CN104101706B - 一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法 - Google Patents
一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104101706B CN104101706B CN201410363297.8A CN201410363297A CN104101706B CN 104101706 B CN104101706 B CN 104101706B CN 201410363297 A CN201410363297 A CN 201410363297A CN 104101706 B CN104101706 B CN 104101706B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stream
- colloidal gold
- pad
- antigen
- test paper
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 29
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 15
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 claims description 5
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 2
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 claims description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 230000004308 accommodation Effects 0.000 claims 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 11
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 8
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 7
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 2
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(carboxymethyl)-2-hydroxybutanedioate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M gold monochloride Chemical compound [Cl-].[Au+] FDWREHZXQUYJFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- SJUCACGNNJFHLB-UHFFFAOYSA-N O=C1N[ClH](=O)NC2=C1NC(=O)N2 Chemical compound O=C1N[ClH](=O)NC2=C1NC(=O)N2 SJUCACGNNJFHLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000005543 nano-size silicon particle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法，所述试纸条包括底板和顺次搭接粘贴在所述底板上的样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中结合物垫为金标-生物素结合物垫和链霉亲和素-金-抗体结合物垫的组合；所述检测甲流抗原的方法中，将待检样品滴加在所述的试纸条上，若在检测线(1)处显示红色条带，则说明所述待检样品中含有甲流抗原。本发明的试纸条具有价格便宜、快速和简便的优点，非常适合现场检测，并能够满足较高检测灵敏度的需求，具有重要的临床诊断意义。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域。具体涉及一种胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法，尤其涉及一种基于信号增强的胶体金免疫层析试纸条及使用该试纸条检测甲流抗原的方法。
背景技术
流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。
流感是由流感病毒引起的流行性感冒，病毒属正粘病毒科，直径80～120nm，球形或丝状。流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。
甲型H1N1是甲型流感病毒的一种，本病具有自限性，但对于婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者而言，容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。因而正确诊断此病原体对迅速治愈具有十分重要的意义。
目前，对于流感病毒的检测已有诸多相关专利申请公开，例如，CN1869703A公开了禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST-ELISA检测方法，该发明所采用的技术手段是使所述高纯融合蛋白GST-HA1在酶联板上用抗GST单抗捕获融合蛋白GST-HA1而制成；CN101899529A公开了一种基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型H1N1流感病毒基因，其具体是应用基因颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，通过计算机软件分析人甲型H1N1流感病毒HA基因的保守序列，设计出六条引物完全与识别的HA靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，最后用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果；CN102086476A公开的是一种利用多重荧光定量RT-PCR同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒，用于对发热病人咽拭子等标本的人新甲型H1N1流感病毒及人季节性H1N1和H3N2流感病毒HA基因的同时检测和监测。
对于甲型流感病毒的检测，目前公开的相关专利申请主要有：CN1591014A，其公开了一种甲型流感病毒胶体金快速检测试纸，其涉及保藏号CGMCC0987的杂交瘤细胞株产生的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，及含有该单克隆抗体的甲型流感病毒胶体金快速检测试纸；CN102286639A公开了甲型H1N1/甲型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，其包括RNA酶抑制剂、RT-PCR反应液、酶混合液、甲型H1N1/甲型流感病毒双重反应液、阳性对照和阴性对照；CN102952896A提供了用于检测甲型流感病毒的引物和探针，还提供了含有用于检测甲型流感病毒的这类引物和探针的制品。
SuwussaBamrungsap等人应用荧光掺杂的硅纳米颗粒作为示踪物，并借助于一个信号读出仪器进行流感病毒抗原的检测(参考文献：“Rapidandsensitivelateralflowimmunoassayforinfluenzaantigenusingfluorescently-dopedsilicananoparticles”，SuwussaBamrungsap，ChayachonApiwat，WarangkanaChantima，TararajDharakul，NatpapasWiriyachaiporn.MICROCHIMICAACTA2014，181：223-230.)；Sun,Jianbin等人主要研究了基于超顺磁性的磁珠的免疫层析试纸条，通过免疫夹心法进行检测H1N1病毒抗原，灵敏度能够达到100pg/mL，该方法只能进行抗原的检测(参考文献：“DevelopmentandEvaluationofaParamagneticNanoparticleBasedImmunochromatographicStripforSpecificDetectionof2009H1N1InfluenzaVirus”，LeiXiaoying；WangWeihua；LiuYonglan；LiangPing；BaoHan；WangQin；Guo，Yanhai；Yang，Jinghua；YanZhen.JOURNALOFNANOSCIENCEANDNANOTECHNOLOGY.2013，13，1684-1690.)。
上述涉及流感抗原检测的相关文献，普遍存在操作复杂，灵敏度差，读取结果不容易获得等缺陷，因而寻找一种灵敏度高、读取结果快捷而直观等特点的检测方法具有重要的临床诊断意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法，特别是一种基于信号增强的胶体金免疫层析试纸条及使用该试纸条高灵敏检测甲流抗原的方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供了一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条，包括底板、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合物垫包括：1)金标-生物素结合物垫；和2)链霉亲和素-金-抗体结合物垫；所述硝酸纤维素膜上包被检测线1和质控线2，所述检测线1处的抗体为甲流的包被抗体；所述质控线2处的抗体为羊抗鼠IgG抗体。
本发明中，所述金标-生物素结合物垫为涂覆有生物素标记的胶体金；所述链霉亲和素-金-抗体结合物垫为涂覆有链霉亲和素和甲流抗体标记的胶体金。
本发明通过采用生物素标记的金纳米颗粒以及链霉亲和素和甲流抗体标记的金纳米颗粒作为增强探针，进行信号放大，提高了检测甲流抗原的灵敏度，可以使灵敏度提高到6ppb-12.5ppb。
作为优选技术方案，所述链霉亲和素和抗体的比例为1：(1-10)，例如可以是0.5:5、1:5、2:5、3:5、4:5、5:5，优选为1:5。
链霉亲和素和抗体的比例达到1:5时，可以使检测灵敏度达到6ppb。
作为优选技术方案，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维膜和吸水纸依次相互搭接地贴在底板上。
本发明中，所述底板的作用在于支持所述吸水纸和硝酸纤维素膜等，其材料不作限定，可以是聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)和玻璃片等材料，本发明优选的是PVC材料的底板。
优选地，所述样品垫为玻璃纤维膜。
优选地，所述结合物垫为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜或人造纤维中的任意一种，优选为玻璃纤维膜。
作为优选技术方案，还包括卡壳盖和卡壳底，所述卡壳盖和卡壳底形成容纳空间，用于容纳所述免疫层析试纸条。
优选地，所述卡壳上开有加样区3和显色区4。
在第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的试纸条的制作方法，包括以下步骤：
1)链霉亲和素-金-抗体结合物垫的制备
调节胶体金溶液的pH值，然后加入甲流标记抗体和链霉亲和素，在室温下振荡反应，然后分两次加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
2)金标-生物素结合物垫的制备
调节胶体金溶液的pH值，然后加入生物素，在室温下振荡反应，然后分两次加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
3)胶体金免疫层析试纸条的组装
将羊抗鼠IgG和甲流的包被抗体，分别作为质控线(2)和检测线(1)包被在硝酸纤维素膜上，然后将样品垫、金标-生物素结合物垫，链霉亲和素-金-抗体结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在底板上，并进行组装即可。
作为优选技术方案，上述步骤1)和步骤2)中，所述胶体金溶液的pH值调整为7.0-9.0，例如可以是7.0、7.1、7.3、7.5、8.0、8.1、8.5，优选为7.1-8.5；更优选为8.5。
优选地，分两次加入的BSA溶液的浓度分别为10％和1％；
优选地，所述室温下振荡反应时间为30min；加入BSA溶液封闭位点后的反应时间为0.5-1小时；所述离心时间为30分钟；所述离心转速为10000-12000r/min。
作为优选技术方案，步骤1)和步骤2)中，所述恢复液包括50mM的NaCl，1％的BSA，0.5％的蔗糖和0.5％的酪蛋白钠。
在第三方面，本发明提供一种检测甲流抗原的方法，包括如下步骤：
1)将待测样品加到本发明的胶体金免疫层析试纸条上，免疫层析反应5-10min；
2)肉眼观察所述试纸条上检测线1和质控线2上胶体金的颜色，得到所述试纸条检测甲流抗原的结果。
本发明中，当检测线1和质控线2均显示红色条带时，则说明所述待测样品中含有甲流抗原。
本发明中，如果被检测样品中不含有甲流抗原，样品移动到检测线1处时，不会显示红色条带，只在质控线2处显示红色条带；只要质控线2不显色，即证明该试纸条无效，需要重新检测样品。
本发明的基于信号增强的胶体金免疫层析试纸条检测甲流抗原的方法，其原理(图1和图2)在于：
在加样区3加入被检测样品后，所滴加的样品经过金标结合物垫，将金-生物素结合物和链霉亲和素-金-抗体结合物释放出来，通过毛细作用，抗原-抗体-金-链霉亲和素-生物素-金的结合物向吸水纸一端的方向移动。经过检测线1处的包被抗体时，该抗体可以与抗原发生免疫反应，形成抗体-抗原-抗体-金-链霉亲和素-生物素-金的复合物，因此在检测线1处显示红色条带，样品继续向前流动，经过质控线2处的二抗时，其可以与金上的标记抗体发生免疫反应，形成二抗-抗体-金-链霉亲和素-生物素-金的复合物，因此在质控线2处显示红色条带(图3)；如果被检测样品中不含有甲流抗原，样品移动到检测线1处时，不会显示红色条带，只在质控线2处显示红色条带(图4)；只要质控线2不显色，即证明该试纸条无效(图5)，需要重新检测实际样品。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
1、本发明所述的胶体金试纸条依照抗原和抗体的特异性反应以及链霉亲和素和生物素的特异性反应的原理测定甲型流感病毒的抗原，通过一次性操作即可检测流感抗原，读取结果快捷而直观，10分钟以内即可获得检测结果。
2、本发明的检测甲流抗原的方法，无需特殊仪器设备，也不需要专业人员的操作，摆脱了对专业仪器的依赖。
3、与传统的双抗体夹心法相比，本发明的检测方法能够通过信号放大，提高检测灵敏度，可达到6ppb-12.5ppb。
4、本发明的检测结果的总体符合率较高，可达到100％，适合于现场检测。
附图说明
图1是本发明的检测甲流抗原的胶体金试纸条示意图
图2是本发明的检测甲流抗原的原理图
图3是检测甲流抗原为阳性的检测结果
图4是检测甲流抗原为阴性的检测结果
图5是检测甲流抗原无效的检测结果
图6是不同比例的抗体与链霉亲和素对T线灰度值的影响
图7是传统方法检测甲流抗原的结果及其T线灰度值的大小示意图
图8是本发明的方法检测甲流抗原的结果及其T线灰度值的大小示意图
图9是购买广州万孚和凯必利公司的甲流检测试纸条的检测结果
图10是阴性样本的检测结果
其中：1-检测线；2-质控线；3-加样区；4-显示区
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
图1是本发明的检测甲流抗原的胶体金试纸条示意图，图2是本发明检测甲流抗原的原理图。
实施例1
所用的试剂仪器设备来源：
1甲型流感，抗原及其抗体：北京沫之东生物技术有限公司；
2羊抗鼠IgG：北京博奥森生物技术有限公司；
3链霉亲和素，生物素：北京博奥森生物技术有限公司；
4硝酸纤维素膜：默克密理博；
5三维平面划膜仪，三维平面喷金仪：上海金标生物科技有限公司；
6冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；
7切条机：上海金标生物科技有限公司；
8PVC胶板，吸水纸，玻璃纤维膜，卡壳购自上海金标生物科技有限公司。
甲型流感病毒抗原的检测：
1、链霉亲和素-金-抗体结合物的制备
(1)取200μg甲型流感标记抗体置于透析袋中对5mMTris-HCl进行透析24h，在此过程中，每隔2h换一次水，透析完成后，将抗体取出置于离心管中，加入超纯水至2mL。离心后弃去沉淀杂质；
(2)取40μg左右的链霉亲和素稀释在2mL的去离子水中；
(3)制备链霉亲和素-金-抗体结合物垫：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金，将所用的玻璃仪器事先用洗液过夜浸泡，然后冲洗干净。将烧杯中加入1000mL超纯水，然后加入10mL的1％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL1％的氯金酸溶液，煮沸15min后至冷却，置于4℃保存。颗粒直径大约为20～30nm，取20mL胶体金溶液置于烧杯中，加入450μL0.01M的K2CO3溶液调节溶液的pH，搅拌均匀，然后分别加入离心好的抗原和链霉亲和素，搅拌30min左右，然后加入2mL10％的BSA溶液，进行离心，(30Min，10000rpm)，然后弃去上清液，再加入1％的BSA的溶液(含有1mM的pH8.6的Tris-HCl缓冲溶液)继续离心，弃去上清液，将沉淀物进行恢复，恢复液的成分为：50mM的NaCl，1％的BSA，0.5％的蔗糖，0.5％的酪蛋白钠，将其涂覆在200cm2大小的玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
链霉亲和素-金-抗体结合物的制备时，需要进行抗体和链霉亲和素的比例(按照5:0.5/5:1/5:2/5:3/5:4/5:5)优化实验，通过检测结果(图6)可以看出，当抗体和链霉亲和素的比例为5：1时，本发明的试纸条上检测线1的显色程度最好。
2、金标-生物素结合物的制备
制备金标-生物素结合物垫：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金，将所用的玻璃仪器事先用洗液过夜浸泡，然后冲洗干净。将烧杯中加入1000mL超纯水，然后加入10mL的1％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL1％的氯金酸溶液，煮沸15min后至冷却，置于4℃保存。颗粒直径大约为20～30nm，取20mL胶体金溶液置于烧杯中，加入300μL0.01M的K2CO3溶液调节溶液的pH，加入50μg左右的生物素，搅拌30min左右，然后加入2mL10％的BSA溶液，进行离心，(30Min，10000rpm)，然后弃去上清液，再加入1％的BSA的溶液(含有1mM的pH8.6的Tris-HCl缓冲溶液)继续离心，弃去上清液，将沉淀物进行恢复，恢复液的成分为：50mM的NaCl，1％的BSA，0.5％的蔗糖，0.5％的酪蛋白钠，将其涂覆在200cm2大小的玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
3、将羊抗鼠IgG和甲流的包被抗体，分别作为质控线2和测试线1包被在硝酸纤维素膜上，然后将硝酸纤维素膜，吸水纸，金标结合物垫(金标-生物素结合物垫，链霉亲和素-金-抗体结合物垫)和样品垫依次贴在PVC底板上，并进行组装。
采用上述组装后的胶体金免疫层析试纸条进行甲流病毒抗原的检测，用PBS配制不同浓度的甲流抗原的标准液(1600/800/400/200/100/50/25/12.5/6/0ng/mL)，滴加10分钟之后，读取检测结果，肉眼观察检测该病毒抗原的检测灵敏度最高为6ppb，如图8所示。而图7所示的传统的双抗体夹心法的检测灵敏度为25ppb。
因此本发明所提出的检测方法能够放大信号，提高检测灵敏度，在实际应用中，对于特定的目标物具有潜在的应用价值。
实施例2
将广州万孚生物技术有限公司和凯必利生物技术有限公司的甲型流感胶体金试纸条与本发明的方法进行对比，通过检测不同浓度的甲型流感抗原，结果如图9所示，万孚和凯必利的胶体金试纸条的灵敏度分别为25ppb和50ppb，而本发明的方法的检测灵敏度为12.5ppb，说明本发明的胶体金免疫层析试纸条具有更高的灵敏度。
实施例3
将甲流抗原用人的血清进行稀释，模拟实际样品的检测，并稀释不同浓度的溶液。用本发明所制备的试纸条对随意抽查的10份实际样本进行检测。将样本滴在试纸条上，15分钟之后读取结果。结果如图10所示，所抽查检测的10份样本都显示阳性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (18)
1.一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条，包括底板、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于，
所述结合物垫包括：1)金标-生物素结合物垫；和2)链霉亲和素-金-抗体结合物垫；
所述硝酸纤维素膜上包被检测线(1)和质控线(2)，所述检测线(1)处的抗体为甲流的包被抗体；所述质控线(2)处的抗体为羊抗鼠IgG抗体；
所述金标-生物素结合物垫为涂覆有生物素标记的胶体金；所述链霉亲和素-金-抗体结合物垫为涂覆有链霉亲和素和甲流抗体标记的胶体金；
所述胶体金免疫层析试纸条采用生物素标记的金纳米颗粒以及链霉亲和素和甲流抗体标记的金纳米颗粒作为增强探针，进行信号放大；
所述链霉亲和素和甲流抗体的比例为1:5。
2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维膜和吸水纸依次相互搭接地贴在底板上。
3.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板为聚氯乙烯、聚乙烯或玻璃片中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板为聚氯乙烯。
5.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维膜。
6.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合物垫为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜或人造纤维中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合物垫为玻璃纤维膜。
8.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，还包括卡壳盖和卡壳底，所述卡壳盖和卡壳底形成容纳空间，用于容纳所述胶体金免疫层析试纸条。
9.根据权利要求8所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述卡壳上开有加样区(3)和显色区(4)。
10.一种权利要求1-9任一项所述的胶体金免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)链霉亲和素-金-抗体结合物垫的制备
调节胶体金溶液的pH值，然后加入甲流标记抗体和链霉亲和素，在室温下振荡反应，然后分两次加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
2)金标-生物素结合物垫的制备
调节胶体金溶液的pH值，然后加入生物素，在室温下振荡反应，然后分两次加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
3)胶体金免疫层析试纸条的组装
将羊抗鼠IgG和甲流的包被抗体，分别作为质控线(2)和检测线(1)包被在硝酸纤维素膜上，然后将样品垫、金标-生物素结合物垫，链霉亲和素-金-抗体结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在底板上，并进行组装即得。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述胶体金溶液的pH值调整为7.0-9.0。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述胶体金溶液的pH值调整为7.1-8.5。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述胶体金溶液的pH值调整为8.5。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，分两次加入的BSA溶液的浓度为10％和1％。
15.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述室温下振荡反应时间为30min；加入BSA溶液封闭位点后的反应时间为0.5-1小时；所述离心时间为30分钟；所述离心转速为10000-12000r/min。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述恢复液包括50mM的NaCl，1％的BSA，0.5％的蔗糖和0.5％的酪蛋白钠。
17.一种用于非诊断目的的检测甲流抗原的方法，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，包括如下步骤：
1)将待测样品加到所述试纸条上，免疫层析反应5-10min；
2)肉眼观察所述试纸条上检测线(1)和质控线(2)上胶体金的颜色，得到所述试纸条检测甲流抗原的结果。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，当检测线(1)和质控线(2)均显示红色条带时，则说明所述待测样品中含有甲流抗原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410363297.8A CN104101706B (zh) | 2014-07-28 | 2014-07-28 | 一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410363297.8A CN104101706B (zh) | 2014-07-28 | 2014-07-28 | 一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104101706A CN104101706A (zh) | 2014-10-15 |
| CN104101706B true CN104101706B (zh) | 2016-05-18 |
Family
ID=51670026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410363297.8A Expired - Fee Related CN104101706B (zh) | 2014-07-28 | 2014-07-28 | 一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104101706B (zh) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105137081A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-12-09 | 南京农业大学 | 一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测试纸条 |
| CN106370844A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-01 | 吕炜锋 | 人骨代谢标志物检测双胶体金试纸条及应用其的检测装置 |
| CN106872690B (zh) * | 2017-01-22 | 2018-09-14 | 武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司 | 一种高灵敏度胶体金试纸及其制备方法与应用 |
| CN107543809B (zh) * | 2017-07-28 | 2019-12-10 | 郑州大学 | 一种谷胱甘肽分子检测用试纸条及检测方法 |
| CN109633174B (zh) * | 2019-01-09 | 2022-04-26 | 昆明医科大学海源学院 | 一种基于生物素量子点探针的c反应蛋白超敏检测方法 |
| CN109900913A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-06-18 | 江苏硕世生物科技股份有限公司 | 一种甲型和乙型流感病毒抗原胶体金法联合检测试剂盒及其制备方法 |
| CN111879924A (zh) * | 2020-01-15 | 2020-11-03 | 杭州奥泰生物技术股份有限公司 | 快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法 |
| CN111537727A (zh) * | 2020-06-04 | 2020-08-14 | 湖南康润药业股份有限公司 | 一种用于流感和covid-19联合检测的试纸条及其应用 |
| CN112881672A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-06-01 | 南京钟鼎生物技术有限公司 | 通用型多核酸产物检测胶体金试纸条及其制备方法和应用 |
| CN112362869B (zh) * | 2021-01-14 | 2021-05-18 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 一种多项呼吸道抗原检测卡及试剂盒 |
| CN116338179A (zh) * | 2023-01-13 | 2023-06-27 | 安徽国泰国瑞医疗科技有限公司 | 一种急性重症呼吸系统综合症冠状病毒抗原检测试剂盒及其应用 |
| CN116930485B (zh) * | 2023-09-14 | 2023-12-22 | 北京市农林科学院智能装备技术研究中心 | 一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法及检测系统 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5968839A (en) * | 1996-05-13 | 1999-10-19 | Metrika, Inc. | Method and device producing a predetermined distribution of detectable change in assays |
| EP2037273A1 (de) * | 1997-12-24 | 2009-03-18 | Roche Diagnostics GmbH | Universell verwendbarer Aufbau eines Analysenelements und Kit enthaltend den universellen Aufbau |
| CN102227631A (zh) * | 2008-11-28 | 2011-10-26 | 英佛皮亚有限公司 | 免疫层析测试中信号放大的方法以及使用该方法的免疫层析试剂盒 |
| CN102445537A (zh) * | 2011-12-20 | 2012-05-09 | 广州万孚生物技术有限公司 | 一种甲型流感病毒抗原和乙型病毒流感抗原的联检试纸及其制备方法 |
| CN202433383U (zh) * | 2011-12-20 | 2012-09-12 | 广州万孚生物技术有限公司 | 一种甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的联检试纸 |
| CN102841207A (zh) * | 2011-06-24 | 2012-12-26 | 北京乐普医疗科技有限责任公司 | 定量检测肌钙蛋白i的荧光免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN103823057A (zh) * | 2014-03-07 | 2014-05-28 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种猪hev总抗体胶体金快速诊断试纸条及其制备方法 |
| US8956859B1 (en) * | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
-
2014
- 2014-07-28 CN CN201410363297.8A patent/CN104101706B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5968839A (en) * | 1996-05-13 | 1999-10-19 | Metrika, Inc. | Method and device producing a predetermined distribution of detectable change in assays |
| EP2037273A1 (de) * | 1997-12-24 | 2009-03-18 | Roche Diagnostics GmbH | Universell verwendbarer Aufbau eines Analysenelements und Kit enthaltend den universellen Aufbau |
| CN102227631A (zh) * | 2008-11-28 | 2011-10-26 | 英佛皮亚有限公司 | 免疫层析测试中信号放大的方法以及使用该方法的免疫层析试剂盒 |
| US8956859B1 (en) * | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
| CN102841207A (zh) * | 2011-06-24 | 2012-12-26 | 北京乐普医疗科技有限责任公司 | 定量检测肌钙蛋白i的荧光免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN102445537A (zh) * | 2011-12-20 | 2012-05-09 | 广州万孚生物技术有限公司 | 一种甲型流感病毒抗原和乙型病毒流感抗原的联检试纸及其制备方法 |
| CN202433383U (zh) * | 2011-12-20 | 2012-09-12 | 广州万孚生物技术有限公司 | 一种甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的联检试纸 |
| CN103823057A (zh) * | 2014-03-07 | 2014-05-28 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种猪hev总抗体胶体金快速诊断试纸条及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104101706A (zh) | 2014-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104101706B (zh) | 一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法 | |
| CN112730851B (zh) | 一种高灵敏SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒 | |
| Chen et al. | Rapid detection of anti-SARS-CoV-2 antibody using a selenium nanoparticle-based lateral flow immunoassay | |
| CN103983776A (zh) | 一种同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条 | |
| CN105567644A (zh) | 一种抗新城疫病毒单克隆抗体 | |
| CN111999492B (zh) | 一种联合检验covid-19n抗原和s蛋白抗体的胶体金免疫层析检测卡 | |
| CN101949937A (zh) | 卵巢癌肿瘤标志物he4时间分辨荧光免疫检测试剂盒 | |
| CN102337351A (zh) | 一种流感病毒分型检测试剂盒 | |
| CN101701958A (zh) | 同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条及应用 | |
| CN107573417A (zh) | 肺炎支原体嵌合抗原、该抗原检测试剂及两者的制备方法 | |
| CN105759046A (zh) | 一种新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN105542014A (zh) | Tp重组抗原及其制备方法和应用 | |
| CN105675866A (zh) | 用于检测o型fmdv抗体的固相阻断elisa试剂盒 | |
| CN105319359A (zh) | 人肺炎链球菌量子点免疫层析检测卡及其制备方法和应用 | |
| CN105181964B (zh) | 水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法 | |
| CN1866023B (zh) | 一种同步检测多种结核杆菌特异性分泌抗原的方法 | |
| CN106290902A (zh) | 一种血清淀粉样蛋白a1的胶体金检测卡及其制备方法 | |
| CN101666800B (zh) | 水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其制作方法 | |
| CN112334478A (zh) | 用于快速甲型流感诊断测试的抗体对 | |
| CN102980997B (zh) | EB病毒衣壳抗原IgM抗体胶体金法检测试剂及其制备方法 | |
| CN108761091A (zh) | 双抗夹心法快速检测hpv抗体的试纸条、试纸卡及其制备方法 | |
| CN201413328Y (zh) | 一种快速检测猪流感h1n1病毒的胶体金试纸条 | |
| CN104090100A (zh) | 布鲁氏菌抗体金标快速检测试剂盒 | |
| CN104330569B (zh) | 一种快速检测抗体的试纸条 | |
| CN100503822C (zh) | 乙型流感病毒胶体金快速检测试纸 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160518 |