CH631015A5 - Verfahren zur herstellung eines reagenzes zum nachweis oder zur bestimmung von antikoerpern, antigenen und antikoerper/antigen-komplexen in einer fluessigkeit. - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines reagenzes zum nachweis oder zur bestimmung von antikoerpern, antigenen und antikoerper/antigen-komplexen in einer fluessigkeit. Download PDF

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines für Immunoassays geeigneten Reagenzes sowie auf die Verwendung dieses Reagenzes zum Nachweis oder zur Bestimmung von Antikörpern, Antigenen und Antikörper/Anti-3 gen-Komplexen in biologischer Flüssigkeiten, beispielsweise Harn oder Serum. Das erfindungsgemäss hergestellte Reagenz könnte auch zur Abtrennung von Antikörper/Antigen-Komple-xen aus Flüssigkeiten verwendet werden.
Der Einfachheit halber werden im folgenden die Symbole 10 «ak», «Ag» und «Ak/Ag» für «Antikörper», «Antigen» bzw. «Antikörper/Antigen-Komplex» benutzt.
Bekanntlich ist es wichtig, dass man biologische Flüssigkeiten auf Ak, Ag und Ak/Ag-Komplexe analysiert. So sind beispielsweise viele Krankheiten durch die Anwesenheit von Ak/ 's Ag-Komplexen im Kreislauf gekennzeichnet. Bei dem Ag kann es sich um eine grosse Vielfalt von Proteinen handeln, und zwar einschliesslich von solchen Proteinen, die auf die Gegenwart von Bakterien oder Viren zurückzuführen sind, oder von solchen Proteinen, die von menschlichen Geweben oder Krebs-20 zellen freigesetzt sind. Die Ak sind natürlich für das besondere Ag spezifisch, und es handelt sich vorwiegend um Immunglobuline der Klasse IgG, die durch das Lymphsystem des Lebewesens synthetisiert sind. Die Feststellung von Ak/Ag-Komplexen im Blut sowie ihre Trennung und Charakterisierung liefern 25 wertvolle Information, die beispielsweise zur Diagnose von Krankheiten verwendet werden kann.
Zur Feststellung und quantitativen Bestimmung von Ag, Ak und Ak/Ag-Komplexen sind zahlreiche Verfahren bekannt.
Dies trifft insbesondere auch für die Bestimmung der Natur 30 und Menge des vorhandenen Ag zu. Die quantitativen Bestimmungsverfahren werden Immunprüfverfahren (Immunoassays) genannt.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass zwei natürlich vorkommende Substanzen, nämlich rheumatischer Faktor, im folgen-35 den mit RF bezeichnet, und eine besondere Komponente von Komplement, nämlich Clq, die Eigenschaft haben, sich mit Ak/ Ag-Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit einem freien Ag oder einem freien Ak. Obwohl es bereits vorgeschlagen wurde (Agnello et al., J. Exp. Med., 134,228,1971), diese Eigenschaft in 4o einer besonderen Weise zur Feststellung von Ak/Ag-Komplexen auszunutzen (allerdings nicht zur quantitativen Analyse oder absoluten Bestimmung), hat man bisher nicht erkannt,
dass RF und Clq potentiell ausserordentlich nützliche Reagenzien bei der Analyse von Ak, Ag und Ak/Ag-Komplexen sind. 45 Es wurde nun überraschend herausgefunden, dass RF und Clq in unlöslich gemachter Form in einem sehr weiten Bereich einsetzbare Reagenzien bei analytischen Verfahren sind, die Ak, Ag und bzw. oder Ak/Ag-Komplexe betreffen. Die Verwendung dieser Reagenzien führt zu einfacheren und genaueren 50 Immunoassays.
RF ist ein bekanntes Material, und Verfahren für seine Gewinnung und Trennung sind bekannt. Es ist im Blut einer Anzahl von Tierarten einschliesslich des Menschen vorhanden oder kann darin hervorgerufen werden. Normalerweise 55 gewinnt man es von Ziegen oder Kaninchen durch intradermale Injektionen ihrer eigenen gereinigten Immunglobuline, die vorher durch Erhitzen für zehn Minuten bei etwa 63 °C angehäuft worden sind. RF wird dann aus dem Serum, das man von den Tieren erhält, isoliert, indem man das Serum durch eine 60 Säule von Immunglobulinaggregaten leitet, an denen RF zurückgehalten wird. Der rheumatische Faktor kann dann aus der Säule eluiert werden, indem man als Eluierungsmittel eine Lösung mit einem geeigneten pH-Wert oder einer geeigneten Salzkonzentration verwendet.
65 Clq ist ein natürlich umlaufendes Protein, und Verfahren zu seiner Trennung und Reinigung sind bekannt. Man erhält es im allgemeinen vom Serum des Menschen, Kaninchen oder Rindes, und zwar durch ein Verfahren, das als Euglobulinausfällung
bekannt und beispielsweise in der Druckschrift J. Immunol., 106,304-413 (1971) beschrieben ist.
Nach der Erfindung werden RF und Clq unlöslich gemacht und in unlöslich gemachter Form als analytische Reagenzien verwendet. Unter «unlöslich gemachtem» RF und Clq ist hier gemeint, dass RF oder Clq kovalent an ein Festphasensubstrat gebunden ist, das in wässrigen Fluiden unlöslich ist.
Die Unlöslichmachung von RF und Clq kann man durch kovalentes Binden von RF oder Clq direkt oder indirekt an eine feste Phase bewirken. Die allgemein bekannten und verwendeten Verfahren zum kovalenten Kuppeln von Proteinen an unlösliche Substrate kann man zur Unlöslichmachung von RF und Clq verwenden. Die Festphasensubstrate müssen für die Kupplungsreaktion eine oder mehrere reaktionsfähige Gruppen enthalten, beispielsweise Amino- oder Carboxyl-Gruppen (carbonsaure Gruppen). Geeignete Festphasensubstrate enthalten natürlich vorkommende Materialien, beispielsweise Immunglobulinaggregate und synthetische Materialien, beispielsweise aminierte Agarose.
In einigen Fällen kann man RF oder Clq direkt an die feste Phase kovalent binden, wenn es sich beispielsweise bei der festen Phase um Nylon, Agarose, Cellulose, Acrylamid oder Acrylpolymere, Polystryol oder verschiedene Glaszubereitungen handelt. Im allgemeinen wird es allerdings bevorzugt, RF oder Clq an die feste Phase unter Verwendung einer Brückensubstanz zu binden, beispielsweise unter Verwendung von Glu-taraldehyd. Ein nach der Erfindung hergestelltes bevorzugtes Reagenz ist durch eine Glutaraldehydbrücke an aminierte Agarose kovalent gebundenes RF oder Clq.
Es wird im allgemeinen bevorzugt, dass die nach der Erfindung hergestellten Reagenzien aus Einzelteilchen bestehen oder in körniger oder granulierter Form vorliegen, beispielsweise als Kügelchen aus aminierter Agarose mit einem Überzug aus RF oder Clq. Bei einigen Anwendungsfällen, beispielsweise bei der kontinuierlichen Durchflussanalyse, ist es allerdings von Vorteil, die Reagenzien als einen Überzug auszubilden, der mindestens über einen Teil der inneren Oberfläche eines Rohres oder Schlauches geht, so dass das durch das Rohr geleitete Reaktionsmittel mit dem Reagenzienüberzug in Berührung kommt.
Es ist bekannt, RF aus dem Serum dadurch zu isolieren, dass das Serum durch eine Säule mit Immunglobulinaggregaten geleitet wird, von denen der rheumatische Faktor zurückgehalten wird. In einer solchen Säule wird RF vorübergehend an den Immunglobulinaggregaten adsorbiert und nicht kovalent gebunden.
Die unlöslich gemachten RF- und Clq-Reagenzien finden bei biologischen Analysen eine sehr grosse Anzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Diese Anwendungsmöglichkeiten beruhen alle auf der Fähigkeit der Reagenzien, sich mit Ak/Ag-Komplexen zu vereinigen, jedoch nicht mit freien Ak und freien Ag. Dadurch ist es möglich, die Reagenzien zum Abtrennen von Ak/Ag-Komplexen zu verwenden, wenn diese Komplexe mit freien Ak und freien Ag als Gemisch vorliegen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Reagenzien können mit besonders grossem Vorteil bei der kontinuierlichen Durchflussanalyse von biologischen Flüssigkeitsproben eingesetzt werden.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden im folgenden verschiedenartige Testverfahren beschrieben, die von einem nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellten Reagenz Gebrauch machen.
1. Trennung
Das Verfahren zum Abtrennen von Ak/Ag-Komplexen von biologischen (oder anderen) Flüssigkeiten besteht darin, dass die Flüssigkeit mit unlöslich gemachtem RF oder Clq in Kontakt gebracht wird. Die in der Flüssigkeit vorhandenen Kom631 015
plexe werden an das unlöslich gemachte RF oder Clq gebunden, während andere anwesende Stoffe, beispielsweise Ak oder Ag, nicht gebunden werden (oder zumindest nicht in einem beachtlichen Mass). Durch Abtrennen des unlöslich gemachten RF oder Clq aus dem Gemisch werden die an RF oder Clq gebundenen Ak/Ag-Komplexe ebenfalls abgetrennt. Sie können dann, sofern es erwünscht ist, mit einem geeigneten Puffer mit einer geeigneten Salzkonzentration und einem geeigneten pH-Wert aus dem unlöslichen RF oder Clq herausgewaschen werden. Auf diese Weise erhält man eine verhältnismässig konzentrierte Lösung des Komplexes bzw. der Komplexe.
Dieses Verfahren kann man in einfacher Weise durchführen, indem man eine Säule verwendet, die unlöslich gemachtes RF oder Clq enthält. Das Serum oder ein andere Probe, die einen Ak/Ag-Komplex aufweist, wird durch die Säule geleitet, und der Komplex wird darin an RF oder Clq gebunden und damit zurückgehalten. Der Komplex kann dann eluiert bzw. ausgespült werden. Bei einem typischen Verfahren wird eine Mikrosäule verwendet, die Kügelchen aus aminierter Agarose enthält, an die RF oder Clq mit Glutaraldehyd gebunden ist. Das Serum wird durch die Säule geleitet, und die zurückgehaltenen Ak/Ag-Komplexe werden anschliessend eluiert, beispielsweise unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen (1-molar bis 3-molar) von Ammoniumrhodanid.
Anstelle der Verwendung einer Säule kann man unlöslich gemachtes RF oder Clq auch einfach mit der Testflüssigkeit mischen, beispielsweise in einem Kolben, und anschliessend durch Zentrifugieren oder Filtrieren eine Trennung vornehmen.
Die Trennverfahren sind nicht nur für Ak/Ag-Komplexe verwendbar, sondern auch indirekt zum Abtrennen besonderer Ak oder Ag aus Lösungen. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, ein Antigen Ag' aus einer Lösung abzutrennen, kann man den spezifischen Antikörper Ak' im Überschuss zugeben, um den Komplex Ak'/Ag' zu bilden, der dann unter Verwendung eines nach dem Verfahren gemäss der Erfindung hergestellten Reagenzes abgetrennt werden kann. Wenn die ursprüngliche Lösung einen Ak/Ag-Komplex enthält, muss dieser im allgemeinen zunächst durch eine Vorbehandlung aufgetrennt werden, bevor der spezifische Antikörper Ak' zugegeben wird.
Ein besonderes Merkmal dieser Trennverfahren besteht darin, dass sie sehr effizient durchgeführt werden können und auf diese Weise die Ansammlung und Konzentration von Ak/ Ag-Komplexen aus äusserst verdünnten Lösungen gestatten. Dies ist ein sehr wichtiger Vorteil, da es durchaus nicht selten vorkommt, dass sich die Komplexe in sehr schwachen Konzentrationen in Seren oder anderen biologischen Flüssigkeiten befinden. Mit den bekannten Verfahren ist es äusserst schwierig, bei solchen schwachen Konzentrationen die Komplexe zu trennen.
2. Trennungsnachweis und quantitative Bestimmung
(a) Dieser Test umfasst die selektive Entfernung von Ak/Ag-Komplexen aus einer biologischen Flüssigkeit durch Inkontakt-bringen der Flüssigkeit mit unlöslich gemachtem RF oder Clq (wie oben beschrieben) und anschliessendem Nachweis der Komplexe. So wird beispielsweise eine Serumprobe behandelt, um irgendwelche darin befindliche Ak/Ag-Komplexe abzutrennen, indem sie an unlöslich gemachtes RF oder Clq gebunden werden. Die auf diese Weise gebundenen Komplexe werden dann vom RF oder Clq befreit und nachgewiesen, indem man beispielsweise lösliches RF oder Clq verwendet. Wenn rote Blutzellen (oder mit Immunglobulin überzogene Teilchen) lösliches RF oder Clq berühren, beginnt das Auftreten einer Agglutination. Wenn allerdings auch ein Ak/Ag-Komplex in der Lösung vorhanden ist, reagiert dieser Komplex mit dem RF oder Clq verhältnismässig schneller und RF und Clq werden in Lösung an den Ak/Ag-Komplex gebunden. Das Ergebnis davon
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ist, dass keine Agglutination der überzogenen Teilchen (oder liehe enzymatische Aktivität geringer als die ursprüngliche roten Blutzellen) auftritt. Das Vorhandensein von Ak/Ag-Kom- Aktivität der zugeführten Anti-IgE-Antikörper, da einige dieser plexen in einer Flüssigkeit kann man somit beispielsweise zuletzt genannten Antikörper mit dem IgE in dem Serum kom-
dadurch nachweisen, dass das Serum mit (löslichem) RF und plexiert und mit den unlöslich gemachten RF entfernt worden Clq und mit Teilchen in Berührung gebracht wird, die mit 5 sind. Dieses Verfahren kann man zur quantitativen Bestimmung Immunglobulin überzogen sind. Falls eine Agglutination beob- einsetzen, um die Menge des IgE in dem Serum zu bestimmen, achtet wird, enthält das Serum keine Ak/Ag-Komplexe. Ein weiteres Beispiel für dieses allgemeine Verfahren
(b) Dieser Test kann auch zum Nachweis des Vorhanden- betrifft die Bestimmung des Antigens Morphin. Bei diesem Ver-seins eines besonderen Ak oder Ag in einer Probe nützlich sein, fahren wird Morphin durch ein Enzym, beispielsweise Amylase, Wenn beispielsweise der Test im Hinblick auf ein besonderes io markiert. Spezifische Anti-Morphin-Antikörper Ak" werden Antigen Ag' durchgeführt werden soll, wird dem Serum zubereitet. Die auf Morphin zu überprüfende Probe aus einem zunächst der geeignete spezifische Antikörper Ak' zugegeben, Serum oder Harn werden mit den Ak" gemischt. Irgendein vor-und anschliessend wird das Gemisch mit einem erfindungsge- kommendes Morphin bildet mit den Ak" einen Komplex. Dann mäss hergestellten Reagenz in Berührung gebracht, um irgend- wird das durch das Enzym markierte Morphin zugegeben. Die-welche darin enthaltenen Komplexe abzutrennen. Das Vorhan-15 ses ist lediglich in der Lage, mit den Ak" entsprechend der densein von irgendwelchen dieser Komplexe kann dann nach- Konzentration des Morphins im Serum oder Harn zu komple-gewiesen werden, wie es oben unter (a) beschrieben ist. Falls xieren.
die Serumprobe ursprünglich andere Ak/Ag-Komplexe enthält, Unlöslich gemachtes RF oder Cl q wird zugegeben, um die müssen diese vor der Zugabe des Ak' entfernt werden. Ak/Ag-Komplexe zu absorbieren, die zwischen dem Ak" und
(c) Ein anderes Nachweisverfahren umfasst den Wettbe- 20 dem Morphin in dem Serum und zwischen dem Ak" und dem werb zwischen zwei Ak/Ag-Komplexen im Hinblick auf eine markierten Morphin gebildet werden. Der unlöslich gemachte begrenzte Menge von RF oder Clq. Wenn dann beispielsweise RF oder Clq (der diese Komplexe mit sich trägt) wird dann aus ein Überschuss eines markierten Ak/Ag-Komplexes einer der Lösung entfernt. Das markierte Morphin verbleibt in der begrenzten Menge von unlöslich gemachtem RF oder Clq Lösung, und durch Messen seiner enzymatischen Aktivität ist zugegeben wird, wird sämtliches RF oder Clq an den Komplex 25 es möglich, festzustellen, ob die ursprüngliche Serumprobe gebunden. Wenn zusätzlich zu dem markierten Komplex eine Morphin enthalten hat oder nicht. Ggfs. kann man weiterhin Serumprobe zugegeben wird, die einen nicht markierten Ak/ feststellen, wieviel Morphin vorhanden war.
Ag-Komplex enthält, kommt es zwischen dem markierten und Obwohl sich das beschriebene Beispiel lediglich auf Mör dern nicht markierten Komplex auf einer molaren Basis zu phin bezieht, kann man das gleiche Verfahren zum Bestimmen einem Wettbewerb um die begrenzte Menge an RF oder Clq. 30 von anderen Antigenen und mutatis mutandis Antikörpern verWenn nach Erreichen des Gleichgewichts der RF oder Clq wenden. Die Markierung braucht nicht auf einem Enzym zu zusammen mit den gebundenen Komplexen entfernt wird, beruhen.
zeigt das Vorhandensein (oder das Vorhandensein einer beson- (e) Die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung herge-deren Minimummenge) an markiertem Komplex in der verblei- stellten Reagenzien sind auch für nephelometrische Immunoas-benden Lösung an, dass die Serumprobe einen Ak/Ag-Komplex 35 says nützlich, insbesondere wenn es gilt, die Empfindlichkeit enthalten hat. Dieses Verfahren kann man zur quantitativen der Assays zu verbessern. Die Verwendung von unlöslich Bestimmung anwenden, um die Menge des Komplexes in der gemachtem RF und Clq hat in einem hohen Masse das Verfah-Serumprobe zu messen. ren der nephelometrischen Inhibitionsimmunoassays erleich-
Darüber hinaus kann man dieses Verfahren auch anwen- tert, bei denen die Restaktivität von Ak nach Absorption mit den, um das Vorhandensein eines besonderen Ag oder Ak 40 dem zu bestimmenden Ag gemessen wird. Bei diesem Verfah-nachzuweisen. ren wird beispielsweise zum Messen von ai-Fetusprotein das
(d) Ein weiteres Nachweisverfahren (das zur quantitativen Serum mit einem Anti-ai-Fetusprotein-Antiserum gemischt. Bestimmung herangezogen werden kann) eignet sich insbeson- Die gebildeten Ak/Ag-Komplexe liegen in einer so niedrigen dere für ein besonderes Ag oder Ak. Wenn beispielsweise fest- Konzentration vor, dass sie durch Zentrifugieren nicht abge-gestellt werden soll, ob eine Serumprobe ein besonderes Anti- 45 trennt werden können. Unlöslich gemachtes RF oder Clq wird gen Ag' enthält, wird der spezifische Antikörper Ak' zuberei- benutzt, um diese Komplexe zu binden und sie aus der Lösung tet und beispielsweise mit einem Enzym markiert. Der mar- zu entfernen. Die in der Lösung frei verbleibenden Ak werden kierte Ak' wird dann mit unlöslich gemachtem RF oder Clq dann mit ai-Fetusprotein gemischt, und die Teilchendichte der gemischt, und die Serumprobe wird zugegeben. Der unlöslich Lösung, die von der Restkonzentration der Ak abhängt, wird gemachte RF oder Clq (mit den anhaftenden Ak'/Ag'-Komple- 50 durch Nephelometrie gemessen.
xen) wird dann abgetrennt, und die verbleibende Flüssigkeit wird auf das Vorhandensein (oder die Menge) von darin befind- 3. Charakterisierung
Iichem, markiertem Ak' untersucht. Wenn das gewonnene Viele der oben beschriebenen Verfahren, bei denen unlös-
Ergebnis weniger als der ursprünglich zugegebenen Menge lieh gemachtes RF oder Clq verwendet wird, können zur Vorentspricht, muss das spezifische Antigen Ag' in der Serum- 55 bereitung der Charakterisierung von Ak, Ag oder Ak/Ag-Kom-probe vorhanden gewesen sein. Die Anwesenheit (oder Abwe- plexen angewandt werden. Einige der Verfahren führen direkt senheit) eines spezifischen Ag, beispielsweise IgE, in einem zu einer Identifizierung von beispielsweise einem besonderen
Serum kann man beispielsweise wie folgt nachweisen. Anti-IgE- Ak oder Ag. Dabei handelt es sich beispielsweise um solche Antikörper, die mit Katalase markiert sind, werden dem unlös- Verfahren, bei denen die Gegenwart eines besonderen Ak verlieh gemachten RF oder Clq (beispielsweise Agarosekügel- 60 mutet wird und dies dann auch durch Zugabe des besonderen chen) in einer Menge zugegeben, die die Menge übersteigt, die Ag bestätigt und das Vorhandensein des Ak/Ag-Komplexes zum Komplexieren mit irgendeinem IgE in der zu untersuchen- bestimmt wird. Die erfindungsgemäss hergestellten Reagen-den Probe erforderlich ist. Die Serumprobe wird dann zugege- zien sind bei der Charakterisierung der Ak, Ag und Ak/Ag-ben, und das Gemisch wird inkubiert. Nach der Abtrennung des Komplexe äusserst nützliche Reagenzien. Dazu wird auf die unlöslich gemachten RF oder Clq (das mit sich irgendwelche 65 folgenden Ausführungen verwiesen.
gebildeten IgE/Anti-IgE-Komplexe trägt) wird die restliche Die Identifizierung (d.h. Charakterisierung eines Antigens enzymatische Aktivität der verbleibenden Flüssigkeit gemes- wird im allgemeinen mit verschiedenartigen Verfahren vorge-sen. Wenn IgE in der Serumprobe vorhanden ist, ist diese rest- nommen, beispielsweise durch Spektrofotometrie, um das Vor-
5
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handensein einer Nukleinsäure festzustellen, durch Elektronenmikroskopie, um Viren zu identifizieren, und durch Immunfluoreszenz mit spezifischen Antiseren, die gegen Virus- oder Gewebeantigene gerichtet sind. Das zuletzt genannte Verfahren kann mit unlöslich gemachtem RF oder Clq (beispielsweise Agarosekügelchen) und daran gebundenen Ak/Ag-Komplexen durchgeführt werden, d.h. der Komplex braucht zuerst nicht entfernt zu werden.
Für gewisse Anwendungen ist es zweckmässig, das unlöslich gemachte RF oder Clq zu markieren, und zwar beispielsweise mit J125, einem Fluoreszenzstoff, einem Enzym oder einem Coenzym (NADH).
Unlöslich gemachtes RF und Clq vereinigen sich nicht nur mit Ak/Ag-Komplexen, sondern auch mit Immunglobulinagre-gaten. Diese Tatsache sollte man bei der Ausführung der oben beschriebenen Verfahren im Gedächnis behalten. Immunglobu-linaggregate kann man beispielsweise mit radioaktivem Jod oder einem Fluorochrom kenntlich machen, und man kann sie bei den oben beschriebenen analytischen Verfahren anstelle der markierten Ak/Ag-Komplexe verwenden.
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgenden Beispiele Bezug genommen.
Beispiel 1
Kupplung von RF oder Clq an eine feste Phase
1 ml einer 25%igen wässrigen Lösung von Glutaraldehyd wurde 5 ml aminierter Agarose (AH-Sepharose) hinzugefügt, die zuvor in einer Salzlösung von 5 ml Carbonatpuffer bei einem pH-Wert von 8,5 gequellt worden war. Das Gemisch wurde für 15 min bei Zimmertemperatur gerührt und dann mit 100 ml Carbonatpuffer gewaschen. Das Gemisch wurde zentri-fugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert, und es wurden weitere 5 ml des Carbonatpuffers den Feststoffen zugegeben. Unter fortwährendem Schütteln wurden 1,25 mg gereinigter RF (oder Clq) und eine hinreichende Menge von Glycin zugegeben, um schliesslich eine 0,2-molare Glycinlösung zu erhalten. Das Schütteln wurde für 10 bis 12 h fortgesetzt. Die feste Phase wurde dann durch Zentrifugieren abgetrennt und mit physiologischer Salzlösung gewaschen.
Beispiel 2
Herstellung von markiertem RF oder Clq
200 ml von 50-mmolarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 wurden 100 |_tg RF (oder Clq) zugegeben.
Das Gemisch wurde in 20-(il-Aliquote aufgeteilt, und jedem aliquoten Teil wurden 10 (iC J125 und danach 50 (ig Chloramin-T s zugesetzt. Für 30 s wurde ein Fortschreiten der Oxidation zugelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 50 jj.1 einer wässrigen Natriummetabisulfitlösung mit 50 p,g Salz unterbrochen.
Markierter RF (oder Clq) wurde dann von dem J125 abge-io trennt, indem das oben beschriebene Gemisch über eine Säule aus Sephadex G25 geleitet wurde und das gewünschte markierte Material mit dem oben angegebenen Phosphatpuffer ausgewaschen wurde. Die Eluatfraktionen wurden auf y-Aktivi-tät überprüft, und die Fraktionen mit einer Spitzenaktivität 15 wurden zusammengebracht, verschlossen und bis zur Verwendung eingefroren.
Beispiel 3
Bestimmung von Tetanusanotoxin + IgG 20 Kaninchenantikörper zum Tetanusanotoxin wurden mit Peroxidase markiert, und zwar unter Anwendung des in Nature, 219,186 (1968), von Miles und Haies beschriebenen Verfahrens.
Zu 100 fxl des Serums, das die Tetanusanotoxin-Ak/Ag-25 Komplexe enthalten sollte, wurde eine solche Menge markierte Ak-Lösung zugegeben, die ausreicht, um 10 mg IgG zu erhalten. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4 °C geschüttelt. 100 jo.1 von unlöslich gemachtem RF, hergestellt entsprechend dem Beispiel 1, wurden der erhaltenen Lösung zugesetzt. Das Gemisch 30 wurde bei Raumtemperatur Vi h geschüttelt und dann bei 3000 g 5 min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einer Pasteur-Pipette entfernt und in ein getrenntes Röhrchen gegeben, das 1 ml einer wässrigen Lösung mit 100 mg Phenol, 30 mg 4-Aminophanzon und 300 jxl 30%iges H2O2 auf 100 ml 35 enthielt.
Die vermischten Lösungen wurden bei 37 C° 10 min inkubiert. Die sich bei 520 mp, entwickelnde Farbe wurde kolorime-trisch festgestellt. Die Konzentration des Tentanusanotoxins war der Peroxidaseaktivität umgekehrt proportional und 40 konnte mit Hilfe einer Eichkurve errechnet werden, die zuvor mit Lösungen aus einem kenntlich gemachten Antikörper erstellt worden war.

Claims (10)

631015 PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines für Immunoassays geeigneten Reagenzes durch kovalentes Binden eines immunologischen Reagenzes direkt oder über ein Bindeglied an ein in wässrigen Flüssigkeiten unlösliches Festphasensubstrat, dadurch gekennzeichnet, dass man als immunologisches Reagenz Rheumafaktor oder Clq verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Festphasensubstrat ein solches verwendet, das in Form von Einzelteilchen oder in granulierter Form vorliegt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Festphasensubstrat aminierte Agarose verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Festphasensubstrat Immunglobulinaggregate verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Festphasensubstrat einen Überzug auf der Innenfläche eines Rohres verwendet.
6. Verwendung eines nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellten Reagenzes zum Nachweis oder zur Bestimmung eines Antikörpers, eines Antigens oder eines Antikörper/Antigen-Komplexes in einer Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe gegebenenfalls nach Zusatz eines in bezug auf den Antikörper oder das Antigen in der Probe spezifischen Antigens bzw. Antikörpers mit dem Reagenz in Berührung bringt, wodurch der unlöslich gemachte Rheumafaktor oder das Clq mit den in dem Gemisch vorhandenen Antikörper/Antigen-Komplexen reagiert.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit dem Reagenz in Berührung bringt, indem man die Probe durch ein Rohr hindurchleitet, in dem sich das Reagenz befindet.
8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man sie nach der Methode des kontinuierlichen Durchflusses durchführt.
9. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe gegebenenfalls nach Zusatz eines in bezug auf den Antikörper oder das Antigen in der Probe spezifischen Antigens bzw. Antikörpers mit einem Reagenz in Berührung bringt, das aus einem Latex mit kovalent an den Teilchen gebundenem Rheumafaktor und Clq besteht.
10. Verwendung eines nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 hergestellten Reagenzes zum Nachweis oder zur Bestimmung eines bestimmten Antikörpers, Antigens oder Antikörper/Antigen-Komplexes in einer Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, dass man a) der Probe eine Menge des spezifischen Antigen oder Antikörpers für den zu bestimmenden Antikörper bzw. das zu bestimmende Antigen oder ein Menge des zu bestimmenden Antikörper/Antigen-Komplexes zusetzt, wobei die zugesetzte Menge mit einem identifizierenden Atom oder Molekül chemisch markiert ist,
b) das Gemisch mit dem Reagenz zur Bindung des Komplexes an das Reagenz in Berührung bringt,
c) das Reagenz mit dem daran gebundenen Komplex aus dem Gemisch abtrennt und d) auf Grund der Markierung die Menge des markierten Antikörpers, Antigens oder Antikörper/Antigen-Komplexes, die in dem Gemisch verbleibt oder die mit dem Reagenz abgetrennt wurde, misst und dadurch das Vorhandensein und die Menge des Antikörpers, Antigens oder Antikörper/Antigen-Komplexes in der ursprünglichen Probe bestimmt.
CH645875A 1974-05-20 1975-05-20 Verfahren zur herstellung eines reagenzes zum nachweis oder zur bestimmung von antikoerpern, antigenen und antikoerper/antigen-komplexen in einer fluessigkeit. CH631015A5 (de)

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