KR101212935B1 - 면역크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 면역크로마토그래피 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분석물을 고감도로 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석에 있어서, 제 1 표지체 및 제 2 표지체의 크기를 구별하여 흐르는 속도를 조절함으로써 신호를 증폭시키는 방법 및 이를 이용한 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다.

보다 자세하게, 본 발명은 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 및 연결자가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체와 분석물을 결합하는 단계; 상기 1차 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체를 결합하는 단계; 및 상기 1차 접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 상기 1차 접합체의 연결자에 결합하는 단계를 포함하며, 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 상기 고정화된 제 2 항체와 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체의 입자가 상기 제 1 표지체의 입자 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 고정화된 제 2 항체에 도달하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법; 및

분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드; 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 및 연결자가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체, 및 상기 1차 접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 포함하고, 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 고정화된 제 2 항체에 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체가 상기 제 1 표지체 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 접합 패드; 상기 1차 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 항체가 고정화 된 탐지부(detection site) 및 오류 확인을 위한 컨트롤부(control site)를 포함하는 멤브레인; 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드 를 포함하는 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다.

특히 본 발명은 기계의 별다른 조작이나 인위적인 단계적 반응 없이 한 번의 시료 주입으로 신호증폭을 수행한다.

Description

면역크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 면역크로마토그래피 키트{METHOD FOR AMPLIFICATION OF SIGNAL IN IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY AND IMMUNOCHROMATOGRAPHIC KIT USING THE METHOD}

본 발명은 분석물을 고감도로 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다. 보다 자세하게, 본 발명은 샌드위치(sandwich) 분석법에 있어서 제 1 표지체 및 이에 결합하는 제 2 표지체의 크기를 구별하여 흐르는 속도를 조절함으로써 신호를 증폭시키는 고감도 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다.

면역크로마토그래피 분석법은 생물학적 물질 또는 화학적 물질이 서로 특이적으로 부착하는 성질을 이용하여 분석 물질을 단시간에 정성 및 정량적으로 검사할 수 있는 방법으로, 특히 샌드위치형 면역분석법은 존재 여부 및 농도 조사의 대상이 되는 분석물의 제 1 에피토프(epitope)에 특이적인 항체가 고체 지지체에 고정화 되고, 분석물의 제 2 에피토프에 특이적인 제 2 항체를 이용하는 것으로서 잘 알려져 있다.

이러한 면역크로마토그래피 분석을 위한 키트로는 분석 스트립 또는 상기 분 석 스트립을 하우징 내부에 장착해 조립한 형태의 면역 분석 키트가 일반적으로 사용된다. 이 때 분석물을 포함하는 유체를 다공성 스트립 한편에 적용하면 모세관 현상에 의해 유체가 흘러가면서 분석 대상물이 표지체를 포함하는 항체 및 고정화 항체에 결합하여 샌드위치형 분석법을 완성한다.

보다 상세하게 면역 크로마토그래피 키트는 일반적으로 액체 시료가 모세관현상으로 흐를 수 있는 멤브레인에 항체가 고정되어 있고, 멤브레인의 상류측에는 샘플 패드와 접합 패드가 구비되어 있으며, 하류 측에 흡수 패드가 연결되어 있다. 상기 샘플패드는 분석물을 포함하는 액체 시료를 흡수하고 균일한 유동을 보장하며, 접합 패드에는 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 표지체가 건조되어 있다. 상기 멤브레인에는 분석물에 선택적으로 결합하는 고정화된 항체 및 표지체에 고정화된 항체와 결합할 수 있는 물질이 각각 다른 위치에 고정화 되어 각각 탐지 부 및 컨트롤 부를 형성한다. 상기 분석물과 선택적으로 결합할 수 있는 멤브레인에 고정화된 항체와 표지체에 고정화된 항체는 분석물에 대해 샌드위치 형태로 결합될 수 있도록 구성된다. 상기 흡수패드는 액체시료를 흡수할 수 있는 물질로 구성된다. 이와 같은 면역 크로마토그래피 분석 키트에 있어서 분석물을 포함하는 액체시료를 샘플패드에 떨어뜨리면, 분석물에 선택성을 가지는 항체-표지체와 멤브레인에 고정화된 항체가 샌드위치 형태로 결합되어 상기 항체가 고정화된 멤브레인 위치에 육안으로 확인할 수 있는 밴드를 형성하게 된다.

종래 기술로서 1차 접합체와 항원이 결합된 후 2차 접합체가 추가로 결합하고 이들이 최종적으로 멤브레인에 고정화된 항체에 결합하는 면역크로마토그래피의 신호증폭 방법이 개시되어 있으나, 종래의 면역 크로마토그래피 방법으로 측정할 수 있는 감도가 낮아 더 높은 감도를 요구하는 시료의 경우 측정하기 어려운 문제가 있다.

이에, 본 발명자들은 면역 크로마토그래피 상에서 1차 접합체와 항원이 결합하여 이들이 고정화된 항체와 샌드위치 반응으로 결합된 후, 후속적으로 2차 접합체가 결합하는 경우 신호 증폭의 감도가 향상됨을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다. 특히 본 발명은 기계의 별다른 조작이나 인위적인 단계적 반응 없이 한 번의 시료 주입으로 신호증폭을 수행한다.

기술적 과제

이에 본 발명의 한 측면은 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법을 제공하는 것이다.

이에 본 발명의 또 다른 측면은 상기 신호 증폭 방법을 이용하여 감도가 향상된 면역 크로마토그래피 키트를 제공하는 것이다.

기술적 해결방법

본 발명의 일 견지에 의하면, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 및 연결자가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체와 분석물을 결합하는 단계; 상기 1차 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체를 결합하는 단계; 및 상기 1차 접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 상기 1차 접합체의 연결자에 결합하는 단계를 포함하며, 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 상기 고정화된 제 2 항체와 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체의 입자가 상기 제 1 표지체의 입자 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 고정화된 제 2 항체에 도달하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체와 분석물을 결합하는 단계; 상기 1차 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체를 결합하는 단계; 및 상기 1차 접합체의 제 1 항체에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 상기 1차 접합체의 제 1 항체에 결합하는 단계를 포함하며, 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 상기 고정화된 제 2 항체와 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체의 입자가 상기 제 1 표지체의 입자 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드; 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 및 연결자가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체 및 상기 1차 접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 포함하고, 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 고정화된 제 2 항체에 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체가 상기 제 1 표지체 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 접합 패드; 상기 1차 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 항체가 고정화 된 탐지부(detection site) 및 오류를 확인을 위한 컨트롤부(control site)를 포함하는 멤브레인; 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드를 포함하는 면역 크로마토그래피 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드; 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체, 및 상기 1차 접합체의 제 1항체에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 포함하고, 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 고정화된 제 2 항체에 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체가 상기 제 1 표지체 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 접합 패드; 상기 1차 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 항체가 고정화 된 탐지부(detection site) 및 오류 확인을 위한 컨트롤부(control site)를 포함하는 멤브레인; 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드를 포함하는 면역 크로마토그래피 키트가 제공된다.

유리한 효과

본 발명의 신호 증폭 방법에 의하면 1차 접합체가 항원과 함께 포획항체에 고정된 후 후속적으로 2차 접합체가 1차 접합체와 결합함으로써 우수한 신호증폭 효과가 제공되며, 이러한 증폭 방법을 이용하여 감도가 향상된 면역크로마토그래피 키트의 제조가 가능하다.

도 1은 본 발명의 방법에 의해 항원을 분석하는 경우 신호 증폭이 일어나는 과정을 나타낸 모식도이며, (1)은 제 1항체, (2)는 연결자, (3)은 제 1표지체, (4)는 분석물, (5)는 제 2 항체, (6)은 제 3항체, (7)은 제 2 표지체를 나타내며, (8)은 1차 접합체 그리고 (9)는 2차 접합체를 나타낸다.

도 2(A)는 본 발명의 면역 크로마토그래피 키트의 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이며, (10)은 시료 패드, (11)는 접합 패드, (12)는 멤브레인, (13)는 탐지부, (14)는 컨트롤부, (15)은 흡수 패드를 나타내며, (17)은 2차 접합체가 고정된 부, (18)은 1차 접합체가 고정된 부를 나타낸다.

도 2(B)는 2개의 접합패드를 갖는 본 발명의 면역 크로마토그래피 키트의 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이며, (16)은 제 2 접합 패드, (17)은 2차 접합체가 고정된 부를 나타내며, (19)는 1차 접합체가 전체적으로 도포된 제 1 접합패드를 나타낸다.

도 2(C)는 상기 2(B)의 면역크로마토그래피 키트의 조립된 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이다.

도 3(A) 및 도 3(B)는 2차 접합체에 사용된 나노입자 크기에 따른 신호 증폭 효과를 트로포닌I을 항원으로 이용하여 측정한 결과를 나타내는 것이다.

도 4는 트로포닌 I 을 이용하여 접합체 분리에 따른 신호 증폭 효과를 실험 한 결과(A) 및 이에 대한 그래프 (B)를 나타낸 것이다.

도 5는 미오글로빈을 이용하여 접합체 분리에 따른 신호 증폭 효과를 실험한 결과(A) 및 이에 대한 그래프(B)를 나타낸 것이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

본 명세서에서 언급되는 '연결자'는 제 3항체와 항원 항체 반응에 의해 특이적으로 결합하여 2차 접합체가 1차 접합체와 결합할 수 있도록 하는 물질을 의미한다. 본 명세서에서 언급되는 '1차 접합체'는 제 1 항체, 연결자 및 제 1 표지체로 이루어진 것을 의미하나, 제 1항체가 하기 2차 접합체의 제 3항체와 결합할 수 있는 경우에는 연결자를 포함하지 않을 수 있다. 1차 접합체는 항원과 결합 후 스트립을 흐르다가 포획항체에 고정된다. 본 명세서에서 언급되는 '2차 접합체'는 상기 1차 접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3항체 및 제 2 표지체로 이루어진 것을 의미하며, 제 3항체가 1차 접합체의 혈청 알부민에 특이적으로 결합함으로써 신호를 증폭한다. 다만, 제 1항체와 제 3항체가 특이적으로 결합할 수 있는 경우로서 연결자가 포함되지 않은 경우에는, 상기 제 3항체는 1차 접합체의 제 1항체에 결합함으로써 신호를 증폭한다.

본 발명의 신호증폭 방법은 면역 크로마토그래피에서 제 1항체 및 제 1표지체로 구성된 1차 접합체가 항원과 결합한 후 고정된 포획항체인 제 2항체에 샌드위치 반응으로 결합되며, 후속적으로 제3항체 및 제 2표지체로 구성된 2차 접합체가 1차 접합체에 결합하여 신호를 증폭시키는 방법이다. 특히 본 발명의 방법에 따라 1차 접합체의 표지체 크기보다 2차 접합체의 표지체 크기가 크도록 조절하여 2차 접합체의 흐름 속도를 조절함으로써 신호 증폭의 감도가 향상되도록 한다.

도 1은 연결자를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 항원을 분석하는 경우 신호 증폭이 일어나는 과정을 나타낸 모식도이며, 제 1항체(1) 및 연결자(2)는 제 1표지체(3)에 결합하여 1차 접합체(8)를 구성하고, 제 3항체(6)는 제 2 표지체(7)에 결합하여 2차 접합체(9)를 구성한다. 1차 접합체(8)가 분석물인 항원(4)과 결합하여 고정된 포획항체인 제 3항체(5)와 결합한 뒤, 후속적으로 2차 접합체(9)가 1차 접합체에 결합한다.

본 발명에 의한 면역크로마토그래피 신호 증폭 방법의 기작을 첨부된 도면을 참고하면서 보다 상세히 살펴보면, 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체(1) 및 연결자(2)가 제 1 표지체(3)에 결합되어 있는 1차 접합체(8)와 분석물(4)을 결합하고, 상기 1차 접합체가 결합된 분석물이 스트립을 따라 흐르다가 상기 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체(5)에 결합하며, 이러한 샌드위치 결합에 후속적으로 상기 1차 접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3 항체(6)가 제 2 표지체(7)에 결합되어 있는 2차 접합체(9)가 상기 1차 접합체의 연결자(2)에 결합한다. 이 때 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 상기 고정화된 제 2 항체와 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체의 입자가 상기 제 1 표지체의 입자 보다 큰 것을 사용하여 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 고정화된 제 2 항체에 도달함으로써 면역크로마토그래피의 신호가 증폭되도록 한다.

상기 1차 접합체에 포함되는 연결자는 BSA(Bovine serum albumin) 또는 HSA(Human serum albumin)일 수 있으며, 이 때 제 3항체는 항-BSA 또는 항-HSA이 사용될 수 있다. 다만 상기 연결자 및 제 3항체는 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 펩타이드와 항체 결합, 비오틴과 아비딘과 같이 2차 접합체가 1차 접합체에 결합할 수 있도록 하는 어떠한 선택적인 반응이 가능하며, 분석물(analyte)과 결합하지 않는 어떠한 물질을 포함한다. 본 발명에 의한 바람직한 연결자로는 혈청 알부민, 특히 BSA를 사용하며, 2차 접합체 제조 시에는 1차 접합체 제조 시에 사용되지 않는 혈청알부민을 사용한다. 다만, 본 발명에서 사용되는 연결자는 2차 접합체가 1차 접합체에 결합할 수 있도록 1차 접합체에 포함된 것이므로, 제 3항체와 제 1항체가 특이적으로 결합할 수 있는 경우에는 연결자를 포함하지 않을 수 있다. 제 3항체와 제 1항체가 특이적으로 결합할 수 있는 경우로는 제 3항체의 항체가 제 1항체를 항원으로 인식하여 결합하는 경우가 포함된다. 이와 같이 본 발명은 2차 접합체가 1차 접합체에 결합할 수 있는 어떠한 구조를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 분석물은 면역학적 반응, 즉 항원항체 반응에 의해 제 1항체 및 제 2항체와 결합하고 샌드위치형 면역 복합체를 형성할 수 있는 것이면 특히 제한되지 아니하며, 대표적으로 단백질 또는 DNA, 환경호르몬 등을 포함하는 환경 오염 물질, 및 바이러스, 식중독 균 등과 같은 질병 인자나 병원 독성 물질에 대해서도 적용할 수 있다.

본 발명에 있어서 항원 및 항체는 항원-항체반응에 의해 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 아니하며, 분석물이 항체인 경우에는 이와 특이적으로 결합하는 물질을 항원으로 할 수 있다. 상기 항원 및 항체는 분석물에 따라 공지의 항원 및 항체를 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서 '표지체' 신호(signal)을 발생하는 착색물질로서, 발색제, 형광제 및 착색되는 라텍스 입자 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 금 콜로이드(colloid), 컨텀 닷(quantum dot) 입자일 수 있다. 1차 접합체 및 2차 접합체에 사용되는 제 1 표지체 및 제 2표지체는 서로 상이할 수 있으나 제조상의 문제 등을 고려하여 동일한 것이 바람직하다.

실시예 3 및 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 제 1 표지체의 입자는 10nm - 20nm 인 것이 바람직하며, 상기 제 2 표지체의 입자는 20nm-60nm 인 것이 바람직하다. 본 발명의 제 2 표지체 입자의 크기는 제 1 표지체 입자의 크기보다 큰 것을 특징으로 하며, 이에 따라 스트립 상에서 2차 접합체의 전개가 1차 접합체보다 늦어져서 1차 접합체가 항원과 함께 제 2항체에 도달하여 결합 후 후속적으로 2차 접합체가 1차 접합체에 결합되도록 한다.

본 발명의 면역 크로마토그래피 키트는 상기 신호 증폭 방법을 이용하는 것으로서, 분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드; 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 및 혈청 연결자가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체, 및 상기 제 1접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 포함하고, 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 고정화된 제 2 항체에 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체가 상기 제 1 표지체 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 접합 패드; 상기 1차 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 항체가 고정화 된 탐지부(detection site) 및 오류 확인을 위한 컨트롤부(control site)를 포함하는 멤브레인; 및 액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드를 포함한다.

도 2(A)는 본 발명의 면역 크로마토그래피 키트의 예시적인 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이며, (10)은 시료 패드, (11)는 접합 패드, (12)은 멤브레인, (13)는 탐지부, (14)는 컨트롤부, (15)은 흡수 패드를 나타내고, (17)은 2차 접합체가 고정된 부, (18)은 1차 접합체가 고정된 부를 나타낸다. 도 2(B)는 2개의 접합패드를 갖는 본 발명의 면역 크로마토그래피 키트의 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이며, (16)은 제 2 접합 패드, (17)은 2차 접합체가 고정된 부를 나타내며, (19)는 1차 접합체가 전체적으로 도포된 제 1접합패드를 나타낸다. 도 2(C)는 상기 2(B)의 면역크로마토그래피 센서의 완성된 구조를 개략적으로 나타낸 모식도이다.

본 발명의 면역크로마토그래피 키트의 제조에 사용될 수 있는 패드는 다공질 재료로서 천연 또는 합성의 재료로서 특히 제한되지 않는다. 바람직하게는 니트로셀룰로오스를 사용한다.

상기 샘플 패드(sample pad)는 분석물을 포함하는 액체 시료가 처음 흡수되는 부분으로, 멤브레인의 한쪽 끝단을 그대로 사용하거나 별도의 부재로 구성될 수 있고 분석물을 포함하는 시료를 흡수하여 모세관 현상에 의해 분석물을 접합패드로 이동시킨다.

상기 접합패드(conjugate pad)는 2차 접합체 및 1차 접합체가 건조된 상태로 존재하다가 분석물을 포함하는 액체 시료가 흡수되는 경우 2차 접합체 및 1차 접합체가 유동성을 획득하여 멤브레인(membrane)으로 이동한다. 상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 고정화된 제 2 항체에 가까운 곳에 배치되며, 제 2표지체 입자의 크기는 제 1표지체 입자의 크기보다 크게 제조되어 스트립 상에서 2차 접합체의 전개가 1차 접합체보다 늦어지도록 한다.

실시예 3 및 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 제 2 표지체의 입자는 20nm-60nm 인 것이 바람직하며, 상기 제 1 표지체의 입자는 10nm - 20nm 인 것이 바람직하다. 따라서, 상기와 같은 접합체의 배치 및 접합체에 포함된 표지체의 입자 크기를 조절하여 1차 접합체와 2차 접합체가 접촉되지 않고 항원과 결합한 1차 접합체가 포획항체게 도달한 뒤 2차 접합체가 후속적으로 결합될 수 있도록 한다.

상기 1차 접합체와 2차 접합체는 도 2(A)에 도시된 바와 같이 단일의 접합 패드 상의 별도의 구역에 분리되어 배치되거나, 상기 1차 접합체를 포함하는 제 1접합패드 및 상기 2차 접합체를 포함하는 제 2접합패드로 분리하여 도 2(B)와 같이 별도의 패드로 제조될 수 있다. 도 2(B)의 스트립이 조립된 결과는 도 2(C)에 도시한 바와 같다. 1차 접합체와 2차 접합체는 시간 차를 두고 순차적으로 이동하는 것이 바람직하므로, 접합패드를 제조 하는 데 있어서 액체 시료가 스트립 상에서 이동 시 상기 1차 접합체와 2차 접합체가 접촉되지 않도록 하여 접합체가 서로 섞이지 않도록 하는 것이 바람직하다.

실시예 4에서 분리된 2개의 접합패드를 이용하여 접합체를 분리함으로써 1차 접합체와 2차 접합체의 접촉을 더욱 제어한 경우 증폭 효과의 향상을 확인할 수 있 다. 그 결과 1차 접합체와 2차 접합체가 접촉되지 않도록 2개의 접합패드로 분리하여 제조한 경우의 신호 증폭 효과가 우수하였다(도 4, 도 5). 제 1 접합패드로서 약 20㎛ 이상의 포어 크기(pore size)로 항원과 용매의 유속을 저해하지 않는 범위에서 PVA(polyvinyl Alcohol)등의 물질을 처리하기에 적합하고 금나노입자 접합체의 전개를 원할하게 유지하는 패드를 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 GFC(Glass fiber conjugate) 패드를 사용할 수 있다. 상기 제 2 접합패드로서 약 2㎛ 이상의 바이오 입자와 비드 입자를 걸러주는 효과가 있어 혈액을 시료로 하였을 때 혈장을 분리시켜 걸러주는 기능을 가지고 있으며, 액체의 흡수력이 뛰어나 금나노입자 접합체 등을 전개시키기에 적합한 패드를 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 Fusion 5 패드를 사용할 수 있다. 다만 상기 패드는 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 특성을 갖는 어떠한 다른 적합한 패드를 대체하여 사용할 수 있다.

상기 멤브레인(membrane)은 니트로셀룰로스(Nitrocellulose) 성분의 입자가 도포된 재질로서 180 sec/cm 의 횡흐름(lateral flow) 유속으로 항원 항체간의 충분한 반응시간을 유지시킬수 있어 액체 시료의 유동성을 확보할 수 있는 재질이라면 특히 제한되지 아니하며, 멤브레인은 1차 접합체가 결합된 분석물의 제 2 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체가 고정화 되어 있는 탐지부(detection site) 및 이에 대한 대조군으로서 오류로 인한 반응 유무를 파악하기 위한 컨트롤부(control site)를 포함한다. 탐지부는 테스트 결과의 판독을 위해 결과를 보여주는 부분이다. 컨트롤부는 금나노입자 접합체와 포획항체의 오류 확인 위해 구성되며 이동성을 가진 물질들이 탐지부/컨트롤부까지 오류없이 반응이 제대로 진행되었는지 여부 를 확인하기 위한 것이다.

흡수 패드(absorbing pad)는 모세관 현상에 의해 반응 후 남은 잔여물을 충분히 흡수할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않으며,

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 이들 실시예는 본 발명의 예시를 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

발명의 실시를 위한 형태

실시예 1: 나노 입자-항체 접합체의 합성

1. 1차 접합체의 합성

금 나노입자 콜로이드 용액(BBInternational, 10 nm) 1 mL에 0.1 mL의 0.1 M 의 붕산 완충액(Borate buffer) (pH 8.5)를 넣고, 1 mg/mL의 제 1항체 10 uL 를 넣어 30분간 반응시켰다. 상기 반응 후 연결자로서 1％(w/v)의 BSA (Bovine serum albumin, Sigma )를 PBS(Phosphate buffered saline)(Gibco)에 녹인 용액을 0.1 mL 첨가하여 15분간 상온에서 반응시켰다. 상기 반응 후, 10,000 rpm, 섭씨 4도 에서 20분간 원심분리하여 10 mM의 PBS에 1 mg/mL 농도로 녹인 BSA (Bovine serum albumin, Sigma) 용액 1 mL에 분산시켰다. 상기의 원심분리 및 분산 공정을 1회 추가 반복 후 다시 원심분리하여 최종적으로 1mL의 PBS에 분산시켜 제 1접합체를 제조한다.

상기 제 1 항체로는 트로포닌 I대한 면역 분석 시 4T21, 560 (HyTest)를 사용할 수 있고, 미오글로빈에 대한 면역 분석 시 M012607(Fitzgerald)를 사용할 수 있다.

2. 2차 접합체의 합성

다양한 크기(10, 20, 40, 60 nm)의 금 나노입자 콜로이드 용액(BBInternational) 1 mL에 0.1 mL의 0.1 M 의 붕산 완충액(Borate buffer) (pH 8.5)를 넣고, 1 mg/mL의 제 3항체로서 항-BSA 항체(Genetex) 10 uL 를 넣어 30분 반응시켰다. 상기 반응 후 1％(w/v)의 HAS(Human serum albumin, Sigma) 를 증류수에 녹인 용액을 0.1 mL 첨가하여 15분 상온에서 반응시켰다. 상기 반응 후, 10,000 rpm, 섭씨 4도에서 20분간 원심분리 후, 1mg/mL HAS농도로 PBS에 녹인 용액 1mL에 분산시켰다. 상기 원심분리 과정 및 분산 과정을 2회 반복하여 2차 접합체를 제조하였다.

실시예 2: 면역 크로마토그래피의 제조

1. 면역크로마토그래피의 제조방법

플라스틱 패드(Millipore)에 니트로셀룰로스 멤브레인(Millipore, 180 sec Nitrocellulose)과 흡수 패드(Millipore)를 붙인 후, 디스펜서(Dispenser) 시스템(Zeta Co.)을 사용하여 PBS에 녹인 포획항체(제 2항체) 1 mg/mL 용액과, 대조구로서 PBS에 녹인 염소 항-마우스(Goat anti-mouse) IgG 항체(Sigma, M8642) 1 mg/mL 용액을 각각 6 cm/sec 속도로 멤브레인에 선을 그어 각각 탐지선(detection site)과 컨트롤선(control line)을 형성하였다. 상기 멤브레인을 건조시킨 후, 절단기에 넣어 3 mm 간격으로 절단하였다.

상기 포획 항체인 제 2항체는 트로포닌 I에 대한 면역 분석을 위해 트로포닌 포획항체(Hytest)를 사용할 수 있고, 미오글로빈에 대한 면역 분석을 위해 미오글로빈 포획항체 M09983110(Fitzgerald)를 사용할 수 있다.

샘플 패드(Millipore, C068) 는 0.5％ 트윈(Tween) 20, 5％ 수크로스, 5％ 덱스트란 0.05％ 아지드화 나트륨(sodium azide) 수용액에 담지 후 건조하여 10×3 mm 정도로 절단하였다.

멤브레인 및 흡수 패드가 조립된 상기 플라스틱 패드에 접합 패드, 샘플 패드를 도 2 B와 유사하게 조립하였으며, 도 2 B와 차이 나는 것은 2차 접합체 패드 제조방법에 관한 것이다. 접합체 패드의 제조방법은 하기에서 보다 자세히 설명한다.

2. 접합 패드의 제조방법

접합 패드를 1차 접합 패드 및 2차 접합 패드로 구분하여 제조하였다. 1차, 2차 접합 패드로 GFC (Millipore사)를 5×3 mm로 절단하여 실시예 1에서 제조된 1차 접합체 및 2차 접합체를 5 μL씩 각각 도포하여 건조하였다.

실시예 3: 금 나노입자의 크기에 따른 신호 증폭 효과

직경이 10 nm및 20 nm인 금 나노입자를 사용한1차 접합체와, 2차 접합체를 구성하는 금 나노입자를 다양한 크기(10, 20, 40, 60 nm)로 제조하여 금 나노입자 크기에 따른 신호증폭 효과를 살펴보았다.

상기 면역 크로마토그래피 센서를 항원으로서 트로포닌 I를 임의의 농도로 녹인 혈청 (Linear chemicals, Cromatest) 70 μL가 담지된 96 well 플레이트에 담지하여 측정하였다. 1차 접합체의 나노입자 직경이 10nm인 경우의 결과는 2차 접합 체의 나노 입자 크기에 따른 K/S 값(1차 접합체의 나노입자 직경은 10 nm)을 나타낸 하기 표 1및 도 3A에 나타난 바와 같으며, 1차 접합체의 나노입자 직경이 20nm인 경우의 결과는 2차 접합체의 나노 입자 크기에 따른 K/S 값(1차 접합체의 나노입자 직경은 20 nm)을 나타낸 하기 표 2및 도 3B에 나타난 바와 과 같다.

표 1

* K/S=(1-Rd)²/2Rd; Rd 상대확산 반사율, K 시료의 흡수계수 K, S 산란계수 S

표 2

10분 후 측정결과를 K/S (=(1-Rd)²/2Rd; Rd 상대확산 반사율, K 시료의 흡수계수 K, S 산란계수 S) 값으로 확인한 결과 금 나노입자 10nm 크기의 1차 접합체와 40 nm크기의 2차 접합체 조합이 다른 크기 조합에 비해 감도가 가장 높게 증가하였 고, 신호를 증폭하지 않은 경우와 비교할 때 로그 값의 2배 (100배정도) 이상 감도가 증가한 것을 확인할 수 있다.

실시예 4: 접합체 분리에 따른 신호 증폭 효과

(1) 접합패드의 제조

1차 접합체와 2차 접합체가 접촉되지 않도록 접합패드를 제조하는 경우, 이에 따른 신호 증폭 효과를 살펴보기 위해 하기와 같이 접합 패드를 제조하였다. 대조군으로서 증폭하지 않은(not enhancing) 면역 크로마토그래피를 제조하였으며, 이 때 접합 패드는 GFC 패드(Millipore)를 사용하여 5×3 mm로 절단한 후, 실시예 1에서 분석물(analyte)에 상응하는 항체를 이용하여 제조된 1차 접합체만을 5 μL 도포하여 건조한 것을 사용하였다.

1) 1차 접합체와 2차 접합체가 접촉되는 접합패드의 제조를 위해, 2 개의 접합 패드(GFC, Millipore GFC203000)를 5×3 mm로 절단한 후, 실시예 1에 의해 제조된 1차 접합체와 2차 접합체를 5 μL씩 각각 도포하여 건조하였다. 이렇게 접합패드 전체를 도포하는 경우에는 두 접합패드가 겹치는 부분이 접촉되어 분석물을 포함하는 액체 시료 유입시 1차 접합체 및 2차 접합체가 혼합될 여지가 있다.

2) 1차 접합체와 2차 접합체가 접촉되지 않는 접합패드의 제조를 위해, 실시예 1에 의해 제조된 1차 접합체 및 2차 접합체를 이용하여 실시예 2에 기재된 방법에 따라 1차 접합체를 5 μL 도포한 후 건조하여 제 1 접합패드를 제조하고, 제 2접합 패드로서 Whatman 사의 Fusion 5™패드를 이용하여 2차 접합체를 선으로 형성하여 면역크로마토그래피를 제조하여 실험하였다. 상기의 접합체 패드를 사용한 면 역 크로마토그래피 센서의 구조는 도 2(B) 및 2(C)와 일치한다. 1차 접합체의 나노입자의 크기는 10nm인 것을 사용하고, 2차 접합체의 나노입자 크기는 40nm인 것을 사용하였다. 상기와 같이 제조하는 경우 제 2접합체 상에 2차 접합체가 선으로 형성되어 1차 접합체가 담지된 제 1접합패드와의 접촉을 방지할 수 있다.

(2) 트로포닌 I분석

이렇게 제조된 2 개의 면역 크로마토그래피 및 대조군 면역 크로마토 그래피를 임의의 농도로 트로포닌I 항원을 녹인 혈장(Linear chemicals, Cromatest) 70 μL 가 담지된 96 well 플레이트에 담지하여 측정하였다.

10분 후 측정결과를 확인한 결과 도 4(A)에서 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 신호 증폭한 경우 감도 증가의 효과를 확인할 수 있으며 특히 1차 접합체와 2차 접합체가 접촉하지 않도록 2차 접합패드로서 Fusion 5™패드를 사용한 것의 신호감도가 가장 바람직한 것을 확인할 수 있다. 도 4(B)는 상기와 같은 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

(3) 미오글로빈 분석

상기의 방법에서 신호증폭 하지 않은 것과 2차 접합체 패드로 Fusion 5™를 사용하여 신호증폭 한 방식으로 미오글로빈을 분석하였다. 1차 접합체에 사용한 제1항체와 포획항체인 제 2항체는 항-미오글로빈 항체로서 Fitzgerald 제품을 사용하였다.

10분 후 측정결과를 확인한 결과 도 5(A)에서 나타낸 바와 같이 역시 신호를 증폭하지 않은 대조군에 비해 신호가 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 도 5(B)는 상 기와 같은 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

Claims (15)

1. 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 및 연결자가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체와 분석물을 결합하는 단계;

   상기 1차 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체를 결합하는 단계; 및

   상기 1차 접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 상기 1차 접합체의 연결자에 결합하는 단계를 포함하며,

   상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 상기 고정화된 제 2 항체와 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체의 입자가 상기 제 1 표지체의 입자 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법.
2. 분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체와 분석물을 결합하는 단계;

   상기 1차 접합체가 결합된 분석물과 상기 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체를 결합하는 단계; 및

   상기 1차 접합체의 제 1 항체에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 상기 1차 접합체의 제 1 항체에 결합하는 단계를 포함하며,

   상기 1차 접합체는 2차 접합체 보다 상기 고정화된 제 2 항체와 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체의 입자가 상기 제 1 표지체의 입자 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 연결자는 소혈청알부민(BSA), 인간혈청알부민(HAS), 비오틴, 아비딘 및 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 분석물(analyte)과 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법.
4. 제 2항에 있어서, 상기 제 3항체가 제 1항체를 항원으로 인식하여 결합하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제 1 표지체의 입자는 10nm - 20nm 이며, 상기 제 2 표지체의 입자는 20nm-60nm 인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 표지체는 금 콜로이드(colloid) 또는 컨텀 닷(quantum dot)인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 분석물은 항원 단백질, DNA, 환경호르몬, 병원 독성 물질, 식중독균으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 분석에서의 신호 증폭 방법.
8. 분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드;

   분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체 및 연결자가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체, 및 상기 1차 접합체의 연결자에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 포함하고, 상기 1차 접합체는 상기 1차 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체에 대해 상기 2차 접합체보다 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체가 상기 제 1 표지체 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 접합 패드;

   상기 고정화된 제 2 항체가 고정화된 탐지부(detection site) 및 오류 확인을 위한 컨트롤부(control site)를 포함하는 멤브레인; 및

   액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수;할 수 있는 흡수 패드

   를 포함하는 면역 크로마토그래피 키트.
9. 분석물을 포함하는 액체 시료가 가해지는 샘플 패드;

   분석물(analyte)의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 항체가 제 1 표지체에 결합되어 있는 1차 접합체, 및 상기 1차 접합체의 제 1항체에 특이적으로 결합하는 제 3 항체가 제 2 표지체에 결합되어 있는 2차 접합체를 포함하고, 상기 1차 접합체는 상기 1차 접합체가 결합된 분석물의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 고정화된 제 2 항체에 대해 2차 접합체보다 가까운 곳에 배치되나, 상기 제 2 표지체가 상기 제 1 표지체 보다 커서 1차 접합체가 도달한 이후 후속하여 2차 접합체가 상기 고정화된 제 2 항체에 도달하는 접합 패드;

   상기 고정화된 제 2 항체가 고정화된 탐지부(detection site) 및 오류 확인을 위한 컨트롤부(control site)를 포함하는 멤브레인; 및

   액체 시료를 모세관 현상에 의해 흡수할 수 있는 흡수 패드

   를 포함하는 면역 크로마토그래피 키트.
10. 제 8항에 있어서, 상기 연결자는 소혈청알부민(BSA)인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 키트.
11. 제 9항에 있어서, 상기 제 3항체가 제 1항체를 항원으로 인식하여 결합하는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 키트.
12. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 접합 패드는 상기 1차 접합체를 포함하는 제 1접합패드 및 상기 2차 접합체를 포함하는 제 2접합패드로 이루어지며, 상기 1차 접합체와 2차 접합체가 접촉되지 않도록 제조되는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 키트.
13. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 제 1 표지체의 입자는 10nm - 20nm 이며, 상기 제 2 표지체의 입자는 20nm-60nm 인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 키트.
14. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 표지체는 금 콜로이드(colloid) 또는 컨텀 닷인 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 키트.
15. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 분석물은 항원 단백질, DNA, 환경호르몬, 병원 독성 물질, 식중독균으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 크로마토그래피 키트.

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