JP6237031B2 - 成分分離方法、成分分析方法及び成分分離装置 - Google Patents

Description

本発明は、目的成分を他の成分から分離する方法及びその装置、並びに、目的成分の分析方法に関する。

近年、マイクロ流路内における安定な層流を用いた連続的な粒子分離方法が開発されている。特許文献１及び特許文献２には、水力学的濾過法を用いた分離方法が開示されている。
また、非特許文献１には、水力学的濾過法を用いて希釈血液から赤血球と白血球を分離し、同時に白血球を濃縮することが開示されている。

特開２００７−２１４６５号公報 特開２００７−１７５６８４号公報

電学論Ｅ ２００８年 １２８巻１０号

特許文献１，２並びに非特許文献１に記載の分離方法では、液体が好適に流れる寸法のマイクロ流路を用いていることから、マイクロ流路の内径に対して極端に小さな分子や細胞等を分離精製するのは困難である。また、外形寸法の差が小さい２成分を精度よく分離することも困難である。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、寸法差による分離が困難な成分を水力学的濾過法を用いて精度よく分離精製することである。また、本発明の別の目的は、寸法差による分離が困難な成分を水力学的濾過法を用いて精度よく分離精製された目的成分を用いた成分分析方法を提供することである。

本発明の一態様は、目的成分を含み得る液性の混合物である試料に対して、前記目的成分に対して特異性を有するアフィニティービーズおよび第二アフィニティービーズを添加し、前記混合物と前記アフィニティービーズと前記第二アフィニティービーズとを含む混合液を主流路に流し、前記アフィニティービーズと前記第二アフィニティービーズとが結合した前記目的成分を、前記主流路に接続された複数の分岐流路の一部に、水力学的濾過法により選択的に導入する成分分離方法である。

本発明の他の態様は、目的成分および第二目的成分を含み得る液性の混合物である試料に対して、前記目的成分に対して特異性を有するアフィニティービーズと、前記第二目的成分に対して特異性を有する第二アフィニティービーズを添加し、前記混合物と前記アフィニティービーズと前記第二アフィニティービーズとを含む混合液を主流路に流し、水力学的濾過法により、前記アフィニティービーズと結合した前記目的成分を前記主流路に接続された複数の分岐流路の一部に選択的に導入し、かつ前記第二アフィニティービーズと結合した前記第二目的成分を、前記複数の分岐流路の一部であって前記アフィニティービーズと結合した前記目的成分とは異なる分岐流路に選択的に導入する成分分離方法である。

前記アフィニティービーズと前記第二アフィニティービーズとは互いに粒子径が異なってもよい。

前記目的成分が細胞と細胞由来成分との少なくともいずれかを含んでいてよい。
前記細胞由来成分が細胞特異的マーカーであってもよい。

本発明の別の態様は、上記態様の成分分離方法を用いた成分分析方法であって、前記目的成分に特異性を有するように選択された物質を有する前記アフィニティービーズと、前記アフィニティービーズ上の前記物質とは異なる結合特異性を前記目的成分に対して有する第二の物質と標識物質との複合体と、前記試料とを混合し、分離された前記アフィニティービーズにおける前記標識物質による標識活性を測定する成分分析方法である。

本発明のさらに別の態様は、上記態様の成分分離方法を用いた成分分析方法であって、前記目的成分に特異性を有するように選択された物質を有する前記アフィニティービーズと、標識物質を含み前記物質と前記目的成分との結合を競合阻害可能な構造を有する複合体と、前記試料とを混合し、分離された前記アフィニティービーズにおける前記標識物質による標識活性を測定する成分分析方法である。

本発明のさらに別の態様は、目的成分に対する特異性を有するアフィニティービーズおよび第二アフィニティービーズと、主流路と、前記主流路に接続された複数の分岐流路とを有し、前記前記アフィニティービーズおよび前記第二アフィニティービーズを含む混合液から前記アフィニティービーズを水力学的濾過法により分離する流路チップと、前記混合液の溶媒と組成が異なり前記流路チップに供給され前記流路チップの一部の流路において前記混合液に対して層流をなして流通可能な緩衝液と、を備えた成分分離装置である。

本発明によれば、寸法差による分離が困難な成分を水力学的濾過法を用いて精度よく分離精製することができる。

本発明の第１実施形態の成分分離装置を示す模式図である。 同実施形態の成分分離装置の作用を説明するための図である。 本発明の第２実施形態の成分分離装置を示す模式図である。 同実施形態の他の構成例の成分分離装置を示す模式図である。 同実施形態のさらに他の構成例の成分分離装置を示す模式図である。 第１実施形態の成分分離装置を用いた実施例を説明するための図である。 同実施形態の成分分離装置を用いた他の実施例を説明するための図である。 同実施形態の成分分離装置を用いたさらに他の実施例を説明するための図である。

（第１実施形態）
本発明の第１実施形態について説明する。
まず、本実施形態の成分分離方法に用いる成分分離装置１の構成について説明する。図１は、本実施形態の成分分離装置を示す模式図である。

図１に示すように、成分分離装置１は、分離する対象となる目的成分５２に対して特異性を有するアフィニティービーズ２と、アフィニティービーズ２を含む混合液５０が流れるマイクロ流路７が形成された流路チップ５と、流路チップ５のマイクロ流路７に注入される緩衝液２３とを有する。

アフィニティービーズ２は、単一の粒子径を有する略球状部材である。アフィニティービーズ２は、アフィニティービーズ２の粒子径を規定するビーズ本体３と、ビーズ本体３の外面に固定された抗体４とを有する。

ビーズ本体３は、任意の粒子径から適宜選択された単一の粒子径を有する略球状部材である。ビーズ本体３の粒子径は、流路チップ５に形成されたマイクロ流路７の内径に対応して選択される。また、ビーズ本体３の粒子径は、目的成分５２以外に試料５１に含まれる粒子の径とは異なっていることが好ましい。
本実施形態では、複数のアフィニティービーズ２を用いて目的成分５２の分離を行う。このため、各アフィニティービーズ２は、比重が揃っていることが好ましい。すなわち、ビーズ本体３は、単一材料からなる樹脂部材や、複数の樹脂が均一に混練された樹脂部材あるいは単一材料からなる金属・無機部材や、複数の金属部材が均一に混練された金属・無機部材等から形成される。
また、ビーズ本体３は、中実であってもよいし、中空であってもよいし、多孔質であってもよい。たとえばビーズ本体３が多孔質であると、抗体４を固定可能な表面積が広くとれる。
ビーズ本体３の材質として、高分子ポリマーが選択されてよい。具体的には、ビーズ本体３は、ポリスチレンやラテックス等からなる。ビーズ本体３の外面には、カルボキシル基が露出していることが好ましい。本実施形態では、ビーズ本体３の外面のカルボキシル基がスクシンイミドで活性化され、抗体４との結合性が高められている。

抗体４は、目的成分５２に対して特異性を有する抗体であれば、構成は特に限定されない。また、目的成分５２に対する特異性を高める目的で、ビーズ本体３の外面に固定される抗体４はモノクローナル抗体であってよい。また、目的成分５２に対する結合可能性を高める目的で、ビーズ本体３の外面に固定される抗体４は、ポリクローナル抗体であってよい。なお、ビーズ本体３の外面に固定される抗体４はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのいずれでも構わないが、量産性を考慮するとＩｇＧ抗体若しくはＩｇＭ抗体が好ましい。
また、目的成分５２以外に対する非特異的結合を防ぐ目的で、ビーズ本体３の外面に固定される抗体４はＦａｂフラグメントであってもよい。

流路チップ５は、たとえば、非特許文献１に開示されたマイクロチャネルを好適に適用できる。
本実施形態における流路チップ５は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の樹脂製基板に所定形状をなすマイクロ流路７がパターン形成された本体部６ａと、マイクロ流路７に蓋をするように本体部６ａに固定されたガラス板等による蓋部６ｂとを有する。

マイクロ流路７は、目的成分５２を含みうる液性の混合物である試料５１とアフィニティービーズ２とを含んだ混合液５０が注入される第一インレット８と、第一インレット８に連通し直線状に延びる主流路９と、緩衝液２３を主流路９に注入するために主流路９に連通して設けられた第二インレット１０と、主流路９の最下流において主流路９に連通された第一アウトレット１１と、主流路９から分岐して直線状に延びる複数の分岐流路１２と、分岐流路１２の最下流において各分岐流路１２に連通された第二アウトレット１８とを有する。

主流路９の断面形状は、略矩形形状であってよい。本実施形態では、主流路９の断面形状は、幅５０マイクロメートル、長さ７ｍｍに設定されている。

第二インレット１０は、主流路９のうち第一インレットの下流であって分岐流路１２の上流にある領域において主流路９に接続されている。

第一アウトレット１１は、第二アウトレット１８において分離されなかった残り成分を貯留するための貯留部である。本実施形態では、第一アウトレット１１には、主に、アフィニティービーズ２よりも粒子径が大きな成分と、緩衝液２３とが貯留される。

複数の分岐流路１２は、長さ、幅、深さ、径などのスケールのうちいずれか１つ以上が適切に調節された流路を１つ以上有する流路構造を有する。複数の分岐流路１２は、主流路９の上流側に接続された第一分岐流路１３と、主流路９と第一分岐流路１３との接続部よりも下流において主流路９に接続された第二分岐流路１４とを有する。複数の分岐流路１２は、主流路９の流通方向に直交する断面において、第二インレット１０と主流路９との接続部に対向する位置で主流路９に対して接続されている。

第一分岐流路１３は、ある一定の大きさ以上のアフィニティービーズ２が第一分岐流路１３に導入されないように、長さ、幅、深さ、径などのスケールのうちいずれか１つ以上が適切に調節された流路を１つ以上有する流路構造を有する。第一分岐流路１３は、試料５１とアフィニティービーズ２との混合液５０から、アフィニティービーズ２よりも粒子径が小さい成分を除去するための流路である。
第一分岐流路１３の寸法は、上流側において相対的に細く、下流側において相対的に太い。具体的には、第一分岐流路１３における上流側の細い部分は幅１５μｍ、下流側の太い部分は幅２５μｍとされている。また、第一分岐流路１３全体の長さは１４ｍｍとされている。また、本実施形態では、１００本の第一分岐流路１３が主流路９に接続されている。

第二分岐流路１４は、アフィニティービーズ２が主流路９から引き込まれ得る断面形状及び寸法を有する流路である。第二分岐流路１４は、長さ、幅、深さ、径などのスケールのうちいずれか１つ以上が適切に調節された流路を１つ以上有する流路構造を有する。
第二分岐流路１４は、第二分岐流路１４と主流路９との分岐点においてある一定の大きさ以上の粒子が第二分岐流路１４に導入されないようにすることができ、ある一定の大きさ以下の粒子も第二分岐流路１４より下流へと導入されないようにすることができる。すなわち、本実施形態では、主流路９を通じて導入された全てのある一定の大きさ以下の粒子を含む流体、もしくはある一定の大きさ以上の粒子を全く含まない流体が、第二分岐流路１４から回収され得る。
第二分岐流路１４は、流通方向に沿う長さが互いに異なる一号分岐流路１５、二号分岐流路１６、及び三号分岐流路１７を有する。本実施形態では、一号分岐流路１５が最も長く、二号分岐流路１６が続いて長く、三号分岐流路１７が最も短い。一号分岐流路１５、二号分岐流路１６、及び三号分岐流路１７の流路幅は、アフィニティービーズ２の粒径に対応して設定されている。一例を挙げると、一号分岐流路１５は、一号分岐流路１５における上流側において相対的に細く、下流側において相対的に太い。具体的には、一号分岐流路１５における上流側の細い部分は幅２５μｍ、下流の太い部分は幅３５μｍとされている。また、一号分岐流路１５全体の長さは１７ｍｍとされており、本実施形態では１０本の一号分岐流路１５が主流路９に接続されている。
また、二号分岐流路１６は、二号分岐流路１６における上流側において相対的に細く、下流側において相対的に太い。具体的には、二号分岐流路１６における上流側の細い部分は幅２５μｍ、下流の太い部分は幅３５μｍとされている。また、二号分岐流路１６全体の長さは７ｍｍとされており、本実施形態では１０本の二号分岐流路１６が主流路９に接続されている。
また、三号分岐流路１７は、三号分岐流路１７における上流側において相対的に細く、下流側において相対的に太い。具体的には、三号分岐流路１７における上流側の細い部分は幅２５μｍ、下流の太い部分は幅３５μｍとされている。また、三号分岐流路１７全体の長さは３ｍｍとされており、本実施形態では１０本の三号分岐流路１７が主流路９に接続されている。

第二アウトレット１８は、アフィニティービーズ２の粒子径に満たない径の粒子成分とアフィニティービーズ２とを分取するための貯留部である。第二アウトレット１８は、第一分岐流路１３の下流に接続された一号アウトレット１９と、一号分岐流路１５の下流に接続された二号アウトレット２０と、二号分岐流路１６の下流に接続された三号アウトレット２１と、三号分岐流路１７の下流に接続された四号アウトレット２２とを有する。
本実施形態では、一号アウトレット１９にはアフィニティービーズ２の粒子径に満たない径の粒子成分が貯留され、二号アウトレット２０と、三号アウトレット２１と、四号アウトレット２２とは、アフィニティービーズ２の粒子径に応じてアフィニティービーズ２が貯留される。

緩衝液２３は、アフィニティービーズ２に対して特異的に結合する物質を含まず、且つ試料５１を変性させない組成を有する液体である。特に、本実施形態の緩衝液２３は、目的成分５２におけるエピトープの構造と、抗体４における抗原認識部位との両方に対して、特異性の低下につながる影響を与えない組成であることが好ましい。さらに、緩衝液２３は、アフィニティービーズ２と試料５１との混合液５０とともに主流路９を流れるときに好適に２層の層流を形成するように、組成が選択されてよい。

上記の成分分離装置１の作用について、本実施形態の成分分離方法とともに説明する。図２は、本実施形態の成分分離装置１の作用を説明するための図である。
図２に示すように、本実施形態の成分分離装置１は、所定の粒子径を有するアフィニティービーズ２に対する目的成分５２の特異的結合と、水力学的濾過法による粒子径に応じたアフィニティービーズ２の分離との組み合わせによって、アフィニティービーズ２に対して特異性を有する目的成分５２を、目的成分５２を含み得る液性の混合物（試料５１）から分離する。

具体的には、まず、第二インレット１０に緩衝液２３を注入し、第二インレット１０に緩衝液２３が注入されている状態で、もしくは同時に、第一インレット８に、試料５１とアフィニティービーズ２とを混合してなる混合液５０を注入する。すると、主流路９には、試料５１とアフィニティービーズ２との混合液５０と緩衝液２３とが層となる２層の層流構造が生じる。試料５１とアフィニティービーズ２との混合液５０は主流路９の流通方向に直交する断面において分岐流路１２に近い側を流れるので、混合液５０の一部は分岐流路１２に入り込む。このとき、分岐流路１２の断面の形状及び寸法に応じて、混合液５０は、粒子径ごとに分画される。

本実施形態では、第一分岐流路１３には、アフィニティービーズ２の粒子径よりも小さい粒子径を有する成分が流れ込む。さらに、第二分岐流路１４には、アフィニティービーズ２を含む成分が流れ込む。

アフィニティービーズ２には、試料５１中の目的成分５２に対して特異性を有する抗体４が固定されているので、第二分岐流路１４において分離されたアフィニティービーズ２には、目的成分５２が結合している。

目的成分５２が結合しているアフィニティービーズ２を回収して、必要に応じて公知の方法により洗浄し、公知の方法によってアフィニティービーズ２から目的成分５２を溶出することにより、目的成分５２を高純度に得ることができる。なお、目的成分５２が結合しているアフィニティービーズ２が、回収後の処理に必要な程度に緩衝液２３によって洗浄されていれば、アフィニティービーズ２の回収後に別途洗浄をしなくてもよい場合もある。

本実施形態の成分分離装置１では、目的成分５２自体がその大きさによる分離が困難な大きさの成分であっても、目的成分５２に特異的に結合するアフィニティービーズ２をその大きさによって試料５１から分離することで、目的成分５２を試料５１中から分離することができる。
また、目的成分５２と他の成分との大きさに顕著な差がない場合でも、アフィニティービーズ２が結合した目的成分５２は、当該他の成分よりも顕著に大きな差を有する複合体となるので、目的成分５２が高純度に分離される。

（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態について説明する。図３は、本実施形態の成分分離装置を示す模式図である。図４は、本実施形態の他の構成例の成分分離装置を示す模式図である。図５は、本実施形態のさらに他の構成例の成分分離装置を示す模式図である。
本実施形態では、成分分離装置における流路チップの構成が上記第１実施形態と異なっている。すなわち、本実施形態では、アフィニティービーズ２の分離手法が上記第１実施形態と異なっている。

（構成例１）
図３に示すように、本構成例の成分分離装置における流路チップ５Ａは、渦巻き状に形成されたマイクロ流路を有している。本構成例の成分分析装置では、目的成分を含み得る試料をマイクロ流路において渦巻きの中心側の端から流すことにより流路内にディーン渦を発生させることにより、マイクロ流路における渦巻きの中心側と外側とに粒子径に応じて各粒子を分離する。
このような構成であっても上記実施形態の成分分離装置１と同様に目的成分を他の成分から分離することができる。

（構成例２）
図４に示すように、本構成例の成分分離装置における流路チップ５Ｂは、２つのインレットが集合されて第１実施形態と同様に層流を形成する主流路に対し粒子懸濁液（第一のインレット）よりもシース液量（第二のインレット）を相対的に多く流すことにより、ピンチ部分で流路壁に整列した粒子が流路壁から粒子中心位置の差を生じ、この差がピンチ部下流で増幅され、粒子の流れと垂直な方向に粒子径に応じた分離が可能であるため、主流路の下流側の端に連通され複数方向へ分岐された分岐流路で各粒子を回収する。
本構成例では、２つのインレットの一方に試料及びアフィニティービーズを注入し、２つのインレットの他方に緩衝液を注入する。
このような構成であっても上記実施形態の成分分離装置１と同様に目的成分を他の成分から分離することができる。

（構成例３）
図５に示すように、本構成例の成分分離装置における流路チップ５Ｃは、移動弾性表面波を発生させる電極部と、電極部の近傍に配された主流路と、主流路の一端に設けられた第一インレット及び第二インレットと、主流路の他端に設けられた分岐流路とを有する。
本変形例では、流路内を流れる細胞その他の粒子に対して移動弾性表面波が到達すると、粒子径に応じて主流路内で各粒子が移動されて、粒子径に応じて分岐流路にて分取できる。
このような構成であっても上記実施形態の成分分離装置１と同様に目的成分を他の成分から分離することができる。

次に、以下に示す各実施例に基づいて、上記第１実施形態の成分分離装置１及び成分分離方法についてより詳細に説明する。図６は、第１実施形態の成分分離装置を用いた実施例を説明するための図である。図７は、同実施形態の成分分離装置を用いた他の実施例を説明するための図である。図８は、同実施形態の成分分離装置を用いたさらに他の実施例を説明するための図である。

ヒト前立腺抗原（ＰＳＡ）に対するモノクローナル抗体１Ｈ１２（ハイテスト）を粒径２．８μｍのビーズ（ダイナビーズ、インビトロジェン）に固定化し、１Ｈ１２とは異なるＰＳＡのエピトープを認識するモノクローナル抗体５Ａ６（ハイテスト）を１０μｍのビーズ（コアビーズ）に固定化した。
０、４、１０ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ（図６に符号２４で示す）と、１Ｈ１２標識ビーズ（図６に符号２５で示す）と、５Ａ６標識ビーズ（図６に符号２６で示す）を含むＰＢＳを、室温にてインキュベートし第一インレット８に３０μＬ／ｍＬで注入し、緩衝液２３となるＰＢＳＴを第二インレット１０に３０μＬ／ｍＬで注入した。
すると、粒径２．８μｍの抗体標識ビーズ２５が一号アウトレット１９へ、粒径１０μｍの抗体標識ビーズ２６が二号アウトレット２０へ、ＰＳＡを介して両ビーズ２５，２６の抗体が結合した複合体ビーズ（図６に符号２７で示す）が三号アウトレット２１及び四号アウトレット２２へそれぞれ分離された。三号アウトレット２１及び四号アウトレット２２において検出される複合体ビーズはＰＳＡの濃度に応じて増加した。
本実施例では、複合体ビーズ２７は、粒径２．８μｍの抗体標識ビーズ２５と粒径１０μｍの抗体標識ビーズ２６とのどちらよりも大きいので、複合体ビーズ２７、粒径２．８μｍの抗体標識ビーズ２５、及び粒径１０μｍの抗体標識ビーズ２６が混合された混合液から複合体ビーズを分離できる。

ヒトＥｐＣＡＭに対する抗体を固定化したビーズ（粒径３μｍ、ＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅＴＭＭＣ２９００、コスモバイオ）、及び目的成分５２である大腸癌細胞（ＨＴ−２９）を希釈した血液に加え、室温にてインキュベートした。
図７に示すように、第一インレット８に抗体標識ビーズ（図７に符号２８で示す）を含む希釈血液を３０μＬ／ｍＬで注入し、第二インレット１０に緩衝液であるＰＢＳＴを３０μＬ／ｍＬで注入した。
すると、赤血球（図７にＲＢＣと示す）及び抗体標識ビーズ２８が一号アウトレット１９へ、白血球（図７にＷＢＣと示す）が二号アウトレット２０及び三号アウトレット２１へ、大腸癌細胞が結合した抗体標識ビーズ２８が四号アウトレット２２へそれぞれ分離された。
なお、本実施例の方法を患者由来の試料５１に適用した場合、ヒトＥｐＣＡＭはヒト上皮細胞もしくはヒト上皮系腫瘍細胞に発現し、特にヒト上皮系腫瘍細胞に高発現であるので、ヒト上皮系腫瘍細胞をＥｐＣＡＭ標識ビーズを用いて精度よく分離できる。

ヒトＣＤ６３に対する抗体を固定化したビーズ（粒径２．８μｍ、ダイナビーズ）、ヒトＩｇＧに対する抗体（ミリポア、ＡＰ１１２）、及びヒト血清アルブミンに対する抗体（アブカム、ａｂ２４０６）を固定化したビーズ（粒径１０μｍ、コアビーズ）を希釈した血清に加え、室温にてインキュベートした。
図８に示すように、抗ＣＤ６３抗体標識ビーズ（図８に符号２９で示す）及びｈＩｇＧ抗体標識ビーズ（図８に符号３０で示す）、及び抗ヒト血清アルブミン抗体標識ビーズ（図８に符号３１で示す）を含む希釈血清を第一インレット８に３０μＬ／ｍＬで注入し、緩衝液であるＰＢＳを第二インレット１０に３０μＬ／ｍＬで注入した。
すると、抗ＣＤ６３抗体標識ビーズ２９が一号アウトレット１９へ、エクソソーム３２がＣＤ６３を介して結合した抗ＣＤ６３抗体標識ビーズ２９が二号アウトレット２０へ、ヒトＩｇＧ３３、αマクログロブリン３４が結合したｈＩｇＧ抗体標識ビーズ３０，３１が三号アウトレット２１及び四号アウトレット２２へそれぞれ分離された。

上記実施形態及び各実施例に示した方法及び装置によれば、アフィニティービーズ２の大きさという単純な物理的特性と抗体４などの特性の高い親和分子を組み合わせることにより、目的成分５２となる分子をその分子の大きさではなくアフィニティービーズ２の粒子径を用いて分離することができる。

例えば、サンドイッチイムノアッセイ可能な捕捉抗体を結合させたビーズをアフィニティービーズとして採用し、このアフィニティービーズと、酵素等により標識した標識抗体とを共に試料に混合し、上記の装置を用いて、未反応の標識抗体と、抗原抗体反応による生じたビーズ複合体とを水力学的濾過により分離計測すれば、ビーズ複合体あたりの標識活性を検出することにより、抗原抗体反応性を定量することも可能である。
同様に、特定のエピトープに特異性を有する抗体が結合されたビーズと、酵素等により標識された抗原と、試料とを混合して、上記の装置を用いて、ビーズ複合体を水力学的濾過により他の成分から分離することもできる。この場合、試料中の目的成分とビーズ上の抗体との結合を、標識された抗原が競合的に阻害するので、水力学的濾過により分離計測したビーズ複合体あたりの標識活性を競合的に検出して試料中の抗原量を定量することも可能である。

さらにまた、異なった大きさのビーズに、サンドイッチイムノアッセイ可能な捕捉抗体と検出抗体をそれぞれ標識しておき、抗原とのサンドイッチ反応に伴うビーズ複合体は未反応抗体標識ビーズよりも粒径が大きくなることから、未反応抗体標識ビーズと抗原抗体反応によるビーズ複合体を水力学的濾過により分離計測すれば、抗原抗体反応性を複合体ビーズ粒子数として検出、定量することも可能である。その際、ビーズ粒径の種類を複数用意すれば、同時に複数の抗原を分析することも可能である。
たとえば、サンドイッチ反応における各ビーズの径が５マイクロメートであるとすると、結合が起こっていない各ビーズの径は５マイクロメートルであり、サンドイッチ反応により複合体化すると１０マイクロメートル程度以上になる。これにより、非特許文献１において開示された赤血球と白血球との径の差と略同様の差が、未結合ビーズとビーズ複合体との間に生じる。これにより、非特許文献１に開示されたマイクロチャネルの構成を用いて目的成分の分離を好適に行うことができる。

また、別な応用例としては、任意の抗体を標識したビーズと生体サンプルを反応させ、その抗体に特異的に結合する表面抗原を有する例えば循環型癌細胞などを抗体の種類とそれに対応したビーズの粒子径に基づいて分離、調製することも可能である。

さらには、細胞から分泌される小胞で、その機能が注目されているエクソソームなど細胞由来成分の分離に応用することができる。エクソソームは従来、煩雑な超遠心分離や密度勾配超遠心分離法で分取されているが、均一でなく、調製の再現性、品質に問題がある。抗ＣＤ６３抗体標識磁性ビーズを用いるアフィニティー分離法も市販されているが、調製には時間がかかる。抗ＣＤ６３抗体等のエクソソームに結合する抗体を標識したビーズと水力学的濾過を用いることによりエクソソームを簡便に分離することができる。また、抗ＩｇＧ、ヒト血清アルブミン抗体を標識したビーズによるアバンダント蛋白質を除去することにより、従来法よりもより簡便に均質なエクソソームを分取することができる。これによりエクソソーム機能解析や新規バイオマーカーの発見が加速される。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
たとえば、目的成分が抗体である場合には、ビーズ本体には、目的分子となる抗体に特異的に結合可能な抗原が結合されてよい。また、ビーズ本体に結合される物質と目的成分との関係は、受容体に対するリガンドなど相互作用に関わる分子、或いはアプタマーのような蛋白質以外の分子であってもよい。
目的成分に特異性を有する物質の例としては、上記実施形態で説明した抗体の他に、ペプチド、アプタマー、オレイル鎖を含む化合物、並びに脂質特異的に結合可能な物質、あるいは低分子化合物等を挙げることができる。

本発明は研究用試薬、診断薬用前処理試薬に用いるタンパクの分離、精製に利用することが可能である。

１ 成分分離装置
２ アフィニティービーズ
３ ビーズ本体
４ 抗体
５ 流路チップ
６ａ 本体部（ＰＤＭＳ）
６ｂ 蓋部（ガラス板）
７ マイクロ流路
８ 第一インレット
９ 主流路
１０ 第二インレット
１１ 第一アウトレット
１２ 分岐流路
１３ 第一分岐流路
１４ 第二分岐流路
１５ 一号分岐流路
１６ 二号分岐流路
１７ 三号分岐流路
１８ 第二アウトレット
１９ 一号アウトレット
２０ 二号アウトレット
２１ 三号アウトレット
２２ 四号アウトレット
２３ 緩衝液
２４ ＰＳＡ
２５ １Ｈ１２標識ビーズ
２６ ５Ａ６標識ビーズ
２７ 複合体ビーズ
２８ 抗ＥｐＣＡＭ抗体標識ビーズ
２９ 抗ＣＤ６３抗体標識ビーズ
３０ 抗ｈＩｇＧ抗体標識ビーズ
３１ 抗ヒト血清アルブミン抗体標識ビーズ
３２ エクソソーム
３３ ヒトＩｇＧ抗体
３４ αマクログロブロン
５０ 混合液
５１ 試料
５２ 目的成分

Claims (8)

1. 目的成分を含み得る液性の混合物である試料に対して、前記目的成分に対して特異性を有するアフィニティービーズおよび第二アフィニティービーズを添加し、
   前記混合物と前記アフィニティービーズと前記第二アフィニティービーズとを含む混合液を主流路に流し、
   前記アフィニティービーズと前記第二アフィニティービーズとが結合した前記目的成分を、前記主流路に接続された複数の分岐流路の一部に、水力学的濾過法により選択的に導入する成分分離方法。
2. 目的成分および第二目的成分を含み得る液性の混合物である試料に対して、前記目的成分に対して特異性を有するアフィニティービーズと、前記第二目的成分に対して特異性を有する第二アフィニティービーズを添加し、
   前記混合物と前記アフィニティービーズと前記第二アフィニティービーズとを含む混合液を主流路に流し、
   水力学的濾過法により、前記アフィニティービーズと結合した前記目的成分を前記主流路に接続された複数の分岐流路の一部に選択的に導入し、かつ前記第二アフィニティービーズと結合した前記第二目的成分を、前記複数の分岐流路の一部であって前記アフィニティービーズと結合した前記目的成分とは異なる分岐流路に選択的に導入する成分分離方法。
3. 前記アフィニティービーズと前記第二アフィニティービーズとは互いに粒子径が異なる、請求項１または２に記載の成分分離方法。
4. 前記目的成分は、細胞または細胞由来成分である、請求項１から３のいずれか一項に記載の成分分離方法。
5. 前記細胞由来成分が細胞特異的マーカーである、請求項４に記載の成分分離方法。
6. 請求項１から５のいずれか一項に記載の成分分離方法を用いた成分分析方法であって、
   前記目的成分に特異性を有するように選択された物質を有する前記アフィニティービーズと、前記アフィニティービーズ上の前記物質とは異なる結合特異性を前記目的成分に対して有する第二の物質と標識物質との複合体と、前記試料とを混合し、分離された前記アフィニティービーズにおける前記標識物質による標識活性を測定する成分分析方法。
7. 請求項１から５のいずれか一項に記載の成分分離方法を用いた成分分析方法であって、
   前記目的成分に特異性を有するように選択された物質を有する前記アフィニティービーズと、標識物質を含み前記物質と前記目的成分との結合を競合阻害可能な構造を有する複合体と、前記試料とを混合し、分離された前記アフィニティービーズにおける前記標識物質による標識活性を測定する成分分析方法。
8. 目的成分に対する特異性を有するアフィニティービーズおよび第二アフィニティービーズと、
   主流路と、前記主流路に接続された複数の分岐流路とを有し、前記前記アフィニティービーズおよび前記第二アフィニティービーズを含む混合液から前記アフィニティービーズを水力学的濾過法により分離する流路チップと、
   前記混合液の溶媒と組成が異なり前記流路チップに供給され前記主流路において前記混合液に対して層流をなして流通可能な緩衝液と、
   を備えた成分分離装置。

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