JPH0244254A - 多重パラメーター粒子分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背崇 発明の分野 患者への輸血を個人から採血した全血に絶えず依存しな
ければならない状態では、多数の血液サンプルについて
血液型の検査が必要である。血液型の判定には、多くの
因子、すなわち特定のＡＢＯ式血液型、ＡＢＯ式血液型
の抗原に対する抗体の存在、およびＲｈ式血液型が重要
になる。 Ｃれらの各因子を独立に判定しなければならない場合、
多数の試験が必要になる。多くの場合、各種６囚子の測
定には血球凝集反応試験が行われてきたが、この試験は
緊張を要する繁雑な主観的作業である。また、自動化さ
れた試験［ｆも利用できるようになったが、これらの装
置は高価で、多数の試験用に設計されたものである。し
たがって、測定数の最小化、測定方法の自動化を可能に
し、しかも血液型の判定に必要な情報を正確に記録でき
る技術の発見が望まれている。 Ａ型およびＢ型抗原以外の細胞表面抗原に対する特異的
抗体が一般に、ヒト血液サンプルの１〜２％に見出され
る。輸血を受ける患者にこのような抗体が存在する場合
、輸血される血液に受血者の抗体と相補性の細胞性抗原
が含まれていると、好ましくない反応が生じる。したが
って、受血者の血液についてこの種の抗体の試験が必要
になる。 通常これは、受血者の血清または血漿を、その表面に関
連抗原をもつことがわかっている「試験細胞」と混合す
ることによって行われる。この混合物をインキュベート
したのち、ＩＩＩ胞を分離し、血清または血漿を洗い流
し、抗−免疫グロブリンとインキュベートする。クーム
ス試薬と呼ばれることが多いこの試薬は、上記ＩｉＩ胞
に結合した受血者の抗体に結合し、細胞を凝集させる。 したがって、凝集は抗体スクリーニングが陽性であるこ
とを示づ。クームス試薬が凝集を起こさせる能力は、洗
浄が不完全な場合に存在する患者の免疫グ１コブリンに
よって遮断されるので、試験細胞の凝集が起こらない場
合は陽性対照試験の実施が必要になる。 これは、杭−免疫グロブリンを含む溶液を遠心分離して
この溶液から試ｗＡ細胞を分離し、この溶液に、予め感
作した、すなわちヒト抗体に結合させた［対照＄１１１
ＩＪを加える。通常、対照細胞は、Ｒｈ陽性ｍａを抗−
Ｒｈ抗体とインキュベートすることによって調製される
。患者の免疫グロブリンが除去されていて、抗−免疫グ
ロブリンが存在すると、対照細胞は凝集し、試験は有効
とみなされる。凝集が起こらなければ、試ｗＡ細胞が凝
集しなかったことによる抗体スクリーニングの陰性の結
果は無効と考えられる。 抗体のスクリーニングのための上述の陽性対照試験では
、対照細胞の添加前に、試験細胞含有溶液を遠心分離す
るかまたは他の方法で試験細胞を抗−免疫グロブリン溶
液から分離することが必要である。対照細胞の存在下に
試験細胞の凝集を観察することは難しいので、上述の操
作は必須と考えられる。 発明の要約 本発明は、あるＩＩＪ胞型の凝集の、伯の細胞型の存在
下での測定の困難性を回避し、したがって、杭体スクリ
ーニングにおける試験細胞陽性対照試験を、懸濁液メジ
ウムから試験細胞を最初に除去することな〈実施するこ
とを可能にするものである。 本発明の一態様は、サンプル中の特異的結合構成要素（
ＳＳＭ）の存在を測定する方法に関する。 この方法は、液体メジウム中で凝集剤と、Ｓ　Ｆ３　Ｍ
の結合が疑われる粒子とを合併する工程、ならびに凝集
が生じたか、およびメジウム中に凝集を起こさせる十分
な凝集剤が存在したかを確認する工程からなる。本発明
の改良は、凝集と確認を一液体メジウム中で、メジウム
からの粒子の除去を介在させることなく（以下に定義す
るように）実施することにある。 本発明の他の態様は、液体メジウム中、第一の粒子（Ｐ
１）に結合したＳＢＭの存在を測定する方法に関する。 この方法は、ｍｐｌに結合したＳＳＭの含有が疑われる
液体メジウム、（ｉｉ）Ｆ１上のＳＳＭの存在に関連し
てＰｌを凝集させる手來手段を与えている第二の粒子（
Ｆ２）の混合物を提供することからなる。Ｐ　　および
Ｆ２の凝集は別個に検出可能で、分光学的な測定によっ
て識別することができる。メジウムをインキュベートし
、各粒子を分離することなくその凝集を分光学的に測定
する。Ｐ　の凝集はＰ１上におけるＳＢＭの存在に関連
し、Ｐｌの凝集の不存在下に（１５けるＰ２の凝集はＰ
１上のＳＳＭの不存在に関連する。 本発明の他の態様は、液体メジウム中の特異的結合構成
要素（ＳＢＭ）の存在を測定する方法に関する。この方
法は、順次、ＳＢＭの含有が疑われる液体メジウム、（
＋）特異的結合構成要素が結合している第一の粒子（Ｓ
　ＢＭ　　　Ｐ　１）　、（ｉｉ）ＳＳＭと反応性で、
ＳＳＭ　　−Ｐｌを凝集させる手段、および（ｉｉｉ）
上記凝集手段に対する特異的結合構成要素が結合してい
る第二の粒子（８８Ｍ２−Ｐ２）の混合物を提供するこ
とからなる。この場合、ＳＢＭｌ−Ｐｌまたは８８Ｍ２
−Ｐ２の少なくとも一方は標識を有し、異なる標識およ
び異なる粒子は、発光、吸光および光散乱である分光学
的な特性によって識別することが可能である。メジウム
をインキュベートし、そのメジウムの少なくとも部分を
光で照射する。この場合上記メジウムは連続性であり、
上記粒子は上記連続性メジウム中に懸濁している。閾値
から異なる電磁波シグナルを有する粒子東回が確認され
、上記集団はＳＳＭの存在に関連する。 本発明の他の態様は、２セットの赤血球の凝集を検出す
る方法に関する。この方法は、液メジウム中、２セット
の赤血球および各セットの細胞を凝集させる手段の混合
物を与えることからなる。 各セットの凝集細胞はそれらの分光学的な性質によって
別個に検出可能で識別できる。メジウムをインキュベー
トし、各セットの粒子の凝集を、各セットの粒子を分離
または個々の粒子の物理的局在化のための前処理を行う
ことなく分光学的に測定する。 本発明の他の態様は、血液サンプル中の抗体を測定する
方法である。この方法は、液体メジウム中、免疫グロブ
リンに対する抗体を用いて、その抗体が結合する表面抗
原を有する第一の細胞を凝集させる工程からなる。免疫
グロブリンに対する抗体が過剰に存在するか否かは、表
面免疫グロブリンを有する第二の細胞を用いてＴｌ１ｇ
される。本発明の改良は凝集および確認工程を一液体メ
ジウム中で、メジウムからの第一の細胞の分離を介在さ
せることな〈実施する点にある。 本発明の他の態様は、サンプル中の抗体の存在を測定す
る方法に関する。抗体の含有が疑われるサンプルを水性
メジウム中、抗体と相補性の表面抗原をもつ第一の細胞
と混合する。細胞をメジウムから分離し、第二の水性メ
ジウム中で、免疫グ

【〕プリンに対する抗体と混合し、
インキュベートする。ついで、その抗体によって認識で
きる表面免疫グロブリンを有する第二の細胞をメジウム
に添加する。第一の細胞または第、−の細胞の少なくと
も一方は蛍光標識を有する。異なる細胞上の異なる標識
は、発光、吸光および光散乱である分光学的な特性によ
って識別することができる。第一の細胞および第二の細
胞の凝集は、Ｉ８胞を互いにまたは第二の水性メジウム
から分離することなく、分光学的に測定される。凝集は
抗体の存在に関連する。 特定の態様の説明 本発明によれば、メジウム中の粒子のセットの凝集を、
測定および粒子の相互またはメジウムからの分離を最小
にして測定する方法を提供する。 この方法は、粒子に結合した特異的結合構成要素の存在
、とくに血液型判定の領域における測定のための、２セ
ットの粒子の凝集の検出に応用できる。 本発明の特定の態様についての説明をさらに進める前に
、以下の用語について定義する。 特異的結合構成要素（ＳＢＭ）−表面上または空洞内に
他の分子と特異的に結合し他の分子の特定の空間的およ
び極性的配置と相補性と定義される領域を有する、２種
の分子の一方。特異的結合構成要素はりガントでも受容
体（アンヂリガンド）であってもよい。これらは通常、
抗原−抗体のような免疫学的ベアの構成要素であるが、
他の特異的結合ベアたとえばビオチン−アビジン、ホル
モン−ホルモン受容体、核酸二重鎖、ＩＱＧブＯティン
Ａ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ等、免疫学的ベア
ではないが、ＳＳＭの定義に包含される。 リガンド−それに対する受容体が天然に存在するか調製
できる任意の有機化合物 受容体（アンチリガンド）−分子の特定の空間的および
極性的配置、たとえばエピトープまたは決定基を認識で
きる任意の化合物または組成。 受容体の例には、天然の受容体、たとえばサイロキシン
結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レ
クチン、核酸、プロティンＡ１補体成分Ｃ１ｑ等が包含
される。 粒子−粒子は一般に少なくとも約０．０２ミクロン、約
１００ミクロン以下、通常は少なくとも約０．０５ミク
ロン、約２０ミクロン以下、好ましくは直径的０．３〜
１０ミクロンである。粒子は、有機物でも無機物でもよ
く、膨潤性でも非膨潤性でもよく、多孔性でも非多孔性
でもよく、密度はほぼ水に等しいことが好ましく一般に
約０．７〜約１．５！？／ａｅであり、透明、部分的に
透Ｉｌｌまたは不透明な材料から構成される。通常、粒
子は細胞および微生物、たとえば赤血球、白血球、リン
パ球、ハイブリドーマ、連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、大
腸菌、ウィルス等のような生物学的材料である。粒子は
また、有機または無機ポリマー、リボゾーム、ラテック
ス粒子、リン脂質小胞、カイロミクロン、リポタンパク
質等であってもよい。 ８１識−シグナル生成システムの構成要素。標識は同位
元素でも非同位元素でもよく、通常は非同位元素であり
、触媒たとえば酵素、色原体たとえば蛍光物質、染料ま
たは化学発光体、放射性物質等、好ましくは蛍光染料で
ある。 シグナル生成システム−シグナル生成システムは１種ま
たは２種以上の成分を有し、少なくともその一成分は標
識である。シグナル生成システムは、サンプル中のＳＢ
Ｍの存在または不存在に関連するシグナルを生成する。 シグナル生成システムには測定可能なシグナルの生成に
必要なすべての試薬を包含する。シグナル生成システム
の他の成分には、基質、エンハンサ−、アクティベータ
ー、化学発光化合物、補因子、インヒビタースカベンジ
ャー、金属イオン、ジグｔル発生物質の結合に必要な特
異的結合構成要素等が包含される。シグナル生成システ
ムの他の成分は補酵素、酵素生成物と反応する基質、他
の酵素および触媒等であってもよい。シグナル生成シス
テムは、外部手段、好ましくは電磁放射線の測定によっ
て検出可能なシグナルを与える。 シグナル生成システムに有用な多数の酵素および補酵素
が、米国特許第４，２７５．１４９号第１９ＩＩＩ〜第
２３ＩＩＩおよび米国特許第４，３１８゜９８０号第１
０１１１〜第１４１１１に示されている。多数の酵素の
組合せが米国特許第４．２７５．１４９号第２３〜第２
８ａ！に掲げられていて、これらの組合せは水元１１に
使用できる。 使用できる蛍光物質は、一般に３５０ｎｍ以上、通常は
４００　ｎｌｌｌ以上、好ましくは４５００ｍ以上の光
を放射する。望ましくは蛍光物質は高い量子効率、大き
いストークスシフトを有し、その抱合および使用条件下
に化学的に安定である。蛍光物質の語は電磁放射線また
は化学的活性化による活性化で光を放射する物質を包含
することを意図し、蛍光およびリン光物質、シンチレー
タ−ならびに化学発光物質を包含する。 興味ある蛍光物質はある種の一次官能性を有する様々な
カテゴリーに分類される。これらの−次官能性をもつ化
合物としては１−および２−アミノナフタレン、ｐ、ｐ
−ジアミノスチルベン類、ピレン類、四級フエ犬ントリ
ジン塩類、９−アミノアクリジン類、ｐ、ｐ−ジアミノ
スチルベン類、イミン類、アントラセン類、Ａキ→ノカ
ルポシアニン、メロシアニン、３−アミノエキレニン、
ペリレン、ごスーベンゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサ
シリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチナー
ル、ビス−３−アミンピリジニウム塩、ヘレブリゲニン
、テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダ
ゾリルフェニルアミン、２オキソ−３−クロメン、イン
ドール、キサンチン、７−ヒドロキシクマリン、４．５
−ベンズイミダゾール類、フェノキサジン、サリチレー
ト、ストロフアンチジン、ポルフィリン類、トリアリ−
ルメタン類、フラビンならびに希土類キレート酸化物お
よび塩がある。蛍光物質の例は米国特許第４．３１８，
７０７号第７１Ｉｍおよび第８１１に列挙されている。 米国特許第４．８０６．４８８号に記載されているスク
アリン染料も蛍光物質として有用である。 多数の蛍光物質の例が米国特許第４．２７５゜１４９号
第３０１１１および第３１１１１に示されている。 介在除去−この除去は液体メジウムから傾宛、濾過等に
よる粒子の分離を意味し、また液体メジウムの、粒子と
上清液体からなる遠心分離物への遠心分離をも包含する
。後者の場合、粒子は液体から分離されているが、上清
は遠心分離物から物理的に分離されても、されていなく
てもよい。 凝集手段−粒子のＵ東を起こさばる手段。好ましい手段
には、凝集される粒子上の特異的結合構成要素と相補性
の特異的結合構成要素が包含される。たとえば、粒子が
抗原または抗体のような特定の特異的結合構成要素（Ｓ
ＢＭ）を含有する場合には、相補性の特異的結合構成要
素、好ましくは抗体が、適当な条件下に凝集を生成させ
るために使用できる。ＳＳＭが抗体である場合、好まし
い凝集手段は免疫グロブリンに対する抗体である。抗体
はよく知られた方法で製造できる。凝集を生成させる条
件には、凝集手段を含有する水性メジウム中における、
粒子を相互に接近されるため好ましくは同時に穏やかな
混合下でのインキュベーションがある。 上述のように、本発明の一態様は、第一の粒子＜１）、
）に結合したＳＢＭの液体メジウム中における存在の測
定方法に関する。Ｐｌに結合したＳＢＭの含有が疑われ
る液体メジウムを、Ｐ１上のＳＢＭの存在に関連してＰ
ｌを凝集させる手段を促供している第二の粒子（Ｐ２）
と混合する。 Ｐ　とＰ２の凝集は分光学的測定によって別個に検出可
能で、識別できる。 上記材料の混合順序は通常、Ｐｌに結合したＳＢＭの含
有が疑われる液体メジウムとＰｌの凝集手段とが最初に
接触するように行われ、ついでその混合物にＰ２を添加
する。好ましくは、Ｐ２の添加前に、混合物を混合しな
がらインキュベートしてＰｌの凝集を起こさせる。つい
で混合物を再び混合しながらインキュベートして、Ｐ２
の凝集を起こさせる。別法として、３種の材料すべてを
同時に混合し、ついで混合しながらインキュベートする
こともできる。 メジウムは通常、水性であり、約４０重世％までの他の
極性溶媒、とくに炭素原子１〜６個、通常は１〜４個を
有する酸素含も溶媒たとえばアルコールおよびエーテル
等を含んでいてもよい。通常、約２０重量％未満の補溶
媒を添加することもできる。サンプルの性質によっては
、水性メジウムの一部またはすべてがサンプル自体によ
って与えられてもよい。 上記材料を混合したのち、メジウムをインキュベートす
る。メジウムのｐＨは通常４〜１１、さらに通常は５〜
１０、好ましくは約６〜９の範囲である。１）Ｈは結合
構成要素の結合親和性が凝集の生成に必要なレベルに維
持され、またシグナル生成システムによるシグナルの発
生に最適なように選択さ゛れる。所望のｐＨの達成およ
びアッセイ時のそのＯＨの維持には各種の緩衝剤が使用
できる。緩衝剤の例にはホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、
トリス、バルビツール等が包含される。使用する！！！
罰剤に特定の制限はないが、個々のアッセイについては
ある緩衝剤が俵に比べて好ましいという場合がある。イ
ンキュベーションおよびその後の工程には、通常、中等
度の、望ましくは実質的に一定の温度が用いられる。イ
ンキュベーションおよびその後の測定時の温度は、一般
に約４°〜５０℃、通常は約１０°〜４０℃、多くの場
合、室温すなわち約１５°〜２５℃の範囲である。 測定される液体サンプル中のＳＢＭまたは１０　　　Ｍ
、通常は約１０−６〜１０−１４Ｍの範囲である。ＳＳ
Ｍ（７）′ａ度やプロトコールを考慮して、通常、他の
試薬の濃度が決定される。 各種試薬および試薬溶液の多くの濃度は、一般に、ＳＳ
ＭまたはＳＢＭを有するＰｌの興味ある濃度範囲によっ
て決定されるが、各試薬の最終的な濃度は興味ある範囲
での測定の感度が至適になるように経験的に決定される
。プロトコールによっては、アッセイの感度に悪影響を
与えることなく過剰に個々の試薬を使用することができ
る。 メジウムと粒子のインキュベーション後、各粒子の凝集
を分光学的に測定する。一般に、少なくともＰｌはそれ
に結合した標識を有する。標識と凝集条件の選択により
、少なくとも２種の識別可能なシグナルが２種のそれぞ
れの凝集粒子から発生する。２種の粒子からのシグナル
は通常、発光、吸光および／または光散乱である。 Ｐ　の凝集はＰ１上、のＳＢＭの存在に関連する。 Ｐｌの凝集の不存在時のＰ２の凝集はＰ１上のＳＢＭの
不存在に関連する。 この方法は、凝集粒子で観察されるシグナルが非凝集シ
グナルで観察されるシグナルと異なること、およびＰ　
の凝集はＰ２の凝集と異なるシブナルを与えることを要
求する。一方の粒子が標識されていないで、光散乱によ
って観察される場合は通常、それは他方の通常標識され
ている粒子より少量存在する。または、他方の粒子は、
サイズが異なるので、異なる光散乱を生成する。両粒子
が蛍光物質で標識されている場合は、標識は異なる発光
および／または吸収換大あるいは発光寿命をｂつように
する。場合によっては、標識は、たとえばリンパ球の場
合の化学発光および赤血球の場合の光吸収のように粒子
の内部に天然に存在する。所望のシグナルが光散乱の場
合には、赤血球、コロイド状金属、コロイド状炭素また
はコロイド染料等のような本来、高度の光散乱を有する
粒子を選択できる。染料で標識した粒子では、吸光また
は発散、通常は発散によるＩａ識粉粒子検出が可能にな
る。検出の一方法では、標識粒子が懸濁されている十分
小容壜のメジウムが検査され、−度に検査される粒子は
平均１個から数個のみである。 粒子の凝集が生じたかどうかを測定プるためには、この
ような測定容量について多数の、時間的、空間的に異な
る測定を行うことができる。凝集が起こらなかった場合
は、各容憬内の粒子数、したがってシグナルは、統計的
に変動し、測定容量と粒子濃度に依存する。′ｇ凝集が
起こった場合には、部の測定容量内での凝集粒子の存在
が増大し、したがって、それらの容量からのシグナルお
よび既測定値を超えるシグナルの測定される頻度が増加
づ−る。 ザンブルは連続的で、静止しているかまたは攪拌され動
揺している。通常、時間的に異なる測定が行われる場合
には測定容量に対して動揺している。通常、測定容量は
懸濁メジウムに隣接し、それによって囲まれ、測定すべ
き全サンプルと拡散性関係にある。 測定容量を放射する一手段では米国特許第４゜５６４．
５９８号に記載される方法および装置が使用される。基
本的には、測定容量は光ファイバーを用いて放射され、
この場合、測定容量を包含する放射容量は光ファイバー
の構成によって決定される。放射容量の形状は、通常、
円錐形である。 光ファイバーは通常、中核領域と少なくとも１個の外殻
領域から構成され、その厚さ（直径）および相対屈折率
が光錐の二分角とファイバーの先端における光錐の最小
直径を決定する。有効な軸し、ずなわち測定容量が位置
する情の良さは、励起光の強度、検出法の感度、および
ファイバー先端からの距離の増加に伴う励起光の強度の
低下率によって決定される。低下率は光鉗の二分角に依
存する。二分角が大きいほど強度の低下率は大きくなり
、したがって有効な軸長は短くなる。メジウムの光散乱
と吸収性も強度の低■に影響する。 観察されるシグナルに影響する各種パラメーターは、測
定容量内に粒子の凝集が存在する場合、測定可能なシグ
ナルが確実に利用できるように選択される。このシグナ
ルは測定容量内に粒子が存在しない場合に生じるシグナ
ルよりも有意に大きくなる。 測定容量の内外へ粒子を拡散さ往ることによって有効な
測定容量を変えることができる。別法として、複数個の
光ファイバーを用い、それぞれが別の放射容量からのシ
グナルを受けるようにすることもできる。また、サンプ
ルが１個もしくは２個以上の光ファイバーについて流動
するかまたは１個もしくは２個以上の光ファイバーがサ
ンプル内を移動するような動的システムを使用すること
もできる。 励起光は全サンプルを放射するように与えてもよく、ま
たサンプルの主部分を励起光で放射してもよい。別法と
して、また好ましくは、励起光を光ファイバーで供給し
、測定用量がそのままｔＩｉｇ容Φとなるようにするこ
ともできる。 本発明の方法は、とくに、サンプル中の抗体の存在の測
定に応用される。この方法では、水性メジウム中、抗体
の含有が疑われるサンプルを、その抗体と相補性の表面
抗原を有する第一の細胞と程合する。たとえば、血液型
の判定では、ルイス、ケルおよびダフイー抗原ならびに
ＲｈまたはＤ抗原に対する抗体の存否が測定される。サ
ンプルは血清、血漿、全面のいずれでもよい。抗体に相
補性の表面抗原を有づる第一の細胞は、検出づべぎ抗体
に対する相補性抗原を有する赤血球であってもよい。細
胞をついでメジウムから分離し、第二の水性メジウム中
で免疫グロブリンに対する抗体と混合する。通常、次に
インキュベーションを行う。 免疫グロブリンに対する抗体によって認識される表面免
疫グロブリンを有する第二の細胞を次に添加する。第一
または第二の１１Ｉ胞の少なくとら一方は蛍光標識を有
し、サンプルが全血である場合には通常それぞれが異な
る蛍光標識を有する。 異なる標：ａ、ｔｙよび異なる細胞は、発光、吸光およ
び光散乱を含む分光学的特性により識別可能である。第
二の水性メジウムをインキュベートする。 第一の細胞および第二の細胞の凝集は、各インキュベー
ション後または最終インキュベーション後に、細胞の第
二のメジウムからの除去を介在させることなく、分光学
的に測定される。凝集は抗体の存在に関連する。第一の
細胞の凝集は抗体の存在を指示し、第一の細胞の凝集が
なく第二の細胞の凝集は抗体の不存在を指示する。 上述のように、本発明はとくに、自動化血液型判定操作
に応用される。本発明はクームス抗グロブリン試験に有
用である。クームス試験では、免疫グロブリン含有血漿
をまず試験細胞と混合し、ついで細胞を分離し、１ｆＩ
ｌｌ漿からの抗体がＩ細胞に結合したか否かを抗グロブ
リンの添加による凝集を調べて確認する前にサンプルの
免疫グロブリンを含まないように注意深く洗浄する。本
発明では、試験細胞の抗グロブリン含有メジウムまたは
陽性対照細胞からの分離工程を介在さけることなく、洗
Ｅが完全かどうかを確認するために陽性対照の使用を可
能にする。 このような試験に際しては、血清または血漿からなるサ
ンプルを、蛍光標識をもち、測定すべき抗体と相補性の
表面結合抗原を有づる試ｌ＆ｌｌｌｌ１１と況合し、イ
ンキュベートする。ついで試験細胞をメジウムから分離
し、ｍ脂を、サンプルからの免疫グロブリンを含まない
ように洗浄する。次に、試験サンプルを免疫グロブリン
に対する抗体と混合する。メジウムをインキュベートし
、ついで凝集を測定する。表面上に免疫グロブリンを有
する対照細胞を、測定前または後に添加する。対照細胞
は標識しないか、または異なる蛍光物質で標識するのが
好ましい。もう−度インキユベートしたのら、対照細胞
と、また前に測定していない場合には試験細胞について
、第二のメジウムからの細胞の分離を介在させないで、
凝集を測定する。試験細胞の凝集はサンプル中の抗体の
存在を指示する。試験細胞の凝集の不存在下にお＋する
対照細胞の凝集は、サンプル中の抗体の不存在を指示す
る。 最初の分離後の洗浄が不完全なためにメジウム中にサン
プルからの免疫グロブリンが存在すると、測定すべき抗
体が存在するのに試験細胞の凝集が起こらない場合が生
じうる。対照細１ムは洗浄が不完全なことを確認するた
めに使用される。対照細胞が凝集すれば、最初の洗浄で
十分に免疫グロブリンが除去されていて、免疫グロブリ
ンに対する添加抗体の吸着が回避されたことを意味する
。したがって、免疫グロブリンが試験細胞に結合してい
た場合、免疫グロブリンに対する抗体は試験細胞の凝集
に利用される。その結果、対照細胞が凝集したときに試
験細胞が、凝集しなければ、それは測定すべぎ抗体がサ
ンプル中に存在しないことを指示する。凝集は、試ｌｉ
ｉ！細胞をメジウムまたは第二の細胞から分離する工程
を介在させないで、１つの液体メジウム中で実施できる
。 本発明の他の態様は、２セットの赤血球の凝集を検出す
る方法に関する。２セットの赤血球は、液体メジウム中
、各セットの細胞の凝集手段とともに混合される。上記
セットそれぞれの凝集細胞は、それらの分光学的特性に
よって別個に検出可能で、識別することができる。メジ
ウムをインキュベートし、上記２セットの細胞のそれぞ
れの凝集を、それらを分離することなく、また細胞選別
に用いられるような各Ｉ＋胞の物理的局在化のための前
処理を行うことなく、分光学的に測定される。 上記セットの細胞の少なくとも一方は１ａ識を有し、標
識は一般に蛍光物質である。分光学的特性は発光および
光散乱である。上記セットの細胞の一方または両者の凝
集は、それぞれ、各細胞に対する凝集剤の存在を指示す
る。 本発明の他の態様は、液体サンプル中におけるＳＢＭの
存在を測定する方法に関する。ＳＢＭの存在が疑われる
液体メジウムを、（１）ＳＢＭに相補性の特異的結合構
成要素が結合している第一の粒子（ＳＢＭ　　−Ｐ１）
および（２）ＳＢＭと反応性であって、Ｓ８Ｍ　　−Ｐ
ｌを凝集させる手段と混合し、そして凝集手段に対する
特異的結合構成要素が結合している第二の粒子（８８Ｍ
２〜Ｐ２）を添加する。ＳＢＭ　　−Ｐｌまたは５Ｂｆ
Ｖ１２Ｐ２の少なくとら一方は標識を有する。異なる標
識および異なる粒子は、発光、吸光および光散乱である
分光学的特徴によって識別ｒ可能である。 血液型判定における試験ＩＩＩ胞の使用の上述の特定例
を考えれば、ＳＳＭはたとえば患者の免疫グロブリンで
ある。上述のように、患者の免疫グロブリンがすべて最
初の洗浄で除去されたかどうかを１ａ認することが望ま
しい。ＳＢＭｌ−Ｐｌはたとえば、血液型判定において
測定される抗体が付着する抗原を有する細胞である。Ｓ
、８Ｍ２−Ｐ２はたとえば対照Ｉ８胞で、凝集手段は免
疫グロブリンに対する抗体である。 メジウムをついでインキュベートし、少なくともメジウ
ムの部分を光で放射する。メジウムは連続的で、連続的
なメジウム中に粒子が懸濁される。 閾値から異なる′１１！磁シグナルを有する粒子の集団
を測定し、ＳＢＭの存在に関連づける。ひとつのアプロ
ーチでは、ＳＢＭ　　−Ｐｌは蛍光物質で標識され、方
法は発光および光散乱の測定を包含する。ＳＳＭ　　−
Ｐｌの凝集はこの粒子に結合した８１３　Ｍの存在を指
示する。ＳＢＭ　　−Ｐｌの凝集の不存在時における８
８Ｍ２−Ｐ２の凝集はＳＢＭ　　−Ｐｌに結合したＳＢ
Ｍの不存在を指示する。 便宜上、本発明の方法の実施のための試薬をキットにし
て提供することができる。キットは試薬のバックされた
組合せである。試薬はそれぞれ相互の反応性に従い、貯
蔵寿命が保証されるようにパックされる。たとえば、各
試薬を別個の容器に充填するか、または相互の反応性に
問題がなければ混合することもできる。血液型判定の領
域では、試薬には、標識を有する試験細胞、対照細胞、
および免疫グロブリンに対する抗体が包含される。 キットにはまた、！１衝剤や安定剤のような補助材料を
包含させることしできる。さらに、弛の補助材料として
、アルブミンのようなタンパク質、界面活性剤とくに非
イオン界面活性剤、結合増強剤たとえばポリアルキレン
グリコール等を包含させることもできる。 例 本発明を以下の例示的実施例によってさらに詳細に説明
する。実施例中の部および百分率は、とくに指示がない
限り、容量部および容量百分率である。 乳ユ 細胞検出システム Ｈｅ／Ｎｅレーザー（２ｍＷ、　Ｈｅ１ｌｓ　Ｇｒｉｏ
ｔ。 Ｓａｎ　　ＨａｒＣＯ３，ＣＡ　）で、６３３　ｎ１ｌ
ｌの光線を、芯線５０μｍ１開口数０．２２の純シリカ
光ファイバーの一端に集中させた。ファイバーの他端は
二相ファイバープローブに導入した。二相ファイバープ
ローブは、ファイバーの末端から発散する光錐の軸が、
各ファイバーの末端から約２２５μｍの距頗で第二の類
似のファイバーの軸と６０°の角度で交差するように設
計された。第一のファイバーからの光錐と第二のファイ
バーの受光光錐の重複として定義される集光容量は約１
０１０−６ｃであった。プローブは直接、分析すべきサ
ンプル中に浸漬されるように設計した。蛍光粒子もしく
は溶質によって発光されるかまたは集光容量内の粒子か
ら散乱される光の一部は第二のファイバーによって伝達
され、回転フィルターを介して光電子増信管（ｌ（ａＩ
Ｉａｍａｔｓｕ、　Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、　ＮＪ）
上に集中ざ「た。回転フィルターには散乱光の検出のた
めの６３３ｎｍＷｔ域フィルターと蛍光の検出のための
縦列配置した６４５ｎｍ長域フィルターを含有させた。 光電ｆ増倍管からの出力を前誼増幅冴および弁別５　（
Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｃｏｎｃ
ｏｒｄ、　ＣＡ）で処理して、光子の計数に適当な光パ
ルス出力を生じされた。光パルスは５００μＳゲ一ト時
間にわたって計数し、カウントはオンラインマイクロプ
ロセッサ−に入力した。連続ゲート時間におけるカウン
トの変動を粒子の凝集程度の評価に使用した。 サンプル輸送と混合 温度調節反応ブロックの上面に接触させた平坦なラテッ
クスゴムシート上で、サンプルと試薬を１Ｗ４中に混合
した。ラテックスシートを置いたブロックの内部には、
直径的１ｏ１１で、底部の１ｍ＋＋の開口を介して真空
ラインにそれぞれ連結したカップ状の凹部を設けた。カ
ップを真空にしてシートの相当部分を伸展させて下方に
下げ、ついで真空を解除してシートをはじめの位置に戻
す操作を交互に実施して、液滴を効率的に混合した。反
応混合物の液滴は表面張力によって所定の位置に保持さ
れ、また真空を適用していないときにシー１〜を動かす
ことによって液滴を一連の凹部に移動することができた
。これは異なる場所での試薬の添加および除去を可能に
し、また同時に一連のナンブルについて処理を行うこと
を可能にした。一連の凹部の最後の四部は、二相ファイ
バープローブの下に位置させた。二相ファイバープロー
ブは、細胞の希釈のためのデイスペンサーを装冒し、懸
濁液中への浸漬が可能なように上下移動できるようにし
た。 全月 赤血球の染色には、１，３−ビス［４−ジブチルアミノ
−２−ヒドロキシフェニル］−２，４−ジヒドロキシシ
ク口ブテンジイリウムジヒドロキシド、ビス（内部塩）
（ＴＢＳ）を使用した。この染料は１当量のスカール酸
を２当量のＮ、Ｎジブチルアニリンと、ｎ−７タノール
およびベンゼンの２：１混合物中で絶えず水を共沸によ
って除去しながら還流することによって、Ｓｐｒｃｎｇ
ｅｒとＺ＋ｅｇｅｂｅｉｎの方法（Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈ
ｅｔ　ｒｎｔｅｒｎａｔ。 ［ｄｉｔ７．　５：８９４，１９６６）で合成した。冷
却すると生成物は緑色結晶として分離し、これを濾集し
、メタノールで洗浄した。染料はメタノールとメチレン
クロリドの１：１混合物から再結晶した。この染料のジ
メチルホルムアミド中の極大吸収は６５０ｎＩ１１、ξ
−３３０，０００Ｍ−１ｃＩＲ−１であった。 抗体試薬 抗−ヒト１ｇＧは、ヒトＩｑＧで免疫感作したつ１ナギ
の血清から［４した（Ｈｏｌｌｉｓｏｎ　　”Ｂｌｏｏ
ｄ丁ｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ″７版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　　１９
８３．５０５〜５０８）。ＩＱＧ分画は硫安沈殿および
イオン交換クロマトグラフィーによって単離し、２Ｑｍ
Ｈ王ｒｉｓ−食塩緩ＶＩＪ液中１．２５％Ｐ　Ｖ　））
とともに１１〜１８ａｙ／Ｉｄに希釈した。 試薬赤血球 抗体スクリーニングのためには、約２０種の臨床的に重
要な抗原のそれぞれが１または２以上の細胞上に表れる
ように選択した３名の異なるドナーから細胞を得た。細
胞は食塩水で洗浄し、２％ＢＳＡ含有食塩水中に約２×
１０９個／ｄになるように懸濁した。ジメチルホルムア
ミド中１０−４Ｍ　　ＴＢ８５０μｌを上述の懸濁液１
１ｄに加え、混合物を室温で１５〜３０分間穏やかに混
合した。 次に、細胞を食塩水で洗浄し、等仮性細胞メジウムｐｉ
ｌｅ　、　３　（Ｕｄａら：丁ｒａｎｓｒｕｓｉｏｎ　
　（Ａ　８５　）、え支：３２５〜３２９）中量終濃度
が、逆グル−ピング細胞の場合５％（Ｖ／Ｖ）、抗体ス
クリーニング細胞の場合１０％にして４℃で保存した。 抗体スクリーニングに使用する細［１（Ｕｄａら：前出
）は、Ｒｈ＜Ｄ）陽性細胞をヒトモノクローナル抗−Ｒ
ｈ（ｄ）抗体（Ｂｉｏｒｅｓｐｏｎｓｅ、　０　、２４
μｇ／ｄ）と、２％ＢＳＡ含有食塩水中、３７℃で４５
分間インキュベートして調製した。抗体被７１１１１胞
は食塩水中で洗浄し、細胞メジウム（Ｗｉｄｍａｎｎら
：゛丁ｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎ／ｌ’ｕａｌ　　、　
９版、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ、　ｖ＾、　Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢｌｏｏｄＢａｎ
ｋｓ、　３７６．１９８５）中に濃度１０％（■ハ）で
保存した。 フェロフルイド コロイド状の磁化性マグネタイトは、ＨａＳＳａｒｔの
報告した方法（Ｉ　Ｅ　Ｅ　Ｅ　　Ｔｒａｎｓａｃｔｉ
ｏｎｓ　ｏｎＨａｇｎｅｔｉｃｓ、　　ＨＡＧ、　　１
　７　　：　　１　２　４　７　　、１９８１）　　を
改良して製造した。等容量の１．５Ｍ水酸化アンモニウ
ムおよび０．１６Ｍ　　ＦｅＣｌ２．０．０８Ｍ　　Ｆ
ｅｃ１２および０．０８Ｍトｔ　ｃ　ｉを含む水溶液を
フラスコに５分間を要してポンプで加えた。添加完了後
、１時間マグネタイトを沈降させ、総容量の約８０％に
相当する上清を傾潟した。濃縮されたマグネタイトのス
ラリーと等容量の２．０Ｍ過クりル酸を同時に、第二の
フラスコにポンプで加えた。懸濁した物質を磁力で分離
した。はじめの容量の１１５の水を加えるとコロイド分
散液が得られ、これを１０ｍＨ過クロルりに対して透析
した。等容量のｍ塩酸を加え、ｐｅｒｓｌＪｉｎらの方
法（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｉｎ、　Ａｃｔａ、　３５　：　
９１〜９８．１９７１）に従って検定すると、得られた
懸濁液は鉄４４■／ｄを含有した。 スクシニル化ＢＳＡは、ジメチルホルムアルデヒド（、
Ｈａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）中０．５Ｍ無水ｍｌ　Ａり
酸（八１ｄｒｉｃｈ　）　２．５ｍｌを、０．１Ｍリン
酸ナナトリシム２５０Ｉｎｌ、　Ｉ）８８　、０中ＢＳ
△（結晶量、Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
　５　、０　’Ｊに、室温で添加して調製した。１．５
時間後、溶液を脱イオンに対して完全に誘析した。修飾
タンパク質の電気泳動移動度は、アガロースゲル電気法
６　（’Ｐａｒａ００ｎＳＰＥ、　　ＢｅｃｋＩＩｌａ
ｎ　）で測定して１．７５（天然ＢＳＡ＝１．００）で
あった。 コロイド状酸化鉄を水で１０η／！ｄに涌釈しくｐＨ１
２，９）、この懸濁液１００ｄを等容量のスクシニル化
ＢＳＡ　（９，５■／ｄ、Ｏ，ＩＭＨＣ１０４でＩ）１
１３．３に調整）と混合した。ついで０．１Ｍデトラメ
チルアンモニウムヒド０キシド１５〜２０ｄを急速に添
加して、溶液の９Ｎを９．０に上昇させた。この過程で
、透明な暗褐色の液体は濁り、ついで再び透明になった
。動的散乱分光法（Ｎｉｃｏｍｐ　Ｉｎ５ｔｒｃｖｅｎ
ｔｓ、　ｆｌＨ５−９Ｑ型）で測定した平均粒子径は５
５〜６５ｎ−であった。 フェロフルイドプレバレージョンの一部を膜限外濾過（
八ｍ１ｃｏｎ）によって濃縮し、２５Ｉｔｇ／ｄ試薬を
調製した。 他の試薬 食塩水（よ０．１５ＮａＣ１の水溶液とした。 低イオン強度溶液（ＬＩＳＳ）は、０．０３ＭＮａＣ１
を含有する等偏性リンＩｎ衝グリシン溶液、ｐＨ５，７
とした。ポリアクリルＭ　（Ａｌｄｒｉｃｈ平均分子恒
−５，０００）は、０．１Ｍグリシン！！ｉｉ液、ＯＨ
２，０中５Ｒｇ／−に希釈した。ポリビニルビＯリドン
（ＰＶＰ）（ＧＡＦ）はに−６０非医薬用を用いた。ポ
リブレン０（ヘキサジメスリンプロミド、Ａｌｄｒｉｃ
ｈ、平均分子ｆｆ１＝４，３００）はＬ　１８３．ｐ）
１６．７中１６■／−溶液とした。 自動化抗体スクリーニング 試験すべき血液０．５ｍ、２５ｒｎｇ／ｄフェロフルイ
ド４０μＡ、ＬＩＳＳ２００μ！およびポリブレン４０
μｍを１１のスクエアカップ中で混合して、まず血液か
ら血漿を分離した。カップの横にできる限り接近させて
２個の２．１キロガウスの同じ極を配置して、ＩＩＩ胞
−フェロフルイド共凝集物を分離した。 細胞を含まない血漿を除去し、染色試薬赤血球の３つの
異なるセットに対して試験した。各試験ｆσに、１０μ
オの細胞と１００μでの血漿をラテックスシート上、反
応ブロックの温度３７℃で９分間混合した。ついで２０
μオのフェロフルイド（５Ｉ１１ｇ／ｄ）　、２０μｍ
のポリブレンおよび５０μノのＬＩＳＳを加え、細胞を
磁気によって分離した。液体を除去し、１Ｂ胞をＬ　Ｉ
　Ｓ　Ｓで洗浄し、１５μｍのポリアクリル酸を加えて
再懸濁した。 次に抗−ヒトＩＱＧ試薬（２０μ１）を加え、細胞懸濁
液を１分間況合した。次に対照１１１胞（１０μりを加
え、１分間インキュベートしたのち、サンプルを食塩水
０．５ｍで希釈した。生成した懸濁液について、試薬細
胞の凝集（蛍光）および対照細胞（光散乱）を順次測定
した。 結果の解釈 赤血球の凝集は、１ｌｌｌ１１懸濁液を二相ファイバー
グローブの末端を通過するように移動させ、５００μｓ
ゲ一ト時間に限定された多数のサンプル容量について蛍
光または散乱光を検査した。連続した測定値を１０秒開
開録した。ｔａｌｆ７ｎを越える光バルスカウンｉへを
有し、すなわＦ）１個または２個以上のＩＩＩ胞がプロ
ーブを通過したことを示す一連のゲート時間の最初の出
現についてデータを解析した。シグナルパルスは、液体
の移動速度に応じて通常約３〜４ゲート時間（１，５〜
２ＩｌｌＳ）に認められた。これらの現象を計数すると
、「凝集指数」が得られた。凝集を生じたサンプルと非
凝集サンプルを識別する目的では、既知サンプルの試験
により「カットオフ」凝集指数値を求めた。 抗体スクリーニング試験では、上記カットオフ凝集指数
以上の蛍光シグナルの上昇変動が染色細胞の凝集によっ
て生じた。６４５　ｎｌ１１長域フイルターを用いて蛍
光シグナルを監視した。抗体スクリニング対照細胞は染
色されておらず、したがって凝集は６３３　ｎｎ＋帯域
フィルターを用いて光散乱シグナルの変動を測定するこ
とによって監視した。 これらの細胞はヒトＩＱＧで被覆されていたので、それ
らの凝集は十分な抗−ヒトＩｇＧが添加されたことのイ
ンデイケータ−として有効であった。 すなわち、抗体スクリーニングで陰性と判定されたサン
プルで、対照細胞の凝集が光散乱の変動によって検出さ
れなければ、不定とみなされた。 周】 自動化試験 自動化抗体スクリーニングは、新鮮面または抗体陽性結
晶（凍結保存）を陽性サンプルの刺激のだめの適合性赤
血球と混合して：ｇｌ製した再構築サンプル、計１０３
の標本について実施した。サンプルは、臨床的に重要な
各種抗原に対する抗体を広範囲の力価で有するものであ
った。自動化方法においては、磁力分離によって得られ
た血漿を３セットの抗体スクリーニング試薬細胞に対し
て試験した。各サンプルについて同じ試薬細胞を用い、
標準的な手動技術および試薬によった試験も実施した。 結果は第１表にまとめた。手動の方法で陰性と判定され
た２６碧のサンプル中の２個が自動化試験で陽性であり
、手動方法で陽性であった７７個のサンプル中７個が自
動化方法で陰性であった。自動化方法で陰性の７例のサ
ンプルは、手動試験できわめて弱いが再現性のある凝集
を示した。 １個の不定とされたサンプルは対照細胞からの光散乱シ
グナルを示さず、多分、細胞洗浄時のＩｇＧの除去が完
全でなかったことによるものと思われた。 第１表 １０３例の患者サンプルについての、手動および手動測
定　　　　　　　　自動化測定 陽性　　　陰性　　　不定８ 陽性　　　　　６９　　　７　　　１ 本発明は、臨床的に立証ずみの凝集化学を利用するもの
であるが、新しい分離方法、サンプル取扱い方法および
検出方法を提供し、自動化および客観的判定を可能にす
るものである。本発明の方法は、遠心分離、頭高等のよ
うな分離工程を必要とせずに実施できる、試験細胞およ
び対照細胞を使用した抗体のスクリーニングを可能にす
る。 以上、本発明を、その理解を容易にするために、例を示
して詳細に説明したが、特許請求の範囲内で改変、＊ｉ
が可能なことは０用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）第一の粒子（Ｐ＿１）に結合した特異的結合構成
   要素（ＳＢＭ）の液体メジウム中における存在を測定す
   る方法において、 （ｉ）Ｐ＿１に結合したＳＢＭの含有が疑われる液体メ
   ジウム、 （ｉｉ）上記Ｐ＿１上のＳＢＭの存在に関連してＰ＿１
   を凝集させる手段、および （ｉｉｉ）上記凝集手段に対する同種または異種の特異
   的結合構成要素が結合してそれ自体の凝集手段を提供し
   ている第二の粒子（Ｐ＿２）を順次合併し、この場合Ｐ
   ＿１とＰ＿２の凝集は分光学的に別個に検出可能で識別
   できるようにし、上記メジウムをインキュベートし、上
   記各粒子の凝集をＰ＿２からＰ＿１を分離することなく
   分光学的に測定し、Ｐ＿１の上記凝集をＰ＿１上の上記
   ＳＢＭの存在にまたＰ＿１の凝集の不存在時のＰ＿２の
   凝集をＰ＿１上の上記ＳＢＭの不存在に関連づけること
   を特徴とする方法。 （２）ＳＢＭは免疫グロブリンである特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。 （３）第一の粒子は、それに抗原が結合した表面抗原を
   有する細胞である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （４）凝集手段は免疫グロブリンに対する抗体である特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 （５）第二の粒子は表面免疫グロブリンを有する細胞で
   ある特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （６）第一の粒子はそれに結合した標識を有する特許請
   求の範囲１項に記載の方法。 （７）標識は蛍光物質である特許請求の範囲第６項に記
   載の方法。 （８）測定には発光および光散乱を利用する特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 （９）２セットの赤血球の凝集を検出する方法において
   、液体メジウム中第一のセットの赤血球、このセットの
   細胞を凝集させる手段、および２セットのそれぞれの凝
   集細胞が分光学的な性質によつて別個に検出可能で識別
   できる第二のセットの細胞を順次混合し、上記メジウム
   をインキュベートし、上記２セットの細胞のそれぞれの
   凝集を、各細胞の分離または物理的局在化のための前処
   理を行うことなく分光学的に測定することを特徴とする
   方法。 （１０）細胞の少なくとも一方のセットは標識を有する
   特許請求の範囲第９項に記載の方法。 （１１）標識は蛍光物質である特許請求の範囲第１０項
   に記載の方法。 （１２）分光学的な性質は発光および光散乱である特許
   請求の範囲第９項に記載の方法。（１３）サンプル中の
   抗体の存在を測定する方法において、水性メジウム中で
   問題の抗体の含有が疑われるサンプルをその抗体と相補
   性の表面抗原を有する第一の細胞と混合し、上記メジウ
   ムから上記細胞を分離し、第二の水性メジウム中上記細
   胞と免疫グロブリンに対する抗体と混合し、上記第二の
   水性メジウムをインキュベートし、ついでこれに上記免
   疫グロブリンに対する抗体によつて認識される表面免疫
   グロブリンを有する第二の細胞に添加し、この場合第一
   の細胞または第二の細胞の少なくとも一方は蛍光標識を
   もつていて異なる標識および異なる細胞は発光、吸光お
   よび光散乱の分光学的特性によつて識別可能であり、上
   記第一の細胞と第二の細胞の凝集を、両細胞を互いにま
   たは第二の水性メジウムから分離することなく分光学的
   に測定し、ついで上記凝集を問題の上記抗体の存在と関
   連づけることを特徴とする方法。 （１４）抗体はヒト赤血球表面抗原に特異的な免疫グロ
   ブリンからなる群より選ばれる特許請求の範囲第１３項
   に記載の方法。 （１５）第二の細胞上の免疫グロブリンは血液サンプル
   中の抗体と同じ結合特性を有する特許請求の範囲第１３
   項に記載の方法。 （１６）蛍光標識はフルオレセインおよびローダミン誘
   導体、フイコピリタンパク質、スクアレイン、ウンベリ
   フエロン、シアニンおよびメロシアニンからなる群より
   選ばれる特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 （１７）第一の細胞および第二の細胞は異なる蛍光標識
   が結合している特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 （１８）第一の細胞は標識され、測定には発光および光
   散乱を利用する特許請求の範囲第１３項に記載の方法。 （１９）サンプル中の特異的結合構成要素（ＳＢＭ）の
   存在を測定する、にあたり、液体メジウム中、ＳＢＭが
   結合している粒子を凝集剤によつて凝集させる工程およ
   び上記凝集後に上記メジウム中に上記凝集剤が存在する
   か否かを測定する工程からなる方法において、上記凝集
   および上記測定を上記メジウムからの上記粒子の分離を
   行うことなく単一の液体メジウム中で実施することを特
   徴とする改良。 （２０）測定は液体メジウムに、その方法の実施中に凝
   集する第二のセットの粒子を添加して行う特許請求の範
   囲第１９項に記載の方法。 （２１）血液サンプル中の抗体の存在を測定する方法に
   おいて、抗体をその抗体と相補性の表面抗原を有する第
   一の細胞と混合し、上記細胞を上記メジウムから分離し
   、液体メジウム中上記細胞と免疫グロブリンに対する抗
   体とを混合し、上記メジウムをインキュベートし、つい
   でこのメジウムに表面免疫グロブリンを有する第二の細
   胞を添加し、この場合上記第一の細胞または第二の細胞
   の少なくとも一方は蛍光標識を有して異なる標識および
   異なる細胞は発光、吸光および光散乱の分光学的特性に
   よつて識別可能であり、上記メジウムをインキュベート
   し、上記メジウムの少なくとも部分に光を放射し、この
   場合上記メジウムは連続性で上記細胞はこの連続性メジ
   ウムに懸濁されていて、閾値から異なる電磁波シグナル
   を有する細胞の集団を測定し、上記集団を上記抗体の存
   在と関連づけることを特徴とする方法。