CN101701958A - 同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条及应用 - Google Patents

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邹明强
张帆
李锦丰
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Abstract

本发明提供了一种同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光标记试纸条，属于动物疫病诊断检测方法技术领域。这种荧光标记试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，在PVC背衬上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫之间有搭接；所述结合垫上包被有新城疫单克隆抗体-荧光标记物以及禽流感单克隆抗体-荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有新城疫单克隆抗体和禽流感单克隆抗体构成的两条检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。本发明的试纸条可以同时检测两种病毒，实现了一步多检的检测方法，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(20分钟)，操作简便等优点。

Description

同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条及应用
技术领域
本发明属于免疫应用领域，涉及养殖场、防疫检疫部门以及医疗机构等单位诊断或检测新城疫病毒的技术。具体的讲，本发明是同时检测新城疫和禽流感病毒的快速检测方法，以及一种同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条。
背景技术
禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的危及禽类、小型哺乳动物和人类的病毒性传染病，它是以呼吸道症状为主，至全身性败血症的疾病综合症，被国际兽医局(OIE)定为A类传染病。新城疫(Newcastle Disease)俗称“亚洲鸡瘟”，新城疫病毒(NewcastleDisease Virus，NDV)是引起鸡瘟病的重要病原体。新城疫与禽流感相似，是严重危害禽类的传染病，其发病率，感染率和死亡率都很高，也被OIE列为A类疫病。
对这两种疾病，目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒分离、血凝抑制试验(HI)，酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等。这些方法均费时费力，且技术含量高，很难在基层推广应用，建立一种简单、快速的，诊断方法实属必要。胶体金免疫层析是一种简单、快速的免疫学检测技术，近年来已在医学、动物检验、食品卫生检验等研究领域中广泛用。
免疫层析是出现于八十年代初期的一种独特的免疫分析方法，免疫层析技术由于广泛使用胶体金作为指示剂，所以又被称为胶体金检测法。目前该方法广泛应用于样品初筛，但缺点是检测灵敏度较低，难以进行定量检测，而且检测结果不易记录和保存。在免疫层析技术中，还有采用其他标记物作为指示剂的报道。Bruning等(J.Clin.Microbiol.1999，81(1-2)：143-154)描述了一种以蓝色乳胶颗粒作为标记物的免疫层析试纸条快速检测牛瘟病毒的方法。Ahn等(Clinica Chimica Acta，2003，332：51-59)报道了使用荧光染料荧光素作为指示剂用于免疫层析，可以获得较高的灵敏度，而且可以实现定量检测。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高，操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的专门用于同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条及其制备方法，填补目前尚未有同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条的空白。
一种用于同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光标记试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，在PVC背衬上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫之间有搭接；所述结合垫上包被有新城疫单克隆抗体-荧光标记物以及禽流感单克隆抗体-荧光标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有新城疫单克隆抗体和禽流感单克隆抗体构成的两条检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。
本发明的快速检测免疫荧光试纸条的制备及检测方法，包括以下步骤：
(1)利用新城疫和禽流感单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得新城疫单克隆抗体和禽流感单克隆抗体；
(2)选择尺寸为20-50nm荧光纳米颗粒作为标记物；
(3)将步骤(1)制备的新城疫和禽流感单克隆抗体分别加入步骤(2)制备的荧光纳米颗粒中，得到新城疫单克隆抗体-荧光标记物和禽流感单克隆抗体-荧光标记物；
(4)将步骤(3)制备的新城疫单克隆抗体-荧光标记物和禽流感单克隆抗体-荧光标记物包被在结合垫上；
(5)将步骤(1)纯化后的新城疫和禽流感单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上构成两条检测线；并将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线；
(6)在PVC背衬上按顺序依次粘附所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，得到所述用于同时检测新城疫和禽流感病毒的荧光标记试纸条；
(7)将待检测的样品加载样品垫上过滤后，若样品中有NDV，则与结合垫中的荧光标记抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的新城疫单克隆抗体结合形成的荧光结合线1，未结合完的荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合形成第二条荧光质控线；若样品中有AIV与结合垫中的荧光标记抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的禽流感单克隆抗体结合形成的荧光结合线2，未结合完的荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合形成第二条荧光质控线；
(8)观察结果：阳性则出现两条结合线(出现结合线1和质控线为样品中含有NDV，出现结合线2和质控线为样品中含有AIV)；阴性则仅出现一条质控线；试剂条无效则不出现线条。
本发明的制备方法，所述步骤(2)中荧光纳米颗粒采用反相微乳法制备，制备的荧光纳米颗粒尺寸大小为20-50nm。
本发明中的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC背衬均购自Millipore公司。
与现有技术相比，本发明具有下列优点：
1.本发明的荧光标记试纸条可以同时检测两种病毒，实现了一步多检的检测方法，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(20分钟)，操作简便等优点。
2.本发明的检测试纸条只需要简单仪器、设备，可现场操作，检测成本低。
3.本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。
4.本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在4-8℃下可保存六个月。
附图说明
图1是本发明新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条的结构示意图。包括样品垫(1)、结合垫(2)、新城疫检测线(3)、禽流感检测线(4)和质控线(5)。
图2是本发明新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条结果判读示意图。该试纸条的检测结果需使用凝胶成像系统，专用的荧光测量仪，或其他仪器进行辅助观察并记录结果。新城疫阳性结果呈现两条线，即质控线(5)和检测线(3)；禽流感阳性结果呈现两条线，即质控线(5)和检测线(4)；而阴性结果只呈现一条质控线(5)；如果质控线(5)也不出现的话，说明该试纸条失效了。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体阐述。
快速检测新城疫病毒的方法，包括如下步骤：
(1)本发明利用抗原抗体反应的特异性和荧光免疫层析简单快速原理，建立了新城疫和禽流感单克隆抗体，用反相微乳法制备尺寸为50nm的荧光纳米颗粒作为标记物。
(2)荧光纳米颗粒与抗体的标记：取亲和纯化的新城疫或者禽流感单克隆抗体200μL(0.5mg/mL)，用0.025M碳酸盐缓冲溶液(pH 9.5)4℃透析6h；然后加入100μL悬浮于碳酸盐缓冲溶液中的荧光纳米颗粒(8mg/mL)，4℃过夜；加入NaBH3CN，终浓度为5mM，反应2h；再加等体积的封闭液(10mM Tris 7.8，含2％BSA、4％蔗糖)最后用10mM Tris 7.8洗涤标记好的抗体3遍，然后用100μL 10mM Tris 7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.1％NaN3)悬浮，4℃保存。
(3)将荧光纳米颗粒标记好的新城疫或者禽流感抗体稀释100倍均匀滴加在玻璃纤维素膜上，每试纸条加入4μL，37℃温箱中烘烤1h。
(4)硝酸纤维素膜上用三维点膜仪分别喷上浓度为0.5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体作为质控线，浓度为0.4mg/mL的新城疫单克隆抗体和浓度为0.3mg/mL的禽流感单克隆抗体为两条检测线。
(5)按照(4)加工好的硝酸纤维素膜、按照(3)加工好的玻璃纤维素膜和吸水纸的先后顺序，将各部分粘贴在支撑板上制造成新城疫病毒的快速检测荧光标记试纸条。
(6)将待检测的样品加载样品垫上过滤后，若样品中有NDV，则与结合垫中的荧光标记抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的新城疫单克隆抗体结合形成的荧光结合线3，未结合完的荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合形成第二条荧光质控线；若样品中有AIV与结合垫中的荧光标记抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的禽流感单克隆抗体结合形成的荧光结合线4，未结合完的荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合形成第二条荧光质控线。
(7)观察结果：阳性则出现两条结合线(出现结合线3和质控线为样品中含有NDV，出现结合线4和质控线为样品中含有AIV)；阴性则仅出现一条质控线；试剂条无效则不出现线条。
以上实施方式仅用于帮助本领域技术人员更加全面的理解本发明，但并不对本发明做任何限制。凡依照本发明的内容所做出的任何本领域等同的替换均属于本发明保护的范围之内。

Claims (5)

1.一种同时检测新城疫新城疫和禽流感病毒的荧光标记试纸条的制备及检测方法，其特征在于其步骤为：
1)利用新城疫和禽流感单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得新城疫单克隆抗体和禽流感单克隆抗体；
2)制备尺寸为50nm荧光纳米颗粒作为标记物；
3)将步骤1)制备的新城疫和禽流感单克隆抗体分别加入步骤2)制备的荧光纳米颗粒中，得到新城疫单克隆抗体-荧光标记物和禽流感单克隆抗体-荧光标记物；
4)将步骤3)制备的新城疫单克隆抗体-荧光标记物和禽流感单克隆抗体-荧光标记物包被在结合垫上；
5)将步骤1)纯化后的新城疫和禽流感单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上构成两条检测线；并将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线；
6)在PVC背衬上按顺序依次粘附所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，得到所述用于同时检测新城疫新城疫和禽流感病毒的荧光试纸条；
7)将待检测的样品加载样品垫上过滤后，若样品中有NDV，则与结合垫中的荧光标记抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的新城疫单克隆抗体结合形成的荧光结合线3，未结合完的荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合形成第二条荧光质控线；若样品中有AIV与结合垫中的荧光标记抗体结合，通过层析作用先与NC膜上的禽流感单克隆抗体结合形成的荧光结合线4，未结合完的荧光标记抗体继续层析与羊抗鼠IgG结合形成第二条荧光质控线；
8)观察结果：阳性则出现两条结合线(出现结合线3和质控线为样品中含有NDV，出现结合线4和质控线为样品中含有AIV)；阴性则仅出现一条质控线；试剂条无效则不出现线条。
2.如权利要求2所述的用尺寸为50nm荧光纳米颗粒作为标记物，其特征在于：荧光纳米颗粒是指尺寸为50nm左右的，适合生物标记的荧光纳米颗粒。
3.如权利要求1所述的使用新城疫病毒的快速检测免疫荧光试纸条，其特征在于：所述形成的检测带和控制带检测是指使用凝胶成像系统，专用的荧光测量仪，或其他仪器进行辅助观察并记录结果。
4.权利要求1中所述的试纸条在同时检测新城疫和禽流感病毒中的应用。
5.权利要求1中所述的试纸条在一步检出多个组分中的应用。
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