CN111007241A - 基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法、装置及应用 - Google Patents

基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法、装置及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法、装置及应用，基于待测抗原Ag配置过量的荧光标记的特异性抗体Ab+，混合后获得混合溶液A，以第一多孔膜层分离大细胞和/或大蛋白得到混合溶液B，将混合溶液B以设置竞争性抗原Ag’的第二多孔膜层分离，竞争性抗原Ag’结合过量的抗体Ab+，检测荧光强度，获得待测抗原的浓度。本发明利用高分子多孔膜的不同分离尺寸，对免疫层析过程不同颗粒进行分离，通过检测荧光强度，获取被标记的待测物抗原的浓度信息；通过不同孔径控制反应物的分离，原理简单，配合可分离的多层试剂管，操作简单，结果准确度高，不需大型设备且可以同时完成多组检测，自动化或人工操作均可。

Description

基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法、装置及应用
技术领域
本发明涉及利用特殊方法来研究或分析材料的技术领域，特别涉及一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法、装置及应用。
背景技术
以荧光物质标记抗体、进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibody technique），用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称为荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法，这两种方法总称为免疫荧光技术。
现有的荧光免疫检测方法包括免疫层析试纸条技术和免疫磁珠检验技术。
免疫层析（lateral flow immunoassay, LFIA ）快速检测试纸条多以胶体金或者荧光色素作为标记物，是利用混合物中各组分的物理性质之差，如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等而建立来的一种分离技术；层析系统是由固相和流动相组成，当待分离混合物随流动相通过固定相时，由于混合物各组分的理化性质差异，与固定相相互作用弱的组分随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动速度快，与固定相相互作用强的组分向前移动速度慢，从而实现混合物中各组分的分离。
免疫层析技术是建立在层析技术和抗体-抗原特异性免疫反应基础上的一种免疫检测技术，以固定有检测线（T）和控制线（C）的条状纤维层材料作为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动；待测物在T线处发生特异性免疫反应，游离物在C线处发生免疫反应。
免疫层析检测方法存在着检测复杂的问题，包括需要孵育试样（条状纤维层材料）、配置激发荧光的大型或小型层析设备、单次可检测试样有限等，最重要的是在检测过程中，试样存在受到污染的可能性，检测结果不精确。
免疫磁珠检验技术是应用在抗体（蛋白）包被的免疫磁珠纯化技术，无需复杂的层析设备，以磁性吸附步骤就可以方便的从单抗表达产物中分离单抗，有效解决传统层析技术的不足之处；在这种检验技术中，磁珠作为核心金属粒，其外层顺次包裹高分子材料和功能配基，磁珠和待测物结合后，在磁场作用下进行分离，可用于分析和随后的检测。
免疫磁珠检验技术的优点在于高质量、高通量，自动化，但是也存在着磁珠需要修饰才可以和被检物进行特异性结合的不足。
发明内容
本发明解决了现有技术中存在的问题，提供了一种优化的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法、装置及应用，反应样品通过多层多孔膜进行逐层分离，最后提取到被标记待测物，通过对被标记待测物进行光照射激发荧光过程进行光学检测，分析荧光信号并进行信号处理分析，从而获取待测抗原（抗体）浓度信息。
本发明所采用的技术方案是，一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：获取检测样本，所述检测样本中含有待测抗原Ag；
步骤2：基于待测抗原，配置过量的进行荧光标记的特异性抗体Ab+；将检测样本和抗体Ab+混合并充分反应，获得混合溶液A；
步骤3：将混合溶液A以第一多孔膜层分离，第一多孔膜层分离直径大于预设直径的大细胞和/或大蛋白，得到混合溶液B；
步骤4：在第二多孔膜层上设置抗原Ag的竞争性抗原Ag’；
步骤5：将混合溶液B以第二多孔膜层分离，检测荧光强度，获得检测样本中待测抗原的浓度。
优选地，所述混合溶液B包括检测样本和抗体Ab+混合后得到的Ag-Ab+和过量的抗体Ab+。
优选地，所述竞争性抗原Ag’固定于第二多孔膜层上。
优选地，步骤4中，第二多孔膜层的膜孔直径大于抗原Ag和特异性抗体Ab+结合后的结合物的直径。
优选地，步骤5包括以下步骤：
步骤5.1：将混合溶液B以第二多孔膜层分离，第二多孔膜层将混合溶液B分离为Ag-Ab+和Ag’-Ab+；
步骤5.2：检测分离到Ag-Ab+的混合物的荧光强度，获得Ag-Ab+的浓度；
步骤5.3：基于步骤5.2的结果，获得检测样本中待测抗原的浓度。
优选地，所述竞争性抗原Ag’与抗原Ag同源。
优选地，所述第一多孔膜层的膜孔直径小于5μm。
一种采用所述的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法的检测装置，所述检测装置包括自上而下可拆卸设置的第一分离腔、第二分离腔和第三分离腔；
所述第一分离腔包括第一腔壁及设于第一腔壁底部的第一多孔膜层，所述第一腔壁顶部可拆卸设有盖体；
所述第二分离腔包括第二腔壁及设于第二腔壁底部的第二多孔膜层，所述第二腔壁的顶部通过第一多孔膜层与第一分离腔空间连通，所述第二多孔膜层上设有竞争性抗原Ag’；
所述第三分离腔的顶部通过第二多孔膜层与第二分离腔空间连通。
一种采用所述的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法的应用，所述基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法应用于针对小分子抗原的荧光竞争法免疫检测。
优选地，所述小分子抗原的直径为20-100纳米。
本发明提供了一种优化的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法、装置及应用，获取含有待测小分子抗原Ag的检测样本，基于待测抗原配置过量的进行荧光标记的特异性抗体Ab+，混合并充分反应后获得混合溶液A，以第一多孔膜层分离直径大于预设直径的大细胞和/或大蛋白，得到混合溶液B，在第二多孔膜层上设置抗原Ag的竞争性抗原Ag’，将混合溶液B以第二多孔膜层分离，竞争性抗原Ag’结合过量的抗体Ab+，检测荧光强度，获得检测样本中待测抗原的浓度。
本发明利用高分子多孔膜的不同分离尺寸，对免疫层析过程不同颗粒进行分离，从而获取被标记的待测物抗原，通过检测荧光强度，可以获得待测物的浓度信息；通过不同孔径控制反应物的分离，原理简单，配合可分离的多层试剂管，操作简单，结果准确度高，不需大型设备且可以同时完成多组检测，自动化或人工操作均可。
附图说明
图1为本发明的检测装置的爆炸图结构示意图；
图2为本发明的方法流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明涉及一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法。
本发明中，高分子多孔膜，又称为高分子分离膜，是一种能分离微小粒子、分子及离子等微物质的分离材料；从分离物质的尺寸上看，它可分离尺寸小于1nm的微物质；从分离物质的分子量上看，它可分离分子量小于100的小分子。在微物质分离材料中，除少量为无机高分子和金属材料外，主要为高分子材料，属于功能性高分子聚合物；
进一步来说，高分子分离膜属于微观分离，可分离分子级大小的物质如无机离子、分子量小于100的分子、细菌及病毒等，按照功能可分为选择性透过膜、渗透膜、反渗透膜、超滤膜、微滤膜和离子交换膜等，按照内部结构不同可分为多孔膜和致密膜两种，其中，致密膜的内部致密无孔隙，常用的离子交换膜、渗透膜、反渗透膜及气体分离膜都属于致密膜，而多孔膜的内部则含有很多微小孔隙，微孔过滤膜及超滤膜都属于此类膜；
其中，微孔过滤膜是一种内部含有许多微孔且孔径分布比较均匀的高分子膜，其孔径一般在0.03~65um之间，可按孔径大小分离质子或粒子。
本发明中，方法、装置及应用主要涉及免疫竞争法，其一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，针对待测抗原上的同一抗原表位，分别用荧光标记的抗体先后和同一抗原结合，样本溶液中的待测抗原占据荧光标记抗体的表位后，通过对应的膜进行过滤，没有与抗原结合的过量荧光标记抗体则与膜上的抗原结合并被吸附在膜上，实现了结合待测抗原与未结合抗原的荧光标记抗体的分离。
所述方法包括以下步骤。
步骤1：获取检测样本，所述检测样本中含有待测抗原Ag。
步骤2：基于待测抗原，配置过量的进行荧光标记的特异性抗体Ab+；将检测样本和抗体Ab+混合并充分反应，获得混合溶液A。
本发明中，为了保证检测样本中的待测抗原的检测值准确，需要配置过量的特异性抗体Ab+，保证反应的充分。
本发明中，对于过量的定义，可以由本领域技术人员根据检测样本的实际情况进行判断处理，一般为额定用量的1.5-3倍。
步骤3：将混合溶液A以第一多孔膜层1分离，第一多孔膜层1分离直径大于预设直径的大细胞和/或大蛋白，得到混合溶液B。
所述混合溶液B包括检测样本和抗体Ab+混合后得到的Ag-Ab+和过量的抗体Ab+。
所述第一多孔膜层1的膜孔直径小于5μm。
本发明中，第一多孔膜层1主要用于粗过滤，过滤μm级别的体液、或血液中的红细胞、白细胞等大型细胞、杂质，一般大于1um以上。
步骤4：在第二多孔膜层2上设置抗原Ag的竞争性抗原Ag’ 3。
所述竞争性抗原Ag’ 3固定于第二多孔膜层2上。
所述竞争性抗原Ag’ 3与抗原Ag同源。
步骤4中，第二多孔膜层2的膜孔直径大于抗原Ag和特异性抗体Ab+结合后的结合物的直径。
本发明中，以竞争性抗原Ag’ 3对过量的Ag+进行拦截，由于竞争性抗原Ag’ 3直接固定在第二多孔膜层2上，无法通过膜孔流下，即使得两种结合物Ag-Ab+和Ag’-Ab+可以被分离。
本发明中，确切地说，竞争性抗原Ag’ 3固定在第二多孔膜层2上且过量设置。
步骤5：将混合溶液B以第二多孔膜层2分离，检测荧光强度，获得检测样本中待测抗原的浓度。
步骤5包括以下步骤：
步骤5.1：将混合溶液B以第二多孔膜层2分离，第二多孔膜层2将混合溶液B分离为Ag-Ab+和Ag’-Ab+；
步骤5.2：检测分离到Ag-Ab+的混合物的荧光强度，获得Ag-Ab+的浓度；
步骤5.3：基于步骤5.2的结果，获得检测样本中待测抗原的浓度。
本发明中，第二多孔膜层2主要用于分离提取不同直径大小的待测物，其精度需要进行预判。
本发明中，由于竞争性抗原Ag’ 3直接固定设置于第二多孔膜层2上，故第二多孔膜层2直接拦截与抗原Ag或竞争性抗原Ag’ 3结合后的结合物，进而减少对第二多孔膜层2的孔径大小精度的要求。
本发明中，步骤5.2的检测针对第二多孔膜层2下的荧光强度。
本发明还涉及采用所述的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法的检测装置，所述检测装置包括自上而下可拆卸设置的第一分离腔4、第二分离腔5和第三分离腔6；
所述第一分离腔4包括第一腔壁7及设于第一腔壁7底部的第一多孔膜层1，所述第一腔壁7顶部可拆卸设有盖体8；
所述第二分离腔5包括第二腔壁9及设于第二腔壁9底部的第二多孔膜层2，所述第二腔壁9的顶部通过第一多孔膜层1与第一分离腔4空间连通，所述第二多孔膜层2上设有竞争性抗原Ag’ 3；
所述第三分离腔6的顶部通过第二多孔膜层2与第二分离腔5空间连通。
本发明中，将第一分离腔4、第二分离腔5和第三分离腔6自上而下组合在一起，相邻的腔体间以多孔膜层进行分隔，其中，第一多孔膜层1的膜孔直径小于5μm，第二多孔膜层2的膜孔直径大于抗原Ag和特异性抗体Ab+结合后的结合物的直径。
本发明中，第一分离腔4、第二分离腔5和第三分离腔6可以拆卸的组装在一起，可以通过边缘处进行螺纹连接或凹凸扣进行扣合，此为本领域技术人员容易理解的内容，本领域技术人员可以依据需求自行设置。
本发明中，在任一分离腔中处理完毕后，即可以卸除不需要的分离腔，保留需要进行检测荧光强度的分离腔或多孔膜层即可，以本发明为例，采用在第二多孔膜层2上固定设置竞争性抗原Ag’ 3的形式，故实际为检测第二多孔膜层2的膜下荧光强度。
本发明还涉及一种采用所述的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法的应用，所述基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法应用于针对小分子抗原的荧光竞争法免疫检测。
所述小分子抗原的直径为20-100纳米。
本发明一般应用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原。
本发明获取含有待测小分子抗原Ag的检测样本，基于待测抗原配置过量的进行荧光标记的特异性抗体Ab+，混合并充分反应后获得混合溶液A，以第一多孔膜层1分离直径大于预设直径的大细胞和/或大蛋白，得到混合溶液B，在第二多孔膜层2上设置抗原Ag的竞争性抗原Ag’ 3，将混合溶液B以第二多孔膜层2分离，竞争性抗原Ag’结合过量的抗体Ab+，检测荧光强度，获得检测样本中待测抗原的浓度。
本发明利用高分子多孔膜的不同分离尺寸，对免疫层析过程不同颗粒进行分离，从而获取被标记的待测物抗原，通过检测荧光强度，可以获得待测物的浓度信息；通过不同孔径控制反应物的分离，原理简单，配合可分离的多层试剂管，操作简单，结果准确度高，不需大型设备且可以同时完成多组检测，自动化或人工操作均可。

Claims (10)

1.一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
步骤1：获取检测样本，所述检测样本中含有待测抗原Ag；
步骤2：基于待测抗原，配置过量的进行荧光标记的特异性抗体Ab+；将检测样本和抗体Ab+混合并充分反应，获得混合溶液A；
步骤3：将混合溶液A以第一多孔膜层分离，第一多孔膜层分离直径大于预设直径的大细胞和/或大蛋白，得到混合溶液B；
步骤4：在第二多孔膜层上设置抗原Ag的竞争性抗原Ag’；
步骤5：将混合溶液B以第二多孔膜层分离，检测荧光强度，获得检测样本中待测抗原的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法，其特征在于：所述混合溶液B包括检测样本和抗体Ab+混合后得到的Ag-Ab+和过量的抗体Ab+。
3.根据权利要求1所述的一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法，其特征在于：所述竞争性抗原Ag’固定于第二多孔膜层上。
4.根据权利要求3所述的一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法，其特征在于：步骤4中，第二多孔膜层的膜孔直径大于抗原Ag和特异性抗体Ab+结合后的结合物的直径。
5.根据权利要求4所述的一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法，其特征在于：步骤5包括以下步骤：
步骤5.1：将混合溶液B以第二多孔膜层分离，第二多孔膜层将混合溶液B分离为Ag-Ab+和Ag’-Ab+；
步骤5.2：检测分离到Ag-Ab+的混合物的荧光强度，获得Ag-Ab+的浓度；
步骤5.3：基于步骤5.2的结果，获得检测样本中待测抗原的浓度。
6.根据权利要求1所述的一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法，其特征在于：所述竞争性抗原Ag’与抗原Ag同源。
7.根据权利要求1所述的一种基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法，其特征在于：所述第一多孔膜层的膜孔直径小于5μm。
8.一种采用权利要求1~7之一所述的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法的检测装置，其特征在于：所述检测装置包括自上而下可拆卸设置的第一分离腔、第二分离腔和第三分离腔；
所述第一分离腔包括第一腔壁及设于第一腔壁底部的第一多孔膜层，所述第一腔壁顶部可拆卸设有盖体；
所述第二分离腔包括第二腔壁及设于第二腔壁底部的第二多孔膜层，所述第二腔壁的顶部通过第一多孔膜层与第一分离腔空间连通，所述第二多孔膜层上设有竞争性抗原Ag’；
所述第三分离腔的顶部通过第二多孔膜层与第二分离腔空间连通。
9.一种采用权利要求1~7之一所述的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法的应用，其特征在于：所述基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法应用于针对小分子抗原的荧光竞争法免疫检测。
10.根据权利要求9所述的基于双层多孔膜的荧光竞争法免疫检测方法的应用，其特征在于：所述小分子抗原的直径为20-100纳米。
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