DE2641713A1

DE2641713A1 - Immunfluoreszenz-nachweisverfahren in fester phase

Info

Publication number: DE2641713A1
Application number: DE19762641713
Authority: DE
Inventors: Michael W Burgett; Robert V Dahlstrom; James F Monthony
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1975-10-09
Filing date: 1976-09-16
Publication date: 1977-04-21
Also published as: BR7605664A; IT1066186B; FR2327546A1; FR2327546B3; JPS5246884A; CA1070612A; GB1552374A; JPS6010578B2

Description

Immunfluoreszenz-ITachweisverfahren in fester Phase

Die Erfindung betrifft ein Immunfluoreszenz-Hachweisverfahren für Antigene (oder Haptene) und ihre Antikörper. Insbesondere betrifft sie die Verwendung eines Immunreaktans, das mit dem zu bestimmenden Antikörper oder Antigen (oder Hapten) verwandt ist und das an polymere Teilchen, deren Größe eine direkte Messung der Fluoreszenz eines markierten immunologischen Reagens in einer wäßrigen Suspension ermöglicht, kovalent gebunden oder gekuppelt ist.

Die kovalente Kupplung von Antigenen (oder Haptenen) und Antikörpern an wasserunlösliche Polymere ist bekannt, so z.B. aus folgenden Arbeiten:

Campbell, D.H. Leusher, E. und Lerman, L.S. Proc. Nat. Acad. U.S. ^, 575 (1951) Weliky, N. and Weetall, H.H. Immun ο chemi s try 2, 293 (1965)

Campbell, D.H. und weliky, N. Methods in Immunology and Immunochemistry, Hrsg.: Williams CA. und Chase, M.V. YoI. 1, Academic Press, IT.X. (196?)

Diese Methode wurde zum Nachweis verschiedener Bestandteile angewendet und ist Gegenstand mehrerer Patente. Nach der USA-Patentschrift 3 555 14-3 werden Antikörper kovalent an wasserunlösliche Polymere gebunden und nach einer kompetitiven Arbeitsweise mit radioaktiv markiertem Protein und unmarkiertem Protein vermischt.

Nach der USA-Patentschrift 3 867 517 wird eine Testvorrichtung mit hepatitis-bezogenem Antikörper oder Antigen überzogen und mit einer Lösung des Antigens oder Antikörpers in Berührung gebracht. Dann wurde diese Anordnimg mit Hepatitis-Antigen oder -Antikörper in Berührung ge-

125 bracht, die mit radioaktivem Jod ^ markiert waren, um eine Sandwich-Anordnung zu erzeugen. Nach dem waschen konnte die Menge des gebundenen Isotops quantitativ bestimmt werden.

Molday et al (Molday, R.S., Dreyer, V.J., Rembaum, A. und Xen S.P.S., Nature 24-9, 3- Mai 1974·) und (Ehe Journal of Cell Biology ,ToI. 64, 75-88, 1975) berichten über die Synthese von Latexkugeln mit einem Durchmesser von I3OO % oder weniger, die Fluoreszenz- oder radioaktive Markierung der Kugeln und die kovalente Bindung von Antikörpern an die Kugeln. Diese wurde anschließend dazu verwendet, um Antigene auf Zelloberflächen festzustellen.

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Ihman und Dintzis (Inman, J.K. und Dintzis, H.M., Biochemistry 8 (10) 4074-4082, 1969) beschrieben die chemische Modifikation von Polyacrylamidperlen zwecks Einführung einer großen Vielzahl von funktioneilen Gruppen. Die chemisch reaktionsfähigen Perlen-Derivate wurden zur kovalenten Bindung von Antikörpern oder Enzymen verwendet.

Ohno und Stahmann (Ohno, Y.und Stahmann, M.A., Immunochemistry 9,1087-1095, 1972) fanden anschließend, daß Perlen mit einer Größe von etwa 10 /U, an welche Penicillin angehängt worden war, bessere Agglutinationsreaktionen als rote Blutzellen ergaben, wenn sie zum Fachweis von Antikörpern für Penicillin verwendet wurden.

Eine Zusammenfassung von immunochemischen Markierungsmethoden findet sich in Methods in Immunology and Immunochemistry, Hrsg.: Williams, CA. und Chase, M.W., Vol. 1, Acad. Press, IT.X. (1967) und Vol. III (1971).

Über die Verwendung von fluoreszenz markierten Antikörpern berichtete Coons (Ooons, A.H., Fluorescent Antibody Methods, J.P. Danielli (Hrsg.:) General Cytochemical Methods, Vol. 1, Academic Press, U.Y. 1958), wobei er die weit verbreitete Anwendung der ELuDreszenzmikroskopie beim Nachweis von Mikroben- und Gewebeantigenen feststellte.

Coons et al (Weller, T.H. und Coons, A.H.) Proc.Soc. Exptl. Biol.Med. 86, 789 (1954) beschrieben weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung von zellgebundenem Antigen unter Verwendung eines bestimmten Antikörpers sowie eines fluoreszierenden Anti-Gammaglobulin-Antikörpers. Die gleichen Verfasser (Coons A.H., Leduc, E.H. und Connolly, J.M., J. Exptl. Med. 102, 49, 1955) beschrieben eine Methode zur Bestimmung von zellgebundenem Antikörper unter Verwendung eines spezifischen Antigens und eines spezifischen fluoreszierenden Antikörpers.

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Capel (Oapel, P.J.A., J. of Immunological Methods 5, 165-178, 1974·) kuppelte Antikörper oder Antigene an die Oberfläche von Agaroseperlen mit einer Größe von 40 bis 190yu. In dieser Arbeit mußte der Verfasser die Bedingungen anpassen, um zu verhindern, daß das Antigen in die Poren der Perlen eindrang, da sonst die folgende Antigen-Antikörper-Eeaktion behindert worden wäre. In dieser Arbeit verband er menschliches IgG- mit Agaroseperlen, setzte diese mit Kaninchen-Anti-Human-IgG-Antikörper um, und führte dann mit Pferde-Anti-Kaninchen-Ig-Serum eine Fluorescein-Isothiocyanat-Markierung (FITG-Markierung) durch. Er bestimmte die Menge der gebundenen Fluoreszenz visuell durch Fluor e s ζ enzmikro skopie ·

Es wurden also bei der Anwendung von kovalent an unlösliche Polymere gebundene Immunreaktantien bei Analysen solche Immunreaktantien verwendet, die entweder mit radioaktiven Tracern oder mit fluoreszierenden Verbindungen markiert waren. Radioaktive Tracer haben den Nachteil, daß ihre Lebensdauer beschränkt ist und daß bestimmte Sicherheitsvorschriften eingehalten werden müssen. Weiterhin sind die Hachweisinstrumente sehr aufwendig. Bei den fluoreszierenden Tracern waren die bisherigen Anwendungen, die als Bestimmungsverfahren angesehen werden könnten, auf indirekte oder verhältnismäßig mühsame und zeitraubende Arbeitsweisen, z.B. die Messung der Fluoreszenz von einzelnen Teilchen, durch Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop, beschränkt.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht eine Messung von fluoreszierend markierten Teilchen durch direkte optische Spektroskopie. Der Grundgedanke des Verfahrens liegt in der Auswahl von polymeren Teilchen mit einer Größe, die während der Durchführung der Analyse eine praktisch homogene Suspension ergibt. Es wurde gefunden, daß die Bedingungen,

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bei denen direkte fluorometrisch^ Messungen durchgeführt werden können, dann gegeben sind, wenn die polymeren Teilchen eine Größe von etwa 0,1 bis 10/U haben, vorzugsweise wenn die Teilchen eine Größenverteilung innerhalb dieses Bereiches haben, die sich um etwa 5/U bewegt.

Bei Verwendung dieser Teilchen wird ein geeignetes Immunreaktans, das mit dem unbekannten, zu bestimmenden Antigen (oder Hapten) oder Antikörper verwandt ist, kovalent damit verbunden. Die Teilchen, das unbekannte Immunreaktans und das in geeigneter Weise fluoreszenz-markierte Immunreaktans werden unter solchen Bedingungen miteinander vermischt, daß eine gewisse Menge des markierten Immunreaktans, die der Konzentration des unbekannten Immunreaktans proportional ist, direkt oder indirekt immunologisch an die Teilchen gebunden wird. Die Teilchen können dann leicht physikalisch abgetrennt werden, worauf ihre Fluoreszenz direkt fluorometrisch bestimmt wird.

Unter dem Ausdruck "immunologisch verwandt" versteht man, daß das Immunreaktans entweder gleich dem darauf bezogenen Immunreaktans oder sein Homologes ist. Ein Antikörper ist das "immunologische Homologe" eines Antigens, welches es erzeugte, oder umgekehrt. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung haben die Antigene und Haptene gänzlich analoge Punktionen. Dies kommt dadurch zum Ausdruck, daß sie durchwegs als Alternativen bezeichnet werden.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes Immunofluoreszenz-Bestimmungsverfahren, bei welchem eine Anzahl von wasserunlöslichen hydrophilen polymeren Teilchen mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10 ,u verwendet wird, an die das immunologische Homologe für ein zu bestimmendes Antigen (oder Hapten) oder einen zu bestimmenden Antikörper kovalent

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gebunden ist. Die Teilchen werden mit dem zu bestimmenden Antigen (oder Hapten) oder Antikörper in einer wäßrigen Lösung vereinigt, um eine immunologische Bindung auszubilden. Dann wird ein fluoreszenz-markiertes Antigen (oder Hapten) oder ein entsprechender Antikörper, die dem zu bestimmenden Antigen (oder Hapten) oder Antikörper entsprechen, immunologisch an die Teilchen gebunden. Die Teilchen werden von der wäßrigen Lösung getrennt, und ihre Fluoreszenz wird fluorometrisch in einer wäßrigen Suspension gemessen, um Daten zu erhalten, aus denen das unbekannte Antigen (oder Hapten) bzw. der unbekannte Antikörper bestimmt werden kann.

Das Verfahren ist· besonders für die Bestimmung von Antigenen (oder Haptenen) aus der Gruppe der Proteine und Polypeptide geeignet, wobei Antikörper für das jeweilige Protein oder Polypeptid verwendet werden. Diese Antikörper werden kovalent an geeignete wasserunlösliche polymere Teilchen gebunden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Anzahl von wasserunlöslichen hydrophilen polymeren Teilchen mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10/U verwendet, an die der Antikörper für das unbekannte, zu bestimmende Antigen (oder Hapten) kovalent gebunden ist. Das unbekannte Antigen (oder Hapten) wird immunologisch in wäßriger Lösung an diese Teilchen gebunden. Weiterhin wird ein fluoreszenz-markiertes Immunreaktans zugesetzt, von dem sich ein Teil entweder direkt oder indirekt (durch gebundenes Antigen oder Hapten) immunologisch mit diesen Teilchen verbindet, so daß die gebundenen Markierungssubstanzen von diesen Teilchen trennbar sind. Die Teilchen werden von ungebundenem Immunreaktans getrennt, und die Fluoreszenz einer flüssigen Suspension wird in einem Fluorometer gemessen, um Analysendaten des unbekannten Antigens (oder Haptens) zu erhalten.

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Es können alle geeigneten wasserunlöslichen polymeren Teilchen verwendet werden. Im allgemeinen liegen die Teilchen in Kugel- oder Perlenform vor und werden aus Polymeren ausgewählt, die so modifiziert werden können, daß eine endständige primäre Aminogruppe, eine endständige Carboxylgruppe oder eine Hydrazidgruppe erhalten wird. Der Antikörper oder das Antigen (oder das Hapten) wird dann bei üblichen Beaktionsbedingungen an den Teilchen unter Ausbildung einer kovalenten Bindung immobilisiert· Bevorzugte polymere Teilchen werden aus vernetzten Polyacrylamiden hergestellt. Die Immobilisierung von Immunreaktantien an diesen bevorzugten Substraten istvon Inman & Dintzis a.a.O. beschrieben,, Andere geeignete polymere Teilchen sind in der USA-Patentschrift 3 555 14-3 sowie in einigen anderen der vorstehend angegebenen Idteraturstellen beschrieben.

Bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung kann eine Anzahl verschiedener Arbeitsweisen angewendet werden. Die Auswahl wird gewöhnlich in Abhängigkeit von der Hatur des jeweils zu bestimmenden Antigens (oder Haptens) oder Antikörpers und aufgrund ihrer Zugänglichkeit getroffen. Im allgemeinen wird eine der nachstehend angegebenen Arbeitsweisen bevorzugt;

Sandwich-Methode

Der immobilisierte Antikörper (der kovalent an die polymeren Teilchen, die vorzugsweise in Engel- oder Perlenform vorliegen, gebunden ist) wird in einer geeigneten Lösung mit einem spezifischen zweiwertigen oder mehrwertigen Antigen (oder Hapten) in solchen Konzentrationen umgesetzt, daß immer ein Überschuß an Antikörper vorhanden ist. Nach Beendigung der umsetzung wird ein fluoreszenz-markierter Antikörper, der für das Antigen (oder Hapten) spezifisch ist,

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in einem geringen Überschuß zugesetzt. Da das Antigen (oder Hapten) zwei oder mehrere Stellen für die Umsetzung zur Verfügung hat und nur eine besetzt ist, reagiert der zweite markierte Antikörper mit den unbesetzten Antigen-Coder Hapten-)Stellen. Die Antikörperperlen, die mit dem Antigen (oder Hapten) und dem markierten Antikörper vereinigt sind, werden abgetrennt und in einem Fluorometer ausgemessen. Die Konzentration des Antigens (oder Haptens) steht in direkter Beziehung mit der Intensität der mit den Perlen verbundenen Fluoreszenz.

Sequentielle Sättigung;

Eine andere Möglichkeit besteht darin, einen Überschuß des immobilisierten Antikörpers mit dem fraglichen Antigen (oder Hapten) umzusetzen. Nach Beendigung der Umsetzung kann markiertes Antigen (oder Hapten) zugesetzt werden, das die auf dem Antikörper verbleibenden, verfügbaren Plätze besetzt. Der immobilisierte Antikörper-Antigen-(oder Hapten-)Komplex kann abgetrennt und die Markierungssubstanz kann ausgemessen werden. Die Menge des immobilisierten, markierten Antigens (oder Haptens) steht in einer umgekehrten Beziehung zu der Menge des Antigens (oder Haptens) in der Probe. Diese Arbeitsweise kann bei einwertigen Antigenen (oder Haptenen) notwendig sein.

AntJKenüberschuß

liegt das Antigen (oder Hapten) im Überschuß vor, so kann eine kompetitive Bindungsmethode angewendet werden. Der für ein Antigen (oder Hapten) spezifische Antikörper wird an die Teilchen angeheftet. Die Menge des dem System zugesetzten gebundenen oder in fester Phase vorliegenden Antikörpers reicht aus, um eine begrenzte Menge Antigen (oder Hapten)

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zu binden« Das spezifische Antigen (oder Hapten) und das homolog markierte Antigen (oder Hapten) werden dem Antikörper zugesetzt« Da die Anzahl der Bindungsstellen am immobilisierten Antikörper beschränkt ist, so treten die markierten und unmarkierten Antigene (oder Haptene) um die verfügbaren Stellen in Wettbewerb. Die Menge an gebundenem markiertem Antigen (oder Hapten) ist umgekehrt proportional der Konzentration von unmarkiertem Antigen (oder Hapten) im System und kann zur quantitativen Bestimmung des unmarkierten Antigens (oder Haptens) im System verwendet werden. Diese Methode kann mit einer zweiten Antikörpermethode kombiniert werden. Durch richtige Auswahl einer Antikörperfraktion kann der in fester Phase vorliegende Antikörper als zweiter Antikörper in den Analysen verwendet werden, z.B. für Haptene, die nur eine Kombinations st eile mit den Antikörpern haben. Bei dieser Methode werden Antikörper zu einem Hapten, wie Thyroxin, Dinitrophenol oder einem Steroid, in an sich bekannter Weise hergestellt. Das Hapten wird mit dem Protein der einen Species konjugiert und in eine unverträgliche Species injiziert. Beispielsweise kann das Hapten-mit menschlichem Serumalbumin konjugiert und Kaninchen injiziert werden. Das Kaninchen erzeugt Antikörper gegen das Protein-Hapten-Konjugat.

Bei dieser Arbeitsweise ist ein zweiter Antikörper notwendig, und die zweiten Antikörper werden beispielsweise gegen eine iraktion von Kaninchenglobulinen erzeugt, indem sie einer Zjqge injiziert werden. Auf diese Weise werden Ziegenanti-Kaninchen-Antikörper erhalten. Diese können beispielsweise mit kleinen Polyacrylamidperlen konjugiert und als zweiter Antikörper für alle Systeme, bei denen der erste Antikörper in Kaninchen erzeugt wurde, verwendet werden. Es kann eine beliebige Seihe von Tieren verwendet werden, soweit Antikörper gegen die erste Tierart (Species) in einer unverträglichen zweiten Tierart erzeugt werden.

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Bei dieser Methode unterscheidet sich die Autikörper-Hapten- oder Antigen-Eombination nicht wesentlich von dem nichtumgesetzten -Antikörper, so daß eine bequeme Abtrennung oder Fällung möglich ist. Es wird ein zweiter -freilchengebundener Antikörper, nämlich gegenüber der Globulinfraktion des zur Erzeugung des ersten Antikörpers verwendeten Tieres verwendet, um eine Fällung zu erzeugen. In diesem Pail kann die zunächst kompetitiv gebundene Autigen-Erster-Antikörper-Eombination als immunologisches Homologes des teilchengebundenen zweiten Antikörpers angesehen werden.

Bei einem weiteren Verfahren werden Hapten-Protein-Eonjugate in einer analogen Weise wie oben zur Herstellung von Antikörpern zu Haptenen verwendet. Die Antikörper zum Hapten sind kovalent mit den Polyacrylamid-Perlen verbunden, so daß sie als Reagens für die Bestimmung eines Haptens verwendet werden können. Dann wird das gleiche Hapten-Protein-Eonjugation hergestellt, und das Protein wird fluoreszenzmarkiert. Dieses wird nun für die kompetitive Bindung oder die sequentielle Sättigung mit dem zu untersuchenden nativen Hapten verwendet. Uaeh dieser Methode erhält man eine Verstärkte molare Fluoreszenzreaktion.

Nach einer anderen Variante dieser Methode wird das Antigen kovalent an die Perlen gebunden. Man läßt das an die Perlen gebundene Antigen mit dem nativen Antigen um eine beschränkte Menge des homologen Antikörpers in Wettbewerb treten. Die Perlen werden abgetrennt und mit einem Überschuß an fluoreszenzmarkiertem zweiten Antikörper, der gegen den Antigen-Antikörper-Eomplex gerichtet ist, reagieren gelassen. Die Perlen können abgetrennt und die Fluoreszenz gemessen werden. Die Intensität der Fluoreszenz steht in umgekehrter Beziehung zur Serumkonzentration des zu bestimmenden Antigens.

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Erfindungsgemäß kommen alle geeigneten fluoreszierenden Verbindungen in Eombination mit Antigenen (oder Haptenen) oder Antikörpern als Markierungssubstanzen in Irage. Beispiele für geeignete Verbindungen mit Idteraturhinweisen auf ihre Verwendung als Markierungssubstanzen sind nachstehend angegeben.

1. Fluoresceinisothiocyanat

!Ehe, T.H. und leltkamp, T.E.W., Immunology, 18, 865 0970)

2. Rhodamin-B-isothiocyanat

Chen, B. F., Arch. Biochem. Biophys. 133, 263 (1969)

3. DNS-Ghlorid (^-Dimethylamino-i-naphthalin-sulfonylchlorid) Weber, G., Biochem. J., 51, 155 (1952)

4. HBD-Chlorid (7-Ghlor-4-nitro-benzo-2-oxa-1,3-diazol) Ghosh, P.B. und Whitehou.se, M.W. Biochem. J. ,108, 155 (1968)

5. MDPS¹ (2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2E)-furanon) Weigele, M., DeBernardo, S., Ieimgruber, W., Cleeland,

R. und Grunberg, E., Biochem.Biophys.Res.Comm. 54, 899(1973)

6. Pluorescamin (Pluram^v '; Roche-Diagnostika) Bohlen, P. Stein, S. Daiman, W. und Udenfriend, S., Arch. Biochem. Biophys. 155, 213 (1973)

7- O-Phthalaldehyd

Benson, J.R. und Hare, P.E., Proc.lTat.Acad. Sei. (USA) 72, 619 (1975)

8. ANS (8-Anilinonaphthalin-i-sulfonat) Hartman, B.E. und Udenfriend, S., Anal.Biochem. 30, 391 (1969).

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Typische allgemeine Arbeitsvorschriften I. Herstellung von Antikörperperlen

A. Kodifizierte (derivatisierte) Polyacrylamidperlen mit einer funktionellen Kapazität von 0,25 bis 6 mVal/g werden zum Anheften des Antikörpers verwendet (Hersteller Bio-Rad Laboratories, Eichmond, Galif., Handelsbezeichnung Affi-Gel 701, 702, 703 oder Derivate).

Weiterhin können Polyacrylamidperlen mit einer Ausschlußgrenze von 6-7000 Dalton*durch Behandlung mit 2 m NaOH über 18 Stunden bei 40⁰C hydrolysiert werden. Die Perlen werden mit HGl neutralisiert und mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Carboxylkapazität der Perlen wird durch direkte Titration bestimmt und soll etwa 6 mVal/g Trockengewicht betragen.

B. Carboxylatperlen werden in 0,00$ m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,3 bis auf eine Endkonzentration von 10 mg Perlen je ml suspendiert.

0. Eine Globulinfraktion eines Antiserums, das für das zu untersuchende Antigen spezifisch ist, wird den Perlen mit einer Konzentration von 12yUg Antikörper/mg Perlen zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt.

D. Ein wasserlösliches Carbodiimid, wie 1-lthyl-3-(3-dimethylami nopropyl)-carbodiimid (EDAG) wird mit einer Konzentration von 0,25 mVal/g EDAG/mYal funktioneller Kapazität der Perlen zugesetzt. Das Keaktionsgemisch wird durch Zusatz von verdünnter Säure bzw. Base 1 Stunde auf einen pH-Wert von 6,3 gehalten. Wach der ersten Stunde bleibt der pH-Wert gewöhnlich konstant, und man läßt die Umsetzung über Hacht bei etwa 4⁰G ablaufen.

*(Moleküle oder andere Teilchen, die größer als 6-7000Dalton sind, dringen nicht in die Poren des Harzes ein)

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E. Die gekuppelten Perlen werden zweimal mit physiologisch gepufferter Kochsalzlösung (0,15 m ITaCl, 0,01 m Phosphatpuffer, pH-Wert = 7,2), dreimal mit 5 m-Guanidin-HCl in 0,05 m Phosphatpuffer (pH = 7»5) noch zweimal mit physiologisch gepufferter Kochsalzlösung und schließlich zweimal mit 0,005 m Phosphatpuffer (pH = 7»5) gewaschen. Die Volumina der Waschwässer betrugen etwa 50 ml/100 mg Perlen. Die Waschungen wurden zur Erzielung einer maximalen Antikörperaktivität bei 4°C durchge führt.

F.Die Perlen können bei O⁰C in 0,005 m Phpsphatpuffer mit 0,01 % Hatriumazid aufbewahrt werden.

II. Hachweisverfahren mit Antigenüberschuß (mit kompetitiver Bindung)

A. Aliquots von 200/ul einer 10 mg/ml-Antikörperperlensuspension (etwa 2 mg Antikörperperlen)werden in ein Borsilikat-Reagensglas von 1$ χ 100 mm, das 1,1 ml physiologisch gepufferte Kochsalzlösung enthielt, gebracht. Die Perlen werden durch Zentrifugieren (etwa 8000 g über 1 Min.) zu einer Pille verdichtet.

B. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10yul markiertes Antigen (10 mg Antigen/ml) einer Serumprobe (10/ul vollständiges Serum liegen etwa im Hachweisbereich für IgG) und ausreichend physiologisch gepufferte Kochsalzlösung um das Volumen auf 1,4 ml zu bringen, in Gang gesetzt. Das Gemisch wird mit einem Wirbelmischer geschüttelt und 30 Minuten&ei Raumtemperatur inkubiert.

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C Nach 30 Minuten werden 4- ml physiologisch gepufferte Kochsalzlösung dem Gemisch zugesetzt. Die Probe wird gemischt und dann wie oben zentrifugiert. Die überstehende flüssigkeit wird sorgfältig entfernt, und die Pille wird erneut in 5 ml physiologisch gepufferter Kochsalzlösung suspendiert. Nach 10 Minuten wird die Suspension erneut zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird wiederum weggeworfen.

D. Die Menge des markierten Antigens auf den Perlen wird direkt in einem Eluorometer bestimmt. Die Menge des durch die Testprobe aufgenommenen markierten Antigens wird durch die von einer Kontrollprobe aufgenommenen Menge (Antikörperperlen und markiertes Antigen ohne Serum) geteilt und als Punktion der Antigenkonzentration in mg/ml auf Log-Logit-Papier * aufgetragen.

III. Sandwich-Nachweisverfahren

A. Aliquots -von 200yul einer 10 mg/ml-Antikörperperlensuspension (etwa 2 mg Antikörperperlen) werden in ein Borsilikat-Reagensglas von 13 χ 100 mm gegeben, das 1,2 ml physiologisch gepufferte Kochsalzlösung enthält. Die Perlen werden durch Zentrifugieren (etwa 8000 g über 1 Min.) zu einer Pille verdichtet.

B. Es wird eine Verdünnung des Serums angefertigt, (etwa 1:1000 für IgG, etwa 1:100 für IgM und IgA). Von (A) wird ein 100 ,ul-Aliquot der Verdünnung dem Reagensglas zugesetzt. Die Probe wird mit einem Wirbelmischer gemischt und 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

*(logarithmische Standardskale auf der Abszisse und Skala nach der Definition Logit χ = log_e £Ί[Ζ~-7 auf der Ordinate)

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C. Ein 100 yul-Aliquot von markiertem Antikörper, das etwa 20 bis 50yug Antikörper enthalten sollte, wird aus (B) dem Heagensglas zugesetzt, und das Gemisch wird nochmals 30 Minuten inkubiert.

D. Nach 30 Minuten werden 4 ml physiologisch gepufferte Kochsalzlösung dem zu analysierenden Gemisch zugesetzt. Die Probe wird gemischt und dann wie oben zentri-: fugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird sorgfältig entfernt, und die Pille wird erneut in 5 nil physiologisch gepufferter Kochsalzlösung suspendiert. Nach etwa 10 Minuten wird die Suspension erneut zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird wiederum verworfen.

E. Es wird die relative Fluoreszenz des markierten Antikörpers auf den Perlen bestimmt, und dieser Wert wird gegen die Antigenkonzentration auf Xog-Logit-Papier aufgetragen. - " „

Die nachstehenden Beispiele von speziellen Ausführungsformen erläutern die Erfindung im Zusammenhang mit Kaninchen-Antihuman-IgG (EaHIgG) gekuppelt mit vernetzten Polyacrylamidperlen.

Beispiel 1

Eine Probe (1 g) von Terpolymer-Mikroperlen (Durchmesser weniger als 10 Ai) wurde durch Behandlung mit 2 m NaOH über 18 Stunden bei 40 C hydrolysiert. Die Perlen wurden mit HCl neutralisiert und sechsmal mit entionisiertem Wasser gewaschen.

Eine 500 mg-Probe der hydrolysierten Perlen wurde in 100 ml 0,003 ni Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,3 suspendiert. Ein 2 ml-Aliquot einer IgG-Fraktion von Kaninchen-Antihuman-IgG-Serum (Miles, Lt 14, Code 64-155) enthielt 2,9 mg/ml Antikörper in einer 1-%igen Proteinlösung. Der pH-Wert des

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Reaktionsgemisches wurde auf 6,3 eingestellt. Dann wurde ein Aliquot von 130 mg EDAO (Bio-Bad) zugesetzt, und der pH-Wert des Gemisches wurde unter Zusatz von verdünnter Säure bzw. Base über einen Zeitraum von 1 Stunde auf 6,3 gehalten. Die Umsetzung wurde unter Rühren bei 4°C über Nacht fortgesetzt. Dann wurden die Perlen zweimal mit etwa 100 ml physiologisch gepufferter Kochsalzlösung, dreimal mit 100 ml 5 m Guanidin-HGl, der 0,01 m Phosphatpuffer enthielt (pH =7,5) und zweimal mit 100 ml physiologisch gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Nach 3 Stunden bei 4⁰O wurden die Perlen zweimal mit 100 ml 0,005 m Phosphatpuffer (pH » 7»5) gewaschen und anschließend in 50 ml der zuletzt genannten Pufferlösung, die 0,01 % Natriumazid enthielt, suspendiert und aufbewahrt (Endkonzentration 10 mg Perlen/ml).

Beispiel 2 AntiKenüberschuß-Nachweisverfahren

Ein 200/Ul (2 mg)-Aliquot von RaHIgG-Perlen von Beispiel 1 wurde zu 1200 >ul physiologisch gepufferter Kochsalzlösung in einer Reihe von 1,5 ml-Eppendorf-Zentrifugengläsern gegeben. Die Perlen wurden in einer Eppendorf-Zentrifuge (Modell 3200/30) durch Zentrifugieren bei der Höchstgeschwindigkeit (etwa 12.000 g) 1 Minute zu Pillen verdichtet. Ein 10/Ul-Aliquot von mit PITG markiertem menschlichem IgG (Cappel), verschiedene Verdünnungen von normalem menschlichem Serum und ausreichend physiologisch gepufferte Kochsalzlösung, um das Analysengemisch auf 1,5 ml zu bringen, wurden jeder Probe zugesetzt. Die Reaktion wurde durch Suspendieren der Perlen mit einem Wirbelmischer in Gang gesetzt. Nach 30 Minuten wurden die Perlen wie oben zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert. Die Perlen wurden durch erneute Suspendierung in 1,5 ml physiologisch gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und anschließend wie oben zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde wiederum abgegossen. Diese Arbeitsweise wurde nochmals wiederholt, und die Perlen wurden

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erneut in 5 ml 0,005 H Tris-HCl (pH = 8,5) suspendiert. Die Fluoreszenz der Perlen wurde unter Verwendung eines Turner-Filter-Fluorometers mit einem Filter 4-7B für das Anregungslicht und mit einem Filter 2A12 für das Emissionslicht bestimmt.

Die Fluoreszenz eines Glases mit etwa 2 mg Suspension mit unbehandelten Perlen wird von der Fluoreszenz jeder zu untersuchenden Probe abgezogen. Die Fluoreszenz der zu untersuchenden Probe wird dann durch die Fluoreszenz der Eontrollperlen (Ab-Perlen und fluoreszierendes Antigen ohne zugesetztes Serum) dividiert und gegen die Antigenkonzentration in mg auf log-logit-Papier aufgetragen, wie es in Fig. 1 dargestellt ist.

Beispiel 3 Sandwich-Hachwei sverfahren

Die folgenden Bestandteile wurden in einem Eppendorf-Zentrifugenglas gemischt und 18 Stunden bei Kaumtemperatur inkubiert: 200 /Ul RaHIgG-Perlen von Beispiel 1, 1200/Ul physiologisch gepufferte Kochsalzlösung mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 100/Ul einer normalen Humanserumverdünnung. Nach 18 Stunden wurden die Perlen in einer Eppendorf-Zentrifuge (Modell 3200/30) bei der Höchstgeschwindigkeit (etwa 12.000 g) 1 Minute zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert. Die Perlen wurden durch erneute Suspension in 1,5 ml physiologisch gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und wie oben zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert, und die Perlen wurden erneut in 1 ml physiologisch gepufferter Kochsalzlösung mit 1 % PSA suspendiert· Ein 10/Ul-Aliquot von mit FITG konjugiertem RaHIgG (Miles Lot 19, Code 64-169) wurde den Perlen zugesetzt, und diese wurden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach 30 Minuten wurden die Perlen zentrifugiert und zweimal mit physiologisch gepufferter Kochsalzlösung wie oben gewaschen.

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Die Perlen wurden erneut in 5 ml 0,005 m Tris-HCl (pH = 8,5) suspendiert. Die Fluoreszenz der Perlen wurde mit einem Turner-PiIterfluorometer unter "Verwendung eines 47B-Filters für das Anregungslicht und eines 2A12-Filters für das Emissionslicht bestimmt. Die Fluoreszenz der Testprobe abzüglich, der Fluoreszenz einer Blindprobe (Probe mit Perlen, die nicht mit Serum in Berührung gebracht wurden, sondern nur mit dem fluoreszierenden Antikörper) wurde gegen die IgG-Konz ent ration (inyug ) auf Io g-iogit-Papier aufgetragen, wie es in Fig. 2 dargestellt ist.

- Patentansprüche -

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Claims

Patentansprüche

1. . Immunfluoreszenz-lTachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserunlösliche hydrophile polymere Teilchen mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10 yu, an welche ein Immunreaktans, das mit einem unbekannten, zu bestimmenden Immunreaktans immunologisch verwandt ist, kovalent gebunden ist, in wäßriger Lösung immunologisch an ein fluoreszenzmarkiertes Immunreaktans, das mit dem unbekannten Immunreaktans immunologisch verwandt ist, bindet, wobei die Menge des markierten Immunreaktans proportional der Konzentration des unbekannten Immunreaktans ist, daß man die Teilchen von der wäßrigen Lösung abtrennt und die Fluoreszenz einer wäßrigen Suspension der abgetrennten Teilchen fluorometrisch bestimmt, um Werte zu erhalten, aus denen die Konzentration des unbekannten Immunreaktans bestimmbar ist.

2. Immunfluoreszenz-Fachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserunlösliche hydrophile polymere Teilchen mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10/U, an welche das immunologische Homologe für ein zu bestimmendes Antigen (oder Hapten) oder einen zu bestimmenden Antikörper kovalent gebunden ist, mit dem zu bestimmenden Aatigen (oder Hapten) oder Antikörper in wäßriger Lösung miteinander kombiniert, um eine immulogische Bindung auszubilden, daß man an die Teilchen fluoreszenzmarkiertes Antigen (oder Hapten) bzw. Antikörper, die dem zu bestimmenden Antigen (oder Hapten) oder Antikörper entsprechen, immonolgisch bindet, daß man die Teilchen von der wäßrigen Lösung abtrennt und die Fluoreszenz einer wäßrigen Suspension der abgetrennten Teilchen fluorometrisch bestimmt, um Werte zu erhalten, bus denen die Konzentration des unbekannten Antigens oder Antikörpers bestimmbar ist.

ORIGINAL INSPECTED

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3. Imnnmfluoreszenz-Nachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserunlösliche hydrophile polymere Teilchen mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10yu, an welche ein Antikörper für das unbekannte, zubestimmende Antigen (oder Hapten) kovalent gebunden ist, in wäßriger Lösung immonologisch an das unbekannte Antigen (oder Hapten) bindet, daß man fluoreszenzmarkiertes Immunreaktans mit den Teilchen vereinigt, um einen Teil davon in Verbindung mit den Teilchen immunologisch zu binden, daß man die Teilchen von dem ungebundenen fluoreszenzmarkierten Immunreaktans abtrennt und die Fluoreszenz einer Flüssigkeitssuspension der abgetrennten Teilchen in einem Fluoro-

meter bestimmt, um Werte zur Bestimmung des unbekannten Antigen (oder Haptens) zu erhalten.

4. Nachweisverfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das unbekannte Antigen (oder Hapten) ein zweiwertiges öder mehrwertiges Antigen (oder Hapten) ist, daß der an die Teilchen kovalent gebundene Antikörper gegenüber dem unbekannten Antigen (oder Hapten) im Überschuß vorhanden ist, und zuerst mit dem unbekannten Antigen (oder Hapten) umgesetzt wird, daß das fluoreszenzmarkierte Immunreaktans ein fluoreszenzmarkierter Antikörper für das im Überschuß zum unbekannten Antigen (oder Hapten) vorliegende Antigen (oder Hapten) ist und damit umgesetzt wird, nachdem der an die Teilchen gebundene Antikörper umgesetzt wurde, wobei das unbekannte Antigen (oder Hapten) sowohl durch die Teilchen als auch durch den fluoreszenzmarkierten Antikörper immunologisch gebunden wird, um mit den Teilchen abgetrennt zu werden.

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5- Uachweisverfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß der an die Teilchen gebundene Antikörper gegenüber dem unbekannten Antigen (oder Hapten) im Überschuß vorhanden ist, und daß das unbekannte Antigen (oder Hapten) zuerst immologisch an die Teilchen gebunden wird, bevor die Kombination mit dem fluoreszenzmarkierten Immunreaktans erfolgt, und daß dann das fluoreszenzmarkierte Antigen (oder Hapten) immunologisch an den überschüssigen Antikörper dieser Teilchen gebunden wird.

6. Nachweisverfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszenzmarkierte Immunreaktans ein markiertes Antigen (oder Hapten) ist und zusammen mit unbekanntem Antigen (oder Hapten) zunächst gleichzeitig im Überschußüber einen ersten Antikörper, an welchen sie kompetitiv gebunden werden, vorhanden sind.

7- Nachweisverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der an die Teilchen gebundene Antikörper einen zweiten Antikörper zur immunologischen Bindung der Kombination des kompetitiv gebundenen fluoreszenzmarkierten und des unbekannten Antigens (oder Haptens) und des ersten Antikörpers darstellt.

8. Nachweisverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszenzmarkierte Immunreaktans ein markiertes Antigen (oder Hapten) darstellt und zusammen mit dem unbekannten Antigen (oder Hapten) gleichzeitig im Überschuß über den an die Teilchen gebundenen Antikörper vorliegt, wobei markiertes und unbekanntes Antigen (oder Hapten) kompetitiv immunologisch an den teilchengebundenen Antikörper gebunden sind.

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9. Nachweisverfaliren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren Teilchen aus vernetztem Polyacrylamid bzw. dessen Derivaten gebildet sind.

10. Nachwei sverf ah ν en nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszenzmarkierte Antigen (oder Hapten) bzw. der Antikörper mit Jluoresceinisothiocyanat markiert ist.

11. Nachweisverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen in mehreren Größen mit einer Verteilung um etwa 5/U vorliegen.

12. Nachweisverfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren Teilchen aus vernetztem Polyacrylamid bzw. einem Derivat gebildet sind.

13. Nachweisverfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, daß das fluoreszenzmarkierte Immunreaktans mit Sluoresceinisothiocyanat markiert ist.

14. Nachweisverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen in mehreren Größen mit einer Verteilung um etwa 5/U vorliegen.

15- Immunfluoreszenz-Nachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserunlösliche hydrophile polymere Teilchen mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10 /U, an welche ein Antigen (oder Hapten), das einem unbekannten, zu bestimmenden Antigen (oder Hapten) immologisch entspricht, sowie ein unbekanntes, zu bestimmendes Antigen (oder Hapten) in wäßriger Lösung kompetitiv an eine bestimmte, begrenzte Menge eines fluoreszenzmarkierten homologen Antikörpers bindet, um einen Teil des markierten Antikörpers an die

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Teilchen zu binden, daß man die Teilchen von der wäßrigen Losung abtrennt und die JBluoreszenz einer flüssigen Suspension der abgetrennten Teilchen in einem Jluorometer mißt, um Werte zur Bestimmung des unbekannten Antigens (oder Haptens) zu erhalten.

16. Immunfluoreszenz-Nachweisverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer wäßrigen Lösung, die unbekanntes, zu bestimmendes intigen (oder Hapten) enthält, fluoreszenzmarkiertes, entsprechendes Antigen (oder Hapten) kompetitiv immunologisch mit einer beschränkten Menge eines homologen ersten Antikörpers an das unbekannte Antigen (oder Hapten) bindet, daß man wasserunlösliche hydrophile Teilchen mit einer Größe von etwa 0,1 bis 10yu, an welche ein zweiter Antikörper kovalent gebunden ist, der mit dem Eeaktionsprodukt aus markiertem Antigen (oder Hapten) und unbekanntem Antigen (oder Hapten) und dem ersten Antikörper immologisch reaktiv ist, um eine Umsetzung zu erzeugen, daß man die Teilchen von dem ungebundenen fluoreszenzmarkierten Antigen (oder Hapten) abtrennt, und daß man die Huoreszenz einer flüssigen Suspension der abgetrennten Teilchen in einem Fluorometer bestimmt, um Werte zur Analyse des unbekannten Antigens (oder Haptens) zu erhalten.