CH637770A5 - Zur durchfuehrung von immunoassays sowie zur abtrennung eines antikoerper/antigen-komplexes aus einer fluessigkeitsprobe geeignetes reagenz sowie verwendung dieses reagenzes. - Google Patents
Zur durchfuehrung von immunoassays sowie zur abtrennung eines antikoerper/antigen-komplexes aus einer fluessigkeitsprobe geeignetes reagenz sowie verwendung dieses reagenzes. Download PDFInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein zur Durchführung von Immunoassays sowie zur Abtrennung eines Antikörper/Antigen- 55 Komplexes aus einer Flüsigkeitsprobe geeignetes Reagenz sowie die Verwendung dieses Reagenzes zum Nachweis oder zur Bestimmung von Antikörpern, Antigenen und Antikörper/ Antigen-Komplexen in einer Flüssigkeit, beispielsweise von Harn oder Serum, sowie zum Abtrennen der genannten Kom- 60 plexe aus der Flüssigkeit.
Der Einfachheit halber werden im folgenden die Symbole «Ak», «Ag» und «Ak/Ag» für «Antikörper», «Antigen» bzw. «Antikörper/Antigen-Komplex» benutzt.
Bekanntlich ist es wichtig, dass man biologische Fluide auf 65 Ak, Ag und Ak/Ag-Komplexe analysiert. So sind beispielsweise viele Krankheiten durch die Abwesenheit von Ak/Ag-Komplexen im Kreislauf gekennzeichnet. Bei dem Ag kann es sich um eine grosse Vielfalt von Proteinen handeln, und zwar einschliesslich von solchen Proteinen, die auf die Gegenwart von Bakterien oder Viren zurückzuführen sind, oder von solchen Proteinen, die von menschlichen Geweben oder Krebszellen freigesetzt sind. Die Ak sind natürlich für das besondere Ag spezifisch, und es handelt sich vorwiegend um Immunglobuline der Klasse IgG, die durch das Lymphsystem des Lebewesens synthetisiert sind. Die Feststellung von Ak/Ag-Komplexen im Blut sowie ihre Trennung und Charakterisierung liefern wertvolle Information, die beispielsweise zur Diagnose von Krankheiten verwendet werden kann.
Zur Feststellung und quantitativen Bestimmung von Ag, Ak und Ak/Ag-Komplexen sind zahlreiche Verfahren bekannt. Dies trifft insbesondere auch für die Bestimmung der Natur und Menge des vorhandenen Ag zu. Die quantitativen Bestimmungsverfahren werden Immunprüfverfahren genannt.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass zwei natürlich vorkommende Substanzen, nämlich rheumatischer Faktor, im folgenden mit RF bezeichnet, und eine besondere Komponente von Komplement, nämlich Clq, die Eigenschaft haben, sich mit Ak/Ag-Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit einem freien Ag oder einem freien Ak. Obwohl es bereits vorgeschlagen wurde (Agnello et al., J. Exp. Med., 134, 228, 1971) diese Eigenschaft in einer besonderen Weise zur Feststellung von Ak/Ag-Komplexen auszunützen (allerdings nicht zur quantitativen Analyse oder absoluten Bestimmung), hat man bisher nicht erkannt, dass RF und Clq potentiell ausserordentlich nützliche Reagenzien bei der Analyse von Ak, Ag und-Ak/AG-Komplexen sind.
Es wurde nun überraschend herausgefunden, dass RF und Clq in unlöslich gemachter Form in einem sehr weiten Bereich einsetzbare Reagenzien bei analytischen Verfahren sind, die Ak, Ag und bzw. oder Ak:Ag-Komplex betreffen. Die Verwendung dieser Reagenzien führt zu einfacheren und genaueren Immunoassays.
RF ist ein bekanntes Material, und Verfahren für seine Gewinnung und Abtrennung sind bekannt. Es ist im Blut einer Anzahl von Tierarten einschliesslich des Menschen vorhanden oder kann darin hervorgerufen werden. Normalerweise gewinnt man es von Ziegen oder Kaninchen durch intradermale Injektionen ihrer eigenen gereinigten Immunglobuline, die vorher durch Erhitzen für zehn Minuten bei etwa 63 °C angehäuft worden sind.'-RF wird dann aus dem Serum, das man von den Tieren erhält, isoliert, indem man das Serum durch eine Säule von Immunglobulinaggregaten leitet, an denen RF zurückgehalten wird. Der rheumatische Faktor kann dann aus der Säule eluiert werden, indem man als Eluierungs-mittel eine Lösung mit einem geeigneten pH-Wert oder einer geeigneten Salzkonzentration verwendet.
Clq ist ein natürlich umlaufendes Protein, und Verfahren zu seiner Abtrennung und Reinigung sind bekannt. Man erhält es im allgemeinen vom Serum des Menschen, Kaninchen oder Rindes, und zwar durch ein Verfahren, das als Euglobulinaus-fällung bekannt und beispielsweise in der Druckschrift J. Immunol., 106,304-413 (1971) beschrieben ist.
Nach der Erfindung werden RF und Clq in unlöslich gemachter Form - in Form eines Latex - als analytische Reagenzien verwendet. Unter «umlöslich gemachtem» RF oder Clq ist hier gemeint, dass RF oder Clq an Latexteilchen als Festphasensubstrat adsorbiert ist.
Die Adsorption an ein Festphasensubstrat kann beispielsweise dadurch bewirkt werden, dass eine Lösung'von RF oder Clq mit der festen Phase in Kontakt gebracht wird.
Es ist bekannt, RF aus dem Serum dadurch zu isolieren, dass das Serum durch eine Säule mit Immunglobulinaggregaten geleitet wird, von denen der rheumatische Faktor zurückgehalten wird. In einer solchen Säule wird RF vorübergehend an den Immunglobulinaggregaten adsorbiert.
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Die unlöslich gemachten RF- und Clq-Reagenzien finden bei biologischen Analysen eine sehr grosse Anzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Diese Anwendungsmöglichkeiten beruhen alle auf der Fähigkeit der Reagenzien, sich mit Ak:Ag-Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit freien Ak und freien Ag. Dadurch ist es möglich, die Reagenzien zum Abtrennen von Ak:Ag-Komplexen zu verwenden, wenn diese Komplexe mit freien Ak und freien Ag als Gemisch vorliegen.
Die Reagenzien der Erfindung können mit besonders grossem Vorteil bei der kontinuierlichen Durchflussanalyse von biologischen Flüssigkeitsproben eingesetzt werden.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden im folgenden als Ausführungsbeispiele verschiedenartige Testverfahren beschrieben, die von einem Reagenz der Erfindung Gebrauch machen.
1. Abtrennung
Das Verfahren zum Abtrennen von Ak:Ag-Komplexen von biologischen (oder anderen) Flüssigkeiten besteht darin, dass die Flüssigkeit mit unlöslich gemachtem RF oder Clq in Form eines Latex in Kontakt gebracht wird. Die in der Flüssigkeit vorhandenen Komplexe werden an das unlöslich gemachte RF oder Clq gebunden, während andere anwesende Stoffe, beispielsweise Ak oder Ag, nicht gebunden werden (oder zumindest nicht in einem beachtlichen Mass). Durch Abtrennen des unlöslich gemachten RF oder Clq aus dem Gemisch werden die an RF oder Clq gebundenen Ak:Ag-Komplex ebenfalls abgetrennt. Sie können dann, sofern es erwünscht ist, mit einem geeigneten Puffer mit einer geeigneten Salzkonzentration und einem geeigneten pH-Wert aus dem unlöslichen RF oder Clq herausgewaschen werden. Auf diese Weise erhält man eine verhältnismässig konzentrierte Lösung des Komplexes bzw. der Komplexe.
Dieses Verfahren kann man in einfacher Weise durchführen, indem man eine Säule verwendet, die den Latex mit unlöslich gemachtem RF oder Clq enthält. Das Serum oder eine andere Probe, die einen Ak:Ag-Komplex aufweist, wird durch die Säule geleitet, und der Komplex wird darin an RF oder Clq gebunden und damit zurückgehalten. Der Komplex kann dann eluiert bzw. ausgespült werden, beispielsweise unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen (1- bis 3molar) von Ammoniumrhodanid.
Anstelle der Verwendung einer Säule kann man den Latex mit den RF oder Clq aufweisenden Teilchen auch einfach mit der Testflüssigkeit mischen, beispielsweise in einem Kolben, und anschliessend durch Zentrifugieren oder Filtrieren eine Abtrennung vornehmen.
Die Abtrennungsverfahren sind nicht nur für Ak/Ag-Komplexe verwendbar, sondern auch indirekt zum Abtrennen besonderer Ak oder Ag aus Lösungen. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, ein Antigen Ag' aus einer Lösung abzutrennen, kann man den spezifischen Antikörper Ak' im Überschuss zugeben, um den Komplex Ak'Ag' zu bilden, der dann unter Verwendung eines Reagenzes nach der Erfindung abgetrennt werden kann. Wenn die ursprüngliche Lösung einen Ak/Ag-Komplex enthält, muss dieser im allgemeinen zunächst durch eine Vorbehandlung abgetrennt werden, bevor der spezifische Antikörper Ak' zugegeben wird.
Ein besonderes Merkmal dieser Abtrennungsverfahren besteht darin, dass sie sehr effizient durchgeführt werden können und auf diese Weise die Ansammlung und Konzentration von Ak/Ag-Komplexen aus äusserst verdünnten Lösungen gestatten. Dies ist ein sehr wichtiger Vorteil, da es durchaus nicht selten vorkommt, dass sich die Komplexe in sehr schwachen Konzentrationen in Seren oder anderen biologischen Flüssigkeiten befinden. Mit den bekannten Verfahren ist es äusserst schwierig, bei solchen schwachen Konzentrationen die Komplexe zu trennen.
2. Trennungsnachweis und quantitative Bestimmung a) Dieser Test umfasst die selektive Entfernung von Ak/Ag-Komplexen aus einer biologischen Flüssigkeit durch Inkontaktbringen der Flüssigkeit mit unlöslich gemachtem RF oder Clq (wie oben beschrieben) und anschliessendem Nachweis der Komplexe. So wird beispielsweise eine Serumprobe behandelt, um irgendwelche darin befindliche Ak/Ag-Kom-plexe abzutrennen, indem sie an unlöslich gemachtes RF oder Clq verbunden werden. Die auf diese Weise gebundenen Komplexe werden dann vom RF oder Clq befreit und nachgewiesen, indem man beispielsweise lösliches RF oder Clq verwendet. Wenn rote Blutzellen (oder mit Immunglobulin überzogene Teilchen) lösliches RF oder Clq berühren, beginnt das Auftreten einer Agglutination. Wenn allerdings auch ein-Ak/Ag-Komplex in der Lösung vorhanden ist, reagiert dieser Komplex mit dem RF ode Clq verhältnismässig schneller, und RF oder Clq werden in Lösung an den Ak/Ag-Komplex gebunden. Das Ergebnis davon ist, dass keine Agglutination der überzogenen Teilchen (oder roten Blutzellen) auftritt. Das Vorhandensein von Ak/Ag-Komplexen in einer Flüssigkeit kann man somit beispielsweise dadurch nachweisen, dass das Serum mit (löslichem) RF und Clq und mit Teilchen in Berührung gebracht wird, die mit Immunglobulin überzogen sind. Falls eine Agglutination beobachtet wird, enthält das Serum keine Ak/Ag-Komplexe.
b) Dieser Test kann auch zum Nachweis des Vorhandenseins eines besonderen Ak oder Ag in einer Probe nützlich sein. Wenn beispielsweise der Test im Hinblick auf ein besonderes Antigen Ag' durchgeführt werden soll, wird dem Serum zunächst der geeignete spezifische Antikörper Ak' zugegeben, und anschliessend wird das Gemisch mit einem Reagenz der Erfindung in Berührung gebracht, um irgendwelche darin enthaltenen Komplexe abzutrennen. Das Vorhandensein von irgendwelchen dieser Komplexe kann dann nachgewiesen werden, wie es oben unter (a) beschrieben ist. Falls die Serumprobe ursprünglich andere Ak/Ag-Komplexe enthält, müssen diese vor der Zugabe des Ak' entfernt werden.
c) Ein anderes Nachweisverfahren umfasst den Wettbewerb zwischen zwei Ak/Ag-Komplexen im Hinblick auf eine begrenzte Menge von RF oder Clq. Wenn dann beispielsweise ein Überschuss eines markierten Ak/Ag-Komplexes einer begrenzten Menge von Latex mit unlöslich gemachtem RF oder Clq zugegeben wird, wird sämtliches RF oder Clq an den Komplex gebunden. Wenn zusätzlich zu dem markierten Komplex eine Serumprobe zugegeben wird, die einen nicht markierten Ak/Ag-Komplex enthält, kommt es zwischen dem markierten und dem nicht markierten Komplex auf einer molaren Basis zu einem Wettbewerb um die begrenzte Menge an RF oder Clq. Wenn nach Erreichen des Gleichgewichts der RF oder Clq zusammen mit den gebundenen Komplexen entfernt wird, zeigt das Vorhandensein (oder das Vorhandensein einer besonderen Minimummenge) an markiertem Komplex in der verbleibenden Lösung an, dass die Serumprobe einen Ak/Ag-Komplex enthalten hat. Dieses Verfahren kann man zur quantitativen Bestimmung anwenden, um die Menge des Komplexes in der Serumprobe zu messen.
Darüber hinaus kann man dieses Verfahren auch anwenden, um das Vorhandensein eines besonderen Ag oder Ak nachzuweisen.
d) Ein weiteres Nachweisverfahren (das zur quantitativen Bestimmung herangezogen werden kann) eignet sich insbesondere für ein besonderes Ag oder Ak. Wenn beispielsweise festgestellt werden soll, ob eine Serumprobe ein besonderes Antigen Ag' enthält, wird der spezifische Antikörper Ak' zubereitet und beispielsweise mit einem Enzym markiert. Der markierte Ak' wird dann mit dem Latex mit unlöslich gemachtem RF oder Clq gemischt, und die Serumprobe wird zugegeben. Der unlöslich gemachte RF oder Clq (mit den anhaftenden
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Ak'/Ag'-Komplexen) wird dann abgetrennt, und die verbleibende Flüssigkeit wird auf das Vorhandensein (oder die Menge) von darin befindlichem, markiertem Ak' untersucht. Wenn das gewonnene Ergebnis weniger als der ursprünglich zugegebenen Menge entspricht, muss das spezifische Antigen Ag' in der Serumprobe vorhanden gewesen sein. Die Anwesenheit (oder Abwesenheit) eines spezifischen Ag, beispielsweise IgE, in einem Serum kann man beispielsweise wie folgt nachweisen. Anti-IgE-Antikörper, die mit Katalase markiert sind, werden dem Latex mit unlöslich gemachtem RF oder Clq in einer Menge zugegeben, die die Menge übersteigt, die zum Komplexieren mit irgendeinem IgE in der zu untersuchenden Probe erforderlich ist. Die Serumprobe wird dann zugegeben, und das Gemisch wird inkubiert. Nach der Abtrennung des unlöslich gemachten RF oder Clq (das mit sich irgendwelche gebildeten IgE/Anti-IgE-Komplexe trägt), wird die restliche enzymatische Aktivität der verbleibenden Flüssigkeit gemessen. Wenn IgE in der Serumprobe vorhanden ist, ist diese restliche enzymastische Aktivität geringer als die ursprüngliche Aktivität der zugeführten Anti-IgE-Antikörper, da einige dieser zuletzt genannten Antikörper mit dem IgE in dem Serum komplexiert und mit dem unlöslich gemachten RF entfernt worden sind. Dieses Verfahren kann man zur quantitativen Bestimmung einsetzten, um die Menge des IgE in dem Serum zu bestimmen.
Ein weiteres Beispiel für dieses allgemeine Verfahren betrifft die Bestimmung des Antigens Morphin. Bei diesem Verfahren wird Morphin durch ein Enzym, beispielsweise Amylase, markiert. Spezifische Anti-Morphin-Antikörper Ak" werden zubereitet. Die auf Morphin zu überprüfende Probe aus einem Serum oder Harn werden mit den Ak" gemischt. Irgendein vorkommendes Morphin bildet mit den Ak" einen Komplex. Dann wird das durch das Enzym markierte Morphin zugegeben. Dieses ist lediglich in der Lage, mit den Ak" entsprechend der Konzentration des Morphins im Serum oder Harn zu komplexieren.
Unlöslich gemachtes RF oder Clq in Form von Latex wird zugegeben, um die Ak/Ag-Komplexe zu absorbieren, die zwischen dem Ak" und dem Morphin in dem Serum und zwischen dem Ak" und dem markierten Morphin gebildet werden. Der unlöslich gemachte RF oder Clq (der diese Komplex mit sich trägt) wird dann aus der Lösung entfernt. Das markierte Morphin verbleibt in der Lösung, und durch Messen seiner enzymatischen Aktivität ist es möglich, festzustellen, ob die ursprüngliche Serumprobe Morphin enthalten hat oder nicht. Gegebenenfalls kann man weiterhin feststellen, wieviel Morphin vorhanden war.
Obwohl sich das beschriebene Beispiel lediglich auf Morphin bezieht, kann man das gleiche Verfahren zum Bestimmen von anderen Antigenen und mutatis mutandis Antikörper verwenden. Die Markierung braucht nicht auf einem Enzym zu beruhen.
e) Die Reagenzien der Erfindung sind auch für nephelo-metrische Immunoassays nützlich, insbesondere wenn es gilt, die Empfindlichkeit der Assays zu verbessern. Die Verwendung von unlöslich gemachtem RF und Clq hat in einem hohen Masse das Verfahren der nephelometrischen Inhibi-tionsimmunoassays erleichtert, bei denen die Restaktivität von Ak nach Absorption mit dem zu bestimmenden Ag gemessen wird. Bei diesem Verfahren wird beispielsweise zum Messen von ai-Fetusprotein das Serum mit einem Anti-ai-Fetuspro-tein-Antiserum gemischt. Die gebildeten Ak/Ag-Komplexe liegen in einer so niedrigen Konzentration vor, dass sie durch Zentrifugieren nicht abgetrennt werden können. Unlöslich gemachtes RF oder Clq in Form von Latex wird benutzt, um dieses Komplexe zu binden und sie aus der Lösung zu entfernen. Die in der Lösung frei verbleibenden Ak werden dann mit ai-Fetusprotein gemischt, und die Teilchendichte der
Lösung, die von der Restkonzentration der Ak abhängt, wird durch Nephelometrie gemessen.
3. Charakterisierung s Viele der oben beschriebenen Verfahren, bei denen unlöslich gemachtes RF oder Clq verwendet wird, können zur Vorbereitung der Charakterisierung von Ak, Ag oder Ak/Ag-Komplexen angewandt werden. Einige der Verfahren führen direkt zu einer Identifizierung von beispielsweise einem io besonderen Ak oder Ag. Dabei handelt es sich beispielsweise um solche Verfahren, bei denen die Gegenwart eines besonderen Ak vermutet wird und dies dann auch durch Zugabe des besonderen Ag bestätigt und das Vorhandensein des Ak/Ag-Komplexes bestimmt wird. Die Reagenzien der Erfin-15 dung sind bei der Charakterisierung der Ak, Ag und Ak/Ag-Komplexe äusserst nützliche Reagenzien. Dazu wird auf die folgenden Ausführungen verwiesen.
Die Identifizierung (d.h. Charakterisierung) eines Antigens wird im allgemeinen mit verschiedenartigen Verfahren vorge-20 nommen, beispielsweise durch Spektrofotometrie, um das Vorhandensein einer Nucleinsäure festzustellen, durch Elektronenmikroskopie, um Viren zu identifizieren, und durch Immunfluoreszenz mit spezifischen Antiseren, die gegen Virus- oder Gewebeantigene gerichtet sind. Das zuletzt 25 genannte Verfahren kann mit unlöslich gemachtem RF oder Clq und daran gebundenen Ak:Ag-Komplexen durchgeführt werden, d.h. der Komplex braucht zuerst nicht entfernt zu werden.
Für gewisse Anwendungen ist es zweckmässig, das unlös-30 lieh gemachte RF oder Clq zu markieren, und zwar beispiels- . weise mit J125, einem Fluoreszenzstoff, einem Enzym oder einem Coenzym (NADH).
Unlöslich gemachtes RF und Clq vereinigen sich nicht nur mit Ak:Ag-Komplexen, sondern auch mit Immunglobulin-35 Aggregaten. Diese Tatsache sollte man bei der Ausführung der oben beschriebenen Verfahren im Gedächtnis behalten. Im-munglobulinaggregate kann man beispielsweise mit radioaktivem Jod oder einem Fluorchrom kenntlich machen, und man kann sie bei den oben beschriebenen analytischen Verfahren 40 anstelle der markierten Ak:Ag-Komplexe verwenden.
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgenden Beispiele Bezug genommen.
Beispiel 1
45 Adsorption von RF oder Clq an eine feste Phase
4,0 mg RF wurden auf 200 mg Latexteilchen von 0,8 |i Teilchengrösse in einer Carbonatpufferlösung mit einem pH-Wert von 8,4 adsorbiert. Die Teilchen wurden dann mit einer 0,l%igen Rinderalbuminlösung gewaschen, um eine weitere so Adsorption zu blockieren. Der zur Bindung von Ak:Ag-Komplexen verwendbare Latex mit an die Latexteilchen adsorbiertem RF enthält beispielsweise 100000 Teilchen/ml.
Beispiel 2
55 Herstellung von markiertem RF oder Clq
200 ml von 50mmolarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 wurden 100 fj.g RF (oder Clq) zugegeben.
Das Gemisch wurde in 20-jxI-Aliquote aufgeteilt, und jedem aliquoten Teil wurden 10 |iC J125 und danach 50 (ig 60 Chloramin-T zugesetzt. Für 30 s wurde ein Fortschreiten der Oxydation zugelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 50 |il einer wässrigen Natriummetabisulfitlösung mit 50 (ig Salz unterbrochen.
Markierter RF (oder Clq) wurde dann von dem J125 abge-65 trennt, indem das oben beschriebene Gemisch über eine Säule aus Sephadex G25 geleitet wurde und das gewünschte markierte Material mit dem oben angegebenen Phosphatpuffer ausgewaschen wurde. Die Eluatfraktionen wurden auf y-
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Aktivität überprüft, und die Fraktionen mit einer Spitzenakti- Die vermischten Lösungen wurden bei 37 °C für 10 min vität wurden zusammengebracht, verschlossen und bis zur inkubiert. Die sich bei 520 m Li entwickelnde Farbe wurde
Verwendung eingefroren. kolorimetrisch festgestellt. Die Konzentration des Tetanusano-
toxins war der Peroxidaseaktivität umgekehrt proportional
Beispiel 3 s und konnte mit Hilfe einer Eichkurve errechnet werden, die
Trennung eines Ak:Ag-Komplexes zuvor mit Lösungen aus einem kenntlich gemachten Antikör-
100 [xl von unlöslich gemachtem RF, zubereitet entspre- per erstellt worden war.
chend dem Beispiel 1, wurden zu 100 |il einer Probe zugegeben, die einen natürlich vorkommenden Ak:Ag-Komplex im Beispiel 5
Serum enthielt. Das Gemisch wurde Vi h bei Raumtemperatur io Verwendung von unlöslich gemachtem RF in einem nach dem geschüttelt und dann 5 min bei 3000 g zentrifugiert. Es wurde kontinuierlichen Durchflussprinzip arbeitenden Analysenge-
festgestellt, dass der Ak:Ag-Komplex aus der flüssigen Phase rät entfernt worden und an dies feste Phase gebunden war. In einem nach dem kontinuierlichen Durchflussprinzip arbeitenden Analysengerät wurde eine zu untersuchende
Beispiel 4 15 Probe mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/min angesaugt
Bestimmung von Tetanusanotoxin + IgG und mit einem Strom mit einem Durchfluss von 0,4 ml/min
Kaninchenantikörper zum Tetanusanotoxin wurden mit von Kaninchenantiserum gegen HPL (Verdünnung 1:2000)
Peroxidase markiert, und zwar unter Anwendung des in zusammengeführt. Dieser Stom wurde mit einem Strom aus
Nature, 219, 186 (1968), von Miles und Haies beschriebenen J125 HPL mit einem Durchfluss von 0,4 ml/min vereint. Die
Verfahrens. 20 vermischten Ströme wurden bei 37 °C durch eine Mischspule
Zu 100 ul des Serums das die Tetanusanotoxin-Ak:Ag- mit einer Verzögerungszeit von 10 min geleitet, und das
Komplexe enthalten sollte, wurde eine solche Menge markier- Gemisch wurde dann mit einem Strom von 0,3 ml/min aus ter Ak-Lösung zugegeben, die ausreicht, um 10 mg IgG zu ent- RF/Latex-Material zusammengeführt, das gemäss Beispiel 1
halten. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4 °C geschüttelt. hergestellt worden war und 100000 Teilchen/ml enthielt.
100 ul von unlöslich gemachtem RF, hergestellt entsprechend 25 Der vermischte Strom wurde erneut bei 37 °C 10 min wär-
dem Beispiel 1, wurden der erhaltenen Lösung zugesetzt. Das mebehandelt. Beim Austritt aus dem Wärmebad wurden die Gemisch wurde bei Raumtemperatur Vi h geschüttelt und dann Latexteilchen von dem Strom abgetrennt und unter Heranzie-
bei 3000 g 5 min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit hung irgendeines üblichen Verfahrens, wie es beispielsweise wurde mit einer Pasteur-Pipette entfernt und in ein getrenntes bei automatischen Blutgruppenuntersuchungsgeräten benutzt
Röhrchen gegeben, das 1 ml einer wässrigen Lösung mit 100 30 wird zum Abfluss abgesaugt.
mg Phenol, 30 mg 4-Aminophanzon und 300 |il 30 %iges H2O2 Der Strom wurde anschliessend durch einen Gammazähler auf 100 ml enthielt. geleitet und der Restzählwert festgestellt. Der Zähl wert ist der
Konzentration von HPL umgekehrt proportional.
Claims (7)
- 637 7702PATENTANSPRÜCHE1. Zur Durchführung von Immunoassays sowie zur Abtrennung eines Antikörper/Antigen-Komplexes aus einer Flüssigkeitsprobe geeignetes Reagenz, bestehend aus einem Latex, dessen Teilchen Rheumafaktor oder C1 q absorbiert 5 enthalten.
- 2. Reagenz nach Ansprüch 1, dadurch gekennzeichnet,dass der Rheumafaktor oder das Clq mit einem zur Identifizierung geeigneten Atom oder Molekül chemisch markiert ist.
- 3. Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, io dass die Markierung ein radioaktives Atom, ein Enzym oder ein Coenzym ist.
- 4. Verwendung eines Reagenzes nach Anspruch 1 zum Nachweis und bzw. oder zur Bestimmung eines Antikörpers, Antigens oder Antikörper/Antigen-Komplexes in einer Flüs- is sigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe ggf. nach Zusatz eines in bezug auf den Antikörper oder das. Antigen in der Probe spezifischen Antigens bzw. Antikörpers mit dem Reagenz in Berührung bringt, wobei der unlöslich gemachte Rheumafaktor oder das Clq mit in dem Gemisch 20 vorhandenen Antikörper/Antigen-Komplexen reagiert.
- 5. Verwendung gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das Verfahren nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses durchführt.
- 6. Verwendung eines Reagenzes nach Anspruch 1 zum 25 Nachweis und bzw. oder zur Bestimmung eines bestimmten Antikörpers, Antigens oder Antikörper/Antigen-Komplexes in einer Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Probe mit einer bestimmten Menge eines für den zu bestimmenden Antikörper oder das zu bestimmende Antigen 30 spezifischen Antigens bzw. Antikörpers oder mit einer Menge des zu bestimmenden Antikörper/Antigen-Komplexes versetzt, die jeweils mit einem zur Identifizierung geeigneten Atom oder Molekül chemisch markiert ist;b) das Gemisch mit dem Reagenz in Berührung bringt, um 35 den Komplex an das Reagenz zu binden ;c) das Reagenz mit dem daran gebundenen Komplex aus dem Gemisch abtrennt und d) aufgrund der Markierung die Menge an markiertem Antikörper, Antigen bzw. Antikörper/Antigen-Komplex, die 40 in dem Gemisch verblieben oder, an das Reagenz gebunden, abgetrennt worden ist, misst, und dadurch das Vorhandensein und die Menge an Antikörper, Antigen bzw. Antikörper/ Antigen-Komplex in der Ursprungsprobe bestimmt.
- 7. Verwendung eines Reagenzes nach Anspruch 1 zum 45 Abtrennen eines Antikörper/Antigen-Komplexes aus einer Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit dem Reagenz versetzt und das Reagenz mit dem daran gebundenen Komplex aus der Probe abtrennt.50
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