ES2321740T3 - Procedimiento para la deteccion rapida y sencilla de celulas y biomoleculas con ayuda de particulas paramagneticas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección de células (ZZ) o biomoléculas seleccionadas en una muestra, caracterizado porque a) se recubren microperlas paramagnéticas con una molécula de detección específica dirigida frente a una característica de las células o biomoléculas, b) se pone en contacto la muestra con las microperlas recubiertas, c) se separa la muestra de las microperlas ya cargadas con ayuda de un imán que ha de colocarse, d) se ponen en suspensión las microperlas cargadas y separadas de la muestra, e) se somete a ensayo la suspensión de microperlas obtenida en d) en el sistema de tarjeta de gel, y f) mediante la existencia de una aglutinación entre las biomoléculas y/o las ZZ y las microperlas recubiertas se determina de manera visual o fotométrica directamente la presencia de la biomolécula que ha de detectarse o de la célula que ha de detectarse.
Description
Procedimiento para la detección rápida y
sencilla de células y biomoléculas con ayuda de partículas
paramagnéticas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento sencillo y rápido de realizar para la detección de
células y biomoléculas con ayuda de partículas (perlas)
paramagnéticas. A la mezcla que va a someterse a ensayo se le
añaden perlas paramagnéticas (comercialmente disponibles de
distintos fabricantes) que están cargadas con antígenos o
anticuerpos monoespecíficos (moléculas de detección) y se mezcla.
Entonces se coloca la muestra con las perlas en un campo magnético
intenso. Mediante el campo magnético se retienen las perlas, y el
resto de la muestra se evacua o se separa completamente. Tras
eliminar el campo magnético las partículas se suspenden. Entonces
un apelmazamiento de las partículas es una prueba de la existencia
de una reacción específica o de un aislamiento específico de
células diana o biomoléculas diana, dado que éstas reaccionan con
las moléculas de detección específicas y junto con las perlas
representan una reticulación (aglutinación) visible. Además, la
existencia de una reacción específica puede detectarse también
mediante determinación fotométrica de la unión de la biomolécula
específica. En este caso se utilizan preferiblemente anticuerpos o
perlas marcados.
Es característico del procedimiento la
sensibilidad extremadamente alta, el manejo sencillo, las rápidas
pruebas y la valoración en cualquier momento y en cualquier lugar.
La reacción puede intensificarse de manera visible o masiva
mediante la adición de otras perlas más pequeñas y no
paramagnéticas, que también están cargadas con moléculas de
detección específicas. Una detección o intensificación adicional de
la reacción es posible mediante las pruebas en el sistema de
tarjeta de gel (sistema de prueba de aglutinación de partículas) o
mediante medición fotométrica especialmente en el caso de perlas de
color o marcadas con europio.
La detección de células y biomoléculas es
necesaria en numerosos campos, tales como por ejemplo la detección
de células fetales en la circulación materna, la identificación
temprana de células tumorales en la circulación de pacientes
afectados, la detección de células tumorales en preparaciones de
células madre antólogas, la detección de proteínas (moléculas en el
fluido corporal o el tejido), la detección de bacterias o gérmenes
en muestras o alimentos, la detección de toxinas (armas biológicas)
etc. Las técnicas sensibles usadas hasta el momento son
relativamente costosas y pueden realizarse sólo en laboratorios
especiales, tales como por ejemplo la citometría de flujo (FACS),
reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) y la inmunohistoquímica
[1-16]. Las micro y nanoperlas paramagnéticas y no
paramagnéticas las ofrecen distintos fabricantes (Dynal, Miltenyi,
Biotec, entre otros) y la purificación de células y biomoléculas con
ayuda de perlas paramagnéticas es un procedimiento conocido
[documentos DE 101 11 520 A1; WO 02/090565 A2; DE 101 37 665 A1; US
2002/0072129 A1; EP 0 855 441 A2; US 2003/0175691 A1; 4.649.116; US
2003/0032028 A1; US 2004/0005718 A1]. Con ayuda de tales perlas
paramagnéticas pueden aislarse y caracterizarse determinadas células
o moléculas a partir de una disolución.
El documento DE4124778 describe un procedimiento
para el análisis de reacciones de aglutinación con el uso de
microcolumnas y partículas magnéticas.
En un protocolo típico se mezcla una suspensión
de partículas magnéticas con una muestra que contiene determinadas
células o moléculas. A continuación se aplica un campo magnético, de
modo que se retienen las partículas con las células diana o
moléculas diana mediante el campo magnético a una pared del
recipiente. Se desecha el sobrenadante y las partículas se lavan al
menos una vez más. Después se añade un tampón adecuado para la
separación de las células o biomoléculas aisladas de las perlas. La
separación tiene lugar mediante centrifugación o mediante la
aplicación de un campo magnético. Las moléculas diana separadas se
detectan con los procedimientos relativamente complicados
mencionados anteriormente, tales como por ejemplo métodos
inmunohistoquímicos, PCR o FACS. Las desventajas de todos los
procedimientos descritos hasta el momento en este contexto son:
- 1.
- la necesidad siempre presente de una separación de las moléculas diana de las perlas,
- 2.
- la pérdida debida a ello de moléculas diana (por la separación),
- 3.
- el trabajo invertido,
- 4.
- el tiempo invertido,
- 5.
- los costes,
- 6.
- la viabilidad por lo general compleja, así como
- 7.
- la necesidad de aparatos especiales.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, era objetivo de la presente invención
desarrollar un procedimiento con el que se superaran las
desventajas del estado de la técnica tratado anteriormente.
Especialmente, el procedimiento debería ser rápido y sencillo en la
realización y a la vez posibilitar una alta sensibilidad.
Por tanto, bajo un primer punto de vista, la
invención se refiere a un procedimiento para la detección de
células o biomoléculas en una muestra, en el que:
- a)
- se recubren perlas paramagnéticas con una molécula de detección (preferiblemente un antígeno o un anticuerpo específico) dirigida frente a una característica de la biomolécula que ha de detectarse o de la célula que ha de detectarse,
- b)
- se pone en contacto la muestra que va a someterse a ensayo con las perlas recubiertas,
- c)
- se separa la muestra de las perlas ya cargadas,
- d)
- se ponen en suspensión las microperlas cargadas y separadas de la muestra,
- e)
- se somete a ensayo la suspensión de microperlas obtenida en (d) en el sistema de tarjeta de gel, y
- f)
- mediante la existencia de una reacción específica se valora la presencia de la biomolécula que ha de detectarse o de la célula que ha de detectarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Este procedimiento se realiza con ventaja de
modo que en la etapa a) y/o b) además de las microperlas se agregan
nanoperlas o anticuerpos, que están recubiertos con una segunda
molécula de detección, que está dirigida o bien frente a la misma
característica o bien frente a otra característica en la célula de
búsqueda/la biomolécula, en la reacción de unión como el denominado
intensificador de la aglutinación (o perlas de intensificación).
Tales intensificadores de la aglutinación pueden
añadirse, en un ejemplo de realización preferido adicional de la
presente invención, de manera alternativa a la misma, también sólo
tras la etapa (c) del procedimiento según la invención.
Las pruebas se realizan en el sistema de tarjeta
de gel (sistema de prueba de aglutinación de partículas).
Según la invención, las nanopartículas presentan
preferiblemente un tamaño de desde 50 nm hasta 0,5 \mum, de
manera preferible aproximadamente de 100 nm.
De manera especialmente preferida, las
nanopartículas y/o microperlas son de color, lo que posibilita una
evaluación fotométrica.
Un sistema especialmente preferido según la
invención para la detección son perlas que contienen europio,
especialmente nanoperlas o también anticuerpos. Por medio de la
fluorescencia retardada en el tiempo pueden detectarse con alta
sensibilidad estas perlas y con ello los aglutinados formados.
Pueden adquirirse nanopartículas con europio por ejemplo de la
empresa Seradyn, Indianápolis, EE.UU. Estas partículas están
"absorbidas" con quelatos de europio, de modo que la
superficie permanece libre para reacciones de acoplamiento y se
retienen los quelatos de europio. Quelato de europio:
tris-(naftiltrifluorobutanodiona)-Eu. Cuando se
excitan estas partículas con luz UV (máximo de 333 nm), emiten una
radiación luminosa a 613 nm con una duración de aproximadamente 0,5
milisegundos, que es de 10.000 veces a 100.000 veces más larga que
la duración de emisión de la mayoría de los fluoróforos. Esta
duración de emisión extremadamente larga y el gran desplazamiento de
Stokes (diferencia entre la longitud de onda de excitación y
emisión) permite su uso en las pruebas basadas en la fluorescencia
retardada en el tiempo. Cada partícula contiene >30.000 átomos de
europio, incluidos en
tris-naftiltrifluorobutanodiona (una dicetona).
Para las partículas con un tamaño de 100 nm, el denominado
rendimiento cuántico ("quantum yield", en inglés) es
equivalente a aproximadamente 3.000 moléculas de fluoresceína (uno
de los fluoróforos más usados). La ficobiliproteína (probablemente
el compuesto conocido con mayor intensidad de fluorescencia) tiene
en comparación una ganancia cuántica que corresponde a la de
aproximadamente 30 moléculas de fluoresceína. Dado que una
partícula de 100 nm tiene un diámetro 10 veces mayor en comparación
con la ficobiliproteína y una razón volumen/masa 1.000 veces mayor,
estas perlas presentan una fluorescencia 100 veces superior en base
molar, que la ficobiliproteína. Las micropartículas según la
invención presentan un tamaño de entre 0,1 y 5 \mum,
preferiblemente de 2,5 a 3 \mum.
Con ventaja se realiza de manera visual o
fotométrica la valoración de la existencia de una aglutinación.
Opcionalmente puede(n) realizarse también
entre las etapas (c) y (d) una o varias etapa(s) de lavado.
Puede prescindirse con ventaja de esta(s) etapa(s) de
lavado cuando las biomoléculas que han de detectarse son
anticuerpos, y se selecciona una manera de proceder correspondiente
a la figura 7.
Las biomoléculas son especialmente antígenos y
anticuerpos, pero en principio pueden detectarse de este modo todas
las biomoléculas habituales para el experto, tales como proteínas,
ácidos nucleicos y otras. Especialmente puede tratarse de
anticuerpos, tales como los que se detectan por ejemplo en la
determinación del grupo sanguíneo.
Las moléculas de detección dependen según la
naturaleza de la biomolécula específica que ha de detectarse.
Preferiblemente, en el caso de moléculas de detección, se trata de
antígenos o anticuerpos específicos, sin embargo puede tratarse
también de otras moléculas de unión, tales como por ejemplo de
ácidos nucleicos, etc.
La expresión "característica de la biomolécula
que ha de detectarse o de la célula que ha de detectarse
(denominación alternativa: célula diana, abreviado ZZ,
(``Zielzelle''))" significa según la invención por ejemplo
un determinante antigénico (epítopo) de la biomolécula o de la
célula que ha de detectarse. Sin embargo puede tratarse por ejemplo
también de un ácido nucleico complementario u otros principios de
unión.
Con el procedimiento según la invención se
superan las desventajas del estado de la técnica, no separándose
las células o biomoléculas aisladas de las partículas, sino que se
valora directamente de manera visual o fotométrica la reacción,
preferiblemente una aglutinación, entre los componentes (véase la
figura 1). Si se produce una aglutinación o una reacción de unión
específica que no conduce a la aglutinación de las partículas,
entonces se trata de una reacción específica, y la muestra se
considera positiva. La sensibilidad puede aumentarse mediante la
adición de cantidades y mediante el uso de tarjetas de gel
comercialmente disponibles para la detección de la aglutinación de
eritrocitos o la aglutinación de partículas (por ejemplo el sistema
de tarjetas ID de la empresa DiaMed) (figura 2). Una
intensificación adicional de la visualización de las reacciones
puede aumentarse mediante una adición de perlas más pequeñas
(nanoperlas) (50 nm - 0,5 \mum) (figura 3). Estas perlas de
intensificación se cargan previamente con anticuerpos o antígenos,
que están dirigidos frente a la misma biomolécula o la misma célula
de búsqueda. Según el procedimiento de medición pueden usarse perlas
de intensificación incoloras o coloreadas. En el último caso las
reacciones pueden medirse también de manera fotométrica. Las perlas
de intensificación pueden mezclarse o bien simultáneamente (figura
3) con las perlas paramagnéticas con la muestra de partida o bien
pueden añadirse a la misma tras el aislamiento y la purificación
(figura 4) de la molécula diana. En lugar de perlas intensificadoras
pueden usarse también anticuerpos marcados, pudiendo usarse los
métodos de marcado conocidos en el estado de la técnica. A este
respecto es preferible un marcado no radiactivo (figura 5 y figura
6). Las reacciones pueden comprobarse de manera visual, automática
o fotométrica. Además, el método no es adecuado solamente para la
detección de biomoléculas antigénicas, sino también de anticuerpos.
En este caso puede prescindirse del proceso de lavado que sirve para
la eliminación de anticuerpos no unidos específicos o no
específicos libres (figura 7). Sin embargo también es posible lavar
(figura 8).
Bajo un punto de vista preferido, el presente
método se refiere por tanto a un procedimiento para la detección de
anticuerpos específicos en una muestra, en el que de manera
adicional a la etapa a) mencionada anteriormente, se coloca
previamente en una etapa a1) adicional un antígeno, frente al que
está dirigido el anticuerpo que ha de detectarse, sobre un soporte
(I), sin unirlo de manera fija al soporte, se recubre en una etapa
a2) adicional, un soporte (II) adicional con un anticuerpo
anti-especie X, siendo la especie X la especie de la
que procede el anticuerpo que ha de detectarse, y estando dispuesto
el soporte de modo que la muestra que va a someterse a ensayo puede
entrar en contacto en la etapa b) en primer lugar solamente con el
soporte (I), se ponen en contacto en una etapa a3) adicional las
perlas recubiertas de la etapa a) con el antígeno de la etapa a1),
y se coloca el imán en la etapa c) de modo que, debido a la fuerza
magnética, se mueven los conglomerados de perlas recubiertas,
antígeno y anticuerpo que ha de detectarse hacia el soporte
recubierto con anticuerpo anti-X, determinándose la
presencia del anticuerpo que ha de detectarse en la muestra mediante
la formación de aglutinados específicos o reacciones de unión
específicas entre este anticuerpo que ha de detectarse y el
anticuerpo anti-X. Esta manera de proceder está
explicada de manera esquemática en la figura 7. A este respecto la
placa de cubierta puede colocarse también sólo antes de la etapa c).
La detección de la unión tiene lugar por medio de los
procedimientos adecuados y dados a conocer.
Una ventaja adicional, muy importante del
procedimiento según la invención consiste en que el volumen de la
muestra que va a someterse a ensayo puede aumentarse casi a
voluntad. Incluso volúmenes de muestra de hasta 100 ml y más no
representan ningún problema debido al uso directo de las perlas
paramagnéticas y de la posibilidad debida a ello de la supresión de
la separación de la muestra y la molécula o ZZ detectada. A este
respecto se reconoce un límite superior teórico para el tamaño de
muestra solamente en la disponibilidad de las perlas magnéticas
usadas. En el estado de la técnica se realizan por ejemplo pruebas
sanguíneas exclusivamente en volúmenes de hasta 100 \mul. En este
caso se observa un motivo para la sensibilidad reducida de las
pruebas hasta el momento, que se mejora de manera decisiva mediante
la presente invención.
La figura 1 muestra el modo de proceder en el
caso del procedimiento según la invención.
La figura 2 muestra el resultado de la
realización del procedimiento según la invención con una tarjeta de
gel-NaCl de la empresa DiaMed, Suiza.
La figura 3 muestra el modo de proceder en el
caso del procedimiento según la invención con el uso de
intensificadores de la aglutinación, que se colocan previamente al
mismo tiempo con las perlas paramagnéticas.
La figura 4 muestra el modo de proceder en el
caso del procedimiento según la invención con el uso de
intensificadores de la aglutinación, que se añaden a ello tras el
aislamiento y la purificación de la biomolécula o de la célula.
La figura 5 muestra un modo de proceder posible
en el caso del procedimiento según la invención con el uso de
anticuerpos como intensificadores de la aglutinación.
La figura 6 muestra un modo de proceder posible
adicional en el caso del procedimiento según la invención con el
uso de anticuerpos como intensificadores de la aglutinación.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 7 muestra el modo de proceder en el
caso del procedimiento según la invención para la detección de
anticuerpos. Deben detectarse anticuerpos (Ac) frente a una célula
diana determinada. Para ello se coloca previamente la célula diana
determinada en un material de soporte sin unión, por ejemplo
pipeteando en la cavidad de una placa de microtitulación. En la
placa de cubierta correspondiente están unidos de manera fija
anticuerpos anti-ser humano. Entonces se añaden a
ello perlas paramagnéticas que están acopladas con un Ac no humano
dirigido frente a un antígeno específico de ZZ adicional. Éstas se
unen a las ZZ. Entonces se añade a ello la muestra humana que va a
someterse a ensayo, simbolizada en la figura 7 mediante los Ac
dibujados en pequeño, que representan simultáneamente los Ac
específicos para las células diana, existentes posiblemente en la
muestra, que, en caso de que existan, deben detectarse. Si hay Ac
dirigidos frente a las ZZ en la muestra, entonces éstos se unen a
las ZZ. Entonces se "levantan" de esta manera los conglomerados
formados con ayuda del imán, de modo que los conglomerados entran
en contacto con los Ac anti-ser humano que se
encuentran en el lado inferior de la cubierta. En los conglomerados
están contenidos entonces solamente Ac humanos, cuando éstos se han
unido como Ac específicos a las ZZ. Ahora se produce una reacción de
unión específica, especialmente una aglutinación, mediada por estos
Ac así como los Ac anti-ser humano, que puede
valorarse directamente de manera visual o también de manera
fotométrica según el marcado de las moléculas y/o perlas implicadas.
En este caso no es necesaria una etapa de lavado.
La figura 8 muestra el modo de proceder en el
caso del procedimiento según la invención para la detección de
anticuerpos. En este caso se detectan asimismo Ac. Sin embargo, en
este caso, para intensificar la sensibilidad y para impedir una
unión no específica se realiza una etapa de lavado. La presencia de
Ac específicos en el suero se determina mediante la existencia de
una reacción de aglutinación.
La figura 9 muestra el resultado del ejemplo 1.
Se reconoce claramente que los sueros que contienen anticuerpo
anti-p53 conducen a la aglutinación de las perlas
recubiertas con p53.
La figura 10 muestra el resultado del ejemplo 2.
Se reconoce claramente que los sueros que contienen IgG conducen a
la aglutinación de las perlas recubiertas con anticuerpo
anti-IgG.
La figura 11 muestra el resultado del ejemplo 3.
Se reconoce claramente que los eritrocitos positivos para Rhesus
(Rh^{+}) reaccionan con las perlas recubiertas con anticuerpo
anti-Rh^{+} y conducen a la aglutinación.
La figura 12 muestra el resultado del ejemplo 4.
Se reconoce claramente que el Ac anti-p53 conduce a
la aglutinación de la perlas en el tubito.
La figura 13 muestra el resultado del ejemplo 5.
Se reconoce claramente que los autoanticuerpos frente a trombocitos
(plaquetas sanguíneas) conducen a la aglutinación de las perlas
recubiertas con antígenos plaquetarios.
La figura 14 muestra el resultado del ejemplo 6.
Se reconoce claramente que los eritrocitos Rh^{+} reaccionan con
perlas recubiertas con anticuerpo anti-Rh^{+} y
conducen a la aglutinación.
La figura 15 muestra el resultado del ejemplo 7.
Se reconoce claramente que el Ac conduce a la aglutinación en la
tarjeta de gel (Ac frente a T47D).
La figura 16 muestra el resultado del ejemplo 7.
Se reconoce claramente que el Ac conduce a la aglutinación en el
tubito (Ac frente a T47D9.
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A continuación se ilustra la invención mediante
ejemplos.
Ejemplo
1
- -
- Se acoplaron perlas (empresa Dynal, Alemania, Magnetobeads M-270, 2,8 \mum de diámetro) según las indicaciones del fabricante con el P53 humano (acetilado en Lys320) (empresa Biotrend, Colonia, Alemania).
- -
- Se incubaron 40 \mul de perlas al 0,1% (v/v) con 20 \mul de suero (tanto de pacientes con cáncer como de pacientes sanos como control) a 37ºC durante 30 min.
- -
- Se lavó 1x con tampón de partículas (empresa DiaMed, Suiza) y se resuspendió en 50 \mul de tampón de partículas.
- -
- Se aplicaron las perlas sobre una tarjeta de gel (empresa DiaMed, "Ziege-anti human" (anticuerpo de cabra anti-ser humano)) 1:2 según las indicaciones del fabricante y se centrifugaron.
Los sueros usados 1, 2, 3 y 4 procedían de
pacientes de los que se sospechaba que tenían cáncer.
El resultado está representado en la figura 9.
La detección de Ac anti-P53 en el suero de pacientes
se logró sin problemas.
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Ejemplo
2
- -
- Se acoplaron las perlas (véase el ejemplo 1) con IgG anti-ser humano (empresa Dianova).
- -
- Se incubó una muestra (suero de paciente) que contenía IgG con 50 \mul de perlas (0,1% v/v) sobre una tarjeta de gel-NaCl (empresa DiaMed, Suiza) a 37ºC durante 15 min. y a continuación se centrifugó. (Figura 10).
Resultado: en la figura 10 se reconoce
claramente que los sueros que contienen IgG conducen a la
aglutinación de las perlas recubiertas con anticuerpo
anti-IgG.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La muestra se mezcló simultáneamente con perlas
magnéticas (véase el ejemplo 1) y nanoperlas (empresa
Mikropartikel, Berlín, 300 nm de diámetro) durante aproximadamente 5 min. a temperatura ambiente. Ambas clases de perlas están cargadas con anticuerpos anti-D (clon BRAD3, Bristol, Inglaterra). Para ello se mezclaron 20 \mug de Ac con 100 \mul de perlas (10^{9} perlas) y se trataron según las indicaciones del fabricante. El modo de proceder adicional correspondía a los ejemplos 1 y 2.
Mikropartikel, Berlín, 300 nm de diámetro) durante aproximadamente 5 min. a temperatura ambiente. Ambas clases de perlas están cargadas con anticuerpos anti-D (clon BRAD3, Bristol, Inglaterra). Para ello se mezclaron 20 \mug de Ac con 100 \mul de perlas (10^{9} perlas) y se trataron según las indicaciones del fabricante. El modo de proceder adicional correspondía a los ejemplos 1 y 2.
Resultado: la sensibilidad es
increíblemente alta. Puede detectarse 1 eritrocito Rh^{+} entre
otras 10.000.000.000 de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
- 1)
- Se recubrieron perlas Dynabeads (véase el ejemplo 1) con P53 humano y se incubaron con suero durante 30 min. a 37ºC.
- 2)
- Se lavó 1X con tampón de partículas.
- 3)
- Se resuspendió en 100 \mul de tampón de partículas.
- 4)
- Se añadieron a ello 10 \mul de nanoperlas (100 nm de diámetro, anticuerpo de conejo anti-ser humano) y se centrifugaron durante 30 s a 300 g en la centrífuga de Coombs (fabricante: Immunocore) (figura 12).
Resultado: Se reconoce claramente que el
Ac anti-p53 conduce a la aglutinación de las perlas
en el tubito.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
- 1)
- Se recubrieron perlas Dynabeads (véase el ejemplo 1) con Ac anti-CD41 o anti-CD49b (anticuerpos monoclonales frente a antígenos plaquetarios) y se incubaron con solubilizado de trombocitos (40 \mul de concentrado) y 20 \mul de suero durante 30 min. a 37ºC.
- 2)
- Se lavó 1X con tampón de partículas.
- 3)
- Se resuspendió en 50 \mul de tampón de partículas y se aplicó sobre una tarjeta de gel de anticuerpo de cabra anti-ser humano (Dynal) 1:4 según las indicaciones del fabricante (figura 13). El resto de la manera de proceder fue tal como en los ejemplos 1 ó 2.
Resultado: Se reconoce claramente que los
autoanticuerpos frente a trombocitos (plaquetas sanguíneas) conducen
a la aglutinación de las perlas recubiertas con antígenos
plaquetarios.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
- 1)
- Se recubrieron 100 \mul de Dynabeads (véase el ejemplo 1) con anticuerpo anti-D (ejemplo 3) y se incubaron con 10 \mul de nanoperlas recubiertas con anticuerpo anti-D (véase el ejemplo 4, 100 \mum de diámetro) durante 10 min.
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- 2)
- Se aislaron las perlas con el imán de la sangre.
- 3)
- Se lavó 1X con NaCl.
- 4)
- Se resuspendió en 100 \mul de NaCl y se centrifugó durante 30 s a 300g en la centrífuga de Coombs (Immunocore) (figura 14).
Resultado: Se reconoce claramente que los
eritrocitos Rh^{+} reaccionan con perlas recubiertas con
anticuerpo anti-Rh^{+} (anticuerpo
anti-D) y conducen a la aglutinación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
- 1)
- Se acoplaron 10 \mul del anticuerpo (clon 5E11, Dianova EP4) diluido 1:5 y biotinilado según un procedimiento convencional con 10 \mul de perlas de estreptavidina (Dynal, M-280) durante 0,5 h en el incubador a 37ºC.
- 2)
- Se lavó 2x con 100 \mul de tampón de partículas.
- 3)
- Se llevó a 100 \mul de tampón de partículas y se añadió en 2 ml de EDTA-sangre con células T47D (como muestra positiva) o en 2 ml de EDTA-sangre sin T47D (muestra negativa).
- 4)
- 15 min. de incubación en el rotor.
- 5)
- Entonces se separó durante 10 min. sobre el imán.
- 6)
- Se llevaron las perlas a 50 \mul de tampón de partículas (en el caso de la muestra positiva se forman aglutinados durante esta etapa) y (a) se añadieron sobre una tarjeta (Dynal) (figura 15) y se centrifugaron durante 10 min. en la centrífuga de tarjetas así como (b) se detectaron en el tubito (figura 16).
Resultado: Se reconoce claramente que el
Ac conduce a la aglutinación en la tarjeta de gel (Ac frente a T47D,
figura 15). También se reconoce claramente que el Ac conduce a la
aglutinación en el tubito (Ac frente a T47D9, figura 16).
Claims (12)
1. Procedimiento para la detección de células
(ZZ) o biomoléculas seleccionadas en una muestra,
caracterizado porque
- a)
- se recubren microperlas paramagnéticas con una molécula de detección específica dirigida frente a una característica de las células o biomoléculas,
- b)
- se pone en contacto la muestra con las microperlas recubiertas,
- c)
- se separa la muestra de las microperlas ya cargadas con ayuda de un imán que ha de colocarse,
- d)
- se ponen en suspensión las microperlas cargadas y separadas de la muestra,
- e)
- se somete a ensayo la suspensión de microperlas obtenida en d) en el sistema de tarjeta de gel, y
- f)
- mediante la existencia de una aglutinación entre las biomoléculas y/o las ZZ y las microperlas recubiertas se determina de manera visual o fotométrica directamente la presencia de la biomolécula que ha de detectarse o de la célula que ha de detectarse.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las microperlas presentan un tamaño de
entre 0,1 y 5 \mum, preferiblemente entre 2,5 y 3 \mum y
preferiblemente son de color o están marcadas con europio.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además, en
la mezcla de reacción, se colocan previamente nanoperlas
preferiblemente de color o marcadas con europio, recubiertas con una
molécula de detección específica, dirigida frente a la célula que
ha de detectarse o la biomolécula que ha de detectarse, como
intensificador de la aglutinación.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque las nanoperlas presentan un tamaño de
desde 50 nm hasta 0,5 \mum, de manera preferible aproximadamente
de 100 nm.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además se
agregan anticuerpos secundarios específicos, preferiblemente
marcados, dirigidos frente a la célula que ha de detectarse o la
biomolécula que ha detectarse, como intensificador de la
aglutinación.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque entre la
etapa (c) y (d) se realizan un proceso de lavado o varios procesos
de lavado.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque para las
etapas e) a g) se usa un tubito de Coombs en lugar de una tarjeta
de gel.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
nanopartículas y/o microperlas son de color.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque la valoración de la existencia de una
reacción específica se realiza de manera fotométrica.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
nanopartículas y/o microperlas están marcadas con europio, y la
detección de los aglutinados se realiza mediante medición de la
fluorescencia.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las
biomoléculas son anticuerpos y las moléculas de detección son los
antígenos correspondientes.
12. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque los antígenos se encuentran en forma
nativa, preferiblemente en forma de un tipo de células
determinado.
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