JPS62294964A - 免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は血清など水溶液中の特定の抗原又は抗体を定量
する免疫分析方法。

（従来の技術） 従来の免疫方法として、たとえば、ラジオアイソトープ
で標識した抗体（又は抗原）と生体より採取した試料中
の抗原（又は抗体）との抗原抗体反応を利用して試料中
の特定の抗原（又は抗体）を定量分析するラジオイムノ
アッセイ法や、酵素で標識した抗体く又は抗原）と生体
より採取した試料中の抗原（又は抗体）との抗原抗体反
応により抗原抗体結合物を得、その抗原抗体結合物に標
識した酵素による酵素反応を利用して試料中の特定の抗
原（又は抗体）を定量分析するエンザイムイムノアツセ
イ法等がある。

これら代表的な例について第４図を参照して説明すると
、ポリスチレンの試験管等に抗体１を固定化してあき、
これにサンプルを添加し、サンプル中の抗原２を反応さ
せて、次に標識抗体３を添加して反応させ、フリーの標
識抗体を洗浄により除き（Ｂ／Ｆ分離）、残った標識物
量を測定することによりサンプル中の抗原を定量してい
た。

（発明が解決しようとする問題点） ところがこのような従来法は、バウンド／フリー（Ｂ／
Ｆ）分離に時間がかかるという問題がある。

本発明の目的は、Ｂ／Ｆ分離の際の洗浄操作をなくし、
免疫分析を一貫したフローシステムの中で簡潔に行なう
ことができるようにすることにある。

［発明の構成］ （問題点を解決するための手段） 上記目的を達成するための本発明は、被検液と、測定対
象抗原又は測定対象抗体に対する抗体又は抗原を結合し
た粒子と、標識した抗体とを反応させた後、これを前記
粒子の径より小さな孔径を有する膜で形成された濾過手
段に通過させ、児反応の標識抗体を濾過手段外に溶出さ
せた後、濾過手段内又は外の標識量を測定することによ
り、被検液中の測定対象抗原又は抗体を定量することと
した。

（作　用） 本発明は上記の構成としたので、次のように作用する。

即ち、被検液と、測定対象抗原又は測定対象抗体に対す
る抗体又は抗原を結合した粒子、及び標識した抗体を反
応させると標識抗体の一部が測定対象抗原又は測定対象
抗体に結合する。そこでこの反応液を一定の孔径を有す
る膜で形成された濾過手段に通すと、測定対象抗原又は
測定対象抗体に結合しなかったものは粒子を有しておら
ず小ざいので濾過手段の膜外に溶出し、測定対象抗原又
は測定対象抗体と結合したものは粒子を有しており大き
いので濾過手段の膜内に残ることとなる。

そこでしかる後に、濾過手段内又は濾過手段外の標識量
を測定することにより、被検液中の測定対象抗原を定量
することができる。

このように本発明によれば、Ｂ／Ｆ分離の際の洗浄操作
をなくすことができ、従って、免疫分析を一貫したフロ
ーシステムの中で簡素に行なうことができる。

（実施例） 本発明に係る免疫分析方法について、抗原を測定対象と
する場合の一例について第１図を参照して説明する。

先ず、反応液中には緩衝液４と、測定対象物に対する抗
体を結合した粒子１が含まれている。ここで抗体を結合
する粒子は孔径０．２μｍのラテックス粒子を用いてい
る。この反応液に測定対象抗原２を含むサンプルを添加
すると、前記粒子１と測定対象光源２とで光源抗体反応
が起こる。これに更に測定対象抗原２に対する抗体に標
識物質を結合したちのく標識抗体３）を添加する。ここ
で標識物質としては一般に免疫分析で用いられている種
々の物質、例えばラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質
等を用いることができる。

標識抗体３を添加すると、標識抗体３の一部は測定対象
抗原２に結合する。その後、反応液を、前記粒子１の径
よりも小さな孔径を有する膜で形成された濾過手段を構
成するホローファイバー５中に通す。これにより、測定
対象抗原２に結合しなかったフリーの標識抗体３はホロ
ーファイバー５外に溶出する。ここでホローファイバー
５としては、例えばミリボア社製中空子！Ｉ！（孔径０
．１μｍ）を用いることができる。外液７に接触させた
ホローファイバー５中に反応液を通過させることにより
、膜孔径よりも大きい、粒子１に結合したものはホロー
ファイバー５内に残り、小ざいフリーの標識抗体はホロ
ーファイバー５外に出てしまう。

以上の方法に於て、標識抗体３の量を過剰に添加するこ
とにより、サンプル中の測定対象抗原２が多い程ホロー
ファイバー５内の標識抗体量は多くなり、ホローファイ
バー５外の標識抗体量が少なくなる。従って、ホローフ
ァイバー５内又は外の標識量を測定することにより、サ
ンプル中の抗原２の量を知ることができる。

尚、サンプル中の抗体を測定する場合は、粒子１は抗原
を結合したものとし、標識抗体３として、サンプル中の
抗体に対する抗体に標識物を結合した標識抗体を用いて
、同様に測定することができる。

第２図は本発明免疫分析方法を利用した分析装置のシス
テム構成図でおる。これは、ホローファイム−５中を緩
衝液４が常に流れるフローシステムとなっている。緩衝
液４は、抗体１．サンプル２、標識抗体３が添加された
後、恒温槽６中を螺旋状に回転しながら通過し、攪拌さ
れると同時に恒温され、免疫反応が促進されるようにな
っている。緩衝液４は、次に外液７と接触したホローフ
ァイバー５中を通過する。このとき反応液４が、螺旋状
に回転すると同時に、外液７は攪拌装置９゜１０により
攪拌され、標識抗体のホローファイバー５外への溶出が
促進されるようになっている。

その後、反応液は標識物の検出装置８に導かれ、標識物
量が測定されるようになっている。

（実験例） 血清中の癌マーカーアルファフェルトプロティン（ＡＦ
Ｐ）を測定した例について説明する。

試薬としては、ＡＦＰに対する抗体を結合した直径０．
２μｍのラテックス粒子、及び抗ＡＦＰ抗体と蛍光標識
物質力ルポキシフルオルセインの結合物を用いた。緩衝
液は、ゼラチンベロナールバッファーを用い、ホローフ
ァイバー外液は純水とした。ホローファイバーは、ミリ
ポア社製中空子膜（杭径０．１μｍ）を用いた。免疫反
応終了後、抗原抗体結合物は、直径０．２μｍのラテッ
クス粒子に結合しているので、ホローファイバー内に残
り、フリーの標識抗体（抗ＡＦＰ抗体と、カルボキシフ
ルオレセイン結合物）は、分子径が０．１μｍ以下なの
で、ホローファイバー外に溶出した。ホローファイバー
内の蛍光強度を蛍光光度計により測定した結果として、
サンプルのＡＦＰ１度と蛍光強度の関係を第３図に示す
。既知濃度のＡＦＰ溶液を用いて得た第３図に示す検量
線（スタンダードカーブ）より血清中の未知のＡＦＰ量
を蛍光強度から知ることができた。

このように本免疫分析方法によれば、Ｂ／Ｆ分離の際の
洗浄操作をなくすことができ、従って、免疫分析を一員
したフローシステムの中で簡潔に行なうことができる。

以上本発明の一実施例について説明したが、本発明は上
記実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範
囲内において適宜変形実施可能であることは言うまでも
ない。

［発明の効果］ 以上詳述したように本発明によれば、Ｂ／Ｆ分離の際の
洗浄操作をなくすことができ、従って、免疫分析を一貫
したフローシステムの中で簡潔に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明係る免疫分析方法の一実施例を模式的に
表わした説明図、第２図は本発明を利用した免疫分析装
置のシステム構成図、第３図は本発明により得られたＡ
ＦＰ測定の検量線（スタンダードカーブ）を示す図、第
４図は従来法の説明図である。 １・・・抗体結合粒子、 ２・・・サンプル中抗原（被測定物質）、３・・・標識
抗体、５・・・濾過手段。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 被検液中の抗原量又は抗体量を定量するための免疫分析
   方法において、前記被検液と、測定対象抗原又は測定対
   象抗体に対する抗体又は抗原を結合した粒子と、標識し
   た抗体とを反応させた後、これを前記粒子の径により小
   さな孔径を有する膜で形成された濾過手段に通過させ、
   未反応の標識抗体を濾過手段外に溶出させた後、濾過手
   段内又は外の標識量を測定することにより、被検液中の
   測定対象抗原又は抗体を定量することを特徴とする免疫
   分析方法。