JPS635265A - 免疫分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は血清など水溶液中の特定の抗原を定置する免疫
分析方法に関する。

（従来の技術） 従来の免疫分析方法として、例えば、ラジオアイソトー
プで標識した抗体（又は抗原）と生体より採取した試料
中の抗原（又は抗体）との抗原抗体反応を利用して試料
中の特定の抗原（又は抗体）を定量分析するラジオイム
ノアッセイ法や、酵素で標識した抗体（又は抗原）と生
体より採取した試料中の抗原（又は抗体）との抗原抗体
反応により抗原抗体結合物を得、その抗原抗体結合物に
標識した酵素による酵素反応を利用して試料中の特定の
抗原（又は抗体）を定量分析するエンザイムイムノアッ
セイ法等がおる。

これら代表的な例について第４図を参照して説明すると
、ポリスチレンの試験管等に抗体１を固定化しておき、
これにサンプルを添加し、サンプル中の抗原２を反応さ
せて、次に標識抗原３を添加して反応させ、フリーの標
識抗原を洗浄により除き（Ｂ／Ｆ分離）、残った標識物
量を測定することによりサンプル中の抗原を定量してい
た。

（発明が解決しようとする問題点） ところがこのような従来法は、抗体１を固定するのに技
術を要し、また、バウンド／フリー（Ｂ／Ｆ）分離に時
間がかかるという問題がある。

本発明の目的は、抗体を固定化する手間を省き、更にＢ
／Ｆ分離の際の洗浄操作をなくし、免疫分析を一貫して
フローシステムの中で簡潔に行うことができるようにす
ることができる。

［発明の構成］ （問題点を解決するための手段） 上記目的を達成するため本発明は、被検液。

測定対象抗原に対する抗体、及び標識した抗原を反応さ
せた後、これを一定の分子量以下のものを外に排除する
濾過手段に通過させ、未反応の抗原を濾過手段外に溶出
された後、濾過手段内又は外の標識量を測定することに
より、被検液中の測定対象抗原を定量することにした。

（作　用） 本発明は上記の構成としたので、次のように作用する。

即ち、被検液、測定対象抗原に対する抗体、及び標識し
た抗原を反応させると、標識抗原の一部が抗体に結合す
る。そこでこの反応液を一定の分子量以下のものを外に
排除する濾過手段に通すと、抗体に結合しなかったもの
は分子量が小さいので濾過手段外に溶出し、抗体と結合
したものは分子量が大きいので濾過手段内に残ることと
なる。そこでしかる後に、濾過手段内又は濾過手段外の
標識量を測定することにより、被検液中の測定対象抗原
を定量することができる。

このように本発明によれば、抗体を固定化する手間を省
き、更にＢ／Ｆ分離の際の洗浄操作をなくすことができ
、従って、免疫分析を一貫したフローシステムの中で簡
潔に行うことができる。

（実施例） 本発明に係る免疫分析方法の一例について第１図を参照
して説明する。

先ず、反応液中には緩衝液４と、測定対象物（抗原）に
対する抗体１が含まれている。これに測定対象抗原２を
含むサンプルを添加すると、抗体１と測定対象抗原２と
で抗原抗体反応が起こる。

これに更に測定対象抗原と同−又は同一の抗原決定基を
有する物質に標識物質を結合したもの（標識抗原３）を
添加する。ここで標識物質としては一般に免疫分析で用
いられている種々の物質、例えばラジオアイソトープ、
酵素、蛍光物質等を用いることができる。

標識抗原３を添加すると、標識抗原３の一部は、抗体１
のうち測定対象抗原２が結合した残りの抗体に結合する
。その後、反応液を、一定の分子量以下のものを外に排
除する濾過手段を構成するホローファイバー５中に通す
。これにより、抗体に結合しなかったフリーの標識抗原
３はホローファイバー５外に溶出する。ここでホローフ
ァイバー５としては、例えば旭化成■社製ＨＣ中空子糸
膜（分画分子量１３，０００＞を用いることができる。

また、分画分子量以下の物質をホローファイバー５外に
溶出させるには、ホローファイバー５の外液７の浸透圧
より低くしておく。これにより、分画分子量よりも分子
量の大きい、抗体に結合したものはホローファイバー５
内に残り、分子量の小さいフリー標識抗原はホローファ
イバー５外に出てしまう。但しここで、標識抗原３はホ
ローファイバー５の分画分子量よりも分子量が小さくな
くてはならない。

以上の方法において、抗体１の量をサンプル中の測定対
象抗原２の量より過剰になるように、標識抗原５を抗体
１の抗原結合部と周囲程度又は過剰になるように添加す
ることにより、サンプル中の測定対象抗原２が多い程ホ
ローファイバー５内の標識抗原量は少なくなり、ホロー
ファイバー５外の標識抗原量が多くなる。従って、ホロ
ーファイバー５内又は外の標識量を測定することにより
、サンプル中の抗原量を知ることができる。

第２図は本発明免疫分析方法利用した分析装置のシステ
ム構成図である。これは、ホローファイバー５中を緩衝
液４が常に流れるフローシステムとなっている。緩衝液
４は、抗体１、サンプル２、標識抗原３が添加された後
、恒温槽６中をらせん状に回転しながら通過し、撹拌さ
れると同時に恒温され、免疫反応が促進されるようにな
っている。

緩衝液４は、次に外液７と接触したホローファイバー５
中を通過する。このとき反応液４が、らせん状に回転す
ると同時に、外液７は撹拌装置９゜１０により撹拌され
、標識抗原のホローファイバー５外への溶出が促進され
るようになっている。

（実験例） 血清中の坑てんかん剤フエノバルビタールを測定した例
について説明する。

試薬としては、フエノバルビタールに対する抗体及び、
フエノバルビタールと蛍光標識物質力ルポキシフルオル
セインの結合部を用いた。緩衝液、ゼラチンベロナール
バッファを用い、ホローファイバー外液は純水とした。

ホローファイバーは、旭化成■社製ＨＣ中空子糸膜（分
画分子量１３゜０００＞を用いた。免疫反応終了後、抗
原抗体結合物は、抗体の分子量が１６万なのでホローフ
ァイバー内に残り、フリーの標識抗原（フエノバルビタ
ールと、カルボキシフルオルセイン結合物）は、分子量
が１０００以下なので、ホローファイバー外に溶出した
。ホローファイバー内の蛍光強度を蛍光光度計により測
定した結果として、サンプルのフエノバルビタール濃度
と蛍光強度の関係を第３図に示す。既知濃度のフエノバ
ルビタール溶液を用いて得た第３図に示す検量線（スタ
ンダードカーブ）より血清中の未知のフエノバルビター
ル量を蛍光強度から知ることができた。

このように本免疫分析方法によれば、抗体を固定化する
手間を省き、更にＢ／Ｆ分離の際の洗浄操作をなくすこ
とができ、従って、免疫分析を一貫したフローシステム
の中で簡潔に行うことができる。

以上本発明の一実施例について説明したが、本発明は上
記実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範
囲内において適宜変形実施可能であることを言うまでも
ない。

［発明の効果］ 以上詳述したように本発明によれば、抗体を固定化する
手間を省き、更にＢ／Ｆ分離の際の洗浄操作をなくすこ
とができ、従って、免疫分析を一貫したフローシステム
の中で簡潔に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る免疫分析方法の一実施例を模式的
に表した説明図、第２図は本発明を利用した免疫分析装
置のシステム構成図、第３図は本発明により得られた薬
物測定の検量線（スタンダードカーブ）を示す図、第４
図は従来法の説明図である。 １・・・抗体、３・・・抗原、３・・・標識抗原、５・
・・濾過手段。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 被検液中の抗原量を定量するための免疫分析方法におい
   て、前記被検液、測定対象抗原に対する抗体、及び標識
   した抗原を反応させた後、これを一定の分子量以下のも
   のを外に排除する濾過手段に通過させ、未反応の抗原を
   濾過手段外に溶出させた後、濾過手段内又は外の標識量
   を測定することにより、被検液中の測定対象抗原を定量
   することを特徴とした免疫分析方法。