DE68913234T2

DE68913234T2 - Teilchenanalyse auf mehrere Parameter.

Info

Publication number: DE68913234T2
Application number: DE1989613234
Authority: DE
Inventors: Vartan Ghazarossian; Edwin F Ullman; John Vorpahl
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1988-06-23
Filing date: 1989-06-22
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2009-06-23
Also published as: JPH0244254A; JP2766677B2; EP0348191B1; CA1324499C; EP0348191A1; DE68913234D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von spezifischen bindenden Mitgliedern, z.B. Antikörpern.
Die andauernde Abhängigkeit von Vollblut, das von Individuen erhalten wurde, zum Ergänzen von Blut in einer anderen Person erfordert die Überprüfung einer großen Anzahl von Blutproben auf ihren Blutgruppentyp. Bei der Bestimmung der Blutgruppe ist man an einer Anzahl von Faktoren interessiert: der speziellen ABO- Gruppe; der Anwesenheit von Antikörpern gegen die Antigene der ABO-Gruppe; und dem Rh-Typ. Wenn jeder dieser Faktoren unabhängig bestimmt werden muß, ist eine große Zahl von Tests beteiligt. Meistens sind Hämagglutinationstests beim Messen der verschiedenen Faktoren beteiligt, die subjektiv arbeitsintensiv und mühsam sind. Darüberhinaus sind Meßgeräte zum automatischen Testen erhältlich, aber diese Meßgeräte sind teuer und für eine große Zahl von Tests ausgelegt. Es ist deshalb wünschenswert, Techniken zu finden, die eine minimale Zahl von Bestimmungen und eine Automatisierung des Bestimmungsverfahrens gestatten, während sie die Information, die zur Bestimmung des Bluttyps notwendig ist, genau feststellen.
Spezielle Antikörper gegen Zelloberflächenantigene, die von den A- und B-Blutgruppenantigenen verschieden sind, werden gewöhnlich in 1-2% von menschlichen Blutproben gefunden. Die Anwesenheit dieser Blutkörper im Empfänger einer Bluttransfusion kann eine ungünstige Reaktion verursachen, falls das Blut, das übertragen wird, Zellantigene enthält, die komplementär zu den Antikörpern des Empfängers sind. Es ist deshalb notwendig, das Blut des Empfängers auf solche Antikörper zu überprüfen. Normalerweise wird dies getan, indem man das Serum oder Plasma des Empfängers mit "Testzellen" vereinigt, von denen bekannt ist, daß sie die einschlägigen Antigene auf ihrer Oberfläche tragen. Nach Inkubation dieser Mischung werden die Zellen abgetrennt, frei vom Serum oder Plasma gewaschen und mit Anti-Immunglobulin inkubiert. Dieses Reagenz, häufig CoombsReagenz genannt, bindet sich an jegliche Empfängerantikörper, die an die Zellen gebunden sind, und veranlaßt die Zellen zum Agglutinieren. Die Agglutination zeigt deshalb an, daß die Antikörperüberprüfung positiv ist. Da die Fähigkeit des Coombs-Reagenz, Agglutination zu verursachen, durch Immunglobulin des Patienten, das anwesend ist, falls das Waschen unvollständig ist, blockiert werden kann, ist es notwendig, eine positive Kontrolle durchzuführen, wenn keine Agglutination dieser Testzellen stattfindet. Dies kann bewerkstelligt werden, indem man die Testzellen aus der Lösung, die das Anti-Immunglobulin enthält, abtrennt, indem man eine solche Lösung zentrifugiert, und dann zur Lösung "Kontrollzellen", die vorsensibilisiert sind, d.h., die Human-Antikörper an sie gebunden aufweisen, gibt. Gewöhnlich werden die Kontrollzellen hergestellt, indem man Rh-positive Zellen mit Anti-Rh-Antikörpern inkubiert. Wenn Patienten-Immunglobulin entfernt worden ist und Anti-Immunglobulin anwesend ist, agglutinieren die Kontrollzellen, und der Test wird als gültig angesehen. Wenn sie nicht agglutinieren, wird ein negatives Antikörperüberprüfungsergebnis, das durch die Anwesenheit von Agglutination der Testzellen angezeigt wurde, als ungültig betrachtet.
Die oben beschriebene positive Kontrolle bei der Antikörperüberprüfung erfordert, daß eine Lösung, die die Testzellen enthält, zentrifugiert wird oder daß die Testzellen auf andere Weise vor Zugabe der Kontrollzellen aus der Anti-Iminunglobulinlösung abgetrennt werden. Dies wird wegen der Schwierigkeit bei der Beobachtung der Testzellenagglutination in Anwesenheit von Kontrollzellen als notwendig erachtet.
Das vorliegende Verfahren vermeidet die Schwierigkeit der Messung von Agglutination eines Zelltyps in Gegenwart eines anderen Zelltyps und gestattet deshalb, die Testzellen-positive Kontrolle bei der Antikörperüberprüfung durchzuführen, ohne daß zuerst die Testzellen aus dem Suspensionsmedium entfernt werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines SBM [spezifischen bindenden Mitglieds], das an erste Teilchen (P&sub1;) gebunden ist, in einem flüssigen Medium. Das Verfahren umfaßt das kombinierte Bereitstellen (i) eines flüssigen Mediums, von dem angenommen wird, daß es an P&sub1; gebundenes SBM enthält, (ii) eines Mittels zum Agglutinieren von P&sub1; in Beziehung zur Anwesenheit von SBM auf P&sub1; und (iii) von zweiten Teilchen (P&sub2;), die SBM oder ein verschiedenes spezifisches bindendes Mitglied für das Mittel zum Agglutinieren daran gebunden aufweisen, wodurch ein Mittel zum Agglutinieren von P&sub2; bereitgestellt wird. Die Agglutination von P&sub1; und P&sub2; wird getrennt nachgewiesen und ist durch spektroskopische Messung unterscheidbar. Das Medium wird inkubiert, und die Agglutination von jedem der Teilchen wird ohne Trennung spektroskopisch bestimmt. Die Agglutination von P&sub1; steht mit der Anwesenheit von SBM auf P&sub1; in Beziehung, und die Agglutination von P2 in Abwesenheit von Agglutination von P&sub1; steht mit der Abwesenheit von SBM auf P&sub1; in Beziehung.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines spezifischen bindenden Mitglieds (SBM) in einem flüssigen Medium. Das Verfahren umfaßt das in Kombination nacheinander Bereitstellen eines flüssigen Mediums, von dem angenommen wird, daß es SBM enthält, (1) von ersten Teilchen, die ein spezifischen bindendes Mitglied daran gebunden aufweisen (SBM&sub1;-P&sub1;), (2) eines Mittels zum Agglutinieren von SBM&sub1;-P&sub1;, wobei das Mittel mit SBM reaktiv ist, und (3) von zweiten Teilchen, die ein spezifisches bindendes Mitglied für das Mittel zum Agglutinieren daran gebunden aufweisen (SBM&sub2;-P&sub2;), worin mindestens eines von SBM&sub1;-P&sub1; oder SBM&sub2;-P&sub2; einen Marker aufweist, wobei verschiedene Marker und verschiedene Teilchen durch spektroskopische Eigenschaften, bei denen es sich um Emission, Absorption und Lichtstreuung handelt, unterscheidbar sind. Das Medium wird inkubiert, und mindestens ein Teil des Mediums wird mit Licht bestrahlt, in dem das Medium kontinuierlich ist und die Teilchen in dem kontinuierlichen Medium suspendiert sind. Die Populationen von Teilchen mit elektromagnetischen Signalen, die von Schwellenwerten verschieden sind, werden bestimmt, und die Populationen werden mit der Anwesenheit von SBM in Beziehung gesetzt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Antikörpers in einer Probe. Die Probe, von der angenommen wird, daß sie den Antikörper enthält, wird in einem wäßrigen Medium mit ersten Zellen vereinigt, die ein zum Antikörper reziprokes Oberflächenantigen aufweisen. Die Zellen werden vom Medium abgetrennt, in einem zweiten wäßrigen Medium mit einem Antikörper gegen Immunglobulin vereinigt und inkubiert. Zweite Zellen mit Oberflächen- Immunglobulinen, die von dem Antikörper erkannt werden können, werden anschließend zum Medium gegeben. Mindestens eine der ersten oder zweiten Zellen weist einen fluoreszierenden Marker auf. Verschiedene Marker auf verschiedenen Zellen sind durch spektroskopische Eigenschaften, bei denen es sich um Emission, Absorption und Lichtstreuung handelt, unterscheidbar. Die Agglutination der ersten Zellen und der zweiten Zellen wird spektroskopisch ohne Abtrennung der Zellen voneinander oder vom zweiten wäßrigen Medium bestimmt. Die Agglutination wird dann mit der Anwesenheit des Antikörpers in Beziehung gesetzt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung der Agglutination von Gruppen von Teilchen in einem Medium mit einem Minimum von Bestimmungen und Abtrennungen der Teilchen voneinander oder vom Medium bereitgestellt. Die Verfahren finden Anwendung zum Nachweis von Agglutination von zwei Gruppen von Teilchen, zur Bestimmung der Anwesenheit eines spezifischen bindenden Mitglieds, das an Teilchen gebunden ist, und speziell auf dem Gebiet der Typisierung von Blut.
Bevor mit einer Beschreibung der speziellen Ausführungsformen fortgefahren wird, werden die folgenden Begriffe definiert.
Spezifisches bindendes Mitglied ("SBM") -- eines von zwei verschiedenen Molekülen mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Vertiefung, das sich spezifisch mit einer speziellen räumlichen und polaren Organisation des anderen Moleküls verbindet und dadurch als komplementär definiert wird. Das spezifische bindende Mitglied kann ein Ligand oder Rezeptor (Antiligand) sein. Diese sind gewöhnlich Mitglieder eines immunologischen Paars, wie beispielsweise Antigen-Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie beispielsweise Biotin-Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, Nukleinsäure-Duplexe, IgG-Protein A, DNA-DNA, DNA-RNA und dergleichen keine immunologischen Paare sind, aber in der Definition von SBM enthalten sind.
Ligand - irgendeine organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich existiert oder hergestellt werden kann.
Rezeptor ("Antiligand") -- irgendeine Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine spezielle räumliche und polare Organisation eines Moleküls, z.B. Epitopen- oder Determinantenstelle, zu erkennen. Erläuternde Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, z.B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren, Protein A, die Komplementkomponente Clq und dergleichen ein.
Teilchen -- die Teilchen weisen gewöhnlich einen Durchmesser von mindestens ungefähr 0,02 µm und nicht mehr als ungefähr 100 µm, gewöhnlich mindestens ungefähr 0,05 µm und weniger als ungefähr 20 µm, vorzugsweise ungefähr 0,3 bis 10 µm auf. Die Teilchen können organisch oder anorganisch, quellbar oder nichtguellbar, porös oder nicht-porös sein, vorzugsweise mit einer Dichte, die ungefähr der von Wasser gleicht, im allgemeinen von ungefähr 0,7 bis ungefähr 1,5 g/ml, und aus einem Material zusammengesetzt, das transparent, teilweise transparent oder opak sein kann. Normalerweise handelt es sich bei den Teilchen um biologische Materialien, wie z.B. Zellen und Mikroorganismen, z.B. Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten, Hybridome, Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli, Viren und dergleichen. Die Teilchen können auch Teilchen sein, die aus organischen und anorganischen Polymeren, Liposomen, Latex-Teilchen, Phospholipid-Vesikeln, Chylomikronen, Lipoproteinen und dergleichen zusammengesetzt sind.
Marker -- Ein Mitglied des signalerzeugenden Systems. Der Marker kann isotop oder nicht-isotop, gewöhnlich nicht-isotop sein, einschließlich Katalysatoren, wie beispielsweise eines Enzyms, eines Chromogens, wie eines Fluoreszenzfarbstoffs, Farbstoffs oder Chemilumineszenzfarbstoffs, einer radioaktiven Substanz usw., vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff.
Signalerzeugendes System -- Das signalerzeugende Systems kann eine oder mehrere Komponenten aufweisen, wobei mindestens eine Komponente ein Marker ist. Das signalerzeugende Systems erzeugt ein Signal, das zur Anwesenheit oder Abwesenheit eines SBM in einer Probe in Beziehung gesetzt werden kann. Das signalerzeugende Systems schließt alle Reagenzien ein, die erforderlich sind, um ein meßbares Signal zu erzeugen. Andere Komponenten des signalerzeugenden Systems können Substrate, Beschleuniger, Aktivatoren, chemilumineszierende Verbindungen, Kofaktoren, Inhibitoren, Abfänger, Metallionen, spezifische bindende Substanzen, die zur Bindung von signalerzeugenden Substanzen erforderlich sind, und dergleichen einschließen. Bei anderen Komponenten des signalerzeugenden Systems kann es sich Coenzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dergleichen handeln. Das signalerzeugende Systems sorgt für ein Signal, das durch äußere Mittel, vorzugsweise durch Messung von elektromagnetischer Strahlung, nachweisbar ist.
Eine große Zahl von Enzymen und Coenzymen, die in einem signalerzeugenden System nützlich sind, sind im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 19 bis 23, und US-Patent Nr. 4,318,980, Spalten 10 bis 14, aufgeführt. Eine Anzahl von Enzymkombinationen ist im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 23 bis 28, angegeben, wobei diese Kombinationen in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können.
Die interessierenden Fluoreszenzfarbstoffe emittieren Licht gewöhnlich oberhalb einer Wellenlänge von 350 nm, gewöhnlich oberhalb 400 nm und vorzugsweise oberhalb 450 nm. Wünschenswerterweise weisen die Fluoreszenzfarbstoffe eine hohe Quantenausbeute, einen großen Stokes-Shift auf und sind unter den Bedingungen ihrer Konjugation und Verwendung chemisch stabil. Der Ausdruck Fluoreszenzfarbstoff soll Substanzen einschließen, die Licht nach Aktivierung durch elektromagnetische Strahlung oder chemische Aktivierung emittieren, und schließt fluoreszierende und phosphoreszierende Substanzen, Szintillatoren und chemilumineszie rende Substanzen ein.
Interessierende Fluoreszenzfarbstoffe fallen in eine Anzahl von Kategorien mit gewissen primären Funktionalitäten. Diese primären Funktionalitäten schließen 1- und 2-Aminonaphthalin, p,p-Diaminostilbene, Pyrene, guaternäre Phenanthridin-Salze, 9-Aminoacridine, p,p'-Diaminostilbene, Imine, Anthracene, Oxacarbocyanin, Merocyanin, 3-Aminoeguilenin, Perylen, Bisbenzoxazol, Bis-p-oxazolylbenzol, 1, 2-Benzophenazin, Retinal, Bis-3-aminopyridinium-Salze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol, Benzimidazolylphenylamin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumarin, 4, 5-Benzimidazole, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane, Flavin und Seltenerdchelate, -oxide und -salze ein. Beispielhafte Fluoreszenzfarbstoffe sind im US-Patent Nr. 4,318,707, Spalten 7 und 8, angeführt. Quadratin-Farbstoffe, die im US-Patent Nr. 4,806,488 beschrieben werden, sind ebefalls als Fluoreszenzfarbstoffe nützlich.
Eine große Zahl von erläuternden Fluoreszenzfarbstoffen ist im US-Patent Nr. 4,275,149, Spalten 30 und 31, angegeben.
Eingreifende Entfernung -- Eine derartige Entfernung bezieht sich auf die Abtrennung von Teilchen aus einem flüssigen Medium, wie beispielsweise durch Dekantieren, Filtrieren und dergleichen, und schließt auch Zentrifugation des flüssigen Mediums ein, um ein Zentrifugat zur Verfügung zu stellen, das aus den Teilchen und einer Überstandsflüssigkeit umfaßt. Im letztgenannten Fall kann der Überstand physikalisch vom Zentrifugat abgetrennt werden oder nicht, obwohl die Teilchen aus der Flüssigkeit entfernt sind.
Mittel zum Agglutinieren -- Mittel zum Verursachen, daß Teilchen aggregieren. Bevorzugte Mittel schließen spezifische bindende Mitglieder ein, die reziprok zu einem spezifischen bindenden Mitglied auf einem zu agglutinierenden Teilchen sind. Wenn z.B. ein Teilchen ein spezielles spezifisches bindendes Mitglied (SBM) enthält, wie beispielsweise ein Antigen oder einen Antikörper, kann das komplementäre spezifische bindende Mitglied, vorzugsweise ein Antikörper, verwendet werden, um unter geeigneten Bedingungen eine Agglutination zur Folge zu haben. Wenn das SBM ein Antikörper ist, ist ein bevorzugtes Mittel zum Agglutinieren Antikörper gegen Immunglobulin. Antikörper können durch wohlbekannte Techniken erzeugt werden. Die Bedingungen zur Verursachen von Agglutination schließen Inkubation der Teilchen in einem wäßrigen Medium, das das Mittel zur Agglutination enthält, ein, vorzugsweise unter gleichzeitigem sanftem Mischen, um die Teilchen in nahe Nachbarschaft zueinander zu bringen. Wie oben erwähnt, beinhaltet ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines an erste Teilchen (P&sub1;) gebundenen SBM in einem flüssigen Medium. Ein flüssiges Medium, von dem man annimmt, daß es an P&sub1; gebundenes SBM enthält, wird in Kombination mit einem Mittel zum Agglutinieren von P&sub1; in Beziehung zur Anwesenheit des SBM auf P&sub1; und zweiten Teilchen (P&sub2;), die das gleiche oder ein verschiedenes spezifisches bindendes Mitglied für das Mittel zum Agglutinieren daran gebunden aufweisen, bereitgestellt, wodurch ein Mittel zum Agglutinieren von P&sub2; bereitgestellt wird. Die Agglutination von P&sub1; und P&sub2; ist getrennt nachweisbar und durch spektroskopische Messung unterscheidbar.
Die Reihenfolge der Vereinigung der obigen Materialien sorgt gewöhnlich dafür, daß das flüssige Medium, von dem man annimmt, daß es an P&sub1; gebundenes SBM enthält, zuerst mit dem Mittel zum Agglutinieren von P&sub1; in Kontakt kommt, und für die anschließende Zugabe von P&sub2; zu dieser Mischung. Vorzugsweise wird die Mischung vor der Zugabe von P&sub2; unter Mischen inkubiert, um für eine Agglutination von P&sub1; zu sorgen. Die Mischung wird dann wiederum unter Mischen inkubiert, um für die Agglutination von P&sub2; zu sorgen. Alternativ können alle drei Materialien gleichzeitig vereinigt werden, gefolgt von Inkubieren und Mischen.
Das Medium ist normalerweise wäßrig, welches bis zu ungefähr 40 Gewichtsprozent andere polare Lösungsmittel, insbesondere sauerstoffhaltige Lösungsmittel mit 1 bis 6, gewöhnlicher 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, einschließlich Alkoholen, Ethern und dergleichen, enthalten kann. Gewöhnlich ist das Cosolvens zu weniger als ungefähr 20 Gewichtsprozent anwesend. Unter einigen Umständen könnte abhängig von der Natur der Probe einiges oder alles wäßrige Medium durch die Probe selbst bereitgestellt werden.
Nachdem die Materialien vereinigt worden sind, wird das Medium inkubiert. Der pH für das Medium liegt gewöhnlich im Bereich von 4-11, gewöhnlicher 5-10 und vorzugsweise im Bereich von ungefähr 6-9. Der pH wird so gewählt, daß ein signifikantes Maß an Bindungsaffinität der bindenden Mitglieder aufrechterhalten wird, um Agglutination zur Folge zu haben, und auch für eine optimale Erzeugung des Signals durch ein signalerzeugendes System. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH zu erreichen und den pH während des Assays aufrechtzuerhalten. Erläuternde Puffer schließen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen ein. Der spezielle verwendete Puffer ist nicht kritisch, aber in einzelnen Assays kann ein Puffer gegenüber einem anderen vorgezogen werden. Gemäßigte und wünschenswerterweise im wesentlichen konstante Temperaturen werden normalerweise für die Inkubation und die darauffolgenden Schritte verwendet. Die Temperaturen für die Inkubation und darauffolgende Bestimmung liegen im allgemeinen im Bereich von ungefähr 4º-50ºC, gewöhnlicher im Bereich von ungefähr 10º-40ºC, und häufig sind sie Umgebungstemperaturen, d.h. ungefähr 15º-25ºC.
Die Konzentration von SBM oder P&sub1; mit SBM in der flüssigen Probe, welche bestimmt werden kann, schwankt im allgemeinen von ungefähr 10&supmin;&sup4; bis ungefähr 10&supmin;¹&sup4; M, gewöhnlicher von ungefähr 10 bis 10&supmin;¹&sup4; M. Überlegungen wie die Konzentration an SBM und das Protokoll legen normalerweise die Konzentration der anderen Reagenzien fest.
Während die Konzentrationen von vielen der verschiedenen Reagenzien und Reagenzlösungen im allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich des SBM oder P&sub1; mit SBM festgelegt werden, wird die Endkonzentration von jedem Reagenz normalerweise empirisch festgelegt, um die Empfindlichkeit der Bestimmung über den interessierenden Bereich zu optimieren. Bei bestimmten Protokollen können einzelne Reagenzien in beträchtlichem Überschuß verwendet werden, ohne die Empfindlichkeit des Assays nachteilig zu beeinflussen.
Nach der Inkubation des Mediums und der Teilchen wird die Agglutination von jedem der Teilchen spektroskopisch bestimmt. Im allgemeinen weist mindestens Pl einen Marker daran gebunden auf. Durch die Wahl des Markers und der Agglutinationsbedingungen werden mindestens zwei unterscheidbare Signale jeweils durch die zwei agglutinierten Teilchen erzeugt. Gewöhnlich handelt es sich bei den Signalen von den zwei Teilchen um Emission, Absorption und/oder Lichtstreuung.
Die Agglutination von P&sub1; steht mit der Anwesenheit des SBM auf P&sub1; in Beziehung. Die Agglutination von P&sub2; in Abwesenheit von Agglutination von P&sub1; steht mit der Abwesenheit des SBM auf P&sub1; in Beziehung.
Das Verfahren erfordert, daß das Signal, das bei agglutinierten Teilchen beobachtet wird, von dem Signal verschieden ist, das bei nicht-agglutinierten Teilchen beobachtet wird, und daß die Agglutination von P&sub1; ein anderes Signal ergibt als die Agglutination von P&sub2;. Gewöhnlich ist, wenn ein Teilchen unmarkiert ist und durch Lichtstreuung beobachtet wird, dieses in kleinerer Menge anwesend als das andere Teilchen, das normalerweise markiert ist. Alternativ kann das andere Teilchen eine verschiedene Lichtstreuung erzeugen, da es von verschiedener Größe ist. Wenn beide Teilchen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, weisen die Marker verschiedene Emissions- und/oder Absorptionsmaxima oder Emissionshalbwertszeiten auf. In gewissen Fällen ist der Marker auf natürliche Weise innerhalb des Teilchens anwesend, wie z.B. die Chemilumineszenz von Lymphozyten und Lichtabsorption von Erythrozyten. Wenn das gewünschte Signal Lichtstreuung ist, können die Teilchen so gewählt werden, daß sie intrinsisch hohe Lichtstreuung aufweisen, wie beispielsweise Erythrozyten, kolloidales Metall, kolloidaler Kohlenstoff oder kolloidale Farbstoffe usw. Das Markieren eines Teilchens mit einem Farbstoff gestattet den Nachweis des markierten Teilchens durch Absorption oder Divergenz, gewöhnlich Divergenz. In einem Nachweisverfahren wird ein hinreichend kleines Volumen des Mediums, in dem markierte Teilchen suspendiert sind, überwacht, so daß im Durchschnitt nur ein oder wenige Teilchen zu einem Zeitpunkt betrachtet werden. Um zu bestimmen, ob Aggregation der Teilchen stattfand, kann eine große Anzahl von Messungen derartiger Meßvolumina vorgenommen werden, wobei die Messungen sich zeitlich oder räumlich unterscheiden. Wenn keine Aggregation stattgefunden hat, schwankt die Anzahl der Teilchen innerhalb jedes Volumens, und demgemäß das Signal, statistisch und hängt vom Meßvolumen und der Konzentration der Teilchen ab. Wenn eine Aggregation stattgefunden hat, vergrößert die Anwesenheit von Teilchenaggregaten in einigen Meßvolumina das Signal aus diesen Volumina, und die Häufigkeit von Messungen eines Signal, das einen vorbestimmten Wert überschreitet, ist demgemäß erhöht.
Die Probe ist kontinuierlich, wobei sie ruhig ist oder gerührt oder bewegt wird, gewöhnlich relativ zum Meßvolumen bewegt wird, wenn sich die Messungen zeitlich unterscheiden. Gewöhnlich ist das Meßvolumen zusammenhängend mit und im wesentlichen umgeben von dem Suspensionsmedium und steht in einer Diffusionsbeziehung mit der gesamten zu messenden Probe.
Ein Mittel zum Bestrahlen von Meßvolumina ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu verwenden, die im US-Patent Nr. 4,564,598 beschrieben werden. Im wesentlichen wird das Meßvolumen unter Verwendung einer optischen Faser bestrahlt, wobei ein Bestrahlungsvolumen, das das Meßvolumen umfaßt, durch die Konstruktion der optischen Faser festgelegt wird. Die Form des Bestrahlungsvolumens ist normalerweise konisch. Die optischen Fasern sind typsicherweise aus einem Kernbereich und mindestens einem Mantelbereich aufgebaut, deren Dicke (Durchmesser) und relativen Brechungsindices sowohl den Halbwinkel des Konus als auch den kleinsten Durchmesser des Konus an der Spitze der Faser festlegen. Die wirksame axiale Länge, d.h. die Länge, innerhalb der das Meßvolumen angeordnet ist, wird durch die Intensität des Anregungsstrahls, der Empfindlichkeit der Nachweisverfahren und der Rate des Intensitätsabfalls des Anregungslichts mit wachsendem axialen Abstand von der Faserspitze festgelegt. Die Rate hängt vom Halbwinkel des Konus ab, wobei größere Halbwinkel größere Raten an Intensitätsabfall und demgemäß kürzere effektive Konuslängen verursachen. Auch die Lichtstreuung und Absorptionseigenschaften des Mediums beeinflußen den Intensitätsabfall.
Die verschiedenen Parameter, die das beobachtete Signal beeinflussen, werden so gewählt, daß sichergestellt ist, daß ein meßbares Signal erhältlich ist, wenn ein Teilchenaggregat innerhalb des Meßvolumens anwesend ist, wobei das Signal signifikant größer ist als das Signal, das ohne Teilchen im Meßvolumen erzeugt wird.
Verschiedene wirksame Meßvolumina können dadurch bereitgestellt werden, daß man eine Diffusion von Teilchen in das Meßvolumen hinein und daraus heraus gestattet. Alternativ kann man eine Mehrzahl von optischen Fasern, von denen jede Signale aus verschiedenen Bestrahlungsvolumina empfängt, vorliegen haben. Alternativ kann ein dynamisches System verwendet werden, worin die Probe durch eine oder mehrere optische Fasern fließt oder sich eine oder mehrere optische Fasern durch die Probe bewegen.
Das Anregungslicht kann durch Bestrahlen der gesamten Probe oder eines großen Teils der Probe mit Anregungslicht bereitgestellt werden. Alternativ und vorzugsweise kann das Anregungslicht durch eine optische Faser bereitgestellt werden, so daß das Meßvolumen direkt in Beziehung zum bestrahlten Volumen steht.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung findet spezielle Anwendung für die Bestimmung der Anwesenheit eines Antikörpers in einer Probe. Das Verfahren umfaßt das Vereinigen der Probe, von der man annimmt, daß sie den Antikörper enthält, mit ersten Zellen, die ein zum Antikörper reziprokes Oberflächenantigen aufweisen, in einem wäßrigen Medium. Zum Beispiel beinhaltet eine Bestimmung bei der Typisierung von Blut die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern gegen die Lewis-, Kell- und Duffy-Antigene und auch gegen das Rh- ode D-Antigen. Bei der Probe kann es sich um Serum, Plasma oder Vollblut handeln. Bei den ersten Zellen mit einem zum Antikörper reziproken Oberflächengen kann es sich um Erythrozyten mit Antigen, das komplementär zum nachzuweisenden Antikörper ist, handeln. Die Zellen werden dann aus dem Medium abgetrennt und in einem zweiten wäßrigen Medium mit Antikörper gegen ein Immunglobulin vereinigt. Gewöhnlich folgt eine Inkubationszeitspanne. Zweite Zellen mit Oberflächen-Immunglobulinen, die von dem Antikörper gegen Immunglobulin erkannt werden können, werden dann dazugegeben. Mindestens eine der ersten oder zweiten Zellen weisen einen fluoreszierenden Marker auf, und gewöhnlich weist jede einen verschiedenen fluoreszierenden Marker auf wenn es sich bei der Probe um Vollblut handelt. Verschiedene Marker und verschiedene Zellen sind durch Spektroskopische Eigenschaften, die Emission, Absorption und Lichtstreuung einschließen, unterscheidbar. Das zweite wäßrige Medium wird inkubiert. Agglutination der ersten Zellen und der zweiten Zellen wird spektroskopisch nach jeder der Inkubationen oder nach der Inkubation ohne eingreifende Entfernung der Zellen aus dem zweiten wäßrigen Medium bestimmt. Die Agglutination steht mit der Anwesenheit des Antikörpers in Beziehung. Die Agglutination der ersten Zellen zeigt die Anwesenheit des Antikörpers an, und die Agglutination der zweiten Zellen in Abwesenheit von Agglutination der ersten Zellen zeigt die Abwesenheit des Antikörpers an.
Wie oben erwähnt, findet die vorliegende Erfindung eine spezielle Anwendung bei automatisierten Bluttypisierungsverfahren. Es ist nützlich beim Coombs-Antiglobulintest, worin Immunglobulin haltiges Plasma zuerst mit Testzellen vereinigt wird, die dann entfernt und sorgfältig frei von Proben-Immunglobulin gewaschen werden, bevor man durch Überprüfen auf Agglutination nach Zugabe von Antiglobulin bestimmt, ob Antikörper aus dem Plasma an die Zellen gebunden worden ist. Die vorliegende Erfindung gestattet die Verwendung von positiven Kontrollzellen, um ohne eingreifende Entfernung der Testzellen aus dem Antiglobulin-haltigen Medium oder von den Kontrollzellen zu bestimmen, ob das Waschen vollständig war.
Bei einer derartigen Bestimmung wird eine Probe, die Serum oder Plasma umfaßt, mit Testzellen vereinigt und inkubiert, welche einen fluoreszierenden Marker tragen und oberflächengebundenes Antigen aufweisen, das reziprok zu dem bestimmenden Antikörper ist. Die Testzellen werden dann aus dem Medium abgetrennt und gewaschen, so daß die Zellen frei vom Immunglobulin aus der Probe sind. Die Testzellen werden dann mit Antikörper gegen Immunglobulin vereinigt. Das Medium wird inkubiert, und die Agglutination wird dann bestimmt. Kontrollzellen, die Immunglobulin auf der Oberfläche aufweisen, werden vor oder nach der Bestimmung dazugegeben. Vorzugsweise sind die Kontrollzellen nicht markiert oder mit einem verschiedenen Fluoreszenzfarbstoff markiert. Nach einer weiteren Inkubation wird die Messung von Agglutination der Kontrollzellen und, falls nicht zuvor gemessen, der Testzellen ohne eingreifende Entfernung der Zellen aus dem zweiten wäßrigen Medium vorgenommen. Eine Agglutination der Testzellen zeigt die Anwesenheit von Antikörper in der Probe an. Eine Agglutination der Kontrollzellen in Abwesenheit von Agglutination der Testzellen zeigt die Abwesenheit von Antikörper in der Probe an.
Ein Versagen der Testzellen zu agglutinieren, wenn der zu bestimmende Antikörper anwesend ist, kann sich ergeben, wenn Immunglobulin aus der Probe wegen unvollständigen Waschens nach der anfänglichen Abtrennung anwesend ist. Kontrollzellen werden verwendet, um die Vollständigkeit des Waschens zu bestimmen. Falls die Kontrollzellen agglutinieren, hat das anfängliche Waschen genügend Immunglobulin entfernt, um eine Absorption des hinzugefügten Antikörpers gegen Immunglobulin zu vermeiden. Die Antikörper gegen Immunglobulin sind deshalb verfügbar, um die Testzellen zu agglutinieren, wenn Immunglobulin an die Testzellen gebunden worden ist. Dementsprechend zeigt ein Versagen der Testzellen zu agglutinieren, wenn die Kontrollzellen agglutiniert haben, an, daß der zu bestimmende Antikörper nicht in der Probe war. Die Agglutination kann in einem einzigen flüssigen Medium ohne eingreifendes Abtrennen der Testzellen aus dem Medium oder von den zweiten Zellen durchgeführt werden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines SBM in dem flüssigen Medium. Ein flüssiges Medium, von dem man annimmt, daß es das SBM enthält, wird in Kombination mit (1) ersten Teilchen, die ein spezifisches bindendes Mitglied, das komplementär zu SBM ist, daran gebunden aufweisen (SBM&sub1;-P&sub1;), und (2) Mitteln zum Agglutinieren von SBM&sub1;-P&sub1; bereitgestellt, worin die Mittel mit SBM reaktiv sind; Inkubieren der Mischung; und Zugabe von zweiten Teilchen, die ein spezifisches bindendes Mitglied für die Mittel zur Agglutination daran gebunden aufweisen (SBM&sub2;-P&sub2;). Mindestens eines von SBM&sub1;-P&sub1; oder SBM&sub2;-P&sub2; weist einen Marker auf. Die verschiedenen Marker und verschiedenen Teilchen sind durch spektroskopische Eigenschaften, bei denen es sich um Emission, Absorption und Lichtstreuung handelt, unterscheidbar.
Mit Bezug auf das obige spezielle Beispiel für die Verwendung von Testzellen bei der Typisierung von Blut dient Patienten-Immunglobulin als Beispiel für SBM. Wie oben erwähnt, ist es wünschenswert zu bestimmen, ob das ganze Patienten-Immunglobulin beim ersten Waschen entfernt worden ist. Zellen, die ein Antigen aufweisen, an das der bei der Bluttypisierung zu bestimmende Antikörper gebunden ist, dienen als Beispiel für SBM&sub1;-P&sub1;. Kontrollzellen dienen als Beispiel für SBM&sub2;-P&sub2;, und Antikörper gegen Immunglobulin dient als Beispiel für das Mittel zur Agglutination.
Das Medium wird dann inkubiert, und mindestens ein Teil des Mediums wird mit Licht bestrahlt. Das Medium ist kontinuierlich, und die Teilchen sind in dem kontinuierlichen Medium suspendiert. Populationen von Teilchen, die elektromagnetische Signale aufweisen, welche sich von einem Schwellenwert unterscheiden, werden bestimmt und mit der Anwesenheit von SBM in Beziehung gesetzt. In einer Ausführungsform wird das SBM&sub1;-P&sub1; mit einem Fluorophor markiert, und das Verfahren beinhaltet die Bestimmung von Emission und Lichtstreuung. Die Agglutination von SBM&sub1;-P&sub1; zeigt die Anwesenheit von an dieses Teilchen gebundenem SBM an. Die Agglutination von SBM&sub2;-P&sub2; in Abwesenheit von Agglutination von SBM&sub1;-P&sub1; zeigt die Abwesenheit von an SBM&sub1;-P&sub1; gebundenem SBM an.
Bequemlichkeitshalber können die Reagenzien zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Kit bereitgestellt werden. Das Kit umfaßt die Reagenzien in abgepackter Kombination. Die Reagenzien sind gemäß ihren jeweiligen Reaktivitäten miteinander und zur Sicherstellung der Lagerfähigkeit abgepackt. Zum Beispiel kann jedes Reagenz in getrennten Behältern abgepackt sein, oder Reagenzien können kombiniert sein, wo es die Reaktivität miteinander gestattet. Im Bereich der Bluttypisierung schließen die Reagenzien Testzellen, die einen Marker tragen, Kontrollzellen und Antikörper gegen Immunglobulin ein. Das Kit kann auch ergänzende Materialien, wie Puffer und Stabilisatoren, einschließen. Zusätzlich schließen andere ergänzende Materialien Proteine, wie Albumine, Tenside, insbesondere nicht-ionische Tenside, Bindungsbeschleuniger, z.B. Polyalkylenglykole, und dergleichen ein.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden erläuternden Beispiele dargelegt. Teile und Prozentsätze sind Volumenteile und -prozentsätze, falls nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1

Zellnachweissystem

Der Lichtstrahl eines bei 633 nm emittierenden He/Ne-Lasers (2 mW, Melles Griot, San Marcos, CA) wurde auf ein Ende einer optischen Faser aus reinem Siliciumdioxid mit einem Kern von 50 µm und einer numerischen Apertur von 0,22 fokussiert. Das andere Ende der Faser wurde in eine duale Fasersonde eingebaut, die so konstruiert war, daß die Achse des Lichtkonus, der aus dem Ende der Faser heraustrat, die Achse einer zweiten ähnlichen Faser bei einer Entfernung von ungefähr 225 µm vom Ende jeder Faser unter einem Winkel von 60º schnitt. Das Sammelvolumen, das als Überlappung des Lichtkonus aus der ersten Faser und des Lichtaufnahmekonus der zweiten Faser definiert war, betrug ungefähr 10&supmin;&sup6; cm³. Die Sonde war so konstruiert, daß sie direkt in die zu analysierende Probe einzutauchen war. Ein Teil des Lichts, das entweder von fluoreszierenden Teilchen oder gelösten Stoffen emittiert wurde oder von Teilchen innerhalb des Sammelvolumens gestreut wurde, konnte durch die zweite Faser übertragen werden und durch ein Filterrad auf einen Sekundärelektronenvervielfacher (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) fokussiert werden. Das Filterrad enthielt einen 633 nm-Bandpaßfilter zum Nachweis von Streulicht und ein Tandempaar von 645 nm-Langpaßfiltern [long-pass filters] zum Nachweis von Fluoreszenzlicht. Das Sekundärelektronenverviel facher-Ausgangssignal wurde durch einen Vorverstärker und Diskriminator (Pacific Instruments, Concord, CA) verarbeitet, was ein Photopuls-Ausgangssignal ergab, das zur Photonenzählung geeignet war. Photopulse wurden über Gatezeiten von 500 µs gezählt, und die Zählung wurde an einen On-Line-Mikroprozessor gegeben. Zählungsschwankungen in aufeinanderfolgenden Gatezeiten wurden verwendet, um den Grad der Teilchenaggregation abzuschätzen.

Probentransport und -mischen

Proben und Reagenzien wurden in einem einzigen Tropfen auf einem flachen Blatt aus Latex-Kautschuk zusammengegeben, das in Kontakt mit der oberen Oberfläche eines Temperatur-gesteuerten Reaktionsblocks gehalten wurde. In dem Block, auf dem das Latexblatt lag, befanden sich becherförmige Vertiefungen, die einen Durchmesser von ungefähr 1 cm aufwiesen, welche jeweils durch Öffnungen von 1 mm am Boden mit einer Vakuumvorrichtung verbunden waren. Ein wirksames Mischen der Tropfen wurde erreicht, indem man abwechselnd die Becher evakuierte, um zu veranlassen, daß ein Teil des Blattes gedehnt wurde und nach unten gezogen wurde, und das Vakuum aufhob, um dem Blatt eine Rückkehr in seine ursprüngliche Lage zu gestatten. Bei ausreichend kleinen Flüssigkeitsvolumina verblieben die Tropfen der Reaktionsmischungen durch Oberflächenspannung an ihrem Ort und konnten durch Bewegen des Blatts während Zeitspannen, in denen kein Vakuum angelegt war, über eine Reihe von Vertiefungen transportiert werden. Dies gestattete die Zugabe und Entfernung von Reagenzien an verschiedenen Stellen und machte es möglich, gleichzeitig eine Reihe von Proben zu verarbeiten. Die letzte Vertiefung in der Reihe war unter der dualen Fasersonde angeordnet, welche mit einer Abgabevorrichtung zur Verdünnung der Zellen versehen war und vertikal bewegt werden konnte, um ein Eintauchen in die Suspension zu gestatten.

Farbstoffe

1,3-Bis[4-dibutylamino-2-hydroxyphenyl]-2,4-dihydroxycyclobutendiyliumdihydroxid, bis (inneres Salz) (TBS) wurde verwendet, um rote Blutzellen anzufärben. Der Farbstoff wurde nach dem Verfahren von Sprenger und Ziegebein, Angew. Chem., Internat. Edit. (1966) 5:894, synthetisiert, indem man ein Äquivalent Quadratsäure mit zwei Äquivalenten N,N-Dibutylanilin in einer 2:1 Mischung von n-Butanol und Benzol unter kontinuierlicher azeotroper Entfernung von Wasser refluxierte. Beim Abkühlen trennten sich die Produkte als grüne Kristalle ab, die durch Filtration gesammelt und mit Methanol gewaschen wurden. Die Farbstoffe wurden aus einer 1:1 Mischung von Methanol und Methylenchlorid umkristallisiert. Das Absorptionsmaximum des Farbstoffs in Dimethylformamid betrug 650 nm, &epsi; = 330 000 M&supmin;¹ cm&supmin;¹.

Antikörperreagenzien

Anti-Human-IgG wurde aus dem Serum von Kaninchen hergestellt, die mit Human-IgG immunisiert waren (Mollison, "Blood Transfusion in Clinical Medicine" (7. Auflage), Blackwell Scientific Publications (1983), 505-508). Die IgG-Fraktion wurde durch Ammoniumsulfat-Fällung und Ionenaustauschchromatographie (DEAE-Sephacell) isoliert und in 20 mM Tris-Kochsalzpuffer mit 1,25% PVP auf 11-18 mg/ml verdünnt.

Rote Blutzellen-Reagenz

Für die Antikörperüberprüfung wurden Zellen von drei verschiedenen Spendern erhalten, die so ausgewählt waren, daß jedes der ungefähr zwanzig klinisch signifikanten Antigene auf einer oder mehreren Zellen vertreten war. Die Zellen wurden mit Kochsalzlösung gewaschen und zu ungefähr 2 x 10&sup9; Zellen/ml in Kochsalzlösung, die 2% BSA enthielt, suspendiert. 50 µl 10&supmin;&sup4; M TBS in Dimethylacetamid wurden zu 1 ml dieser Suspension gegeben, und die Mischung wurde sanft 15-30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Die Zellen wurden dann mit Kochsalzlösung gewaschen und bei 4ºC mit einer Endkonzentration von 5% (Vol/Vol) bei Zellen zum umgekehrten Gruppieren [reverse grouping cells] und 10% bei Antikörperüberprüfungszellen in einem isotonen Zellmedium (pH 8,3) (Uda et al., Transfusion (A85) 25:325-329) aufbewahrt.
Kontrollzellen, die für die Antikörperüberprüfung verwendet wurden (Uda et al., oben) wurden durch Inkubieren von Rh(D)- positiven Zellen mit einem monoklonalen Human-Anti-Rh(d)-Antikörper (Bioresponse, 0,24 µg/ml) in Kochsalzlösung mit 2% BSA über 45 Minuten bei 37ºC hergestellt. Die mit Antikörper beschichteten Zellen wurden in Kochsalzlösung gewaschen und bei einer Konzentration von 10% (Vol/Vol) in Zellmedium (Widmann et al., "Technical Manual", 9. Auflage, Arlington, VA, American Association of Blood Banks (1985) 376) aufbewahrt.

Ferrofluid

Kolloidaler magnetisierbarer Magnetit wurde durch eine Abwandlung des von Massart beschriebenen Verfahrens (IEEE Transactions on Magnetics, MAG 17 (1981) 1247) hergestellt. Gleiche Volumina von 1,5 M Ammoniumhydroxid und einer wäßrigen Lösung, die 0,16 M FeCl&sub2;, 0,08 M FeCl&sub2; und 0,08 M HCl bei Raumtemperatur enthielt, wurden über einen fünfminütigen Zeitraum in einen Kolben gepumpt. Nachdem die Zugabe beendet war, ließ man den Magnetit 1 Stunde sich absetzen, und der Überstand, der ungefähr 80% des Gesamtvolumens ausmachte, wurde dekantiert. Die konzentrierte Aufschlämmung an Magnetit und ein gleiches Volumen von 2,0 M Perchlorsäure wurden gleichzeitig in einen zweiten Kolben gepumpt. Das suspendierte Material wurde magnetisch getrennt. Nach Zugabe von einem Fünftel des ursprünglichen Volumens an Wasser wurde eine kolloidale Dispersion erhalten, die gegen 10 mM Perchlorsäure dialysiert wurde. Die resultierende Suspension enthielt 44 mg/ml Eisen, wie durch Zugabe eines gleichen Volumens an konzentrierter Salzsäure und Untersuchen gemäß dem Verfahren von Persijn et al. (Clinica Chimica Acta (1971) 35:91-98) bestimmt.
Succinyliertes BSA wurde durch Zugabe von 2,5 ml 0,5 M Bernsteinsäureanhydrid (Aldrich) in Dimethylformamid (Mallinckrodt) zu 5,0 g BSA (kristalliner Gütegrad, Miles Laboratories) in 250 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 8,0, bei Raumtemperatur hergestellt. Nach 1,5 Stunden wurde die Lösung erschöpfend gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die elektrophoretische Mobilität des modifizierten Proteins betrug 1,75 (natives BSA = 1,00), bestimmt durch Agarosegel-Elektrophorese (Paragon, SPE, Beckman)
Das kolloidale Eisenoxid wurde mit Wasser auf 10 mg/ml (pH 2,9) verdünnt, und 100 ml dieser Suspension wurden mit einem gleichen Volumen an succinyliertem BSA (9,5 mg/ml, mit 0,1 M HClO&sub4; auf pH 3,3 eingestellt) vereinigt. Der pH der Lösung wurde dann durch schnelle Zugabe von 15-20 ml 0,1 M Tetramethylammoniumhydroxid auf 9,0 angehoben. Während dieses Vorgehens wurde die klare, dunkelbraune Flüssigkeit trüb und klärte sich dann wieder. Die durchschnittliche Teilchengröße wurde durch dynamische Streuungsspektrometrie (Nicomp Instruments, Model HM5-90) zu 55-65 nm bestimmt. Ein Teil des Ferrofluid-Präparats wurde fünffach durch Membranultrafiltration (Amicon) konzentriert, um ein 25 mg/ml- Reagenz herzustellen.

Andere Reagenzien

Kochsalzlösung war eine wäßrige Lösung von 0,15 NaCl. Lösung mit geringer Ionenstärke (LISS) war eine isotone Phosphatgepufferte Glycinlösung, die 0,03 M NaCI enthielt, pH 6,7. Polyacrylsäure (Aldrich, durchschnittliches Mol.-Gew. = 5000) wurde in 0,1 M Glycinpuffer, pH 8,0, auf 5 mg/ml verdünnt. Polyvinylpyrrolidon (PVP) (GAF) war K-60, nicht-pharmazeutische Güteklasse. Polybrene (Hexadimethrinbromid, Aldrich, durchschnittliches Mol.-Gew. = 4300) war eine 16 mg/ml-Lösung in LISS, pH 6,7.

Automatisierte Antikörperüberprüfung

Plasma wurde zuerst durch Mischen von 0,5 ml Blut, 40 µl Ferrofluid zu 25 mg/ml, 200 µl LISS und 40 µl Polybrene in einem Becher von 1 cm² aus dem zu testenden Blut entfernt. Die Zell-Ferrofluid-Koaggregate wurden durch Anordnen gleicher Pole von zwei Magneten mit 0,21 Tes (2,1 kgauss) so nahe wie möglich an angrenzenden Seiten des Bechers abgetrennt. Das zellfreie Plasma wurde entfernt und gegen drei verschiedene Sätze von angefärbtem Rote Blutzellen-Reagenz getestet. Bei jedem Test wurden 10 µl Zellen und 100 µl Plasma bei einer Reaktionsblocktemperatur von 37ºC 9 Minuten auf dem Latexblatt gemischt. 20 µl Ferrofluid (5 mg/ml), 20 µl Polybrene und 50 µl LISS wurden dann dazugegeben, und die Zellen wurden magnetisch getrennt. Die Flüssigkeit wurde entfernt, und die Zellen wurden mit LISS gewaschen und durch Zugabe von 15 µl Polyacrylsäure wieder suspendiert. Anti-Human-IgG-Reagenz (20 µl) wurde dann dazugegeben, und die Zellsuspension wurde 1 Minute gemischt. Als nächstes wurden Kontrollzellen (10 µl) dazugegeben, und nach einminütiger Inkubation wurde die Probe mit 0,5 ml Kochsalzlösung verdünnt. Die resultierende Suspension wurde nacheinander bezüglich Agglutination der Reagenzzellen (Fluoreszenz) und der Kontrollzellen (Lichtstreuung) analysiert.

Interpretation der Ergebnisse

Die Agglutination von Erythrozyten wurde durch Ziehen der Zellsuspension hinter das Ende der dualen Fasersonde und Aufzeichnen der Fluoreszenz oder Lichtstreuung in mehrfachen Probenvolumina, die durch Gatezeiten von 500 µs definiert waren, bestimmt. Kontinuierliche Messungen wurden 10 Sekunden lang aufgezeichnet. Die Daten wurden für eine erste identifizierende Reihe von aufeinanderfolgenden Gatezeiten, die Lichtpuls-Zählereignisse über einem Schwellenwert aufwiesen und demnach dem Durchgang von einer oder mehreren Zellen an der Sonde vorbei zugeschrieben wurden, analysiert. Signalpulse dauerten gewöhnlich ungefähr 3-4 Gatezeiten (1,5-2 ms), abhängig von der Geschwindigkeit der Bewegung der Flüssigkeit. Diese Ereignisse wurden gezählt, um einen "Agglutinationsindex" bereitzustellen. Für den Zweck der Unterscheidung einer agglutinierten von einer nichtagglutinierten Probe wurde "Cut-Off"-Agglutinationsindexwerte durch Testen bekannter Proben erhalten.
Im Antikörper-Überprüfungstest wurden erhöhte Schwankungen im Fluoreszenzsignal über einem "Cut-Off"-Agglutinationsindex einer Agglutination der angefärbten Zellen zugeschrieben. Das Fluoreszenzsignal wurde unter Verwendung eines 645 nm-Langpaßfilters überprüft. Die Antikörperüberwachungs-Kontrollzellen wurden nicht angefärbt, und die Agglutination wurde deshalb durch Überwachung von Schwankungen im Lichtstreuungssignal unter Verwendung des 633 nm-Bandpassfilters überwacht. Da diese Zellen mit Human-IgG überzogen waren, diente ihre Agglutination als Indikator dafür, daß genügend Anti-Human-IgG hinzugefügt worden war. Demgemäß wurde eine Probe, bei der der Test bei der Antikörperüberprüfung negativ verlief, als undefiniert betrachtet, falls keine Agglutination der Kontrollzellen durch Lichtstreuungsschwankungenen nachgewiesen wurde.

ERGEBNISSE

Automatisiertes Testen

Die automatisierte Antikörperüberprüfung wurde an 103 Proben durchgeführt, bei denen es sich entweder um frisches Blut oder um "wiederhergestellte" Proben handelte, die durch Mischen von Antikörper-positivem Plasma (gefroren aufbewahrt) mit kompatiblen roten Blutzellen hergestellt worden waren, um eine positive Probe zu simulieren. Die Proben wiesen einen breiten Bereich an Antikörper-Titern gegen eine Vielfalt von klinisch signifikanten Antigenen auf. Im automatisierten Verfahren wurde Plasma, das durch magnetische Trennung erhalten worden war, gegen eine Gruppe von drei Sätzen von Antikörperüberprüfungs-Reagenzzellen getestet. Jede Probe wurde auch unter Verwendung von manuellen Standardtechniken und -reagenzien mit den gleichen Reagenzzellen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Zwei von 26 Proben, bei denen der Test im manuellen Verfahren negativ verlief, waren im automatisierten Test positiv, und 7 von 77 Proben, die im manuellen Verfahren positiv waren, waren im automatisierten Verfahren negativ. Die sieben Proben, die vom automatisierten Verfahren nicht erfaßt wurden, erzeugten eine sehr schwache, aber reproduzierbare Agglutination beim manuellen Testen. Die eine unbestimmte Probe zeigte kein Lichtstreuungssignal von den Kontrollzellen, vermutlich aufgrund von unvollständiger Entfernung von IgG während des Waschens der Zellen. Tabelle 1 Korrelation zwischen manueller und automatisierter Antikörperüberprüfung von 103 Patientenproben Manuelle Bestimmung Automatisierte Überprüfung Positiv Negativ Unbestimmta a Keine Agglutination der Kontrollzellen
Das vorliegende Verfahren zieht Vorteile aus der klinisch erprobten Agglutinationschemie, während es eine neue Trennung, Probenhandhabung und neue Nachweisverfahren bereitstellt, um eine Automatisierung und objektive Interpretation zu gestatten. Das Verfahren gestattet, daß eine Antikörperüberprüfung, an der die Verwendung von Testzellen und Kontrollzellen beteiligt ist, ohne die Notwendigkeit für einen Abtrennungsschritt wie Zentrifugation, Dekantieren und dergleichen durchgeführt werden kann.
Obwohl die vorangehende Erfindung mittels Erläuterung und Beispiel für die Zwecke der Klarheit und des Verständnisses in einiger Einzelheit beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß gewisse Veränderungen und Abwandlungen innerhalb des Bereichs der angefügten Ansprüche ausgeführt werden können.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines spezifischen bindenden Mitglieds (SBM), das an erste Teilchen (P&sub1;) gebunden ist, in einem flüssigen Medium, wobei das Verfahren umfaßt:

das in Kombination nacheinander Bereitstellen (1) eines flüssigen Mediums, von dem man vermutet, daß es SBM an P&sub1; gebunden enthält, (2) Mittel zum Agglutinieren von P&sub1; in Beziehung zur Anwesenheit des SBM auf P&sub1; und (3) zweite Teilchen (P&sub2;), die das gleiche oder ein verschiedenes spezifisches bindendes Mitglied für das Mittel zum Agglutinieren an sie gebunden aufweisen, wodurch sie dafür sorgen, daß das Mittel P&sub2; agglutiniert, worin Agglutination von P&sub1; und P&sub2; durch spektroskopische Messung getrennt nachweisbar und unterscheidbar sind;

das Inkubieren des Mediums;

das spektroskopische Bestimmen von Agglutination jedes der Teilchen ohne Trennung von P&sub1; von P&sub2;; und

das Inbeziehungsetzen der Agglutination von P&sub1; zu der Anwesenheit des SBM auf P&sub1; und der Agglutination von P&sub2; in Abwesenheit von Agglutination von P&sub1; zu der Abwesenheit des SBM auf P&sub1;.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das SBM ein Immunglobulin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die ersten Teilchen Zellen sind, die ein Oberflächenantigen mit einem daran gebundenen Antikörper aufweisen.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Mittel zur Agglutination Antikörper gegen Immunglobulin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweiten Teilchen Zellen mit Oberflächen-Immunglobulinen sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das erste Teilchen einen an es gebundenen Marker aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Marker ein Fluorophor ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bestimmung Emission und Lichtstreuung beinhaltet.

9. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Antikörpers in einer Probe, wobei das Verfahren umfaßt:

das Vereinigen einer Probe, von der man annimmt, daß sie einen interessierenden Antikörper enthält, mit ersten Zellen, die ein zu dem Antikörper reziprokes Oberflächenantigen aufweisen, in einem wäßrigen Medium;

das Abtrennen der Zellen aus dem Medium;

das Vereinigen der Zellen und eines Antikörpers gegen ein Immunglobulin in einem zweiten wäßrigen Medium,

das Inkubieren des zweiten wäßrigen Mediums und die Zugabe zu demselben von zweiten Zellen mit für den Antikörper gegen ein Iiniaunglobulin erkennbaren Oberflächen-Immunglobulinen, worin mindestens eine der ersten oder zweiten Zellen einen fluoreszierenden Marker aufweist, wobei verschiedene Marker und verschiedene Zellen durch spektroskopische Eigenschaften unterscheidbar sind, welche Emission, Absorption und Lichtstreuung sind,

das spektroskopische Bestimmen von Agglutination der ersten Zellen und der zweiten Zellen ohne Abtrennung der Zellen voneinander oder aus dem zweiten wäßrigen Medium; und

das Inbeziehungsetzen der Agglutination zur Anwesenheit des interessierenden Antikörpers.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Antikörper aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus für Humanerythrozyten Oberflächenantigene spezifischen Immunglobulinen besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Immunglobuline auf den zweiten Zellen die gleichen Bindungseigenschaften wie der Antikörper in der Blutprobe aufweisen.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin der fluoreszierende Marker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluorescein- und Rhodamin-Derivaten, Phycobiliproteinen, Quadratainen, Umbelliferonen, Cyaninen und Merocyaninen besteht.

13. Verfahren nach Anspruch 9, worin die ersten und zweiten Zellen unterschiedliche an sie gebundene fluoreszierende Marker aufweisen.

14. Verfahren nach Anspruch 9, worin die ersten Zellen markiert sind und die Bestimmung Emission und Lichtstreuung beinhaltet.

15. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Probe eine Blutprobe ist und die spektroskopische Bestimmung das Bestrahlen mindestens eines Teils des Mediums mit Licht, worin das Medium kontinuierlich ist und die Zellen in dem kontinuierlichen Medium suspendiert sind, und das Bestimmen von Populationen von Zellen mit elektromagnetischen Signalen, die von Schwellenwerten verschieden sind, umfaßt; und

das Inbeziehungsetzen der Populationen zur Anwesenheit des Antikörpers.