JPH06258323A - 定量分析装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】試験溶液中の分析成分の量を視覚的に簡単に測
定できる方法の提供 【構成】(a) 分析成分の移動のための流路を規定する液
体浸透性固体媒体であって、上記媒体に試験溶液の加入
をするための帯と、上記媒体により規定された流路に沿
って連続隔置された少なくとも一個の反応帯を持ち；上
記反応帯がその中に、分析成分と結合して予定生成物を
生じることのできる反応体の所定量を非拡散的に固定し
て持っている上記媒体を用意し；(b) 上記試験溶液を、
流路に沿って上記加入するための帯と上記反応帯を通し
て連続的に流し；そして；(c) 上記分析成分、反応体ま
たは予定生成物の存在が検出される上記反応帯の数が上
記試験溶液中の分析成分の存在と関連する、上記反応帯
において上記分析成分、反応体または予定生成物の存在
を検出する、段階からなる上記試験溶液中の分析成分の
分析法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は定量化学分析方法及び該
方法に使用する装置に関するものであり、特にミルク、
血液、尿その他のような生物学的流体中の少量の化学物
質の検出に特に適する。

【０００２】

【従来の技術と発明が解決しようとする課題】溶液中の
化学物質濃度の定量法は多数知られている。これらの方
法の多くは長時間および面倒な操作を必要とし、人為的
誤差を生じ易い。多くの方法は、検出すべき化学成分
（分析成分）を反応体と反応させて生成物を形成させる
操作を含み、この操作は消費された反応体の測定（例え
ば滴定）、生成した生成物量の測定（例えば呈色反応生
成物の吸光度測定）または溶液から（例えば蒸留によ
り）分離できる化学成分もしくは反応生成物の測定等の
工程が含まれる。ラジオイムノアッセイで用いられるよ
うなある種の定量分析法においては、既知量の標識分析
成分（例えば放射性沃素、酵素、螢光、発色性もしくは
螢光性分子等で標識した分析成分）と、未知量の非標識
分析成分とを競合的に反応させ、未知溶液中の分析成分
量を、反応もしくは結合した分析成分と未反応もしくは
結合しなかった分析成分とを適当な方法で分離した後、
テストで得られた試料の放射活性もしくは他の特性と関
連させることによりあるいは結合したもしくは結合しな
かった識別可能な標識分析成分の特性により求めるよう
になっている。それらの方法の多くは、色の変化（水素
イオン濃度変化に対して色の変化で反応する化学呈色成
分を用いた時等）、または濁度の変化（方法が固体反応
生成物の形成を伴なうとき等）を伴なう。

【０００３】ある種の分析法は、流体（例えば空気）中
の成分と接触したとき色の変化を生じる反応体を含有す
るカラム中に該流体を通過させることよりなる。例え
ば、米国特許第３，２８６，５０６号明細書には、一定
量のガスを指示薬を含むガラスカートリッジに通過さ
せ、カラム中で色の変化を生じた指示薬の量に比例して
検出すべきガス量が判明するガスの分析技術が開示され
ている。同様な装置は米国特許第３，３１２，５２７号
および第３，５４５，９３０号明細書にも記載されてい
る。

【０００４】分析分野においては迅速性、簡易性および
人為的誤差の少ない分析法を提供しようとする強い要望
がなされている。例えば、糖尿病診断のための血糖値の
概量を測定するための簡単な迅速測定試薬は市販されて
いる。しかしながら、そのような測定試薬は、しばしば
比較的精度が低い。一方において高感度という特徴を有
し、しかも他方において簡単、迅速かつ人為誤差が比較
的小さいことを特徴とする化学成分の定量試験法を提供
することが特に望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、一態様におい
て、流体例えば溶液中の化学的に反応しうる物質（以
下、分析成分という）の定量分析用の装置を提供するも
のである。この装置は、予め定められた数の連続的に隔
置された反応帯を有し、該反応帯を連続的に流体が流れ
るための流路を規定する流体浸透性固体媒体を有する。
この装置を用いるための流体の典型は液体である。予め
定められた量の反応体が前記反応帯の固体媒体に結合し
ており、この結合反応体は分析成分または分析成分の誘
導体と反応して予め定められた生成物を生じうるように
なっている。本発明の装置は、隔置された反応帯中で分
析成分もしくはその誘導体、反応体、または分析成分も
しくはその誘導体と反応体との反応により生じた予め定
められた反応生成物の存在を検出するための検出手段を
更に有しても良い。さらに本発明の装置は、微量の分析
成分もしくはその誘導体、反応体、または分析成分もし
くはその誘導体と反応体との反応により生じた予め定め
られた反応生成物の検出がされなくなるような手段を有
してもよい。更に説明すると、本発明は下記の発明に関
する： (a) 分析成分の移動のための流路を規定する液体浸透性
固体媒体であって、上記媒体に試験溶液の加入をするた
めの帯と、上記媒体により規定された流路に沿って連続
隔置された少なくとも一個の反応帯を持ち；上記反応帯
がその中に、分析成分と結合して予定生成物を生じるこ
とのできる反応体の所定量を非拡散的に固定して持って
いる上記媒体を用意し； (b) 上記試験溶液を、流路に沿って上記加入するための
帯と上記反応帯を通して連続的に流し；そして； (c) 上記分析成分、反応体または予定生成物の存在が検
出される上記反応帯の数が上記試験溶液中の分析成分の
存在と関連する、上記反応帯において上記分析成分、反
応体または予定生成物の存在を検出する、段階からなる
上記試験溶液中の分析成分の分析法。及び、 (a) 分析成分の移動のための流路を規定する液体浸透性
固体媒体であって、上記媒体に試験溶液の加入をするた
めの帯と、上記媒体により規定された流路に沿って連続
隔置された少なくとも一個の反応帯を持ち；上記反応帯
がその中に、分析成分と結合して予定生成物を生じるこ
とのできる反応体の所定量を非拡散的に固定して持って
いる上記媒体を用意し； (b) 上記分析成分、反応体または予定生成物を、標識可
能な配位子に結合している第２の配位子−受容体−結合
対構成員と反応させ； (c) 上記試験溶液を、流路に沿って上記加入するための
帯と上記反応帯を通して連続的に流し；そして； (d) 上記分析成分が上記試験溶液中に予定量存在する場
合にのみ検出されかつ検出の段階が標識物の存在を検出
するようにして、上記反応帯中に標識物の存在を検出す
る；段階からなる上記試験溶液中の配位子−受容体−結
合対構成員である分析成分の分析方法。

【０００６】本明細書中、「反応体」、「反応性」等の
用語が分析成分またはその誘導体と反応体との反応との
関連において使用されるときは、反応体が共有結合また
は水素結合あるいは他の任意の方法で、分析成分または
その誘導体と結合して、予め定められた生成物を生成も
しくは結果として生成する能力のことを意味する。即
ち、これらの用語は、最も広い意味で使用され、反応体
が分析成分もしくは分析成分誘導体と作用し、作用され
または相互に作用し合って分析成分もしくはその誘導
体、反応体または両者に検知可能な変化を与え、こうし
て反応生成物の生成をもたらす全ての反応に用いられ
る。同様に「反応生成物」とは分析成分もしくはその誘
導体と反応体との反応によって生じ、両者と識別検出し
うる程度に異なる任意の生成物を意味する。「分析成分
誘導体」とは、分析成分から誘導されたもので、好まし
くは標識分析成分を意味し、即ち分析成分とその標識さ
れた（taggedまたはlabeled ）誘導体との間の競合反応
を含む分析方法で採用されるような成分のことである。

【０００７】その分析成分誘導体には、標識化した分析
成分の他に、反応体と結合させた後に標識化するものが
ある。以下、２番目及び３番目の検出方法の中で、反応
体と反応するときは、まだ標識化されていない分析成分
誘導体についてその使用目的と共に説明する。分析成分
誘導体は分析成分と競合して、反応体と反応しなければ
ならない。かくの如き競合性により、分析成分と分析成
分誘導体は、同部位の反応帯の反応体に試験溶液中の含
有量に比例して順次反応、その反応部位は試験溶液の流
れる方向に沿って拡大していく。かくして、下記の方法
により分析成分誘導体を介して分析成分の反応体との反
応部位を検出することができる。１番目の検出方法とし
ての、分析成分誘導体が既に標識化されている場合はそ
の標識部の検出により分析成分の反応部位を検出でき
る。２番目の検出方法は、反応体との反応において、分
析成分と競合できる標識化した分析成分誘導体を取得で
きない場合についてである。この場合は、標識化はして
いないが後で他の化合物と結合せしめて標識化できる分
析成分誘導体であって、反応体との反応において分析成
分と競合できる分析成分誘導体を、先ず分析成分と共に
反応体と反応せしめる。次いで他の化合物を用いて反応
体と反応した分析成分誘導体である予定生成物を標識化
し、次いでその標識部を介して分析成分の反応部位を検
出する。３番目の検出方法は、反応体と結合した分析成
分、即ち予定生成物が分析成分誘導体に該当する場合で
あって、この予定生成物がそのままでは検出が困難な場
合に、検出を容易にするためにこのものを他の化合物で
標識化して検出する方法である。この２番目の例のよう
にして、標識化してない分析成分誘導体を分析成分と共
に試験溶液に入れ、反応帯中の反応体と反応させた後標
識化することにより、反応体と反応した分析成分の反応
部位の検出を容易にできる。以上の説明では、反応体と
の分析成分または分析成分誘導体の例を挙げたが、この
関係は反応体と分析成分が、抗体と抗原、または抗原と
抗体の関係にある場合も同様である。

【０００８】本発明の装置においては、反応体は分析成
分が通過する連続的に隔置された反応帯中の浸透性固体
媒体に結合されている。この装置を採用して行なう方法
は、分析成分もしくはその誘導体が反応帯を通過する際
に反応体と結合し、反応帯内で分析成分またはその誘導
体の存在が色の変化等で検出される様式で行なわれる。
同様に、多少変形した態様においては、分析成分もしく
はその誘導体は反応体と反応して、それ自体反応帯に結
合保持される生成物を形成し、次いで該生成物自体を検
出してもよい。これらの態様においては、上流の反応帯
から始まって、連続反応帯のいくつが分析成分もしくは
その誘導体の存在または反応体と分析成分もしくはその
誘導体との反応による生成物の存在を示すかを検出する
ことにより、非常に良好な精度をもって分析成分の濃度
を決定することができる。他の態様においては、浸透性
固体媒体に結合している反応体自体が適当な検出手段に
よって検出可能であり、分析成分もしくはその誘導体と
の反応によって、そのような検出ができなくなるような
態様であっても良い。この方法においては、分析成分ま
たは分析成分−分析成分誘導体混合物が連続反応帯を通
過するにつれ、連続する反応帯中の反応体は分析成分ま
たは分析成分−分析成分誘導体混合物が実質的に全部消
費されるまで次々と検出不能にされ、残りの下流の反応
帯にのみ検出可能な反応帯を残すことになる。変法にお
いては、分析成分もしくは分析成分誘導体と反応体との
反応により、反応体が結合している固体媒体から分離
し、連続反応帯から洗い流されるようにしてもよい。分
析成分もしくは分析成分誘導体又は両者がこうして消費
された後、ひき続くもしくは下流での反応により依然と
して浸透性媒体に結合し検出可能な反応体の存在が検出
される。この態様においては、上流反応帯から数えてい
くつの反応帯の反応体が検出不能となったか数えること
ができる。

【０００９】本明細書において、「分析成分」とは、分
析すべき特定の化学成分のみならず、測定すべき成分と
他の化学成分との反応物質である化学成分をも意味す
る。例えば、未知量の化学成分を含有する生物学的流体
を溶液その他の状態で他の化学成分と反応させて生成物
を得、該生成物の濃度を測定すべき化学成分の最初の濃
度に関連づけることができる。この場合の生成物も本発
明の装置および方法に使用する「分析成分」となりう
る。従って「分析成分」とは定量測定すべき任意の化学
成分をいう。好ましい態様においては、本発明は分析成
分と反応体とが、特定のリガンド−抗体（抗リガンド）
結合系の各成分に相当する免疫反応を用いる。

【００１０】図１は本発明の装置を表わす一部欠損部分
断面図を表わし、図２は本発明の他の装置を表わす一部
欠損部分断面図を表わし、図３は図２の線３−３に沿う
断面図を表わし、図４は本発明の他の態様の平面図を表
わし、図５は本発明のさらに別の試験装置の斜視図を表
わし、図６は図５の線６−６に沿う部分断面図を表わ
し、図７は本発明の他の試験装置の一部欠損斜視図を表
わす。

【００１１】図１において、ガラス等の透明中空カラム
１２は上端開口部１２．１および下端開口部１２．２を
有する。上端開口部１２．１は好ましくは外方へ拡大す
るフレア部１２．３を有する。支持体１４がカラムの下
端に設けられ、該支持体14は上方に開口する中空部１
４．１を有してよく、ここにカラムの下端部１２．４が
プレス止め等によりぴったり嵌合する。支持体１４は板
状物のような平らで水平方向を向く面を有する比較的広
い底部１４．２を有する。支持体の内部１４．４は好ま
しくは中空であり、支持体の上部壁部１４．５は好まし
くは、カラムの上端開口部１２．１へ液体を注加したと
き空気を逃がすための通気孔１４．６が設けられてい
る。通気孔１４．６は所望により綿栓等のゆるい多孔プ
ラグを設け、くず入れ等に廃棄したとき装置からの漏れ
の遅延を図ってもよい。所望により、試験用カラム中の
液体流速を調節する典型的流速調整手段として、ポンプ
〔例えばペリスタポンプ（peristaltic pump）、シリン
ジドライブ式吸引ポンプ（syringe drive withdrawal p
ump ）等と接続する柔軟なチューブを設けてもよい。カ
ラム内には液体が浸透でき且つ分析成分、分析成分誘導
体、反応体および検出手段に適合性を有する浸透性固体
媒体、例えばビーズ状アガロース、ビーズ状ポリアクリ
ルアミド、有孔ガラス、セルロースまたは他の材料が詰
められた連続隔置された反応帯１６，１６．１，１６．
２，１６．３…が置かれている。反応帯中の媒体には後
で詳述するとおり、反応体が結合している。カラム内部
は理解されるとおり、全体として垂直な流体流路を規定
し、反応帯中に位置する浸透性固体媒体は、好ましくは
流路の全断面を占める。間隔を置いて配列された（隔置
された）反応帯の間には、好ましくは、液体が流れうる
液体浸透性固体媒体よりなる非反応性スペーサーの層１
８，１８．１，１８．２，１８．３…を配置し、このス
ペーサーの層は好ましくは反応帯と密接して存在する。
このスペーサーの層は、好ましくは反応帯と同じ浸透性
固体媒体よりなり、好ましくはスペーサーの層１８．４
および１８．５はカラムの頂部および底部にも設けて、
各反応帯は全てスペーサーの層で挟まれた状態にすると
よい。カラム１２の上端部付近には、スペーサーの層１
８．４から一定距離だけ上方へ離して開口１２．５を設
け、スペーサーの層の上面と該開口との間のカラム内に
一定容積の空間を規定してもよい。公知の方法により、
液体１９をカラムの上端開口部１２．１に注入すれば、
カラム頂部の空間にたまるが、所望量より過剰の液体２
０は開口１２．５を通って流れ去り、こうして予め決定
された一定量以上の液体がカラムを下方に移動すること
が防止される。上記一定容積の空間には、所望により全
面的もしくは部分的に多孔性の非反応性材料、例えばガ
ラスウールまたは同様な材料を詰めて、カラムの上端へ
の液体注入時に液が跳ね返ることを防止してもよい。隔
置された反応帯１６，１６．１…内の液体浸透性固体媒
体には、特定の分析成分または分析成分誘導体と反応し
て反応生成物を生じうる反応体が結合しており、これら
の成分は全て上記定義および本明細書に例示するもので
あってよい。典型例としては、反応体と反応成分とは、
分析成分もしくは分析成分と分析成分誘導体とを含む試
験溶液がカラムを下方へ流下するとき、反応成分もしく
はその誘導体が反応体と化学結合するように選択される
が、カラム内の反応体の全量は、試験溶液中に予想され
る量の分析成分および分析成分誘導体と反応するに要す
るより過剰に存在させるよう注意する。試験溶液がカラ
ムを下方へ通過し始めたら、場合により典型的には蒸留
水又は脱イオン水を洗浄液としてカラムの上端に注入し
て試験溶液のカラムの下方への通過を助けることもでき
る。最後に、分析成分もしくは分析成分誘導体、反応生
成物または反応体の存在を検出する指示薬もしくは検出
剤、例えば反応帯１６，１６．１等で色の変化を生ずる
物質をカラム上部から注入することができる。試験溶液
がカラムを下方に移動すると、各反応層中で一定量づつ
の分析成分もしくはその誘導体が反応体と反応または結
合して、試験溶液から分析成分もしくはその誘導体を消
費する。溶液中の分析成分の濃度は上部から数えて色を
変えた連続反応帯の数を数えるだけで決定できる。他の
態様において、反応帯の媒体に結合している反応体を分
析成分もしくはその誘導体又はその両者との反応により
不活性化もしくは無効化して、不活性化されなかった反
応体を検出剤で変色反応により検出してもよい。この態
様において、試験溶液と接触した連続する反応帯中の反
応体は、試験溶液から分析成分および分析成分誘導体が
消費されるまで不活性化される。不活性化されなかった
反応体を含む反応帯はどれか調べることにより、例えば
反応体が検出されなかった反応帯の数をカラム上部から
数えることにより、溶液中の分析成分の濃度を決定する
ことができる。もちろん、この態様において前記態様同
様に反応帯の数を下から数えてもよい。

【００１２】本発明の装置の他の物理的態様は図２およ
び図３に示されているが、この態様においては、連続隔
置された反応帯を有する濾紙片もしくは類似物質の片を
液体が浸透もしくは毛細管現像で上昇する方法を採って
いる。この態様において、浸透性固体媒体は、図２およ
び図３で番号２０が付された濾紙片の形状を有してよ
い。濾紙片よりなる隔置された反応帯２０．１には、上
記した反応体が結合されており、反応帯の隔置はスペー
サー層もしくはスペーサー部２０．２によりなされてい
る。濾紙片２０を製造する方法の一つは、長方形の小濾
紙片各々に反応体を結合させ、次いで、これら反応帯を
形成する濾紙片を反応体を含まない同様の濾紙片と交互
に並べ、並べた濾紙片を例えば、薄い接着テープ片で接
着することによる。他の変形された製造法が採用しうる
ことも当業者により明らかである。

【００１３】図２および図３から明らかなとおり、濾紙
片２０は、断面路Ｃ字型の長いプラスチックホルダー中
に保持してもよい。プラスチックホルダーの下端は綿も
しくは他の繊維材料のよりひもから成って良い芯２４の
末端を受け入れるように形成されている。プラスチック
ホルダーの上端は同様の芯２４．１を受け入れるように
なっている。芯２４，２４．１の末端は夫々濾紙片２０
の各末端と接触している。図２に示すとおり、芯２４，
２４．１と接触する濾紙片の上端および下端にはスペー
サー層２０．２を設けて、各反応帯２０．１は全てスペ
ーサー層２０．２で挟まれた状態としてある。濾紙片お
よびホルダーは、試験管２６または他の容器に挿入でき
るようになっており、従って、図２に示すように、下部
の芯２４は試験管の底に接し、上部の芯２４．１は試験
管外に延長し、次いで試験管の底部へ向っている。試験
管２６の底部の試験溶液２８は、毛細管現像によって濾
紙片の長さ方向に沿って上方へ流れ、図１に示したカラ
ムに沿う試験溶液の流れと同様に連続的に反応帯２０．
１と接触する。後で詳述するとおり、濾紙片およびホル
ダーは一つの試験管から別の試験管に移し変えることが
でき、こうして異なる溶液をその長さ方向に連続的に流
すことができる。

【００１４】図４に示す態様の本発明の装置は、濾紙、
多孔ガラス等のような浸透性、固体媒体のディスクを有
する。ディスク３０はペトリ皿のような適当な容器中に
水平に置かれている。ディスク３０は中心に試験溶液ま
たは他の溶液を受けるウエル３０．１を有する。このウ
エル３０．１から放射状に配された反応帯は、環状リン
グ３０．２として示され、同様に環状リング３０．３を
形成するスペーサー層で互いに隔てられている。ディス
クの最内リングおよび最外リングは好ましくはスペーサ
ー層である。反応帯３０．２およびスペーサー層３０．
３は同心である。中心ウエル３０．１に受け入れられた
試験溶液は、毛細管現像または拡散により、所望により
遠心力を適用して放射状に移動し、試験溶液は連続的に
隔置された反応帯３０．２を通過する。

【００１５】図５および図６は本発明の装置の他の態様
を示すものである。この装置は、図２および図３の装置
と同様の濾紙片４０を有し、該濾紙片はスペーサー層４
０．２で隔てられた隔置反応帯４０．１を有する。好ま
しくはプラスチックよりなるホルダー４２は、平面基部
４２．１およびその両端に存在する上方へ延びる脚４
２．２，４２．３を有する。脚４２．２には上方に開口
するウエル４２．４が設けられ、この中に濾紙片４０の
上端を挿入しうるようになっているが、この際濾紙片の
末端４２．５がウエルの底に達するように注意する必要
がある。この濾紙片はウエルから斜め下方に延長して、
その下端は脚４２．３に形成されたスロット４２．６中
に支持されている。使用時には、試験溶液または他の溶
液をウエル４２．４に加え、重力および毛細管現像によ
って該溶液を下方に移行させ、溶液を連続的に隔置反応
帯４０．１と接触させる。

【００１６】図７は本発明の装置のさらに別の態様を示
すものであり、この装置は同時に複数の試験を実施する
ために使用できる。番号５０で示す装置は、一対のプレ
ート５０．１，５０．２を対向して有する。図７の右手
部を参考に説明すれば、該プレートに挟まれた空間は長
い隔壁５２，５２．１によって略垂直なチャンネルに区
分されている。図に示すとおり、隔壁により形成された
チャンネル５２．２は、広い上部セクションと狭い下部
セクションを有する。下部セクションには反応体が結合
した液体浸透性固体媒体（この媒体は上記のいずれのも
のでもよい）よりなる一連の垂直方向に隔置された反応
帯５４が設けられている。各反応帯の間にはスペーサー
層５６が置かれ、該層は間に反応帯５４を挟んでいる。
チャンネル上端の隔壁５２，５２．１の間には、チャン
ネルの上部を２セクション５２．４および５２．５に分
割する長い垂直分割部５２．３が置かれている。隔壁と
同じ材料より成ってよいプラグ５８は、上部の指でつま
む部分５８．１およびチャンネル５２．５に挿入しうる
形状の下部テーパープラグ部５８．２を有する。隔壁お
よびプラグ各々の平面部は勿論両面のガラスプレートに
接してチャンネルから物質が漏れ出さないようになって
いる。

【００１７】使用にあたって、試験溶液等の溶液を隔壁
５２，５２．１により形成されたチャンネルの上端から
注入し、次いでプラグ５８を挿入して１方のチャンネル
５２．５の上部の気体流通を遮断する。その結果、他方
のチャンネル５２．４中の液体は反応帯およびスペーサ
ー層を通って選択的に下方へ流れる。チャンネル５２．
４の液面が分割部５２．３の下端より下方に下ると、空
気の泡がチャンネル５２．５を通って上方へ移行し、該
チャンネルの内容物を反応帯を通って同様に下方へ移動
させる。こうして、最初はチャンネル５２．４から、次
いでチャンネル５２．５からの連続流れが自動化され
る。好ましくは、一方のプレート（例えばプレート５
０．１）は透明とし、反応帯におけるいかなる色の変化
も容易に観察できるようにする。他方のプレート５０．
２は透明でもよく、或いは不透明白または他の明るい色
として、色の変化が容易に対比しうる背景として役立て
てもよい。

【００１８】次に、分析成分−反応体の系について説明
する。本発明で検出しうる分析成分には、前記のとお
り、反応体と反応して生成物を形成しうる実質的に全て
の化学物質を含む。本発明は特定の分析成分または反応
体に限定されるものでなく、実質的に任意の分析成分−
反応体の組合せに有用である。

【００１９】本発明に公知化学反応を単に適用するだけ
で、多くの分析成分が分析できる。例えば、弱アルカリ
性pHにおいてフェノールフタレインを用いて二酸化炭素
を分析できる。カルモデュリン（calmodulin）および哺
乳類ホスホジエステラーゼまたは他のカルモデュリン感
受性酵素を使用してカルシウムイオンを分析することも
できる〔前川および安部バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bioc
hemical and Biophysical Research Communications
），９７：６２１（１９８０）〕。反応体としてフェ
ロセン誘導体を使用して鉄イオンを分析できる〔カッツ
（Katz）等、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc. ），１０４：３
４６（１９８２）〕。さらに別の多くの例はジョン・エ
イチ．ヨー（John H. Yoe）の「化学及び物理ハンドブ
ック（Handbook of Chemistry and Physics ）」，Ｐ．
Ｄ１２６−１２９，第５７版，ロバート・シー．ウィー
スト（Robert C. Weast ）編，ＣＲＣ出版社、クリーブ
ランド，１９７６および本明細書に引用の他の文献から
選択できる。有機化学分野から選ばれた典型的分析成分
−反応体の組合せも同様に公知化学反応を本発明に適用
して選択できる。例えば、殆んどいかなるフェノールも
ジッブス試薬（Gibbs Reagent）（２，６−ジクロロ−
ｐ−ベンゾキノン−４−クロルイミン）を使用して分析
できる〔ダクレ（Dacre)、ジャーナル・オブ・アナリテ
ィカル・ケミストリー（J. Analytical Chemistry ）、
４３：５８９（１９７１）〕。インドール用の試薬はｐ
−ジメチルアミノ−ベンズアルデヒドである〔フィーザ
ー及びフィーザー（Fieser and Fieser ）、「有機合成
のための試薬（Reagents For Organic Synthesis）」、
第１巻第２７３頁、ジョン・ワイリー・アンド・サン
ズ，インコーポレイテッド（John Wiley ＆ Sons,In
c.）、ニューヨーク（１９６７）〕。この文献はコーチ
ゾン及び類似のステロイドに対する反応体としてのフェ
ニルヒドラジンの使用および不飽和ステロールのリーバ
ーマン−バーチャード試験（Liebermann-Burchard tes
t）でスルホ酢酸を反応体として使用することも示して
いる。ニンヒドリン試薬（インダン−１，２，３−トリ
オン・ハイドレート）を使用してアミノ酸およびアンモ
ニウム塩を分析することもできる〔パスト（Pasto ）
等、「有機構造決定（Organic Structure Determinatio
n ）」、第４２９頁、プレンティス−ホール、インコー
ポレイテッド（Prentice-Hall, Inc. ）、エングルウッ
ド クリフス（Englewood Cliffs) 、ニュージャージ
ー，１９６９）〕。還元糖はレッドテトラゾリウム
（２，３，５−トリフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム・
クロライド）を使用して測定できる〔フィーザー、「有
機実験（Organic Ex-periments）」、第１３５頁、レイ
テオン・エデュケーション・カンパニー（Raytheon Edu
cation Co.）、レキシントン（Lexington ）、マサチュ
セッツ，１９６８〕。

【００２０】化学分野から、他の種々の分析成分と試薬
の組合せを選択して本発明に適用することが可能であ
り、これらは例えばシャース（Schuurs ）等、米国特許
第３，６５４，０９０号明細書〔酵素結合免疫吸着分析
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ）〕；ケイ〔Ka
y 〕、米国特許第３，７８９，１１６号明細書〔螢光標
識した抗体試薬（Fluorescent Labeled Antibody Reage
nts ）〕；ルーベンシタイン（Rubenstein）等、米国特
許第３，８１７，８３７号明細書〔均質酵素免疫分析
（Homogeneous Enzyme Immunoassay）〕；リング（Lin
g）、米国特許第３，８６７，５１７号明細書〔免疫放
射分析（Radioimmuno-assay ）；ジアエバー（Giaever
）、米国特許第３，９０６，４９０号明細書〔放射免
疫拡散（Radial Immunodiffusion）；ウルマン（ullma
n）、米国特許第３，９９６，３４５号明細書〔螢光抑
制均質免疫分析（Fluorescence Quenching Homogeneous
Immunoassay）〕；マギオ（Maggio）、米国特許第４，
２３３，４０２号明細書（酵素チャンネル均質酵素免疫
分析）〕；ボグスラスキ（Boguslaski）等、カナダ国特
許第１，０８２，５７７号〔ハプテン−コファクター均
質酵素免疫分析（Hapten-Cofactor Homogeneous Enzyme
Immunoassay）〕；ショーンフェルド・エイチ．（Scho
nfeld H.）編、「免疫分析における新らたな進展（New
Developments in Immunoassays）」、抗生物質および化
学療法（Antibiotics and Chemotherapy）、第２６巻、
１９７９；オサリバン（O' Sullivan ）等、「酵素免
疫分析：現状（Enzyme Immunoassays ：A Review）」、
アナルス・オブ・クリニカル・バイオケミストリー（An
nals of Clinical Biochemistry ）１６：２２１（１９
７９）；シャース（Schuurs ）等、酵素免疫分析、クリ
ニカ．キミカ．アクタ（Clin. Chim. Acta. ），８１：
１（１９７７）；フェルドマン（Feldmann）等編、「免
疫酵素技術に関する第１回国際シンポジウム（First In
ternational Symposium on Immunoenzymatic Technique
s ）」、インセルム・シンプ（INSERM Symp.）No. ２，
ノース・ホランド・パブリシング・カンパニー（North
Holland PublishingCo. ）、アムステルダム，１９７
６；ウイリアムス（Williams）等、「免疫および免疫化
学の方法（Methods in Immunology and Immunochemistr
y ）」、第３巻、アカデミック・プレス（Academic Pre
ss）、ニューヨーク，１９７１；およびヤロウ（Yalow
）等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティ
ゲーション（J. Clin. Invest.）、３９：１１５７（１
９６０）に記載されている。さらに別の分析成分−反応
体の組合せは、次の文献中に見出すことができる：ファ
イグル，エフ．（Feigl, F. ）、「無機分析におけるス
ポットテスト（SpotTests in Inorganic Analysi
s）」、第６版、エルシーバー（Elsevier）出版社、ニ
ューヨーク，１９７２年；ファイグルおよびフリッツ
（Fritz ）、「有機分析におけるスポットテスト（Spot
Tests in Organic Analysis）」、第７版、エルシーバ
ー出版社、ニューヨーク，１９６６年；スネル，エフ．
およびスネル，シー．（Snell, F. and Snell, C.)、
「呈色による分析法（Colorimetric Methods of Analys
is）」、第１−４ＡＡＡ巻、ファン・ノストランド・レ
インホルド社（Van Nostrand Reinhold Co. ）、ニュー
ヨーク、１９６７−７４年；およびブライバンチ，エ
イ．（Braibanti, A. ）編、「生物熱力学および熱力
学：モデルシステム−合成及び天然キレート並びに生物
学的および薬理学的研究のモデルとしてのマクロサイク
ル（Bioenergetics and Thermodynamics：Model System
s-Synthetic and Natural Chelates and Macrocycles a
s Models for Biologicaland Pharmaceutical Studie
s）」、ディー．ライデル（D. Reidel ）出版社、ボス
トン、１９８０年。上記参考文献の内容も参考のため本
明細書中に記載する。

【００２１】本発明にとって特に重要な組合せは、一方
が抗体で、他方が該抗体に特異的なリガンドである特定
の結合ペアーを構成する分析成分−反応体の組合せであ
る。そのような免疫化学的反応体の組合せは当該技術分
野で公知であり、分析成分の存在もしくは量またはその
両者を、特に該成分が非常に低濃度で存在している場合
に検出するための広範な種類の試験法が考案されてい
る。これらも前記特許明細書および刊行物中に見出され
る。

【００２２】次に検出剤について説明する。本発明に有
用な検出剤は、連続する反応帯における分析成分、分析
成分誘導体、反応体または予め定められた反応生成物
（これらは全て前記した）を検出可能なものである。検
出方法は種々の形態であって良い。好ましい態様におい
ては、検出は色の変化、または色の変化の欠如が装置の
個々の反応帯で生ずるか否かで行なわれる。しかしなが
ら、検出はまた他の方法、例えば反応帯の発光もしくは
螢光、反応帯の放射活性その他で行なってもよい。多く
の反応にとって、検出はpH変化で行なわれ、検出剤はフ
ェノールフタレイン、ナイルブルーＡ、チモールブルー
およびメチルバイオレットなどのpH呈色試薬の形であっ
てよい。他の試験において、反応帯中の適当な化学成分
の存否を固体反応生成物が連続スペーサー層に貯ったか
どうかを観察して検出することもできる。当業者にとっ
て種々の検出機構は知られており、本明細書中に詳述す
る必要はない。しかしながら、分析成分または分析成分
およびその誘導体と反応体との免疫反応を使用する好ま
しい態様においては、しばしば非常に低濃度の分析成分
を測定する必要があり、従って拡大もしくは増幅機構を
採用すると良い。そのような機構の１つは、反応生成物
と検出剤との反応を促進させて目に見える呈色を起させ
る酵素を使用することである。例えば、試験すべき分析
成分を分析成分誘導体としての既知量の分析成分−グル
コース酸化酵素結合物と一緒に該分析成分に特異的抗体
を含む本発明装置の隔置連続反応帯に供給してもよい。
信号発生系として、反応帯中の浸透性固体媒体に結合し
た西洋ワサビパーオキシダーゼ、及びｏ−ジアニシジン
（グルコースとともに試験溶液に加える）を採用するこ
ともできる。分析成分、分析成分−グルコース酸化酵素
結合物、グルコース、カタラーゼ及びｏ−ジアニシジン
を図１に示すようなカラムに注加し、次いで装置に通過
させる。分析成分および分析成分−グルコース酸化酵素
結合物は、結合した抗体の結合部を奪い合い、こうして
ｏ−ジアニシジンと（グルコース酸化酵素で触媒された
酸素とグルコースとの反応で生じた）過酸化水素との反
応で呈色を生ずる。未反応の分析成分および分析成分−
グルコース酸化酵素結合物は、混合物中のこれら成分が
消費され終るまで連続反応体を流れる。この方法の種々
の変法は当業者に公知である。

【００２３】

【実施例】本発明を下記の実施例により更に詳細に説明
する。これら実施例は、本発明の限定を意図するもので
はない。 実施例１ 発色成分５，５′〔３−（２−ピリジル）−１，２，４
−トリアジン−５，６−ジイル〕ビス−２−フランスル
ホン酸二ナトリウム塩〔フェレン（Ferene）、ケミカル
ダイナミックス社（Chemical-Dynamics Corp.）の製
品：登録商標〕を使用して血清中の鉄を５９３nmでの吸
光度測定による溶液分析で測定する：この５９３nmの波
長では血清中の他の色素の影響が最も小さい。フェレン
はニトロ化、還元、ジアゾ化およびアルブミンのような
蛋白質へのジアゾニウムカップリング（この蛋白質はア
ガロースビーズ、紙片、もしくは他の適当な浸透性固体
媒体に不溶化しておく）によって有用な担体誘導体に共
有結合させることができる。この不溶化（固定化）信号
発生試薬（発色性キレート剤）は、試験溶液を移行せし
めるべき連続隔置層もしくはバンド（反応帯）中に物理
的に配される。

【００２４】シラン化パスツールピペットの両端を折
り、下端（先が狭くなった方）に短かいチューブを接続
し、ピペットの下部にグラスウールの栓をすることによ
り、小カラムを製造する。カラムには、アガロース−フ
ェレンの層を未変性アガロースの層で隔てて連続的に充
填する。典型的には、１：１アガロース分散液０．４ml
を直接綿栓上に充填し、次いでアガロース−フェレンの
１：１分散液５０マイクロリッターとアガロース分散液
０．２mlの層を交互に充填して行く。各層の充填終了後
には、カラムの壁をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で洗
い、ゲル面上の溶液をゲル内へ流入せしめ、その後次の
層を充填する。

【００２５】分析に使用するには、上記で調製したカラ
ム底部のチューブをペリスタポンプ（peristaltic pum
p）に接続して分析時の流速を調節する。鉄を分析する
ための試験サンプルの適当希釈液をカラムに導入する。
この鉄溶液（試験溶液）を調節された流速、典型的には
完全に液がカラム中に入るまでに１０〜１５分を要する
流速で分析カラムを通過させる。全溶液がゲルベッド中
に入ったとき、カラムを水で洗う。試験溶液が流れるに
つれて、フェレン含有反応帯中のいくつかに発色が生ず
る。こうして発色した反応帯の数が試験溶液中の鉄の濃
度の指標である。

【００２６】実施例２ Ａ．酵素であるコリンエステラーゼは毒性の有機リン酸
およびカルバメート剤と反応して不活化される。コリン
エステラーゼおよび発色性スルフヒドリル試薬５，５′
−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）〔エルマン試薬
（Ellman's Reagent）〕をアガロースビーズに不溶化
し、次いでこれを実施例１の方法でカラムに充填する。
試験溶液（希釈血清）をカラムに導入し、反応帯を通過
させ、続いてブチリルチオコリンヨージドを加える。触
媒活性を有するコリンエステラーゼを保持している反応
帯は、コリンエステラーゼの加水分解作用により生じた
チオコリンと不溶化エルマン試薬との反応により黄色く
呈色する。試験溶液中にコリンエステラーゼの反応性を
阻害する毒物が存在すれば呈色反応はカラムの下端付近
のわずかな数の反応帯のみで生じる。 Ｂ．アミノ酸及び他の求核性アミン化合物を反応により
黄色生成物を生じる発色性試薬２，４−ジニトロフルオ
ロベンゼン（ＦＤＮＢ）を使用して測定する。アミノ分
析成分を約０．１〜１．０マイクロモル有する水性サン
プル０．１mlをシリコン処理したガラス容器に入れる。
必要であればpHを７．０に調整し、ＮａＨＣＯ₃ ２mg
（２５マイクロモル）を加えて溶解する。次いで無水ア
ルコール中の０．１５％ＦＤＮＢを０．１２ml（１．５
マイクロモル）加える。この溶液は使用の直前に新たに
調製する。反応がほぼ完了した後、その残存ＦＤＮＢ
（反応体）量を実施例１で用いた分析系の液体通過によ
り分析する。この場合には、同様のアミン含有分析成分
を浸透性固体媒体中の反応帯に公知濃度（例えば反応帯
当り０．１〜０．２５マイクロモル）で不溶化する。５
０％エタノール水溶液で洗浄後、呈色して洗浄後にも保
持される黄色反応帯の数は試験サンプル中の分析成分量
と負の相関を有する。

【００２７】実施例３ ウサギ抗−ペニシロイル−牛ガンマグロブリンからのＩ
ｇＧフラクションを、３３％飽和硫酸アンモニウムで沈
殿させて部分精製した。沈殿を再溶解し、リン酸緩衝塩
溶液（ＰＢＳ）で透析した。このＩｇＧを粒状アガロー
スに抗体を結合させるために使用した。アガロースをジ
オキサンに懸濁し、次いでカルボニルジイミダゾールと
反応させた。ジオキサンで洗浄後、水に懸濁し、次いで
pH９．０のホウ酸水性緩衝液に分散した。ＩｇＧを次い
で活性化アガロースに添加し、ゲル懸濁液を４℃で２日
間振って攪拌した。ＰＢＳで十分に洗浄した後、不溶化
抗体を含むゲルは分析に直ちに使用可能であった。シラ
ン化パスツールピペットの両端を折り、底部（先が狭く
なった方）に短かいチューブを取り付け、カラムの底に
グラスウールの栓を詰めた。カラムに未変性アガロース
の層で隔てられたアガロース−ＩｇＧの繰返し層を連続
的に充填した。典型的には、栓の上に１：１アガロース
分散液０．４mlを直接充填し、続いて、反応帯を形成す
るアガロース−ＩｇＧの１：１分散液５０マイクロリッ
ターとスペーサー層を形成する１：１アガロース分散液
０．２mlの繰返し層を充填した。各層の添加の後には、
カラムの壁をＰＢＳで洗い、ゲル面より上の溶液をゲル
内に移行させてから次の層を重層した。分析に使用する
ため、調製したカラムの底のチューブをペリスタポンプ
に接続して分析の流速を調節した。適当希釈したペニシ
ロイル−グルコース酸化酵素（Ｐｅｎ−ＧＯ）（典型的
にはＰＢＳ１ml中Ｐｅｎ−ＧＯ０．１マイクログラム）
を、既知量の分析成分（ペニシロイル−イプシロンアミ
ノカプロエート：Ｐｅｎ−ＥＡＧ）と一緒に又は別にカ
ラムに通した。Ｐｅｎ−ＧＯはペニシリンＧをグルコー
ス酸化酵素とpH９．０のホウ酸緩衝液中で４℃にて２〜
３日間反応させて製造した。Ｐｅｎ−ＧＯ溶液は、調整
された流速、典型的にはゲル中への完全移行が１０ない
し１５分間に終了する速度で分析カラムに通した。全溶
液がゲルベッド内に移行した後、カラムに検出溶液を加
える。検出溶液は次のように調製した：西洋ワサビパー
オキシダーゼ（ＨＲＰ）溶液（２mg／ml）０．２０ml、
１８％グルコース溶液２ml、０．２Ｍリン酸緩衝液（pH
６．０）１mlおよび１％ｏ−ジアニシジン０．１００ml
をＰＢＳ中に１：１０に希釈し、１mlもしくはそれ以下
を前記溶液と同じ流速でカラムに導入した。反応帯のい
くつかに茶色い色が生じた。Ｐｅｎ−ＧＯ溶液中のペニ
シロイル成分の存在は、上方の単数もしくは複数の反応
帯での呈色を僅かにし、カラムのより下方の反応帯で呈
色を生ずる。この実施例は、ペニシリン−グルコース酸
化酵素結合物を、アルブミン−グルコース酸化酵素結合
物と置き代えて、血清アルブミン（大きな蛋白分子）の
分析にも使用できる。

【００２８】実施例３Ａ 抗ペニシリンウサギ血清から製造したパーオキシダーゼ
標識ＩｇＧを、実施例３に記載した方法で小濾紙片に不
溶化した。別の同様な濾紙片にカタラーゼを結合させ
た。次いで先に示した濾紙片と後に示した濾紙片を長方
形に切り取って、夫々反応帯とスペーサー層にした。次
いで濾紙の長方形小片を接着テープのストリップ上に重
ね連続する濾紙片の端が互いに重なり合うか少なくとも
互いに触れ合うようにして、連続毛細管流路を形成し
た。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液中のペニシロイ
ル−グルコース酸化酵素（Ｐｅｎ−ＧＯ）を試験管内で
凍結乾燥した。光から内容物を保護するため褐色ガラス
で出来た他の試験管には、pH６．０のリン酸緩衝塩溶液
に溶解したｏ−ジアニシジン及びグルコースの溶液を凍
結乾燥した。前記のようにして製造した濾紙片の底部に
短芯を取りつけ、該濾紙片の上端には長い芯を接触させ
た。濾紙片はそれ自体冷所に保存でき、好ましくは前記
製造条件に由来する湿潤状態で保存できる。一つの使用
例においては、既知濃度のペニシリンＧを含有する一定
量のミルクよりなる試験溶液を凍結乾燥Ｐｅｎ−ＧＯを
含む試験管に加え、次いで内容物を穏かに振って混合す
る。次いでこの濾紙片を試験管に挿入し、上部の長芯は
図２に示すとおり、試験管の口を越えて外方へ延び次い
で下方に延長するようにする。全溶液が濾紙片に吸収さ
れたとき（あるいはその代りに、溶液が上部芯に刻まれ
図２中Ｆで示した任意に定められた流れ指示線に達した
とき）、濾紙片を試験管から取り出し、予め水を加えて
凍結乾燥内容物を溶解しておいた褐色ガラス試験管に入
れる。この試験管の溶液もまた濾紙片を通って上方へ移
行し、初めの試験溶液中のペニシリンＧの量によって一
定数の反応帯に呈色をひき起す。この例において、ミル
ク中のペニシリンＧとＰｅｎ−ＧＯのペニシリンが、濾
紙片の反応帯に不溶化された抗体の結合部位を奪い合
う。もちろん、ミルクサンプル中のペニシリンＧ濃度が
大きければ、ペニシリンＧ及びＰｅｎ−ＧＯは濾紙片の
遠くまで移動する。反応帯でのＰｅｎ−ＧＯの存在はパ
ーオキシダーゼで触媒されたＨ₂ Ｏ₂ とｏ−ジアニシジ
ンとの反応で生じた呈色により示されるが、このＨ₂ Ｏ
₂ はグルコースと酸素の存在下にグルコース酸化酵素に
より形成されたものである。スペーサー層中のカタラー
ゼはＨ₂ Ｏ₂ のＯ₂ とＨ₂ Ｏへの変換を触媒し、したが
ってＨ₂ Ｏ₂ を一つの反応帯から他の反応帯へ移動する
ことを防止する。前記各装置について記載したとおり、
本実施例の装置は試験操作の結果、反応帯のいくつが呈
色したかを決めることにより定量する。例えば、ある反
応帯では試験溶液（例えばミルク）が少なくとも分析成
分（例えばペニシリンＧ）を１ml当り９ngより多く含有
しなければ、色の変化を生じない。未知濃度のペニシリ
ンＧを含有するミルクサンプルについて、色の変化した
反応帯の数を数えるだけで、ペニシリンＧ濃度を狭い特
定の濃度範囲で知ることができる。

【００２９】実施例４ 多価抗原（例えば血清アルブミン）分析成分に対する抗
体をパーオキシダーゼで標識し、実施例３に従って浸透
性固体媒体に結合させて、カラム中に反応帯を形成し
た。同一または類似抗体を別のバッチとしてグルコース
酸化酵素のような酵素で標識した。カラム中に未知量の
分析成分（抗原）を含む試験サンプルを注入した。次い
で、グルコース、カタラーゼ及びｏ−ジアニシジンの存
在下にカラムに液状の抗グルコース酸化酵素抗体を流し
た。生じた呈色バンドの数は、抗体層の抗原結合能に応
じて、試験溶液中の分析成分（抗原）の量と直接関連す
る。この実施例において、抗原は先ず結合抗体と反応し
てこの抗体に結合し、予め決定された生成物を形成す
る。この生成物は該抗原上の抗原決定部へのグルコース
酸化酵素抗体結合物の結合により、ひき続く呈色反応で
検出される。

【００３０】実施例５ 分析成分またはその誘導体（例えばペニシリン−パーオ
キシダーゼ）を実施例３に従って浸透性固体媒体に共有
結合させた。酵素標識受容体（例えばグルコース酸化酵
素−抗ペニシリン抗体）を調製し、不溶化分析成分に接
触させて特異結合複合体（例えば免疫複合体）を製造し
た。分析系は実施例３と同様に定めた。次いで未知量の
分析成分を含む試験サンプルとの接触を、高めた温度
（例えば６０℃）で行なって、不溶化分析成分および試
験サンプル中の分析成分と酵素標識抗体との間の競合的
結合の平衡状態到達を速めた。このような条件下で試験
サンプル中の分析成分は、不溶化分析成分から競合的に
標識抗体を置換する。この方法で得られる呈色反応帯の
数は、試験サンプル中の分析成分の量に反比例する。こ
れらのバンドはカラムの最後部もしくは下流部に出現す
る。

【００３１】実施例６ 実施例３に従って、各々４つの反応帯を有する分析カラ
ムを調製したが、但し、最上段の反応帯はＩｇＧ−アガ
ロース分散液（１：１）７５マイクロリットルで形成
し、その下の３つの反応帯は５０マイクロリットルで形
成した。０．５０および２００ngのＰｅｎ−ＥＡＣを含
有し、且つ各々Ｐｅｎ−ＧＯを２００ng１ml含有する試
験サンプルを各カラムに注入した。試験サンプル流入に
要した時間は２０分である。信号発生剤の溶液の導入に
より、０ngＰｅｎ−ＥＡＣサンプルでは２つの呈色帯、
５０ngサンプルでは３つ、２００ngサンプルでは４つの
呈色帯を生じた。反応帯の数を増加させれば、より広い
範囲でより厳密に分析成分量が求められる。好ましい態
様においては、一種の液状物質を１回だけ装置に通過さ
せるだけでよい。分析成分は分析成分誘導体、発色成分
または他の物質と混合し、装置に流して適する試験結果
を得ることができる。さらに好ましい態様においては、
本発明の装置は反応体および分析成分の定量分析に必要
もしくは好ましい他の化学成分全てを含むことにより化
学的に完成し、このようにすれば、分析に要する操作は
液体担体中の分析成分を装置に流すことだけとなる。も
し必要なら、分析成分不存在下に反応を生ずる要素を装
置に別の層として設けてもよい。例えば、図２のストリ
ップの最底部の層、２０．２には、隣接反応層中の反応
体と物理的に分離して一つの反応体を有してよい。液体
担体中の分析成分が最底部の層２０．０を通過すると
き、この層の反応体は、分析成分および液体担体と一緒
に最初の反応体に流れ込む。所望により、反応体は固体
状で供給されてもよく、そして、図１のカラムの上方の
層１８．４上に置かれるだけでもよい；反応体は液体担
体に溶解されて液体担体および分析成分と一緒にカラム
中へ運ばれる。上記態様は、前記装置同様に本発明の好
ましい態様を例示する実施例７ないし９により説明す
る。この態様は、少なくとも二種の酵素を必要とし、そ
の一方は分析成分と結合して分析成分誘導体を形成して
呈色反応を触媒する；そして、他方の酵素は分析成分に
対する抗体をも含む反応帯に不溶化されており、後者の
酵素は呈色反応酵素の基質を提供する。従って、この態
様においては、試験すべき分析成分よりなるもしくは分
析成分を含む単一の溶液を、固体媒体に流すだけで反応
帯に呈色が生じ、その呈色反応帯の数を直接試験溶液中
の分析成分濃度に関連させることができる。

【００３２】実施例７ 抗ペニシロイル−牛血清アルブミン・ウサギ抗体から、
３３％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させてＩｇＧ分画を
部分精製した。このＩｇＧ蛋白質を、ジオキサン中のセ
ルロースとカルボニルジイミダゾールの反応後、洗浄
し、次いでこれを該ＩｇＧ部分精製品とpH９．０のホウ
酸緩衝液中４℃にて２日間反応させることにより、微結
晶セルロースに結合させた。次いでセルロースをＰＢＳ
で十分洗浄し、バンド状ストリップの製造に使用した。
グルコース酸化酵素も同様の方法で微結晶セルロースに
結合させた。ペニシロイルパーオキシダーゼは先ずポリ
アクリルアミドアミンをＨＲＰに結合させ、この結合物
にペニシリンＧを反応させて調製した。ハプテン（ペニ
シリンＧ）を酵素に結合させるために、線状ポリマーを
スペーサーとして使用すると、各酵素分子当りのハプテ
ン分子の結合量が増加し、ハプテン分子が抗体と結合す
べく抗体に接する機会を増して、結合速度を速めると考
えられている。ポリアクリルアミドは、アクリルアミド
０．５ｇを脱イオン水２００mlに溶解し、脱ガスし、次
いでＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミ
ン０．２mlおよび過硫酸アンモニウム０．１５ｇを加え
ることにより調製した。この溶液を混合し、次いで室温
に３０分静置し、次いで限外濾過膜を通過させ、脱イオ
ン水で透析して凍結乾燥した。次いで、このポリアクリ
ルアミドをpH７．７の０．２Ｍリン酸緩衝液１．０mlに
溶解し、そして２５％グルタールアルデヒド０．３mlを
加えた。この溶液を３７℃で１９時間加温し、その後セ
ファデックスＧ−２５カラムを通過させて過剰のグルタ
ールアルデヒドを除去した。２３０nmの吸光度の強いボ
イド・ボリュームフラクションを採取し、pH９．０のジ
アミノジプロピルアミン（水２．０ml中にて０．５mlを
とかしたもの）の溶液に注加した。この溶液を４℃で一
夜反応させた。次いで反応混合物をセファデックスＧ−
１５０カラムに通し、２３０nmで相当の吸光を示すフラ
クションを等量ずつ四フラクションに集め、第２フラク
ションをパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させた。Ｈ
ＲＰを室温で１５時間pH７．０で１．２５％グルタール
アルデヒドと反応させた。反応混合物をセファデックス
Ｇ−２５カラムに通過させた後、ＨＲＰ−含有フラクシ
ョンを一緒にし、前記ポリアクリルアミド−ジアミンに
添加し、pHを９．０に調整し、この溶液を４℃で一夜反
応させた。このパーオキシダーゼ−ポリアクリルアミド
ジアミンを、次いでバイオゲルＰ−１００カラムに通
し、ボイド・ボリューム部を集めて濃縮し、次いでペニ
シリンと反応させた。ペニシリンＧは５０mgこのパーオ
キシダーゼ−ポリアクリルアミド−ジアミンに添加し、
pHを９．０に調整して４℃で一夜攪拌した。この調整物
を次いで十分に透析し、次いで分析に使用した。親水性
表面を有する０．５×８．０cmのポリエステルフイルム
片を切りとり、この表面にワットマン３ＭＭクロマトグ
ラフィー用濾紙片を貼りつけてバンド状ストリップを調
製した。一方の端には３．５mmのスペースを設けた後長
さ０．５×４．０cmの濾紙片を貼りつけた。前記ポリエ
ステル〔デュポン社のマイラー（Mylar ）〕フイルム片
に、長さ１cmの濾紙片３枚を各々２mmのスペースを置い
て貼り付けした。マイラー上の濾紙を０．０２％ｏ−ジ
アニシジン水溶液で湿めらせた。次いで各スペースをＩ
ｇＧ−セルロースおよびグルコース酸化酵素−セルロー
ス夫々の５０％懸濁液を２０：１に混合して調製した微
結晶セルロース懸濁液に浸した。第一のスペースはこの
懸濁液を２０μl 含浸させ、他の三つのスペースには各
々１０μｌ含浸させた。これらのストリップを風乾し、
次いで使用時まで乾燥状態に保存した。ストリップの長
い濾紙スペーサーを有する末端を現像液の入った小バイ
アルに入れて現像した。この溶液は、パーオキシダーゼ
−ポリアクリルアミド−ジアミン−ペニシリン（０．２
５μg ／ml溶液にして２５μl 分）、グルコース（pH
６．０の０．２Ｍリン酸緩衝液中の１．１２５％グルコ
ース溶液として０．３ml分）およびペニシロイル−アミ
ノカプロン酸（ＥＡＣ）の水中希釈液10μl を含む。上
記条件において、２０〜３０分後にバンドが桃色に発色
するが、現像液中にペニシロイル−ＥＡＣが存在しない
ときは、一つのバンドが発色し、ペニシロイル−ＥＡＣ
（ハプテン）が０．４マイクロモル存在すれば二つのバ
ンドが発色し、ペニシロイル−ＥＡＣが１．０μＭ存在
すれば三つのバンド全部が発色した。所望もしくは必要
により、パーオキシダーゼに対する抗体、ＨＲＰ−結合
レクチンまたはその他のパーオキシダーゼに対する結合
剤もしくは不活性化剤をスペーサー層に含ませて、反応
帯呈色測定の鋭敏性および精度を向上させることもでき
る。さらに、スペーサー層にカタラーゼを不溶化して、
該スペーサー層に発色を生ずることなく反応帯での発色
をより速めることもできる。

【００３３】実施例８ 実施例７と同様にしてバンド状ストリップを製造した
が、試験すべきサンプルを除く全分析成分をストリップ
に含ませた。パーオキシダーゼ−ポリアクリルアミド−
ジアミン−ペニシリンを２．５％グルコースおよびpH
６．０リン酸緩衝液０．２Ｍを含む０．５ないし１．０
％ゼラチン溶液に溶解し、その０．１mlを下端濾紙片に
含ませて乾燥した。したがって、この実施例において
は、使用者は分析成分を含有すると思われる溶液にスト
リップを浸漬し、所定時間経過するのを持ち、次いでス
トリップ上の発色バンド数を数えて結果を判読するのみ
でよい。

【００３４】実施例９ 実施例３と同様に分析カラムを製造したが、反応帯はＩ
ｇＧ−アガロースおよびグルコース酸化酵素−アガロー
ス（２０：１）の混合物より形成した。パーオキシダー
ゼ−ペニシリン（実施例７と同様にして製造）、グルコ
ース、ｏ−ジアニシジン、およびリン酸緩衝液（乾燥状
態で保存しておいたもの）を試験サンプル１．０mlに溶
解し、次いでこれをカラムに導入して通過させた。所定
時間後にカラム上の発色バンドの数から結果を判読し
た。分析すべき試験溶液中に添加した試薬は、小ペレッ
ト状であってもよく、あるいはサンプル等の容積を測定
するための小容器のキャップの裏面に乾燥付着させてお
いてもよい。後者の場合には、容器にサンプル液を満
し、キャップをかぶせ、容器を数回逆さにし、その後サ
ンプル液をカラムに注加する。さらに、サンプルと混合
すべき試薬はカラム頂部に被せてある小プラグに乾燥付
着させておいてもよく、その場合は、サンプルをカラム
に注加したとき溶解する。反応帯で発色を得るために他
にも種々の酵素の組合せを使用することができる。例え
ばアルカリホスファターゼを反応帯に不溶化し、β−ガ
ラクトシダーゼを分析成分に結合させてもよい。アルカ
リホスファターゼの基質としてナフトール−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド−６−ホスフェートを用いれば、ナフ
トール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを生じ、これをβ
−ガラクトシダーゼで加水分解してナフトールを生成せ
しめ、これからジアゾニウム塩の存在下に反応帯で呈色
生成物を生じさせることができる。本発明装置の精度お
よび信頼度は、各々の反応帯での発色もしくは他の検出
可能な変化がどの程度容易に確保しうるかによりある程
度決定される。分析成分の流れ方向の反応帯は、好まし
くは、分析成分または他の検出すべき物質が、先行する
反応帯を有意である最低量だけ通り抜けたときのみ検出
しうる変化を示すことを要求される；何故ならば、装置
の物理構造上、しばしば各反応帯で反応が十分完了する
ことを許さず、小さいテーリング、例えば微量の物質が
後段の反応帯に流れ込み、それらの反応帯でかすかに検
出されて、判読の困難な結果を与えることがあるからで
ある。しかしながら、この問題の大部分は数種の方法で
回避可能である。検出すべき最低濃度以上の化学成分に
のみ感受性を有する検出剤を使用することができる。例
えば上記実施例においてｏ−ジアニシジンの代りに発色
剤としてｏ−フェニレンジアミンを使用すれば、感度を
低めることができる。別の方法は、実施例７に記載した
ように、スペーサー層中または、あまり好ましくはない
が、反応帯中に微量物質を不動化もしくは不活性化する
能力のある清浄剤を少量加えることよりなる。これによ
り、本発明の装置の感度および使用性を特定の分析への
所望に応じて調節することができる。感度および精度の
調節は、固体反応帯中の反応体量にも依存し、ある分析
においては発色生成物のような物質の溶解性にも依存す
る。本発明を好ましい態様に基づいて説明したが、本発
明および特許請求の範囲を逸脱することなく、種々の変
法、応用および修正を行ないうることは明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の装置の一例の部分断面図を表わす。

【図２】本発明の他の装置例の部分断面図を表わす。

【図３】図２の線３−３に沿う断面図を表わす。

【図４】本発明の他の装置例の平面図を表わす。

【図５】本発明の他の装置例の斜視図を表わす。

【図６】図５の線６−６に沿う部分断面図を表わす。

【図７】本発明の他の装置例の一部欠損斜視図を表わ
す。

【符号の説明】

１２…カラム １４ 支持体 １６，１６．１，１６．２，１６．３…反応帯 １８…スペーサー層 １９…液体 ２０…空間 ２２…プラスチックホルダー ２４…芯 ２６…試験管 ２８…試験溶液 ３０…濾紙デイスク ３０．１…ウエル ４０…濾紙片

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ 6807−4Ｂ (72)発明者 パトリック イー．ガイアー アメリカ合衆国，55344 ミ ネソタ，エ ーデン プレイリー，タータン カーブ 6741

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(a) 分析成分の移動のための流路を規定す
   る液体浸透性固体媒体であって、上記媒体に試験溶液の
   加入をするための帯と、上記媒体により規定された流路
   に沿って連続隔置された少なくとも一個の反応帯を持
   ち；上記反応帯がその中に、分析成分と結合して予定生
   成物を生じることのできる反応体の所定量を非拡散的に
   固定して持っている上記媒体を用意し； (b) 上記試験溶液を、流路に沿って上記加入するための
   帯と上記反応帯を通して連続的に流し；そして； (c) 上記分析成分、反応体または予定生成物の存在が検
   出される上記反応帯の数が上記試験溶液中の分析成分の
   存在と関連する、上記反応帯において上記分析成分、反
   応体または予定生成物の存在を検出する、 段階からなる上記試験溶液中の分析成分の分析法。
2. 【請求項２】(a) 分析成分の移動のための流路を規定す
   る液体浸透性固体媒体であって、上記媒体に試験溶液の
   加入をするための帯と、上記媒体により規定された流路
   に沿って連続隔置された少なくとも一個の反応帯を持
   ち；上記反応帯がその中に、分析成分と結合して予定生
   成物を生じることのできる反応体の所定量を非拡散的に
   固定して持っている上記媒体を用意し； (b) 上記分析成分、反応体または予定生成物を、標識可
   能な配位子に結合している第２の配位子−受容体−結合
   対構成員と反応させ； (c) 上記試験溶液を、流路に沿って上記加入するための
   帯と上記反応帯を通して連続的に流し；そして； (d) 上記分析成分が上記試験溶液中に予定量存在する場
   合にのみ検出されかつ検出の段階が標識物の存在を検出
   するようにして、上記反応帯中に標識物の存在を検出す
   る； 段階からなる上記試験溶液中の配位子−受容体−結合対
   構成員である分析成分の分析方法。