KR100946566B1

KR100946566B1 - 측방 유동 면역 분석 디바이스

Info

Publication number: KR100946566B1
Application number: KR1020090111353A
Authority: KR
Inventors: 배병우; 안범주; 신지훈; 이석기; 장진희
Original assignee: 주식회사 인포피아
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2009-11-18
Publication date: 2010-03-11
Also published as: WO2011062405A3; WO2011062405A2; US8859265B2; US20110117636A1

Abstract

본 발명은 전혈 샘플(whole blood sample) 내의 목표 분석물(analyte)을 정량 또는 정성적으로 측정하는 측방 유동 면역 분석 디바이스(lateral flow immunoassay device)를 제공한다. 이 디바이스는 샘플 수용 패드(sample receiving pad), 접합체 패드(conjugate pad), 흐름 지연 패드(flow delaying pad) 및 위킹 멤브레인(wicking membrane)을 측 방향으로 이 순서대로 포함하고 있다. 상기 샘플 수용 패드는 전혈 샘플을 수용하여 이 전혈 샘플로부터 적혈구(red blood cell)를 분리하며, 이로써 상기 적혈구의 흐름을 차단한다. 특히, 상기 샘플 수용 패드, 상기 접합체 패드 및 상기 흐름 지연 패드의 평균 기공 크기를 각기 P₁, P₂ 및 P₃라고 할 때에, P₁ > P₂ > P₃의 관계가 성립된다.

면역 분석, 측방 유동, 기공 크기, 다가 양이온 및 적혈구 분리

Description

측방 유동 면역 분석 디바이스{A LATERAL FLOW IMMUNOASSAY DEVICE WITH A MORE RAPID AND ACCURATE TEST RESULT}

본 발명은 전반적으로 보다 개선된 신속도 및 보다 개선된 정확도로 해서 전혈 샘플(whole blood sample) 내의 목표 분석물(analyte)을 정량 또는 정성적으로 측정하는 측방 유동 면역 분석 디바이스(lateral flow immunoassay device)에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 가정, 클리닉 또는 의사의 수술에서 사용되기에 적합하며 신속한 검사 결과를 제공하되 사용자의 기술 수준 또는 관여 정도가 최소화되는 면역 분석 디바이스에 관한 것이다.

면역 화학 기법을 사용하여서 생물학적 유체 샘플 내에 분석물의 존재를 검출하는 다양한 방법이 개시되어 왔다. 이른바 "샌드위치" 방법에서는, 항원과 같은 목표 분석물이 표지화된 항체 및 고체상 모세관 지지물 상에 고정화된 항체 간에서 샌드위치된다. 항원-표지화된 항체라는 고정화된 결합체의 존재를 검출하거나 그 양을 측정함으로써 면역 분석이 수행된다. 이하에서도 기술될 이러한 방법은 항원 및 항체 모두를 검출할 수 있기 때문에, 일반적으로 면역 화학적 항원-항체 분석법으로 지칭된다.

이러한 고체상 면역 분석 디바이스는 전혈 샘플과 같은 생물학적 유체 샘플 내에 존재하는 목표 분석물을 민감하게 검출할 수 있다. 이러한 고체상 면역 분석 디바이스는 리간드-수용체(ligand-receptor) 쌍 중 한 성분, 가령 항원, 항체, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer) 또는 합텐(hapten)이 고정화되어 있는 고체상 모세관 지지물을 포함한다. 이러한 고체상 모세관 지지물의 통상적인 초기 형태는 방사선 동위 원소 면역 분석 및 효소 면역 분석 분야에서 잘 알려진 폴리스티렌으로 구성된 판, 튜브 또는 비드(bead)이다. 최근에는, 나일론, 니트로셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 유리 섬유, PVDF(poly-vinylidene fluoride) 및 다른 기공성의 폴리머와 같은 다수의 기공을 갖는 물질들이 고체상 모세관 지지물로서 사용되어 왔다. 항원, 항체 또는 합텐과 같은 면역 화학적 성분들의 고체상 모세관 캐리어(carrier)로서 기공성 물질을 사용하는 다수의 자급식 면역 분석 키트(kit)들이 개시되어 왔다.

1983년 2월 23일자에 출원된 미국 특허 제 5,073,484 호는 액체 흐름 경로를 규정하는 액체 투과성 고체 매체를 사용하여 생물학적 액체 내의 목표 분석물을 정량적으로 검출하는 디바이스를 개시하고 있다. 여기서, 이 매체는 액체 흐름 경로를 따라서 서로 이격된(spaced) 다수의 반응 구역을 포함하고 있으며 이 반응 구역에서는 상기 목표 분석물 또는 목표 분석물 유도체(가령, 표지화된(labelled) 목표 분석물)와 반응체(reactant) 간의 반응이 발생하여서 사전 결정된 생성물이 생성된다. 이 반응 구역들에서 상기 목표 분석물, 상기 목표 분석물 유도체(analyte derivatives), 상기 반응체 또는 상기 사전 결정된 생성물을 검출하기 위해서 검출 수단들이 사용된다. 이러한 검출이 발생하는 반응 구역들의 개수가 그 생물학적 액체 내의 목표 분석물의 양을 표시한다.

1992년 6월 1일자에 출원된 미국 특허 제 6,020,147 호는 목표 분석물을 함유하리라고 추측되는 생물학적 액체 중의 목표 분석물의 존재를 결정하기 위한 디바이스를 개시하고 있다. 이 디바이스는 모세관 흐름을 제공하여서 유체 흐름 경로를 규정하는 액체 침투성 고체 매체를 포함하며, 이 고체 매체는 상기 유체 흐름 경로를 따라서 (i) 상기 생물학적 유체를 떨어뜨리기 위한 부위와, (ii) 상기 목표 분석물 또는 상기 목표 분석물과 화학 성분(chemical moiety)과의 반응 생성물에 대해 특이성을 갖는 확산 가능하게 부착된 표지화된 반응체(diffusively bound labelled reactant)━상기 표지화된 반응체는 상기 유체 흐름 경로를 따라서 흐를 수 있으며, 상기 표지화된 반응체와 상기 목표 분석물 또는 상기 표지화된 반응체와 상기 반응 생성물은 특정 리간드-수용체(항원-항체) 쌍을 형성함━와, (iii) 상기 유체 흐름 경로를 따라서 서로 이격되어 있는 하나 이상의 반응 구역을 포함한다. 각 반응 구역은 자신에게 부착되어서 상기 목표 분석물 또는 상기 목표 분석물과 화학 성분과의 반응 생성물에 대해 특이성을 갖는 사전 결정된 양의 반응체를 갖는다. 상기 생물학적 유체를 떨어뜨리기 위한 부위에 생물학적 유체를 떨어뜨리면 이 유체는 모세관 현상에 따라서 상기 유체 흐름 경로를 따라서 이동하게 되고 상기 목표 분석물 또는 상기 목표 분석물과 화학 성분과의 반응 생성물은 상기 반응 구역에서 상기 표지화된 반응체와 상기 반응 구역에 부착된 반응체 모두에 부착되게 된다. 따라서, 상기 표지화된 반응체와 상기 반응 구역에 부착된 반응체 사이에서 상기 목표 분석물 또는 상기 목표 분석물과 화학 성분과의 반응 생성물이 샌드위치되게 된다.

1992년 12월 23일자에 출원된 미국 특허 제 5,713,389 호는 생물학적 유체와 같은 액체 샘플 내에서 사전 선정된 리간드를 검출하기 위한 테스트 셀을 개시하고 있다. 이 테스트 셀은 수용성 용액을 이동시키며 샘플 인입 부위, 테스트 부위 및 샘플 저장 부위를 규정하는 내부의 침투성 물질을 하우징하는 긴 외부 케이스를 포함한다. 샘플 저장 부위는 샘플 인위 부위로부터 떨어져서 배치되고 흡수 물질로 충진된다. 이 샘플 저장 부위는 샘플 인위 부위로부터 흘러서 테스트 부위를 통과한 액체를 수용하는 역할을 한다. 테스트 부위는 상기 사전 선정된 리간드의 제 1 에피토프(epitope)에 대해 특이성을 갖는 부착 자리(binding site)를 갖는 제 1 프로테인(protein)이 고정화된 테스트 라인을 갖는다. 테스트 라인이 케이스의 창을 통해서 관찰될 수 있다.

1993년 7월 15일자에 출원된 미국 특허 제 5,622,871 호는 습기가 통하지 않은 고체 재료로 구성된 중공 케이스(hollow case) 내에 건식 다공질 캐리어(dry porous carrier)를 수용하고 있는, 가령 임신 테스트 시에 사용하는 분석 시험 디바이스를 개시하고 있다. 상기 건식 다공질 캐리어는 액체 테스트 샘플이 떨어뜨려 지는 흡습성의 샘플 수용 부재(sample receiving member)를 통해서 케이스의 외부 와 간접적으로 연통하게 되며, 이 샘플 수용 부재는 상기 케이스로부터 돌출되어 있어서 샘플이 이 샘플 수용 부재로 떨어지게 되고 이어서 샘플 수용 부재를 통해서 상기 건식 다공질 캐리어로 침투하게 된다. 습윤 상태에 있어서 다공질 캐리어 내부를 자유롭게 이동할 수 있으면서 샘플에 대하여 특이적인 부착성을 갖는 표지화된 시약(labelled reagent)이 다공질 캐리어의 제 1 구역에 배치되어 있다. 또한, 이 제 1 구역에서 떨어진 제 2 구역에는 동일한 샘플에 대하여 특이적인 부착성을 갖는 표지화되지 않은 시약이 영구적으로 고정화되어 있으며 습윤 상태에서도 이동하지 않게 된다. 제 2 구역은 제 1 구역의 하류 방향에 배치되어 있다. 또한, 표지화된 시약이 제 2 구역에서 어느 정도로 부착되는지를 관찰하기 위해서 케이스에는 개구가 형성되어 있다. 또한, 이 디바이스는 케이스로부터 돌출되어 있는 샘플 수용 부재에 착탈 가능한 캡(cap)을 더 포함하고 있다.

1993년 6월 3일자에 출원된 미국 특허 제 5,559,041 호는 베이스 부재 및 상기 베이스 부재 상에 배치된 어레이를 포함하는 면역 분석 디바이스를 개시하고 있다. 이 어레이는 (i) 분석이 이행될 때 액체 시료를 받아서 함유하기에 충분한 다공성과 부피를 가지는 저장 패드(reservoir pad)와, (ⅱ) 상기 저장 패드에 떨어져 배치되고 이 저장 패드에서 받은 상당한 양의 시료를 흡수하기에 충분한 다공성과 부피를 갖는 위킹 멤브레인(wicking membrane)과, (ⅲ) 상기 위킹 멤브레인과 상기 저장 패드에 인접하되 이들 사이에 위치하는 적어도 하나의 필터 구역(filter zone)을 포함한다. 상기 필터 구역에는 상기 시료 내에 존재하는 목표 분석물에 특이적으로 부착되어서 면역 결합체(immuno-complex)를 형성하는 표지화된 면역 화학 적 성분이 스며들어 있다. 또한, 상기 필터 구역은 상기 저장 패드에서 위킹 멤브레인으로 이동하는 시료에 함유된 임의의 특정 면역 결합체의 통과를 가능하게 해주는 반면, 상기 면역 결합체보다는 큰 성분은 통과되지 않게 한다. 상기 저장 패드의 하류 방향에 있어서 상기 위킹 멤브레인의 적어도 하나의 분석 테스트 구역에는 상기 시료 내에 함유되어 있는 특정 면역 결합체와 특이적으로 부착되는 물질이 고정화되어 있다.

2001년 2월 12일자에 출원된 미국 특허 제 7,109,942 호는 액체 샘플 내에 존재하는 목표 분석물을 결정하는 테스트 디바이스를 개시하고 있다. 이 테스트 디바이스는 (i) 니트로셀룰로즈 캐리어와, (ii) 상기 니트로셀룰로즈 캐리어 내에 규정된 검출 구역에 배치되어서 만일 목표 분석물이 존재한다면 이 목표 분석물을 포획할 수 있는 바인딩 시약(binding reagent)과, (iii) 액체 샘플을 따라서 상기 니트로셀룰로즈 캐리어를 자유롭게 이동할 수 있는 표지화된 시약━상기 표지화된 시약은 목표 분석물이 액체 샘플 내에 존재할 때에 상기 검출 구역에서 포획될 수 있도록 선택됨━과, (iv) 샘플 수용 부재와, (v) 샘플 수용 부재로부터 떨어져 있는 상기 검출 구역의 하류 측에 배치된 콘트롤 구역(control zone)을 포함한다. 이 컨트롤 구역은 목표 분석물이 샘플 내에 존재하는지의 여부와는 상관없이 상기 표지화된 시약이 부착되는 콘트롤 바인딩 시약을 포함한다.

본 발명의 목적은 샘플 수용 패드 및 접합체 패드를 포함하는 측방 유동 면역 분석 디바이스에 있어서 다음과 같은 3 가지 특징 또는 효과 ① 내지 ③ 모두를 동시에 달성하는 것이다.

① 혈액이 샘플 수용 패드로부터 시작하여서 접합체 패드를 통과하기까지의 혈액의 플로우 레이트(flow rate)를 증가시켜서 더욱 신속한 테스트가 가능하게 한다.

② 전혈 샘플을 수용하는 샘플 수용 패드에 있어서 적혈구를 전혈 샘플로부터 분리하여서 테스트 라인에서의 백그라운드 효과를 감소시켜서 테스트 라인의 시각적 감도를 개선한다.

③ 혈액 내의 목표 분석물에 바인더(binder)가 부착되는 양을 증가시켜서 테스트 라인에서의 신호 강도를 증진시켜서 테스트 품질 및 정확성을 개선한다.

한편, 상기 특징 ① 내지 ③을 모두 동시에 달성하고자 하는 필요 및 이를 위한 구성은 위에서 열거된 미국 특허 문헌들 및 위에서 열거되지는 않았지만 본 발명자들에 의해서 선행 검색된 다수의 미국 특허들에서는 전혀 개시 또는 시사되어 있지 않았다.

상술한 목적은 전혈 샘플(whole blood sample) 내의 목표 분석물(analyte)을 정량 또는 정성적으로 측정하는 측방 유동 면역 분석 디바이스(lateral flow immunoassay device)를 제공함으로써 달성될 수 있다. 이 디바이스는 베이스 부재(base member)와, 상기 베이스 부재 상에 배치된 횡형 어레이(horizontal array)를 포함한다. 상기 횡형 어레이는 상기 베이스 부재의 일 단부 상에 배치되고 다수의 기공(pores)을 가지며 상기 전혈 샘플을 수용하는 샘플 수용 패드(sample receiving pad)를 포함한다. 이 디바이스는 상기 샘플 수용 패드와는 별개의 패드이면서 상기 샘플 수용 패드와 접촉하고 있으며 다수의 기공을 갖고, 확산 가능하게 부착된 접합체(diffusively bound conjugate)가 그 내에 스며들어 있는 접합체 패드(conjugate pad)를 더 포함한다. 상기 접합체 패드는 상기 적혈구가 분리된 상기 전혈 샘플을 상기 샘플 수용 패드로부터 수용하며, 상기 접합체 패드 내에서 상기 전혈 샘플 내에 존재하는 목표 분석물과 상기 접합체가 서로 결합함으로써 제 1 면역 결합체(first immuno-complex)가 형성된다. 상기 접합체는 상기 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 1 바인더(first binder)와 표지자(label)를 포함하며, 상기 접합체에 있어서 상기 제 1 바인더와 상기 표지자는 서로 접합(conjugate)되어 있다. 상기 디바이스는 상기 접합체 패드와는 별개의 패드이며 상기 접합체 패드와 접촉하고 있으며 다수의 기공을 갖고, 상기 접합체 패드 내에서 서로 결합되지 않은 목표 분석물과 접합체 및 상기 형성된 제 1 면역 결합체를 함유하고 있는 혈액을 상기 접합체 패드로부터 수용하며, 상기 수용된 혈액의 흐름을 지연시키는 흐름 지연 패드(flow delaying pad)를 더 포함한다. 상기 흐름 지연으로 인해서, 상기 서로 결합되지 않은 목표 분석물과 접합체가 상기 흐름 지연 패드 내에서 서 로 결합되어 제 1 면역 결합체가 새롭게 더 형성되게 되는 반응 시간이 길어지게 된다. 상기 디바이스는 상기 흐름 지연 패드와 접촉하며 상기 흐름 지연 패드로부터 혈액을 수용하는 위킹 멤브레인(wicking membrane)을 더 포함한다. 상기 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 2 바인더가 상기 위킹 멤브레인의 테스트 라인에 고정화되어 있으며, 상기 제 2 바인더와 상기 제 1 면역 결합체가 서로 결합되어서 상기 테스트 라인에 고정되게 되는 제 2 면역 결합체(second immuno-complex)가 형성된다. 상기 샘플 수용 패드는 상기 전혈 샘플로부터 적혈구(red blood cell)를 분리하며, 이로써 상기 적혈구의 흐름을 차단한다. 또한, 상기 샘플 수용 패드, 상기 접합체 패드 및 상기 흐름 지연 패드의 평균 기공 크기를 각기 P₁, P₂ 및 P₃라고 할 때에, P₁ > P₂ > P₃의 관계가 성립된다. 본 단락에서 지금까지 열거된 구성에 의해서 상기 특징 ① 내지 ③가 모두 동시에 달성될 수 있으며, 구체적인 달성 과정에 대해서는 이하의 본 발명의 상세한 설명 부분에서 설명될 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 다가 양이온(polycations)이 상기 샘플 수용 패드 내에 부착되게 제공되어서 적혈구를 전혈 샘플로부터 분리시킨다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 위킹 멤브레인은 상기 목표 분석물에는 특이적으로 부착되지 않지만 상기 제 1 바인더에는 특이적으로 부착되는 제 3 바인더를 더 포함한다. 상기 제 3 바인더는 상기 위킹 멤브레인의 콘트롤 라인(control line)에 고정화되어 있으며, 상기 콘트롤 라인은 상기 테스트 라인의 하류 방향에 위치한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 표지자는 금 나노 입자(gold nanoparticle), 발색 효소 또는 형광 물질이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 목표 분석물은 항체, 항원, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 합텐(hapten), 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질(DNA-binding protein), 호르몬, 종양 특이적 마커(tumor-specific marker) 및 조직 특이적 마커(tissue-specific marker)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 제 1 바인더, 상기 제 2 바인더 및 상기 제 3 바인더는 항체, 항원, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 및 호르몬-수용체로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 흐름 지연 패드의 평균 기공 크기는 2 내지 4 ㎛이며, 상기 접합체 패드의 평균 기공 크기는 6 내지 12 ㎛이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 횡형 어레이는 상기 베이스 부재의 다른 단부 상에 배치되며 상기 위킹 멤브레인에 접촉되고 다수의 기공을 가지며 상기 위킹 멤브레인으로부터 혈액을 흡수하는 흡수 패드(absorbent pad)를 더 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 다가 양이온이 폴리-L-리신 하이드로브로마이드, 폴리-L-아르기닌 하이드로클로라이드, 폴리-L-히스티딘, 폴리(리신, 알라닌) 3:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 알라닌) 2:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 알라닌) 1:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 트립토판) 1:4 하이드로브로마이드 및 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 흐름 지연 패드는 폴리비닐 알콜 부착된 유리 섬유(polyvinyl alcohol-bound glass fiber)로 구성된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 제 1 바인더는 상기 목표 분석물의 제 1 에피토프(first epitope) 또는 제 1 리간드(first ligand)에 특이적으로 부착되고, 상기 제 2 바인더는 상기 목표 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 리간드에 특이적 또는 비특이적으로 부착된다.

본 발명을 통해서, 보다 개선된 신속도 및 보다 개선된 정확도로 해서 전혈 샘플 내의 목표 분석물을 정량 또는 정성적으로 측정하는 측방 유동 면역 분석 디바이스가 획득되게 된다.

본 발명 및 이의 장점을 더욱 완전하게 이해하기 위해서, 첨부 도면과 함께 본 발명에 대한 상세한 설명이 이제 이루어질 것이다. 여기에서는, 본 발명의 예시적인 실시예들이 첨부 도면을 참조하여 기술될 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 측방 유동 면역 분석 디바이스(100)의 사시도이다. 본 실례에서는, 면역 크로마토그래픽 분석에 있어서 색상화(colorization) 과정을 위해서 금 나노 입자가 표지자(9)로서 사용된다. 금 나오 입자는 통상적으로 적색을 뛰고 있다. 테스트 샘플은 목표 분석물(본 실례에서, 목표 분석물은 참조 번 호(8)로서 표시되며, 구체적으로는 항원(antigen)임) 및 적혈구 등을 함유하고 있는 전혈 샘플이다. 본 명세서에서, "분석물" 또는 "목표 분석물"은 하나 이상의 에피토프(epitope) 또는 부착 부위(binding site) 또는 리간드(ligand)를 갖는, 검출 또는 측정되는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 목표 분석물에는, 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩타이드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물(치료학적 용도로 투여되는 것뿐만 아니라 불법 목적으로 투여되는 것도 포함됨) 또는 위의 물질들 중 어느 하나의 대사물 또는 이에 대한 항체가 포함되지만 이들로만 한정되는 것은 아니다. 또한, 목표 분석물(8)은 특정한 항원성 물질, 합텐(hapten), 항체, 거대분자 및 이의 배합물도 포함한다.

샘플 수용 패드(1)는 분석이 행해질 전혈 샘플을 수용하여 함유하기에 충분한 기공성(porosity)을 갖는 물질로 구성되며 얇은 막의 플라스틱으로 구성된 베이스 부재(14)의 일 단부(본 실례에서는 좌측 단부) 상에 배치된다. 샘플 수용 패드(1)는 임의의 적합한 다공성 흡수 물질로서 구성될 수 있다. 이러한 물질로서는 섬유성 종이, 종이와 같은 셀룰로즈 물질로 된 미세 기공 멤브레인, 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트와 같은 셀룰로즈 유도체, 니트로셀룰로즈, 유리 섬유, 천연 발생 면(cotton), 나이론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있지만 이로만 한정되는 것은 아니다.

한편, 전혈 내에 함유되어 있는 적혈구는 측방 유동 면역 분석 시에 있어서 많은 악영향을 준다. 적혈구는 특정 부착 쌍들 간의 부착을 방해한다. 또한, 크래마토그래피 면역 분석 디바이스에 있어서, 적혈구는 이 디바이스 상에서 반응이 일 어나기에 필요한 유체 흐름을 방해한다. 중요하게는, 적혈구의 색깔로 인해서 위킹 멤브레인(4)의 테스트 라인(5) 주위에서 백그라운드 효과가 나타나며 이로써 테스트 라인에 있어서 시각적 감도를 떨어트린다. 이러한 이유들로 인해서, 전혈 샘플 내의 혈장으로부터 적혈구를 분리하기 위한 다수의 공지된 기술이 존재한다. 이러한 기술들에는 (i) 전혈 샘플을, 응집된 적혈구를 제거하기 위해 하나 이상의 특이적 결합쌍 구성원이 결합된 고체 흡수성 요소를 통해 혼합물을 여과시키는 적혈구 결합제와 배합시키는 기술; (ii) 도입된 응집제를 갖거나 갖지 않는 유리 미세섬유 필터를 통해 전혈을 통과시키는 기술; (iii) 적혈구가 통과되는 것을 방지하고 무수 시험 스트립 상에서 시그날의 검출 또는 가시화를 방해하지 못하도록 다당류 물질의 차단 또는 배제 층을 사용하는 기술; 및 (iv) 혈장이 아니라 적혈구가 결합하는 다가 양이온 표면을 갖는 고분자를 사용하는 기술이 포함된다.

이제, 본 발명의 해결하고자 하는 과제 부분에서 상술한 바와 같은 2 가지 특징들을 동시에 달성하기 위해서, 즉 ① 혈액이 샘플 수용 패드(1)로부터 시작하여서 접합체 패드(2)를 통과하기까지의 혈액의 플로우 레이트를 증가시켜서 더욱 신속한 테스트가 가능하게 하고, (ii) 샘플을 수용하는 샘플 수용 패드에 있어서 적혈구를 전혈 샘플로부터 분리하여서 테스트 라인에서의 백그라운드 효과를 감소시켜서 테스트 라인의 시각적 감도를 개선하기 위해서, 본 발명은 다음과 같은 2 가지 구성적 특징들을 구비하고 있다. 첫째로, 샘플 수용 패드(1)의 평균 기공 크기(P₁)가 접합체 패드(2) 및 흐름 지연 패드(3)의 평균 기공 크기(P₂,P₃)보다 매우 크게 되어 있다. 둘째로, 상기 샘플 수용 패드(1)는 가령 공지된 기술들 중 하나를 사용하여서 적혈구를 분리시켜서 적혈구의 흐름을 차단한다. 이러한 구성에 대하여 자세히 살펴보면, 혈액이 샘플 수용 패드(1)로부터 시작하여서 접합체 패드(2)를 통과하기까지의 혈액의 플로우 레이트를 증가시키기 위해서는, 혈액을 제일 먼저 수용하는 샘플 수용 패드(1)의 평균 기공 크기(P₁)가 순서상 그 다음에 배치되는 접합체 패드(2) 및 흐름 지연 패드(3)의 평균 기공 크기(P₂, P₃)보다 매우 크게 되어 있다. 이로써, 신속한 혈액의 수용 및 흐름이 가능하게 된다. 그러나, 이렇게 샘플 수용 패드(1)의 평균 기공 크기(P₁)를 매우 크게 하게 되면, 적혈구가 샘플 수용 패드에서 분리되지 않고 샘플 수용 패드를 통과하게 되어서 면역 분석에 있어서 악영향을 주게 된다. 따라서, 본 발명에서는 적혈구가 샘플 수용 패드(1)에서 분리되도록 되어 있다. 일 실시예에서, 다가 양이온을 샘플 패드 내에 처리하여서 적혈구가 다가 양이온에 부착되어서 분리되게 하고 있다. 이렇게 본 발명에서는 샘플 수용 패드에서 신속한 혈액 흡수 및 혈액 통과와 더불어 적혈구 분리라는 2 가지 효과가 동시에 달성된다.

샘플 수용 패드(1)에 다가 양이온을 침투시키는 작업은 다가 양이온 고분자 용액에 샘플 수용 패드(1)를 담근 다음에 빼내서 건조하는 방법이 있을 수 있다. 한편, 상기 다가 양이온 고분자는 폴리-L-리신 하이드로브로마이드, 폴리-L-아르기닌 하이드로클로라이드, 폴리-L-히스티딘, 폴리(리신, 알라닌) 3:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 알라닌) 2:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 알라닌) 1:1 하이 드로브로마이드, 폴리(리신, 트립토판) 1:4 하이드로브로마이드 및 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 적혈구 분리제인 다가 양이온을 뛰는 고분자 용액은 전혈 샘플로부터 적혈구를 분리시키는 기능을 하는 모든 적합한 양으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 적혈구 분리제는 약 0.04% 내지 약 1.3%(용적당 중량), 더욱 바람직하게는 약 0.13% 내지 약 0.33%(용적당 중량), 및 가장 바람직하게는 약 0.20% 내지 약 0.33%(용적당 중량)의 농도로 존재할 수 있다.

다음으로, 접합체 패드(2)가 샘플 수용 패드(1)와는 별도로 해서 샘플 수용 패드(1)에 접촉되게 배치되어 있다. 이 접합체 패드도 역시 다수의 기공을 가지고 있어서 샘플 수용 패드(1)로부터 혈액을 수용하게 된다. 이때 혈액은 적혈구가 분리된 혈액이다. 또한, 이 접합체 패드(2) 내에는 확산 가능하게 부착된 접합체(diffusively bound conjugate)가 그 내에 스며들어 있다. 이 접합체는 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 1 바인더(first binder)(10)와 표지자(label)(9)를 포함하며, 상기 접합체에 있어서 상기 제 1 바인더와 상기 표지자는 서로 접합(conjugate)되어 있다. 이로써, 이 접합체 패드(2) 내에서, 전혈 샘플 내에 존재하는 목표 분석물과 접합체가 서로 결합함으로써 제 1 면역 결합체(first immuno-complex)가 형성된다. 상술한 바와 같이, 본 실례에서, 상기 표지자는 금 나노 입자(9)이다. 또한, 도 1에서 도시된 바와 같이, 차단제(blocking agent)(11)가 제 1 바인더(10)와 금 나노 입자(9) 간의 공간 내에 충진되고 금 나노 입자(9)에 부착되어 있다. 이 차단제는 목표 분석물(9)이 아닌 다른 원하지 않은 비목표 물질들이 금 나노 입자(9)에 부착되는 것을 방지한다. 이 차단제(9)의 실례로는 BSA(bovine serum albumin)가 있다. 또한, 금 나노 입자(9)는 가령 510 내지 540 nm의 광 흡수 계수를 갖는다.

본 명세서에서, "접합체(cojugate)"는 특정 부착 성분에 접합된 검출 가능한 표지 물질(label) 및 상기 특정 부착 성분을 포함한다. 특정 부착 성분 또는 바인더와 표지 물질(label) 간의 접합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있고, 핵산 하이브리드화(nucleic acid hybridization)가 포함될 수 있다. 이 표지 물질은 시험 샘플 내의 목표 분석물의 양과 직접 또는 간접적으로 관련된 검출 가능한 신호가 생성되게 한다. 본 실례에서 표지 물질은 금 나노 입자(9)이다. 상기 접합체 내에 포함된 특정 부착 성분 또는 바인더는 목표 분석물에 특이적으로 부착되도록 선택된다. 이 특정 부착 성분 또는 바인더는 특정 부착 쌍, 즉 2 개의 상이한 분자(여기서, 한 분자는 화학적 또는 물리적 방식에 의해 다른 분자에 특이적으로 부착됨)의 쌍 중 어느 하나의 분자를 의미한다. 이 특정 부착 성분 또는 바인더는 반응이 면역 반응인 경우에는 항원, 항체, 합텐 또는 이들의 복합체일 수 있다. 항체가 사용되는 경우에는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 단백질(recombinant protein) 또는 키메라 항체(chimeric antibody) 등일 수 있다.

도 2는 본 발명에 따른 면역 분석에서 다수의 패드를 따라 발생하는 확산 흐름을 도시하고 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 금 나노 입자(9)가 제 1 바인더(10)와 접합되어 있는 접합체가 목표 분석물(8)에 부착되어 있다. 구체적으로, 목표 분석물(8)과 제 1 바인더(10)가 서로 간에 부착되어 있다. 도 2에서는 참조 부호가 생략되었지만, 그 참조 부호는 도 1의 대응하는 구성 요소와 동일하다. 한편, 이 목표 분석물(8)이 PSA(prostate-specific antigne)이면, 제 1 바인더(10)는 PSA의 제 1 에피토프에 특이적인 제 1 항체이다. 목표 분석물(8)이 항체로서 TSH( Thyroid-stimulating hormone)이면, 제 1 바인더(10)는 TSH의 제 1 에피토프에 특이적인 제 1 항체이다. 목표 분석물(8)이 항체로서 NTProBNP(N-terminal of human Pro B-type natriuretic peptide의 아미노 액시드 1-76으로 구성된 폴리펩타이드)이면, 제 1 바인더(10)는 NTProBNP의 제 1 에피토프에 특이적인 제 1 항체이다. 목표 분석물(8)이 항체로서 CK-MB(Creatine Kinase MB)이면, 제 1 바인더(10)는 CK-MB의 제 1 에피토프에 특이적인 제 1 항체이다. 목표 분석물(8)이 MYO(Myoglobin)이면, 제 1 바인더는 MYO의 제 1 에피토프에 특이적인 제 1 항체이다. 목표 분석물(8)이 CEA(carcinoembryonic antigen)이면, 제 1 바인더는 CEA의 제 1 에피토프에 특이적인 제 1 항체이다. 목표 분석물은 종양에 특이적인 마커들 또는 조직(tissue)에 특이적인 마커들을 포함할 수 있다.

목표 분석물들(8) 모두가 접합체 패드(2) 내에서 제 1 바인더(10)와 부착되는 것은 아님이 주목될 필요가 있다. 즉, 접합체 패드(2) 내에서도 제 1 바인더(10)와 결합하지 않은 분석물들이 여전히 존재하게 된다. 또한, 제 1 바인더를 포함하는 접합체는 혈액의 확산 흐름과 같이 확산되게 된다. 따라서, 이러한 혈액의 확산 흐름 가운데에 아직 결합되지 않은 분석물과 접합체가 서로 결합될 필요가 있으며, 또한 이러한 결합량을 증가시킬 필요가 있다. 본 발명은 이를 위해서 접합체 패드(2)에 후속하여 별도로 배치되어서 혈액의 확산 흐름을 지연시키는 흐름 지 연 패드(3)를 포함하고 있다. 이렇게 흐름 지연 패드(3)를 설치함으로써 접합체 패드(2) 내에서 아직 서로 결합되지 않은 접합체와 분석물이 서로 결합되는 반응 시간이 길어지게 되어서 제 1 면역 결합체의 생성량이 증가하게 되어서 이후의 테스트 라인(5)에서의 면역 반응 신호 강도가 커지게 되어서 더욱 정확한 측정 결과를 얻을 수 있게 된다. 이를 위해서, 본 발명에 있어서 흐름 지연 패드(3)의 평균 기공 크기(P₃)는 상류 방향의 접합체 패드(2)의 평균 기공 크기(P₂)보다 작아야 한다. 즉, 평균 기공 크기가 작게 되면 확산 흐름의 속도가 저하게 되어서 아직 서로 결합 또는 부착되지 않은 분석물과 접합체 간의 결합이 발생하는 결합 시간이 증가하게 되어서 최종 생성되는 제 1 면역 결합체의 양도 역시 증가하게 되는 것이다. 달리 말하면, 흐름 지연 패드(3)로 인해서 면역 분석 시의 최종 테스트 품질 및 정확도가 개선되게 된다. 이로써, 발명의 해결하고자 하는 과제 부분에서 기술된 특징 또는 효과 ③가 접합체 패드(2)의 평균 기공 크기(P₂) > 흐름 지연 패드(3)의 평균 기공 크기(P₃)로 해서 달성되게 된다.

이제, 위에서 설명한 본 발명의 구성적 특징들을 서로 통합하여 살펴보자. 상술한 본 발명의 효과 또는 특징들 ① 내지 ③을 모두 동시에 달성하기 위해서, 구체적으로 말하자면, ① 혈액이 샘플 수용 패드로부터 시작하여서 접합체 패드를 통과하기까지의 혈액의 플로우 레이트를 증가시켜서 더욱 신속한 테스트가 가능하게 하고, ② 전혈 샘플을 수용하는 샘플 수용 패드에 있어서 적혈구를 전혈 샘플로부터 분리하여서 테스트 라인에서의 백그라운드 효과를 감소시켜서 테스트 라인의 시각적 감도를 개선하며, ③ 혈액 내의 목표 분석물에 바인더(binder)가 부착되는 양을 증가시켜서 테스트 품질 및 정확도를 개선하기 위해서, 본 발명에서는 상기 샘플 수용 패드(1)가 적혈구를 전혈 샘플로부터 분리시켜서 적혈구의 흐름을 차단하고, 상기 샘플 수용 패드(1), 상기 접합체 패드(2) 및 상기 흐름 지연 패드(2)의 평균 기공 크기를 각기 P₁, P₂ 및 P₃라고 할 때에, P₁ > P₂ > P₃의 관계가 성립된다.

일 실시예에서, 흐름 지연 패드(3)의 평균 기공 크기는 2 내지 4 ㎛이며, 접합체 패드(2)의 평균 기공 크기는 6 내지 11 ㎛이다. 또한, 흐름 지연 패드(2)는 폴리비닐 알콜 부착된 유리 섬유로 구성될 수 있다.

도 3은 본 발명에 따른 면역 분석에서 위킹 멤브레인을 따라 발생하는 모세관 흐름(capillary flow)을 도시하고 있다. 도 3에서도 역시 참조 부호가 생략되었지만, 각 구성 요소의 참조 부호는 도 1의 대응하는 구성 요소의 참조 부호와 동일하다. 모세관 흐름은 위킹 멤브레인(4)에서 주로 발생하는 흐름 기재이다. 위킹 멤브레인(4)은 흐름 지연 패드(3)와 접촉되어서 흐름 지연 패드(3)로부터 혈액을 수용한다. 위킹 멤브레인(3)은 목표 분석물(8)에 특이적으로 부착되면서 자신의 테스트 라인(5)에 고정화되어 있는 제 2 바인더(12)를 가지고 있다. 접합체 패드(2)의 제 1 바인더는 혈액의 흐름과 함께 이동하는데 반해서, 제 2 바인더는 혈액의 흐름과 함께 이동하지 않고 테스트 라인에 고정화되어 있다. 이 테스트 라인(5)에서 상기 형성된 제 1 면역 결합체가 제 2 바인더(12)와 결합되어서 제 2 면역 결합체가 형성되게 되고 이 제 2 면역 결합체는 도 3에 도시된 바와 같이 테스트 라인에 고정되게 된다. 이러한 방식으로, 목표 분석물(8)은 테스트 라인(5)에서 제 1 바인더(11)와 제 2 바인더(12) 간에 샌드위치되게 된다. 따라서, 제 2 바인더(12)는 테스트 라인에 고정되고 제 2 바인더(12)는 분석물에 부착되게 되고 표지자(9)도 역시 테스트 라인에 고정화되게 된다. 즉, 테스트 라인에 고정된 표지자의 양은 혈액 내에 함유되어 있는 목표 분석물(8)의 양과 비례하게 된다. 따라서, 테스트 라인(5)의 색상화 정도를 측정함으로써 혈액 샘플 내의 목표 분석물의 양을 정확하게 측정할 수 있게 된다. 가령, 테스트 라인의 색상화 정도를 측정하기 위해서 CMOS 카메라 또는 CCD 카메라가 사용될 수 있다.

특히, 상술한 바와 같이, 본 발명에 있어서, 흐름 지연 패드(3)는 접합체 패드(2) 내에서 아직 서로 결합되지 않은 분석물(8)과 접합체(이 접합체는 제 1 바인더(10)를 포함함) 및 이미 접합체 패드 내에서 형성된 제 1 면역 결합체(이 면역 결합체는 분석물과 접합체의 결합 생성물임)를 포함하는 혈액을 수용하게 되고, 수용된 혈액의 흐름을 지연시킴으로써 아직 서로 결합되지 않은 분석물과 접합체가 서로 결합되게 되는 시간을 길게 함으로써 그 내에서 새로운 제 1 면역 결합체가 더 많이 생성되게 한다. 이로써, 테스트 라인(5)에서 제 2 바인더(12)와 결합하여서 새로운 고정화되는 제 2 면역 결합체의 생성량이 증가하게 되어서 면역 분석의 색상의 강도 또는 신호의 강도가 더욱 증진되게 된다. 그러므로, 종래에 접합체 패드와 위킹 멤브레인 간에 어떠한 패드도 없을 경우와 비교하여 본원 발명에서는 테스트 라인에서의 신호 강도 증진 효과가 더욱 우수하게 된다. 한편, 접합체 패드와 위킹 멤브레인 간에 소정의 다공성 패드가 설치되어 있다고 하더라도, 이 소정의 다공성 패드의 평균 기공 크기가 접합체 패드의 평균 기공 크기와 같거나 그보다 크다면, 본원 발명에서와 같이 혈액 흐름 지연으로 인한 테스트 라인에서의 신호 증강 또는 색상화 강도 증강 효과는 현저하지 않게 된다.

한편, 제 1 바인더와 결부시켜서 제 2 바인더(12)에 대해서 말하자면, 이 목표 분석물(8)이 PSA이면, 제 2 바인더(12)는 PSA의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체이다. 목표 분석물(8)이 항체로서 TSH이면, 제 2 바인더(12)는 TSH의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체이다. 목표 분석물(8)이 항체로서 NTProBNP이면, 제 2 바인더(12)는 NTProBNP의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체이다. 목표 분석물(8)이 항체로서 CK-MB이면, 제 2 바인더(12)는 CK-MB의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체이다. 목표 분석물(8)이 MYO이면, 제 2 바인더는 MYO의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체이다. 목표 분석물(8)이 CEA이면, 제 2 바인더는 CEA의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체이다.

이어서, 접합체 패드(2) 및 흐름 지연 패드(3)에서 분석물(8)과 결합되지 않은 접합체는 혈액의 흐름과 함께 테스트 라인(5)을 지나쳐 버린다. 접합체 패드(20) 내에서, 표지 물질 또는 표지자(9) 및 제 1 바인더(10)를 포함하고 있는 확산 가능하게 부착된 접합체의 양은 혈액 샘플 내에 함유되어 있는 것으로 추측되는 목표 분석물(8)의 양에 비해서 매우 충분히 존재하고 있다. 테스트 라인(5)을 통과한 접합체는 위킹 멤브레인(4)의 콘트롤 라인(control line)(6)에 부착되게 된다. 즉, 위킹 멤브레인(4)은 분석물(8)에는 부착되지 않지만 제 1 바인더(10)에는 특이 적으로 부착되는 제 3 바인더(13)를 자신의 콘트롤 라인(6)에서 포함하고 있다. 이 제 3 바인더(13)는 콘트롤 라인(6)에 고정화되어 있어서 혈액의 흐름과 함께 흘러가지 않게 된다. 콘트롤 라인은 도시된 바와 같이 테스트 라인의 하류 방향에 위치하고 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 분석물(8)에는 부착되지 않는 제 1 바인더(10)가 콘트롤 라인(6)의 제 3 바인더(13)에 부착되어서 고정화되게 된다. 이러한 콘트롤 라인의 목적은 크게 다음과 같은 2 가지이다. 첫째로, 콘트롤 라인(6)은 혈액 내에 목표 분석물의 존재 여부와는 상관없이 혈액이 패드들(1,2,3) 및 멤브레인(4)을 통해서 모세관 현상에 의해서 이 콘트롤 라인(6)까지 이동하였는지를 표시하는 기능을 한다. 즉, 콘트롤 라인의 해당 테스트가 성공적으로 수행되었는지의 여부를 표시한다. 둘째로, 콘트롤 라인은 면역 분석의 양성 음성 결과 표시 중에 양성 결과를 표시하는 기능을 한다. 구체적으로 말하자면, 목표 분석물(8)이 혈액 내에 존재하지 않는다면, 테스트 라인(5)에서의 색상화는 발생하지 않을 것이지만 콘트롤 라인(6)에서는 발생하게 되어 있다. 이로써, 콘트롤 라인에서만 색상이 나타난다면 목표 분석물이 혈액 내에 존재하지 않는다는 면역학적 양성 표시를 하고 있는 것이다.

여기서, 제 3 바인더(13)에 대해서 말하자면, 제 3 바인더는 항체, 항원 및 합텐으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 항체로서 제 3 바인더는 Fc 영역 또는 Fab 영역과 같은 항체 분절(antibody fragments) 또는 전체 Ig 분자에 대해서 특이성을 갖는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체이다. 가령, 접합체로서 콜로이드 형태의 금 입자로 표지화된 마우스 안티-휴먼 IgG(mouse-anti human IgG)가 접합체 패드(2)에서 사용된다면, 콘트롤 라인(6)에서의 제 3 바인더는 항체로서 안티-마우스 IgG(anti-mouse IgG)가 된다.

이어서, 콘트롤 라인(6)을 통과한 혈액은 베이스 부재(4)의 다른 단부(본 실례에서는 우측 단부) 상에 배치되고 위킹 멤브레인(4)에 접촉되어 있는 흡수 패드(7) 내로 흡수된다. 이 흡수 패드(7)는 위킹 멤브레인(4)으로부터 혈액을 흡수하기 위해서 다수의 기공을 가지고 있다.

실례 1: PSA 테스트

A. 접합체 준비

금 졸 입자(gold sol particle)들이 미국 특허 제 4,313,734호에 개시된 바와 같이 잘 알려진 절차를 따라서 준비된다. 금 졸의 pH는 7로 조절된다. 마우스 안티-PSA 항체(최종 농도 20ug/ml)가 1 ml의 금 졸 용액에 부가되고 약 30 분 동안 주위 온도에서 강하게 저어진다. 10% 네오 프로테인 세이버(Neo Protein Saver) 0.1 ml이 부가되고, 부가된 용액이 대략 30분 동안 주위 온도에서 연속적으로 저어진다. 콜로이드 형태의 금-모노클로날 항체 접합체가 약 20 분 동안 GSA 로터(rotor)에서 10,000 rpm으로의 원심 분리에 의해서 회수된다. 그리고, 상층 액체를 버리고 나서, 그 회수된 물질을 pH 7.4의 1ml 50mM 붕산 용액 위에 붓고 섞는다. 이어서, 이를 GSA 로터에서 약 20 분 동안 10,000 rpm으로 원심 분리하여서 필요한 물질이 다시 가라 않게 한다. 이어서, 다시 상층 액체를 버리고 원하는 물질을 회수하여서 pH 7.4 50mM 붕산 용액 내의 0.5ml의 1% 네오 프로테인 세이버 및 1% 수크로즈(sucrose)로 구성된 저장 용액 내에 부어진다.

B. 베이스 부재 상에 횡형 어레이의 제조

양면 투명 접착 테이프가 얇은 플라스틱의 상부 표면 상에 부착된다. 니트로셀룰로즈 멤브레인 스트립이 절단되어 양면 투명 접착 테이프의 위킹 멤브레인 위치 상에 바로 부착된다. PSA를 위한 고정화된 테스트 라인에 1mg/ml 모노클로날 PSA 항체 용액 15 ul을 침투시킨다. 콘트롤 라인에 대해서는, 고트 안티-마우스 항체(goat anti-mouse antibody) 1mg/ml가 테스트 라인의 하류 방향 위치에 침투된다. 이어서, 멤브레인이 대략 12 시간 동안 주위 온도에서 건조된다. 베이스 부재 및 위킹 멤브레인은 후속 처리시까지 건조기(desiccator) 내에 저장될 수도 있다. 이어서, 흐름 지연 패드가 약 2 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는 폴리비닐 알콜 부착된 유리 섬유로 구성된다. 이어서, 이 흐름 지연 패드가 절단되어서 위킹 멤브레인에 접촉되도록 양면 테이프 상에 바로 부착된다. pH 7.4의 10 mM PBS(phosphate buffer saline) 내의 3% 덱스트런 설페이트(dextran sulfate), 5% 수크로즈 및 2% 네오 프로테인 세이버와 콜로이드 형태의 금 마우스 안티-PSA 항체로 구성된 용액에 11㎛의 평균 기공 크기를 갖는 사전 처리된 유리 섬유 조각을 젖게 함으로써 접합체 패드가 형성된다. 이어서, 이 접합체 패드는 사용시까지 건조기에서 건조 저장된다. 이 접합체 패드를 흐름 지연 패드에 접촉되게 하여서 양면 접착 테이프 상에 바로 부착한다. 약 30 내지 150㎛의 기공 크기를 갖는 샘플 수용 패드를 pH 7.4의 10 mM PBS 내의 다가 양이온을 뛰는 1.3% 양이온 폴리머인 폴리-L-리신-하이드로브로마이드로 구성된 용액에 젖게 하여서 건조된다. 건조된 샘플 수용 패드는 접합체 패드와 접촉되면서 베이스 부재의 좌측 단부 상에 배치되도록 양면 투명 접착 테이프 상에 바로 부착된다.

C. 분석 결과

전혈 100 ul 피펫(pipette)이 샘플 수용 패드에 부여된 경우에, 검출 가능한 신호가 2분 40초 후에 테스트 라인에서 나타났다. 분석 민감도(assay sensitivity)는 0.5ng/mL이 되었다.

본 발명의 몇몇 실시예들이 위에서 기술되었지만, 본 발명의 기술적 사상 및 장점을 실질적으로 벗어나지 않는 한 수많은 수정 실시예들이 본 기술 분야의 당업자에게는 가능하다는 것을 주목할 필요가 있다. 이러한 수정 실시예들도 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다.

가령, 본 발명의 일 수정 실시예에서, 상기 위킹 멤브레인은 상기 테스트 라인과 상기 콘트롤 라인 간에 배치된 다른 테스트 라인을 더 포함하며, 상기 목표 분석물의 제 3 에피토프 또는 제 3 리간드에 특이적으로 부착되는 제 4 바인더가 상기 다른 테스트 라인에 고정화되어 있다.

또한, 본 발명의 다른 수정 실시예에서, 상기 전혈 샘플 내의 목표 분석물은 다수의 목표 분석물이며, 다른 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 4 바인더와 표지자가 서로 접합되어 있는 확산 가능하게 부착된 다른 접합체가 상기 접합체 패드 내에 스며들어 있으며, 상기 위킹 멤브레인은 상기 테스트 라인과 상기 콘트롤 라인 간에 배치된 다른 테스트 라인을 더 포함하고, 상기 다른 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 5 바인더가 상기 다른 테스트 라인에 고정화되어 있다. 한편, 상기 목표 분석물은 유리형 PSA(free prostate specific antigen)이며, 상기 다른 목표 분석물은 결합형 PSA(complex prostate specific antigen)일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 수정 실시예에서, 상기 다가 양이온을 중화시키는 다가 음이온(polyanions)이 상기 접합체 패드 내에 부착되게 제공된다. 한편, 상기 다가 음이온은 덱스트란 설페이트, 폴리(아크릴산), 폴리(나트륨-4-스티렌 설포네이트), 폴리(비닐 설폰산), 폴리(메틸 메타크릴산), 폴리-L-아스파르트산 및 카복시메틸 셀룰로즈로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이로써, 다가 음이온은 적혈구 분리 역할을 하는 다가 양이온을 전기적으로 중화시킬 수 있어서, 적혈구 분리 역할을 하는 다가 양이온에 의한 악영향들이 제거될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 측방 유동 면역 분석 디바이스의 사시도이다.

도 2는 본 발명에 따른 면역 분석에서 다수의 패드를 따라 발생하는 확산 흐름을 도시하고 있다.

도 3은 본 발명에 따른 면역 분석에서 위킹 멤브레인을 따라 발생하는 모세관 흐름(capillary flow)을 도시하고 있다.

도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명

1 : 샘플 수용 패드 2 : 접합체 패드

3 : 흐름 지연 패드 4 : 위킹 멤브레인

5 : 테스트 라인 6 : 콘트롤 라인

7 : 흡수 패드 8 : 목표 분석물

9 : 색상을 띠는 입자 10 : 제 1 바인더

11 : 차단제 12 : 제 2 바인더

13 : 제 3 바인더 14 : 베이스 부재

100 : 측방 유동 면역 분석 디바이스

Claims

전혈 샘플(whole blood sample) 내의 목표 분석물(analyte)을 정량 또는 정성적으로 측정하는 측방 유동 면역 분석 디바이스(lateral flow immunoassay device)로서,

베이스 부재(base member)와,

상기 베이스 부재 상에 배치된 횡형 어레이(horizontal array)를 포함하며,

상기 횡형 어레이는,

(i) 상기 베이스 부재의 일 단부 상에 배치되고 다수의 기공(pores)을 가지며 상기 전혈 샘플을 수용하는 샘플 수용 패드(sample receiving pad)와,

(ii) 상기 샘플 수용 패드와는 별개의 패드이면서 상기 샘플 수용 패드와 접촉하고 있으며 다수의 기공을 갖고, 확산 가능하게 부착된 접합체(diffusively bound conjugate)가 그 내에 제공되어 있는 접합체 패드(conjugate pad)━상기 접합체 패드는 상기 적혈구가 분리된 상기 전혈 샘플을 상기 샘플 수용 패드로부터 수용하며, 상기 접합체 패드 내에서 상기 전혈 샘플 내에 존재하는 목표 분석물과 상기 접합체가 서로 결합함으로써 제 1 면역 결합체(first immuno-complex)가 형성되며, 상기 접합체는 상기 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 1 바인더(first binder)와 표지자(label)를 포함하며, 상기 접합체에 있어서 상기 제 1 바인더와 상기 표지자는 서로 접합(conjugate)되어 있음━와,

(iii) 상기 접합체 패드와는 별개의 패드이며 상기 접합체 패드와 접촉하고 있으며 다수의 기공을 갖고, 상기 접합체 패드 내에서 서로 결합되지 않은 목표 분석물과 접합체 및 상기 형성된 제 1 면역 결합체를 함유하고 있는 혈액을 상기 접합체 패드로부터 수용하며, 상기 수용된 혈액의 흐름을 지연시키는 흐름 지연 패드(flow delaying pad)━상기 흐름 지연으로 인해서, 상기 서로 결합되지 않은 목표 분석물과 접합체가 상기 흐름 지연 패드 내에서 서로 결합되어 제 1 면역 결합체가 새롭게 더 형성되게 되는 반응 시간이 길어지게 됨━와,

(iv) 상기 흐름 지연 패드와 접촉하며 상기 흐름 지연 패드로부터 혈액을 수용하는 위킹 멤브레인(wicking membrane)━상기 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 2 바인더가 상기 위킹 멤브레인의 테스트 라인에 고정화되어 있으며, 상기 제 2 바인더와 상기 제 1 면역 결합체가 서로 결합되어서 상기 테스트 라인에 고정되게 되는 제 2 면역 결합체(second immuno-complex)가 형성됨━을 포함하며,

상기 샘플 수용 패드는 상기 전혈 샘플로부터 적혈구(red blood cell)를 분리하며, 이로써 상기 적혈구가 흐름을 차단하고,

상기 샘플 수용 패드, 상기 접합체 패드 및 상기 흐름 지연 패드의 평균 기공 크기를 각기 P₁, P₂ 및 P₃라고 할 때에, P₁ > P₂ > P₃의 관계가 성립되는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1 항에 있어서,

다가 양이온(polycations)이 상기 샘플 수용 패드 내에 부착되게 제공되어서 적혈구를 전혈 샘플로부터 분리시키는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1 항에 있어서,

상기 위킹 멤브레인은 상기 목표 분석물에는 특이적으로 부착되지 않지만 상기 제 1 바인더에는 특이적으로 부착되는 제 3 바인더를 더 포함하며,

상기 제 3 바인더는 상기 위킹 멤브레인의 콘트롤 라인(control)에 고정화되어 있으며,

상기 콘트롤 라인은 상기 테스트 라인의 하류 방향에 위치하는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 표지자는 금 나노 입자(gold nanoparticle), 발색 효소 또는 형광 물질인 것을 특징으로 하는,

측 방향 면역 분석 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 목표 분석물은 항체, 항원, 핵산 압타머(nucleic acid aptamer), 합텐(hapten), 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질(DNA-binding protein), 호르몬, 종양 특이적 마커(tumor-specific marker) 및 조직 특이적 마커(tissue-specific marker)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 5 항에 있어서,

상기 제 1 바인더, 상기 제 2 바인더 및 상기 제 3 바인더는 항체, 항원, 핵산 압타머, 합텐, 항원 단백질, DNA, DNA 결합성 단백질 및 호르몬-수용체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 흐름 지연 패드의 평균 기공 크기는 2 내지 4 ㎛인 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 7 항에 있어서,

상기 접합체 패드의 평균 기공 크기는 6 내지 11 ㎛인 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 횡형 어레이는 상기 베이스 부재의 다른 단부 상에 배치되며 상기 위킹 멤브레인에 접촉되고 다수의 기공을 가지며 상기 위킹 멤브레인으로부터 혈액을 흡수하는 흡수 패드(absorbent pad)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 2 항에 있어서,

상기 다가 양이온이 폴리-L-리신 하이드로브로마이드, 폴리-L-아르기닌 하이드로클로라이드, 폴리-L-히스티딘, 폴리(리신, 알라닌) 3:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 알라닌) 2:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 알라닌) 1:1 하이드로브로마이드, 폴리(리신, 트립토판) 1:4 하이드로브로마이드 및 폴리(디알릴디메틸암 모늄 클로라이드)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 흐름 지연 패드는 폴리비닐 알콜 부착된 유리 섬유(polyvinyl alcohol-bound glass fiber)로 구성되는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 6 항에 있어서,

상기 제 1 바인더는 상기 목표 분석물의 제 1 에피토프(first epitope) 또는 제 1 리간드(first ligand)에 특이적으로 부착되고,

상기 제 2 바인더는 상기 목표 분석물의 제 2 에피토프 또는 제 2 리간드에 특이적 또는 비특이적으로 부착되는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 12 항에 있어서,

상기 위킹 멤브레인은 상기 테스트 라인과 상기 콘트롤 라인 간에 배치된 다 른 테스트 라인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 13 항에 있어서,

상기 목표 분석물의 제 3 에피토프 또는 제 3 리간드에 특이적으로 부착되는 제 4 바인더가 상기 다른 테스트 라인에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 3 항에 있어서,

상기 전혈 샘플 내의 목표 분석물은 다수의 목표 분석물이며,

다른 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 4 바인더와 표지자가 서로 접합되어 있는 확산 가능하게 부착된 다른 접합체가 상기 접합체 패드 내에 스며들어 있으며,

상기 위킹 멤브레인은 상기 테스트 라인과 상기 콘트롤 라인 간에 배치된 다른 테스트 라인을 더 포함하고,

상기 다른 목표 분석물에 특이적으로 부착되는 제 5 바인더가 상기 다른 테스트 라인에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 15 항에 있어서,

상기 목표 분석물은 유리형 PSA(free prostate specific antigen)이며,

상기 다른 목표 분석물은 결합형 PSA(complex prostate specific antigen)인 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 2 항에 있어서,

상기 다가 양이온을 중화시키는 다가 음이온(polyanions)이 상기 접합체 패드 내에 부착되게 제공되는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.
제 17 항에 있어서,

상기 다가 음이온은 덱스트란 설페이트, 폴리(아크릴산), 폴리(나트륨-4-스티렌 설포네이트), 폴리(비닐 설폰산), 폴리(메틸 메타크릴산), 폴리-L-아스파르트산 및 카복시메틸 셀룰로즈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,

측방 유동 면역 분석 디바이스.