁した。

ＰＤＣＩを結合した細胞の一部を、白血球部分集合に対して特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）と共に２Ｘ１０’細胞当たり２０〜４０μｌの濃度で培養した。使用したモノクローナル抗体は、ヘルパーＴ白血球及び単球に対して特異的な抗−ＣＤ４、ザブレッサー／障害性Ｔリンパ球を認識する抗−ＣＤ８、Ｂリンパ球に対して特異的な抗−ＣＤ１９、及びＩ　ｇＧ、イソタイプのモノクローナル抗体のネカティブコントロールであった。すべてのモノクローナル抗体はＡＭＡＣインコーポレーテッドから入手した。細胞はモノクローナル抗体と共に４℃ で３０分間培養し、洗浄緩衝液で２回洗浄し、２００μＩの洗浄緩衝液に再懸濁し、４ｍｌ容のポリプロピレンチューブに入れた。次いで、磁性ビーズ（ダイナル・インコーホレーテッド）と結合したヤギ抗マウスイムノグロブリン５０μｌを各チューブに加え、それらのチューブを血液撹拌機（ｂｌｏｏｄｒｓｉｘｅｒ、ロビング・サイエンティフィック）に乗せて４℃で３０分間培養した。

磁性ビーズ、及び該ビーズに結合した細胞を、該チューブに洗浄緩衝液１ｍｌを加え、次いで反応チューブを１分間磁石に近接配置して分離した。反応液と結合していない細胞とを含む上澄液を除去した。磁石を除去し、１ｍｌの洗浄緩衝液をゆるやかに撹拌しながらチューブに加え、得られたペレットを再度懸濁させた。上記と同様に磁石を再び近接させ、上澄液を除去した。この手順を反復した。

各反応チューブからの全ての上澄液は保存した。最後の洗浄の後、保存した上澄液を遠心して細胞を２００μｌの洗浄緩衝液に再度懸濁させた。

磁石で分離した洗浄されたペレットもまた２００μｌの洗浄緩衝液に再度懸濁させた。

各チューブ（洗浄されたペレットを含むチューブと、磁石分離の保存された上澄液からの細胞を含むチューブ）から一部（１５０μｌ）を９６穴プレートの穴に移した。このプレートを遠心して上澄液を捨てた。次いで、各穴の細胞を２５０ μｌの１％トリトンｘ−ｉｏｏに再度懸濁させてＰＤＣＩを抽出した。

これらの抽出物を実施例Ｉに記載したようにフルオロスカン■ブレートリーダーで分析した。この装置は１分以下で９６の抽出物の蛍光検出を行うことができる。モノクローナル抗体で標識された細胞のパーセンテージは次により計算された。

同一提供者からの細胞の一部をＰＤＣＩで染色せずに免疫蛍光標識に用いた。

これらのサンプルはモノクローナル抗体とともに上記と同様に培養し、次いでフィコエリスリンと複合したヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｂｉｏｍｅｄａ、　Ｃｏｒｐ、）と反応させた。免疫蛍光標識された細胞をフローサイトメトリーにより分析した。この分析方法は、この検出に従来から一般に用いられてきたものである。

フローサイトメトリーは、−回の蛍光検出あたり約１分間の時間を必要とする。

モノクローナル抗体（Ｍａｂ）で標識された細胞のパーセンテージは次のように計算された。

この検査の結果は下表の通りであった。

これらの結果は、特徴的な抗原を発現している集団における細胞部分集合の比率が本発明方法により決定できること、この方法によって得られた結果は在来のフローサイトメトリー分析によって得られた結果に匹敵すること、及び多数の蛍光検査に関して本発明の方法は在来の方法よりも大幅に少ない分析時間しか必要としないことを示している。本発明の若干の実施例を以上に説明して来たが、当業技術の熟達者には、上記の開示から多くの他の実施態様が明らがであろう。例えば、細胞性免疫に必須の抗原特異性細胞が本発明を用いて決定され得る。この決定は試験サンプルの全ての免疫細胞を、その免疫細胞の膜の脂質成分と安定に結合し得る上述のリポータ−物質と結合させ、そのリポータ−物質をもった細胞を固体支持体に結合した注目する抗原とともに培養し、結合した細胞を分離し、リポータ−物質を抽出し、結合した抗原特異的細胞の存在又は量を決定する。特異的免疫細胞部分集合の同定に加えて、本発明はモノクローナル抗体のパネルが得られる他のあらゆる系、例えば細菌、菌類、ウィルス及び寄生生物の分析の同様な決定を行うのに用い得る。

更に、本発明の好適な実施例による被分析物の決定では検出可能なリポータ−物質と被分析物とがリポータ−物質と被分析物の脂質成分との安定な結合を介して結合することが必須であったが、この手法はかなり広汎な応用をもっている。この点に関して、次のことが理解されるべきである。すなわち同一の基本的手法が化学的、物理的または物理化学的結合１例えば共有結合、水素結合９極性吸引力（ｐｏ］、ａｒ　ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）　、ファンデルワールス吸引力又はファンデルワールス吸着、生物特異的吸着（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）を含めて、リポータ−物質と被分析物との結合を達成する他のあらゆる手段を用いて、広汎な被分析物の決定に適用できることである。したがって、ここに記載した方法は、実質的に脂質を含まない被分析物の決定にも用い得ることを意図している。かかる方法は本発明の範囲に包含される。

したがって、本発明は以上に記述し実証された特定の実施例に限定されず、添付の請求の範囲から逸脱する事なく相当な変形と修正が可能である。

図１０　０．２　０．４濃度（μＭ）国際調査報告ＰＣ丁／ｌ’！ｉ９０１０２３４１Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ＰＣＴ／ＩＳ入／２１０、　（Ｉ　Ｉ＋　ａｔ　：ｔＪ、ｓ、　ＣＬ、＋　５３０７３５９．３１１０．３８７．８０Ｆｌ：　Ｊ２Ｊ／１１．４１７．４５０ｘｐｃ　ｆｓｌ：　入６１Ｍ　３７１０４．２２；　ＧＯＩＮ　３３／Ｊ８．５３．　９２．　５３２．　Ｓ３３．　５３Ｊ、５３７；５５５、　５６６、　５６フーーーー＾−−■−一、ＰゎＭ１℃ｓ１

Claims

【特許請求の範囲】１．特徴的なディターミナントを有する被分析物の存在が推定される試験サンプルにおいて、上記ディターミナントを有する被分析物の存在又は量を決定する下記を含む方法、（ｉ）検出可能なリポーター物質を、上記被分析物または上記被分析物の少なくとも一つの特徴的ディターミナントと選択的に相互作用することができる特異的結合物質と結合させ、その際上記リポーター物質が結合する上記被分析物または特異的結合物質は脂質成分を有し、上記リポーター物質を上記脂質成分と安定に結合させること、（ｉｉ）上記試験サンプルを上記特異的結合物質と、それらの間に複合体を形成させる条件下で接触させること、（ｉｉｉ）上記試験サンプルを、上記複合体を含む部分と上記複合体を実質的に含まない部分とに分別すること、及び（ｉｖ）上記分別された部分の一つに上記リポーター物質の存在を検出して、上記試験サンプル中に上記特徴的ディターミナントを有する上記被分析物の存在または量の表示を与えること。２．請求範囲第１項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを予め定められた標準と関連づけて、上記試験サンプル中の被分析物の存在または量を決定する手順を含む上記方法。３．請求範囲第２項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを、上記リポーター物質の予め定められた量を含む標準と関連づけて、それにより上記試験サンプル中に上記特徴的ディターミナントを有する被分析物を定量的に決定する上記方法。４．請求範囲第１項記載の方法であって、上記検出可能なリポーター物質が上記被分析物と結合する上記方法。５．請求範囲第４項記載の方法であって、上記被分析物が真核細胞，原核細胞及びウィルスよりなる群から選択された生体膜含有体を含む上記方法。６．請求範囲第４項記載の方法であって、上記検出可能なリポーター物質の存在が、上記複合体含有部分において検出される上記方法。７．請求範囲第４項記載の方法であって、上記試験サンプルが固相に固定された特徴的結合物質と接触される上記方法。８．請求範囲第７項記載の方法であって、上記特異的結合物質が結合される上記固相が磁性材料を含み，上記上記複合体を支持する上記固相が上記複合体を含まない部分から磁気的に分別される上記方法。９．請求範囲第４項記載の方法であって、上記試験サンプルが特異的結合物質としての少なくとも一つの抗原と接触させられる上記方法。１０．請求範囲第９項記載の方法であって、上記試験サンプルと接触させられる抗体が固相に固定されている上記方法。１１．請求範囲第９項記載の方法であって、上記試験サンプルと接触させられる抗体がモノクローナル抗体である上記方法。１２．請求範囲第４項記載の方法であって、上記試験サンプルを上記被分析物の少なくとも一つの特徴的ディターミナントと選択的に相互作用できる第１の特異的結合物質及び上記第１の特異的結合物質と選択的に相互作用できる第２の特異的結合物質と接触させることを含み、上記第２の特異的結合物質が上記固相に固定されている上記方法。１３．請求範囲第１２項記載の方法であって、上記試験サンプルが第１の特異的結合物質としての第１の抗体と接触させられ、第２の特異的結合物質としての第２の抗体と接触させられる上記方法。１４．請求範囲第４項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルが、上記リポーター物質と結合した膜結合体の既知量を含む標準と関連づけて、上記試験サンプル中に上記特徴的ディターミナントを有する被分析物を定量的に決定する上記方法。１５．請求範囲第４項記載の方法であって、検出可能なリポーター物質が上記被分析物と結合されており、上記リポーター物質がその検出に先立ってそれから抽出される上記方法。１６．請求範囲第４項記載の方法であって、上記被分析物に結合したリポーター物質が吸光，蛍光，リン光，またはルミネッセンス特性に基づいて直接に又は間接に検出可能な分子またはイオン、放射性特性により検出可能な分子またはイオン、及び核磁気共鳴または常磁性特性により検出可能な分子またはイオン、よりなる群から選択される上記方法。１７．膜囲繞細胞の集団において少なくとも一つの特徴的抗原を発現している細胞の副集団の存在または量を決定するための膜囲繞細胞の集団を分析する方法であって、（ｉ）上記細胞を抽出可能なリポーター物質に結合させ、抽出可能なリポーター物質が上記細胞の膜に安定に固定されること、（ｉｉ）上記細胞集団を上記抗原と選択的に相互作用できる抗体と接触させ、その際その抗原と抗体とを結合させる条件下で接触させ、その抗体は磁性粒子に固定されており、（ｉｉｉ）上記細胞の副集団を支持している上記磁性粒子を上記集団から分別すること、（ｉｖ）上記分別された細胞の副集団から上記リポーター物質を抽出すること、及び（ｖ）上記分別された細胞の副集団又は上記副集団が分別された後に残った集団において抽出されたリポーター物質のレベルを検出し、上記集団内の上記特徴的な抗原を発現している細胞の副集団の存在または量の表示を与えること、を含む上記方法。１８．請求範囲第１７項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを予め定めた標準と関連づけて上記集団内の上記副集団の存在または量を決定する手順を含む上記方法。１９．請求範囲第１８項記載の方法であって、上記検出されたリポーター物質のレベルを上記リポーター物質の既知量を含む標準と関連づけて、上記集団内の上記特徴的な抗原を有する細胞数を決定する上記方法。２０．請求範囲第１７項記載の方法であって、上記細胞に結合したリポーター物質が吸光，蛍光，リン光，又はルミネッセンス特性に基づいて直接または間接に検出可能な分子又はイオン、放射線特性によって検出可能な分子又はイオン、及び核磁気共鳴または常磁性特性により検出可能な分子またはイオンよりなる群から選択される上記方法。２１．請求範囲第１７項記載の方法であって、上記細胞がリポーター物質としてのフルオロクロームと結合される上記方法。２２．請求範囲第１７項記載の方法であって、上記細胞の集団が白血球，赤血球，及びそれらの混合物よりなる群から選択される上記方法。２３．請求範囲第１７項記載の方法であって、上記集団が血液細胞（ｈｅｍｏ− ｐｏｉｅｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ）を含み、上記生物体の副集団がある系，機能，または分化段階の血液細胞を含む上記方法。２４．膜囲繞細胞の集団を分析して、上記集団内に少なくとも一つの特徴的抗体を発現している副集団の存在または量を決定する方法であって、（ｉ）上記細胞を検出可能なリポーター物質と結合させて、上記検出可能なリポーター物質を上記細胞の膜と安定に結合させること、（ｉｉ）上記細胞集団を（ａ）生物体の上記副集団の特徴的な第１のディターミナントと選択的に相互作用する抗体及び（ｂ）上記抗体と選択的に相互作用する特異的結合物質と接触させること、その際上記特異的結合物質は固相に固定されていること、（ｉｉｉ）上記集団から上記細胞の副集団を支持している固相を分別すること、（ｉｖ）上記分別された細胞の副集団から上記リポーター物質を抽出すること、（ｖ）上記分別された細胞の副集団または上記副集団を分別した後に残った集団において抽出されたリポーター物質のレベルを検出して、上記集団内に上記特徴的な抗原を発現している細胞の副集団の存在又は量の表示を与えること。２５．請求範囲第２４項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを予め定めた標準と関連づけて、上記集団内の上記副集団の存在又は量を決定する手順を含む上記方法。２６．請求範囲第２５項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを上記リポーター物質と結合した膜囲繞体の既知の量を含む標準と関連づけて、上記集団内の上記特徴的抗原を発現している細胞数を決定する手順を含む上記方法。２７．請求範囲第２４項記載の方法であって、上記細胞に結合するリポーター物質が、吸光，蛍光，リン光又はルミネッセンス特性に基づいて直接又は間接に検出可能な分子又はイオン、放射性特性により検出可能な分子又はイオン、及び核磁気共鳴又は常磁性特性により検出可能な分子又はイオンよりなる群から選択される上記方法。２８．請求範囲第２４項記載の方法であって、上記細胞がリポーター物質としてのフルオロクロームに結合される上記方法。２９．細胞集団内に存在し、少なくとも一つの特徴的ディターミナントを有する細胞の副集団を分析し、その際上記細胞の副集団が注目する異なった部分集合を含み、各部分集合は少なくとも特徴的なディターミナントを含み、それにより上記細胞副集団の少なくとも一つの部分集合の比率を決定する方法であって、（ｉ）上記細胞副集団を含むと推定される上記集団の実質的に全ての細胞を検出可能なリポーター物質と結合させ、それにより上記細胞の膜と安定に結合させること、（ｉｉ）上記細胞集団の第１のサンプルと，上記細胞副集団の特徴的なディターミナントと選択的に相互作用できる少なくとも一つの特異的結合物質を有する第１の試薬とを、上記第１の試薬と上記副集団の細胞とを結合させる条件下で接触させ、それにより上記第１の副集団内に第１の複合体を形成させること、（ｉｉｉ）上記第１の副集団内において結合しなかった細胞から上記第１の副集団における第１の複合体を分別すること、（ｉｖ）上記第１の複合体におけるリポーター物質の存在を検出すること、（ｖ）上記（ｉ）の上記細胞集団の上記第１のサンプルと同量及び同濃度の第２のサンプルと、注目する特徴的なディターミナントと選択的に相互作用できる特異的結合物質を含む第２の試薬とを、上記第２の試薬と上記ディターミナントとを結合させて上記第２のサンプル中に第２の複合体を形成させる条件下で上記第２の複合体と接触させること、（ｖｉ）上記第２のサンプル中の上記第２の複合体を上記第２のサンプル中の結合していない細胞から分別すること、（ｖｉｉ）上記第２の複合体中のリポーター物質の存在を検出すること、及び（ｖｉｉｉ）上記細胞副集団中の注目する上記部分集合の比率を、上記第２の複合体と結合したリポーター物質の量を、上記第１の複合体と結合したリポーター物質の量に関して定量することにより、決定すること、を含む上記方法。３０．請求範囲第２９項記載の方法であって、（ｉｘ）上記（ｉ）の工程の上記細胞集団の更なるひとつ以上のサンプルを更なる試薬と接触させ、その際、各サンプルは上記第１のサンプルと同量かつ同一細胞濃度であり、上記更なる各試薬は、注目する更なる部分集合の特徴的ディターミナントと選択的に相互作用できる特異的結合物質を含み、かつ各更なる試薬と各部分集合とを結合させて上記更なる部分集合中に更なる複合体を形成させる条件下で接触させること、（ｘ）上記更なるサンプル中の上記更なる複合体を上記更なるサンプルの各々における結合しなかった細胞から分別すること、（ｘｉ）上記細胞複合体中のリポーター物質の存在を検出すること、及び（ｘｉｉ）上記細胞副集団中の上記更なる部分集合の比率を、上記更なる複合体と結合したリポーター物質の量を、上記第１の複合体と結合したリポーター物質の量に関して定量することにより、決定すること、を含む上記方法。３１．請求範囲第２９項記載の方法であって、上記第１の試薬が特異的結合物質を含み、上記各特異的結合物質は上記副集団を含む注目する異なった部分集合の特徴的なディターミナントと結合可能であり、それによって上記部分集合の実質的に全ての細胞が上記結合物質と結合する上記方法。３２．請求範囲第２９項又は３０項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを予め定めた標準と関連づけて、上記副集団地位の上記部分集合の存在又は量を決定する工程を更に含む上記方法。３３．請求範囲第３２項記載の方法であって、上記サンプル中の検出されたリポーター物質のレベルが、上記リポーター物質と結合した生体膜含有体の予め定められた量を含む標準と関連づけられ、それにより上記サンプル中の細胞数を決定する上記方法。３４．請求範囲第２９項又は３０項記載の方法であって、上記細胞サンプルと接触された上記第１の試薬，第２の試薬及び上記更なる試薬が上記固相と結合された上記特異的結合物質である上記方法。３５．請求範囲第２９項又は３０項記載の方法であって、上記細胞サンプルと接触させられた上記第１の試薬，上記第２の試薬，及び上記更なる試薬が、磁性粒子と結合した上記特異的結合物質を含み、注目する上記副集団を支持する上記第１の複合体，上記第２の複合体，及び上記更なる複合体が上記サンプルから磁気的に分別される上記方法。３６．請求範囲第２９項又は３０項記載の方法であって、上記細胞サンプルと接触させられた上記第１の試薬，上記第２の試薬，及び上記更なる試薬が特異的結合物質としての少なくとも一つの抗体を含む上記方法。３７．請求範囲第２９項又は３０項記載の方法であって、上記細胞サンプルと接触させられた上記第１の試薬，上記第２の試薬，及び上記更なる試薬が、特異的結合物質としての少なくとも一つのモノクローナル抗体を含む上記方法。３８．請求範囲第２９項又は３０項記載の方法であって、抽出可能なリポーター物質が上記細胞に結合され、上記リポーター物質がリポーター物質の検出に先立って上記細胞から抽出される上記方法。３９．請求範囲第２９項又は３０項記載の方法であって、上記被分析物に結合したリポーター物質が、吸光，蛍光，リン光又はルミネッセンス特性に基づいて直接又は間接に検出可能な分子又はイオン、放射性特性により検出可能な分子又はイオン、及び核磁気共鳴又は常磁性特性により検出可能な分子又はイオンよりなる群から選択される上記方法。４０．請求範囲第２９項又は３０項記載の方法であって、上記細胞に結合した上記検出可能なリポーター物質がフルオロクロームである上記方法。４１．請求範囲２９項記載の方法であって、上記第１のサンプルを上記第１の試薬と選択的に相互作用し得る補助的な特異的結合物質と接触させられ、上記補助的な特異的結合物質が上記固相に固定されている上記方法。４２．請求範囲第２９項記載の方法であって、上記第２のサンプルを上記第２の試薬と選択的に相互作用し得る補助的な特異的結合物質と接触させられ、上記補助的な特異的結合物質が上記固相に固定されている上記方法。４３．請求範囲３０項記載の方法であって、上記更なるサンプルの少なくとも一つを上記更なるサンプルが接触させられる更なる試薬と選択的に相互作用し得る補助的な特異的結合物質と接触させられ、上記補助的な特異的結合物質が固相に固定されている上記方法。４４．請求範囲第４１項，４２項又は４３項記載の方法であって、上記第１のサンプル，上記第２のサンプル，又は上記少なくとも一つの更なるサンプルが補助的な特異的結合物質としての抗体と接触させられる上記方法。４５．請求範囲第４４項記載の方法であって、上記第１のサンプル，上記第２のサンプル，又は上記少なくとも一つの更なるサンプルと接触させられる抗体がモノクローナル抗体である上記方法。４６．膜囲繞細胞の集団を分析して上記集団内において特徴的なディターミナントを発現している細胞の副集団の存在又は量を決定する方法であって、（ｉ）上記細胞を抽出可能なリポーター物質に結合させて上記抽出可能なリポーター物質を上記細胞の膜に安定に結合させること、（ｉｉ）上記細胞集団を上記ディターミナントと選択的に相互作用し得る特異的結合物質と、上記特異的結合物質を上記ディターミナントに結合させて上記特異的結合物質を固相に固定させる条件下で接触させること、（ｉｉｉ）上記副集団を支持している上記固相を上記集団から分別すること、（ｉｖ）上記リポーター物質を上記分別された細胞の副集団から抽出すること、及び（ｖ）抽出されたリポーター物資のレベルを検出して上記集団内で上記特徴的なディターミナントを発現している細胞の副集団の存在又は量の表示を与えること、を含む上記方法。４７．請求範囲第４６項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを予め定められた標準と関連づけて上記集団内の上記副集団の存在又は量を決定する工程を含む上記方法。４８．請求範囲第４７項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルが検出されたリポーター物質に結合した膜囲繞体の予め定めた量を含む標準と関連づけて、上記集団内の上記特徴的なディターミナントを発現している細胞数を決定する上記方法。４９．請求範囲第４６項記載の方法であって、上記被分析物に結合したリポーター物質が、吸光，蛍光，リン光又はルミネッセンス特性に基づいて直接又は間接に検出可能な分子又はイオン、放射性特性により検出可能な分子又はイオン、及び核磁気共鳴又は常磁性特性により検出可能な分子又はイオンよりなる群から選択される上記方法。５０．請求範囲第４６項記載の方法であって、上記細胞がリポーター物質としての抽出可能なフルオロクロームと結合される上記方法。５１．請求範囲第４６項記載の方法であって、上記副集団が特徴的な抗原を発現しており、上記細胞集団が特異的結合物質としての上記抗原に対する抗体と接触させられる上記方法。５２．請求範囲第５０項記載の方法であって、上記細胞集団と接触させられた抗体がモノクローナル抗体である上記方法。５３．請求範囲第１項記載の方法であって、上記検出可能なリポーター物質が上記特異的結合物質に結合される上記方法。５４．請求範囲第５３項記載の方法であって、上記被分析物が固相に固定されており、上記固相が上記試験サンプルから分別され、上記固相上の上記検出可能なリポーターの存在が決定される上記方法。５５．請求範囲第５４項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルが、予め定められた標準と関連づけられて、上記試験サンプル中における上記被分析物の存在又は量を決定する工程を含む上記方法。５６．請求範囲第５４項記載の方法であって、上記被分析物に結合されたリポーター物質が、吸光，蛍光，リン光又はルミネッセンス特性に基づいて直接又は間接に検出可能な分子又はイオン、放射性特性により検出可能な分子又はイオン、及び核磁気共鳴又は常磁性特性により検出可能な分子又はイオンよりなる群から選択される上記方法。５７．請求範囲第５４項記載の方法であって、上記特異的結合物質が検出可能なリポーター成分としてのフルオロクロームに結合されている上記方法。５８．請求範囲第５７項記載の方法であって、上記フルオロクロームが検出に先立って上記試薬から抽出される上話方法。５９．請求範囲第５４項記載の方法であって、上記試験サンプル中の多数の被分析物の存在又は量を、上記試験サンプルを決定されるべき上記多数の被分析物の各々に対する異なった特異的結合物質と接触させられることにより決定し、各被分析物が特徴的なディターミナントを有し、上記各特異的結合試薬が接触させられる上記試験サンプル中の異なった被分析物の特徴的なディターミナントと上記各特異的結合物質とが選択的に相互作用し、上記異なった被分析物の各々に対する特異的結合試薬がリポーター物質を有し、そのリポーター物質は他の特異的結合試薬のリポーター物質から識別可能である上記方法。６０．請求範囲第５９項記載の方法であって、各特異的結合物質のリポーター物質が異なったスペクトル特性を有するフルオロクロームである上記方法。６１．少なくとも一つの特徴的なディターミナントを有する試薬であって、上記試薬が脂質含有成分，上記特徴的なディターミナントと選択的に相互作用し得る特異的結合成分，及び上記脂質含有成分と安定に結合する検出可能なリポーター成分を含む被分析物決定用試薬。６２．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記試薬の上記脂質含有成分及び上記特異的結合成分が、上記被分析物の特徴的なディターミナントと選択的に相互作用する天然に存在する受容体を有する細胞を含んでいる上記試薬。６３．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記試薬の上記脂質含有成分及び上記特異的結合成分が、誘導された受容体を有する細胞を含み、その受容体が上記被分析物の特徴的なディターミナントと選択的に相互作用する上記試薬。６４．請求範囲第６３項記載の試薬であって、上記細胞が組換えＤＮＡ技術によって誘導されて上記受容体を発現する上記試薬。６５．請求範囲第６３項記載の試薬であって、上記細胞が形質導入によって誘導されて上記受容体を発現する上記試薬。６６．請求範囲第６３項記載の試薬であって、上記細胞が生理学的活性化により誘導されて上記受容体を発現する上記試薬。６７．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記試薬の上記脂質含有成分及び上記特異的結合成分がそれに結合した抗体又は抗原を有する細胞を含み、その抗体又は抗原が上記被分析物の特徴的なディターミナントと選択的に相互作用する上記試薬。６８．請求範囲第６７項記載の試薬であって、誘導された抗体又は抗体断片が上記細胞の表面に結合されており、上記誘導された抗体又は抗体断片が炭化水素置換基を有し、その置換基が上記誘導された抗体又は抗体断片を充分に非極性化して１０％までの血清を含む食塩水中で２４時間にわたり少なくとも９０の表面膜滞在係数をもつようにさせ、上記係数のパーセンテージ変化が上記時間にわたって１０％未満である上記試薬。６９．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター成分が、吸光，蛍光，リン光又はルミネッセンス特性に基づいて直接又は間接に検出可能な分子又はイオン、放射性特性により検出可能な分子又はイオン、及び核磁気共鳴又は常磁性特性により検出可能な分子又はイオンよりなる群から選択される上記試薬。７０．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター成分がルミネッセンス物質である上記試薬。７１．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター成分が吸光物質である上記試薬。７２．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター成分がシアニン，アクリジン，ピリジン，アントラキノン，クマリン，キノリン，キサンチン，フェノキサジン，フェノチアジン及びヘキサトリエン染料及びそれらの誘導体よりなる群から選択されたフルオロクロームである上記試薬。７３．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター成分が下式の化合物である試薬、 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）ここで、Ｒ及びＲ１は同一でも異なっていても良く、水素，アルキル，アルケニル，アルキニル，アルカリル又はアラルキルからなる群から独立に選択された置換体を示し、それらの炭化水素鎖の炭素数は１〜３０であり、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、上記置換体はひとつ以上の非極性官能基で置換されていてもされていなくても良く、ＲとＲ１との一方は少なくとも１２個の直鎖状の炭素原子を有し、ＲとＲ１における直鎖状の炭素原子の合計は少なくとも２３であり；Ｘ及びＸ１は同一でも異なっていても良く、Ｏ，Ｓ，Ｃ（ＣＨ３）２又はＳｅを示し、Ｙは−ＣＨ＝，−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝，−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝，又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝からなる群から選択されたリンク結合基であり、Ｚ及びＺ１は同一でも異なっていても良く、Ｈ，アルキル，ＯＨ，ＮＨ２，ＣＯＯＨ，ＣＯＮＨ２，ＳＯ３Ｈ，ＳＯ２ＮＨ２，ＮＨＮＨ２，ＮＣＳ，ＮＣＯ，ＣＯ２ＮＨ２，ＣＯＭＨ−アルキル，ＣＯＮ−（アルキル）２，ＮＨ−アシル，Ｏ −アルキル，ＮＨ−アルキル，Ｎ（アルキル）２，ＳＨ，Ｓ−アルキル，ＮＯ２又はハロゲン，よりなる群から選択された置換体を示し、上記Ｚ置換体を構成するアルキル基は１〜３の炭素原子を有し、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。７４．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター成分が下式の化合物である試薬、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）ここで、Ｒ及びＲ１は同一でも異なっていても良く、炭素数１〜３０のアルキル置換体であり、直鎖状でも分岐鎖状でも良く、ハロゲンで置換されていてもされていなくても良く、ＲとＲ１の一方は少なくとも１２個の直鎖状の炭素を有し、ＲとＲ１における直鎖状の炭素原子の合計が少なくとも２３であり、Ｚ及びＺ１は同一でも異なっていても良く、Ｈ又は炭素数１〜３の低級アルキルであり、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。７５．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター物質が３，３−ジ −ｎ−オクタデシルオキサカーボシアニン・パークロレートである上記試薬。７６．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター物質が３−ｎ−ペンチル−３′−ｎ−オクタデシルオキサカーボシアニン・イオダイドである上記試薬。７７．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター物質が３−ｎ−オクチル−３′−ｎ−オクタデシルオキサカーボシアニン・イオダイドである上記試薬。７８．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター物質が３−ｎ−プロピル−３′−ｎ−エイコサニルオキサカーボシアニン・イオダイドである上記試薬。７９．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター物質が３−ｎ−プロピル−３′−ｎ−ドコサニルオキサカーボシアニン・イオダイドである上記試薬。８０．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター成分が下式の化合物である試薬、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）ここで、Ｒ及びＲ１は同一でも異なっていても良く、炭素数１〜３０のアルキル置換体であり、直鎖状でも分岐鎖状でも良く、ハロゲンで置換されていてもされていなくても良く、ＲとＲ１の一方は少なくとも１２個の直鎖状の炭素原子を有し、ＲとＲ１における直鎖状の炭素原子の合計が少なくとも２３であり、Ｚ及びＺ１は同一でも異なっていても良く、Ｈ又は炭素数１〜３の低級アルキルである置換体であり、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。８１．請求範囲第６１項記載の試薬であって、上記リポーター物質が１，１−ジ −ｎ−オクタデシル−３，３，３′，３′−テトラメチルインドカーボツアニン・パークロレートである上記試薬。（ｉ）上記被分析物に結合するための検出可能であり、上記脂質成分と安定に結合し得るリポーター物質、及び（ｉｉ）上記被分析物の少なくとも一つの特徴的なディターミナントと選択的に相互作用し得る少なくとも一つの特異的結合物質を含む試薬、とを含む上記テストキット。９５．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記リポーター物質を上記被分析物に結合するための媒体を含んでいる上記テストキット。９６．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記特異的結合物質が固相に固定されている上記テストキット。９７．請求範囲第９６項記載のテストキットであって、上記固相が磁性素材を含んでいる上記テストキット。９８．請求範囲第９６項記載のテストキットであって、上記特異的結合物質が抗体である上記テストキット。９９．請求範囲第９８項記載のテストキットであって、上記抗体がモノクローナル抗体である上記テストキット。１００．請求範囲第９７項記載のテストキットであって、上記特異的結合物質が抗体である上記テストキット。１０１．請求範囲第１００項記載のテストキットであって、上記抗体がモノクローナル抗体である上記テストキット。１０２．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記被分析物から上記リポーター物質を抽出する抽出剤を含む上記テストキット。１０３．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記試験サンプル中の上記被分析物の存在又は量を決定するための少なくとも一つの予め定めた標準を含む上記テストキット。１０４．請求範囲第１０３項記載のテストキットであって、上記標準が上記リポーター物質と安定に結合する膜囲繞体を含む上記テストキット。１０５．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記試験サンプル中の上記被分析物の存在又は量を決定するための標準の作成仕様書を含む上記テストキット。１０６．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記リポーター物質がルミネッセンス物質である上記テストキット。１０７．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記リポーター物質が吸光物質である上記テストキット。１０８．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記リポーター物質がシアニン，アクリジン，ピリジン，アントラキノン，クマリン，キノリン，キサンチン，フェノキサジン，フェノチアジン及びヘキサトリエン染料及びそれらの誘導体よりなる群から選択されたフルオロクロームである上記テストキット。１０９．請求範囲第９４項記載のテストキットであって、上記リポーター物質が下式の化合物である上記テストキット、▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）ここで、Ｒ及びＲ１は同一でも異なっていても良く、水素，アルキル，アルケニル，アルキニル，アルカリル又はアラルキルからなる群から独立に選択された置換体を示し、それらの炭化水素鎖の炭素数は１〜３０であり、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、上記置換体はひとつ以上の非極性官能基で置換されていてもされていなくても良い、Ｘ及びＸ１は同一でも異なっていても良く、Ｏ，Ｓ，Ｃ（ＣＨ３）２又はＳｅを示し、Ｙは−ＣＨ＝，−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝，−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝，又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝からなる群から選択されたリンク結合基であり、Ｚ及びＺ１は同一でも異なっていても良く、Ｈ，アルキル，ＯＨ，ＮＨ２，ＣＯＯＨ，ＣＯＮＨ２，ＳＯ３Ｈ，ＳＯ２ＮＨ２，ＮＨＮＨ２，ＮＣＳ，ＮＣＯ，ＳＯ２ＮＨ２，ＣＯＮＨ−アルキル，ＣＯＮ−（アルキル）２，ＮＨ−アシル，− Ｏ−アルキル，ＮＨ−アルキル，Ｎ（アルキル）２，ＳＨ，Ｓ−アルキル，ＮＯ２又はハロゲン，よりなる群から選択された置換体を示し、上記Ｚ置換体を構成するアルキル基は１〜３の炭素原子を有し、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。１１０．少なくとも一つの特徴的ディターミナントを有する生体膜含有体の集団内に存在し、各々が少なくとも一つの特徴的ディターミナントを有する異なった部分集合を含む副集団を分析して、上記副集団中の少なくとも一つの部分集合の比率を決定するテストキットであって、上記テストキットは、（ｉ）上記生体膜の脂質成分と安定に結合することができ、上記生体膜含有体の集団に結合するための検出可能なリポーター物質、（ｉｉ）上記副集団の少なくとも一つの特徴的ディターミナントと選択的に相互作用可能な少なくとも一つの特異的結合物質を含む第１の試薬、及び（ｉｉｉ）上記副集団の少なくとも一つの部分集合の少なくとも一つの特徴的ディターミナントと選択的に相互作用可能な少なくとも一つの特異的結合物質を含む少なくとも一つの更なる試薬、を含む上記テストキット。１１１．請求範囲第１１０項記載のテストキットであって、上記第１の試薬と上記副集団との間、及び少なくとも一つの更なる試薬と，その試薬と複合体を形成する部分集合との間で形成された複合体を定量するための少なくとも一つの予め定められた標準を含む上記テストキット。１１２．試験サンプル中の被分析物であり、特徴的なディターミナントを有する上記被分析物を決定するテストキットであって、上記テストキットが脂質成分，上記特徴的ディターミナントと選択的に相互作用可能な特異的結合成分，及び上記脂質含有成分と安定に結合する検出可能なリポーター成分とを有する上記テストキット。１１３．請求範囲第１１２項記載のテストキットであって。上記リポーター成分がルミネッセンス物質である上記テストキット。１１４．請求範囲第１１２項記載のテストキットであって。上記リポーター成分が吸光物質である上記テストキット。１１５．請求範囲第１１２項記載のテストキットであって、上記リポーター成分が、シアニン，アクリジン，ピリジン，アントラキノン，クマリン，キノリン，キサンチン，フェノキサジン，フェノチアジン及びヘキサトリエン染料及びそれらの誘導体よりなる群から選択されたフルオロクロームである上記テストキット。１１６．請求範囲第１１１項記載のテストキットであって、上記リポーター成分が下式の一般式で表される化合物である上記テストキット、▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）ここで、Ｒ及びＲ１は同一でも異なっていても良く、水素，アルキル，アルケニル，アルキニル，アルカリル又はアラルキルからなる群から独立に選択された置換体を示し、それらの炭化水素鎖の炭素数は１〜３０であり、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、上記置換体はひとつ以上の非極性官能基で置換されていてもされていなくても良く、ＲとＲ１との一方は少なくとも１２個の直鎖状の炭素原子を有し、ＲとＲ１における直鎖状の炭素原子の合計は少なくとも２３であり；Ｘ及びＸ１は同一でも異なっていても良く、Ｏ，Ｓ，Ｃ（ＣＨ３）２又はＳｅを示し、Ｙは−ＣＨ＝，−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝，−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝，又は−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝からなる群から選択されたリンク結合基であり、Ｚ及びＺ１は同一でも異なっていても良く、Ｈ，アルキル，ＯＨ，ＮＨ２，ＣＯＯＨ，ＣＯＮＨ２，ＳＯ３Ｈ，ＳＯ２ＮＨ２，ＮＨＮＨ２，ＮＣＳ，ＮＣＯ，ＳＯ２ＮＨ２，ＣＯＮＨ−アルキル，ＣＯＮ−（アルキル）２，ＮＨ−アシル，Ｏ −アルキル，ＮＨ−アルキル，Ｎ（アルキル）２，ＳＨ，Ｓ−アルキル，ＮＯ２又はハロゲン，よりなる群から選択された置換体を示し、上記Ｚ置換体を構成するアルキル基は１〜３の炭素原子を有し、Ａは生物学的に適合するアニオンを示す。１１７．請求範囲第１１２項記載のテストキットであって、上記被分析物を固定するための固相を更に含む上記テストキット。１１８．請求範囲第１１２項記載のテストキットであって、上記脂質含有成分から上記リポーター物質を抽出する抽出剤を更に含む上記テストキット。１１９．請求範囲第１１２項記載のテストキットであって、上記試験サンプル中の上記被分析物の存在又は量を決定するための予め定められた標準を更に含む上記テストキット。１２０．請求範囲第１１２項記載のテストキットであって、上記試験サンプル中の上記被分析物の存在又は量を決定するための標準を作成するための仕様書を更に含む上記テストキット。１２１．請求範囲第１項記載の方法であって、上記検出可能なリポーター物質が上記特異的結合物質に結合しており、上記試験サンプルを上記特異的結合物質に接触させる工程が、決定されるべき上記被分析物の既知の量を上記試験サンプルに加えることを含み、それにより上記試験サンプル中に最初から存在する何等かの被分析物と上記特異的結合物質と複合体を形成するために加えられた被分析物との間で競合させる上記方法。１２２．生物体の集合内で、少なくとも一つの特徴的なディターミナントを有する生物体副集団の存在又は量を決定する方法であって、（ｉ）上記生物体に検出可能なリポーター物質を結合させること、（ｉｉ）上記生物体を上記生物体副集団の少なくとも一つの特徴的なディターミナントと選択的に相互作用し得る特異的結合物質と、上記特異的結合物質を上記少なくとも一つのディターミナントに結合させる条件下で接触させること、（ｉｉｉ）上記生物体副集団を支持している上記結合物質を上記集団から分別すること、及び（ｉｖ）上記分別された生物体副集団又は上記副集団の分別の後に残存する集団に含まれる上記検出可能なリポーター物質の存在を検出して、上記集団中の上記特徴的なディターミナントをもった生物体の副集団の存在又は量の表示を与えること、を含む上記方法。１２３．請求範囲第１２２項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを予め定められた標準と関連づけて、上記集団内で上記副集団の存在又は量を決定する工程を含む上記方法。１２４．請求範囲第１２２項記載の方法であって、検出されたリポーター物質のレベルを上記リポーター物質の既知の量を含む標準と関連づけて、上記集団内で上記特徴的なディターミナントを有する生物体数を決定する上記方法。