KR101587645B1 - 멀티 인플루엔자 검출용 키트 및 이를 이용하여 인플루엔자를 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단일클론항체를 이용한 멀티 인플루엔자 검출용 키트 및 이를 이용하여 멀티 인플루엔자를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인플루엔자 A형, B형, H1 아형H1 아형H1 아형아형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체가 포함된 인플루엔자 검출용 키트 및 이를 이용하는 인플루엔자 검출방법에 관한 것이며, 본 발명에 따른 단일클론항체를 이용한 멀티 인플루엔자 검출용 키트는 인플루엔자 A, B형 및 H1, H3, H5 아형을 동시에 검출할 수 있어, 신속하고 민감도가 높은 인플루엔자의 현장 검출 및 진단에 유용하다.

Description

멀티 인플루엔자 검출용 키트 및 이를 이용하여 인플루엔자를 검출하는 방법{Multi-influenza Detection Kit and Method for Detecting Influenza Using the Same}
본 발명은 멀티 인플루엔자 검출용 키트 및 이를 이용하여 인플루엔자를 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인플루엔자 A형, B형, H1 아형, H3 아형, H5 아형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체가 포함된 멀티 인플루엔자 검출용 키트 및 이를 이용하는 인플루엔자 검출방법에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체로, NP (nuleocapsid)와 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이 중 A형은 다시 HA (hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형까지, NA 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류된다 (참고문헌: Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56:365-394, 1987). 이 중 일반적으로 사람에게 병을 일으키는 항원의 종류는 H1, H2, H3와 N1, N2이다. 조류에서 나타나는 H항원과 N항원은 일반적으로 사람에게는 병을 일으키지 않지만, 바이러스 내에서 유전자 돌연변이가 일어나거나 사람에게 병을 일으키는 종류의 항원과 유전자를 교환하면 사람에게도 쉽게 병을 일으키는 형태로 변할 수 있다. 사람에게 기존에 면역이 없는 이러한 새로운 인플루엔자 바이러스가 나타나면 전 세계를 휩쓰는 대유행을 일으킬 수 있다.
최근 이러한 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위해 다양한 진단키트가 개발되고 있으며, 특히 신종플루와 같은 변이된 고병원성 조류인플루엔자에 의해 사망자 수가 급격히 증가함에 따라 조기 진단을 위한 신속한 진단키트가 요구되고 있다. 2009년에 유행하던 신종인플루엔자와 같이 학교, 직장 등 공공장소에서 불특정 다수에게 전파되는 질환은 대유행(Pandemic)을 막기 위해 조기 감염자의 진단 현장에서 격리가 필요함과 동시에 신속, 정확한 조기 측정시스템이 요구되며, 이 시스템은 국민 안전을 위한 국가적 공공기술 및 장비로서 필수적이다. 현장 진단형 급속진단 시스템은 휴대하기가 적합하도록 크기가 작고 사용이 간단하며, 사용자가 조작하기 편리하도록 사용자 환경을 제공해야 한다.
인플루엔자를 진단하는데 사용되는 기존의 세 가지 방법은 주로 배양검사, 급속항원검사, PCR검사이다. 이 중 전통적인 진단법인 바이러스 배양검사는 정확하지만 소요시간이 길고 배양방법도 까다로워 진단이 늦어지고 치료에도 적용하지 못한다는 한계가 있다. 또한, 인플루엔자 감염자의 일차분류를 위한 항원-항체 반응을 이용한 신속항원검사법(Rapid test)은 30분 정도의 간편하고 빠른 검사로서 검사를 위해 추가 장비와 기술 인력이 필요 없는 장점이 있는 반면, A/B의 핵단백질(Nucleoprotein)만을 검출하기 때문에 감도와 정확도가 낮은 단점이 있어 오진을 유발하여 환자가 사망하는 등 현장적용에 어려움이 따르는 실정이다. 인플루엔자의 아형진단은 인플루엔자 치료제에 대한 약제내성여부를 예측할 수 있는 지표가 되며 역학적으로 의미 있는 질환 유병상태를 알려준다. 현재 인플루엔자 아형의 진단은 RT-PCR을 통해서만 가능하고, 고가의 진단 비용이 들며, A 아형의 분류가 가능한 급속항원진단시약은 SD사의 H1/A/B 진단시약을 제외하고는 전 세계적으로 개발되어 사용된 바 없다.
신종인플루엔자의 확진검사로 인정되어 사용되고 있는 Real-time PCR은 높은 감도와 정확도를 통해 감염질환의 진단에 가장 효과적인 수단이다. 그러나, 검사시간이 2~4시간 소요되고, 현장검사가 불가능하여 전문기관에 의뢰할 경우 통상적으로 2~3일 정도 검사시간이 소요되며, 고가의 검사비용으로 감염성 질환의 대유행이 예상되는 시점에서 국가적 규모의 초기대응수단으로 사용이 불가능한 실정이다. 또한 인체뿐만 아니라 닭, 칠면조, 야생조류 등 여러 종류의 조류에 감염되는 조류인플루엔자는 전파가 빠르고 병원성이 다양한데, 고병원성 조류인플루엔자가 발생한 경우에는 우리나라를 포함하여 전세계의 대부분 국가들이 살처분하고 있으며 발생국가에서는 양계산물을 수출할 수 없어 막대한 피해를 입고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 종전과 같이 인플루엔자 A/B형의 핵단백질을 검출하는 것뿐만 아니라, 인플루엔자 H1, H3, H5 아형의 헤마글루티닌 (Hemagglutinin)을 교차반응 없이 동시에 검출할 수 있는 인플루엔자 검출용 키트를 개발하였고, 이를 이용하면 현장에서 H5형 조류인플루엔자를 포함하는 인플루엔자의 아종까지 즉시 검출 및 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 인플루엔자 A/B형 외에도 H1/H3/H5 아형을 동시에 검출할 수 있는 멀티 인플루엔자 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 멀티 인플루엔자 검출용 키트를 이용하는 인플루엔자 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 스트립 및 제2 스트립으로 이루어진 인플루엔자 검출용 키트에 있어서, 상기 제1 스트립 및 제2 스트립은 각각 검체패드, 접합체패드, 신호패드, 및 흡수패드를 포함하고,
상기 제1 스트립의 접합체패드 및 신호패드에는 인플루엔자 H3 아형, 인플루엔자 A형, 인플루엔자 B형과 각각 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체가 포함되어 있고,
상기 제2 스트립의 접합체패드 및 신호패드에는 인플루엔자 H1 아형, 인플루엔자 H5 아형과 각각 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체가 포함되어 있는 인플루엔자 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 멀티 인플루엔자 검출용 키트를 이용하는 인플루엔자 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단일클론항체를 이용한 멀티 인플루엔자 검출용 키트는 인플루엔자 A, B형 및 H1, H3, H5 아형을 동시에 검출할 수 있어, 신속하고 민감도가 높은 인플루엔자의 현장 검출 및 진단에 유용하다.
도 1은 멀티 인플루엔자 항원 진단 시스템의 기본 원리를 나타낸 그림이며, 스트립 A는 제1 스트립을, 스트립 B는 제2 스트립을 의미한다.
도 2는 제조된 금입자의 파장별 O.D값을 나타낸 그림이다.
도 3은 멀티 인플루엔자 항원 진단 시스템의 조립 모식도를 나타낸 그림으로, 스트립 A는 제1 스트립을, 스트립 B는 제2 스트립을 의미한다.
도 4는 스트립의 구성을 나타낸 그림이며, Sample pad는 검체패드, Conjugate pad는 접합체패드, NC membrane은 신호패드, Absorbent pad는 흡수패드를 의미한다.
도 5 는 스트립 구성 및 디바이스 모식도를 나타낸 그림으로, 스트립 구성의 A는 제1 스트립을, B는 제2 스트립을 나타낸다.
도 6은 멀티 인플루엔자 항원 농도에 따른 민감도를 보여주는 인플루엔자 검출용 키트의 사진이다.
도 7은 바이러스 희석 배수에 따른 H5N3 아형 바이러스 검출 한계 시험 결과를 보여주는 인플루엔자 검출용 키트의 사진이다.
도 8은 바이러스 희석 배수에 따른 H5N2 아형 바이러스 검출 한계 시험 결과를 보여주는 인플루엔자 검출용 키트의 사진이다.
도 9는 다양한 아형에 대한 H5 아형 검출 키트의 교차반응 시험 결과를 보여주는 인플루엔자 검출용 키트의 사진이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 인플루엔자 H3 아형, 인플루엔자 A형, 인플루엔자 B형과 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 제1 스트립; 및 인플루엔자 H1 아형, 인플루엔자 H5 아형과 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 제2 스트립으로 구성되는 인플루엔자 검출용 키트를 제작하고, 인플루엔자 A의 아형인 H1, H3, H5까지 효과적으로 검출해낼 수 있는지 알아보기 위해 민감도, 특이도 평가 및 교차반응 실험을 수행하였다. 그 결과 본 발명의 인플루엔자 검출용 키트가 타사의 A/B typing 만 가능한 키트에 비해 민감도가 높음을 확인하였고, H1, H3, H5 아형까지 효과적으로 검출해낼 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 제1 스트립 및 제2 스트립으로 이루어진 인플루엔자 검출용 키트에 있어서, 상기 제1 스트립 및 제2 스트립은 각각 검체패드, 접합체패드, 신호패드, 및 흡수패드를 포함하고,
상기 제1 스트립의 접합체패드 및 신호패드에는 인플루엔자 H3 아형, 인플루엔자 A형, 인플루엔자 B형과 각각 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체가 포함되어 있고,
상기 제2 스트립의 접합체패드 및 신호패드에는 인플루엔자 H1 아형, 인플루엔자 H5 아형과 각각 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체가 포함되어 있는 인플루엔자 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 스트립의 접합체패드 및 신호패드에 포함되어 있고 인플루엔자 H3 아형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 H3 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하고, 인플루엔자 A형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 A형의 핵단백질에 특이적으로 결합하고, 인플루엔자 B형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 B형의 핵단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하고,
상기 제2 스트립의 접합체패드 및 신호패드에 포함되어 있고 인플루엔자 H1 아형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 H1의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하고, 인플루엔자 H5 아형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 H5 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 스트립의 접합체패드에는 인플루엔자 H3 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는 NCCP. 76024 단일클론항체; 인플루엔자 A형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 7307 SPTN-5 단일클론항체; 및 인플루엔자 B의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 9901 SPTNE-10 단일클론항체가 포함되고,
상기 제1 스트립의 신호패드에는 인플루엔자 H3 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는 NCCP. 76024 단일클론항체; 인플루엔자 A형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 A60010044P 단일클론항체; 및 인플루엔자 B형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 10-I55B 단일클론항체가 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 스트립의 접합체패드에는 인플루엔자 H1 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체; 및 인플루엔자 H5 아형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 3H5N-15A6 단일클론항체가 포함되고,
상기 제2 스트립의 신호패드에는 인플루엔자 H1 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체; 및 인플루엔자 H5 아형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 3H5N-15A6 단일클론항체가 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 검출용 키트는 제1 스트립과 제2스트립으로 구성되어 있고, 제1 스트립 및 제2 스트립에는 각각 검체패드, 접합체패드, 신호패드, 흡수패드가 조립되어 들어가 있다. 샘플패드는 분석할 시료 (혈청, 혈액, 타액)를 빠른 속도로 흡수하는 역할을 하고, 접합체패드는 눈으로 신호를 검출하기 위해 색을 띠는 금입자 (colloidal gold)와 항체를 결합시킨 접합체를 증착시키는 역할을 하며,신호패드는 항체를 물리흡착법으로 고정화하여 항원-항체 반응 후 신호가 나타나도록 하는 역할을 하고, 흡수패드는 시료 첨가 후 모세관 현상에 의해 시료가 위로 전개되도록 하는 driving force를 제공해 주는 역할을 한다.
인플루엔자 바이러스 내부에 있는 가용성의 핵단백질(nucleoprotein, NP)의 항원성에 의해서 인플루엔자 A형, B형 또는 C형의 3종의 유형으로 분류되고, 인플루엔자 A형의 바이러스 표면에 존재하는 적혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 단백질과 뉴라미니다제(neuraminidase, NA) 단백질의 항원성에 의해 인플루엔자 A형이 H 및 N아형으로 분류된다. 본 발명의 일 실시예에서는 각각의 인플루엔자 아형을 구분하여 검출하기 위해, 인플루엔자 A, B형의 경우 바이러스 내부의 서로 다른 핵단백질과 각각 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 인플루엔자 검출에 사용하였고, H1, H3, H5 아형의 경우 바이러스 표면의 서로 다른 헤마글루티닌과 각각 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 인플루엔자 검출에 사용하였다. 각 단일클론항체는 실시예 2의 표 1에 기재된 바와 같이, H1 아형의 경우 직접 생산하였고, 나머지 형들에 대한 단일클론항체는 질병관리본부, hytest사, Biospacific사, Fitzgerald사, Medix사 등에서 구입하여 본 발명의 인플루엔자 검출 키트에 도입하였으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 스트립과 제2 스트립의 긴 축이 서로 평행하게 놓여져 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 제1 스트립 및 제2 스트립의 접합체패드에는 포함된 단일클론항체가 표지물질과 결합된 접합체 형태로 존재하고, 신호패드에는 포함된 단일클론항체가 검사선 형태로 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 접합체패드에 포함된 단일클론항체와 결합된 표지물질은 금입자(colloidal gold)인 것을 특징으로 할 수 있다.
제1 스트립과 제2 스트립의 긴 축이 서로 평행하게 놓여져 있다는 것은 도 5에서와 같이 제1 스트립과 제2 스트립이 긴 축을 맞대고 나란히 놓여져 있는 것을 뜻한다. 본 발명의 일 실시예에서, 항체-표지물질 접합체가 항원과 결합하여 신호패드로 이동 후 신호패드에 고정된 검사선 항체와 다시 결합하였을 때 발색하여 신호를 방출하게 하는 표지물질로 금 콜로이드 입자를 사용하였는데, 이 외에도 겨자무 과산화 효소(horseradish peroxidase), 알카리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 알쓰로마이시스 라모서스 과산화 효소(arthromyces ramosus peroxidase), 글루코우즈 옥시데이즈, 유리에이즈, 페니실린 옥시데이즈 및 콜레스테롤 옥시데이즈와 같은 효소가 사용될 수 있으며, Co2+, Cu2 +, Mg2 +, Fe2 +와 같은 금속이온 혹은 이들의 화합물도 사용될 수 있고, 기질용액은 각 효소에 특이한 발색용 기질성분, 발광용 기질성분(예: 루미놀), 전기화학신호 발생용 기질성분을 포함하거나 실버 화합물 등을 포함하며, 효소-기질 반응 또는 화학반응에 의해 발색, 변색, 발광, 전기전도도 변화, 전류변화 또는 전압변화를 신호로 나타내는 작용을 한다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 스트립 신호패드의 검사선은 검체패드와 가까운 쪽에서부터 인플루엔자 H3 아형 검사선, 인플루엔자 A형 검사선, 인플루엔자 B형 검사선의 순으로 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 제2 스트립 신호패드의 검사선은 검체패드와 가까운 쪽에서부터 인플루엔자 H1 아형 검사선, 인플루엔자 H5 아형 검사선의 순으로 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 제1 스트립 및 제2 스트립의 신호패드는 시료의 전개를 확인하기 위한 대조군(control)인 마우스항체 C와 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 마우스항체 C와 특이적으로 결합하는 항체는 검체패드와 가장 먼 쪽에 검사선의 형태로 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는, 상기 제1 스트립 신호패드의 인플루엔자 H3 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 0.7~1.1cm, 인플루엔자 A형 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.1~1.5cm, 인플루엔자 B형 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.5~1.9cm, 마우스항체 C 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.9~2.3cm 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 제1 스트립; 및 상기 제2 스트립 신호패드의 인플루엔자 H1 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 0.6~1.2cm, 인플루엔자 H5 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.2~1.8cm, 마우스항체 C 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.8~2.4cm 부분에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱 바람직하게는, 상기 제1 스트립 신호패드의 인플루엔자 H3 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 0.9cm, 인플루엔자 A형 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.3cm, 인플루엔자 B형 검사선은 신호패드 하단부로부터 2.1cm, 마우스항체 C 검사선은 신호패드 하단부로부터 2.1cm 부분에 위치하는 것을 특징으로 하고; 상기 제2 스트립 신호패드의 인플루엔자 H1 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 0.9cm, 인플루엔자 H5 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.5cm, 마우스항체 C 검사선은 신호패드 하단부로부터 2.1cm 부분에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "마우스항체 C"의 "C"는 대조군(control)을 의미하고, 시료의 전개를 확인하기 위한 마우스항체를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 제1 스트립의 검사선은 검체패드와 가까운 쪽에서부터 인플루엔자 H3 아형 검사선, 인플루엔자 A형 검사선, 인플루엔자 B형 검사선, 마우스항체 C의 검사선 순으로 고정시키고, 제2 스트립 신호패드의 검사선은 검체패드와 가까운 쪽에서부터 인플루엔자 H1 아형 검사선, 인플루엔자 H5 아형 검사선, 마우스항체 C의 검사선 순으로 고정시켰는데, 이는 항체의 교차반응(cross reaction)을 피하기 위한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서 밝혀진 바와 같이 인플루엔자 A형을 검출하는 반응에서 H5 아형도 함께 양성으로 나타났으나, 인플루엔자 H5 아형을 검출하는 반응에서는 다른 인플루엔자들이 양성 반응을 보이지 않았다. 따라서 인플루엔자 A형과 H5 아형의 검출 항체는 교차반응을 피하기 위해 다른 스트립에 존재하게 하였고, 본 발명의 인플루엔자 검출 키트는 특히 H5 아형에 대한 민감도 및 특이도가 높다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 제1항의 단일클론항체가 포함되어 있는 인플루엔자 검출용 키트를 이용하는 인플루엔자 검출방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1 : 금입자(colloidal gold)의 제조방법
1-1. 금입자의 제조방법
금입자는 HAuCl4를 구연산 (citrate)으로 환원시키는 방법을 사용하여 제조하였다. 먼저, Heating mantle에 설치된 10L three neck-flask 내에 하나의 neck를 개방하여 흘리지 않도록 주의하여 3차 증류수를 1.98L를 가하고, 다시 5% Gold chloride 0.4 mL을 가하여 교반시키며 온도를 95℃까지 높였다. 이 때, 교반 속도는 중간으로 하였다. Stock solution을 사용할 경우에는 용액을 냉동상태로 보관하다 사용했기 때문에 완전히 녹은 후 잘 흔들어 주었고, Gold chloride을 칭량할 때에는 금속성 물질이 접촉하면 즉시 산화되므로 플라스틱 spatula를 사용하였다. 반응액의 양이 손실 없이 일정하게 유지되도록 냉각기를 연결하여 휘발되는 수증기를 잡았다. 이 때, 용액은 옅은 노란색을 띠고 있었다.
95℃ 이상에 도달하였을 때 교반 속도를 가능한 한 최대로 높인 후 미리 준비된 5% Sodium citrate용액 20 mL, 25 mM K2CO3 0.1 mL, 1% tannic 0.1 mL 등의 혼합액(60℃)을 주사기나 피펫을 이용하여 신속히 방출하였다. 개방한 neck는 대단히 뜨거우므로 조심하고 수증기의 손실을 막기 위해 최대한 신속하게 하였다. 즉시 색깔이 검정으로 되었다가 시간이 지날수록 붉은색이 점점 강해지면서 보라색 (포도주색)으로 안정되어, 교반 속도를 낮추고 20분 정도 더 교반시킨 후 가열만 중지시켰다.
마지막으로, 용액이 식은 후 spectrophotometer에서 500~600 사이에서 scanning하였다. 그 결과, O.D 520nm 에서 peak를 형성하였고, O.D 520nm value = 0.8 로 표시되었다 (도 2).
1-2. 금입자 제조시 주의사항
HAuCl4를 다룰 때는 반드시 비금속성 기구로 해야 하고, 금입자 용액을 만드는 데 사용되는 기구는 비금속성 세척도구로 세척해야 한다. 또한, HAuCl4용액을 첨가할 때 임펠러 회전속도가 중요하며 HAuCl4용액을 첨가할 때에는 되도록 빠르게 한번에 분주해야 한다. 이는 용액이 혼합되는 속도가 느리면 반응이 일어나다 멈춰버리기 때문인바, 이러한 경우 dark blue에서 색의 변화가 일어나지 않는다. gold 용액을 다룰 때에도 DIW로 처리한 용기를 사용해야 한다. 보관할 때는 갈색병에 넣고 어두운 곳에 보관한다. 본 실험에 사용하는 물은 3차 증류수로서 멸균할 필요는 없으나 반드시 pore size 0.2μm의 여과지로 여과하여 금입자 이외의 입자성 물질이 혼입되지 않도록 하여야 한다.
실시예 2 : 항체- 금입자 중합체의 제조방법
2-1. 인플루엔자 H1 아형 검출용 항체 선별 및 정제
본 발명에서, 인플루엔자 A형, B형, H3 아형, H5 아형에 특이적인 항체는 구입하여 사용하고, H1 아형에 특이적인 항체는 직접 제작하여 사용하였다.
인플루엔자 바이러스 H1 아형 검출을 위한 항체를 선별하기 위해 당업계에 알려진 융합세포주 제조방법(Kohler, G. and Milstein, C,. 1975; Kozbar et al. 1983)을 이용하여 2009년 신종인플루엔자 항원을 면역하여 얻은 항체 pool을 제조하였다. 상기 방법을 간단히 설명하면, 신종 인플루엔자 바이러스를 6~8주령 생쥐의 복강에 주사하여 면역화시키고, 비장을 적출하여 단일세포화한 후, 골수종 세포와 반응시켜 융합세포주를 제조하였다. 이렇게 제조된 융합세포주(하이브리도마; hybridoma)를 안정한 단클론 세포주가 얻어질 때까지 클로닝을 반복하여 단클론 항체를 생산하는 융합세포주를 제조하였으며, 상기 융합세포주에서 생성되는 항체 중에서 인플루엔자 바이러스 H1 아형에 대해 친화도를 가진 항체를 선별하였다.
인플루엔자 바이러스 H1 아형 검출용 항체를 선별하기 위해 ELISA 방법을 이용하였으며, 캡춰 항체는 SRID용 표준항체(A/Brisbane/59/2007 (IVR-148); NIBSC, Lot No. 10/120)를, 항원은 1종의 인플루엔자 바이러스(A/Brisbane/59/2007(IVR-148))를 MDCK 세포에 감염시켜 제조한 샘플 상층액을 사용하였다.
상기 SRID용 표준항체 및 IVR-148를 감염시킨 배양 상층액을 순차적으로 코팅한 96well 플레이트(plate)에 인플루엔자 항체 pool의 각각의 항체를 처리하여 IVR-148 바이러스에 대한 친화도(affinity)를 가진 항체를 선별하였으며, 이후 2차 선별 및 ELISA 조건 확립에 사용하기 위해 각각의 항체를 당업계에 알려진 IgG 정제방법으로 정제하였다.
항체를 정제한 후, 인플루엔자 바이러스의 H1 아형 단백질과 높은 결합성을 보이는 SF587 및 SF757의 Fab 단편에 대하여 각각의 경쇄 가변영역(variable light chain) 및 중쇄 가변영역(variable heavy chain)의 아미노산 서열을 분석하였다 (표 1).
SF587 및 SF757 항체의 아미노산 서열
항체 아미노산 서열 서열번호
SF587 중쇄
가변영역		 VQLQQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYDMS WIRQAPGKGLEWVS GILGGGERSYYNDSVKG RFTISRDNSRKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR HGSSGYVDY GMDYWGQGTTVTVSS 서열번호 1
경쇄
가변영역		 DIVLTQSPSFLSASVGDRVTITC RASQGIGDNLG WYQQKPGKAPKRLIY GVSTLDS GVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYC LQHSNYPMYT FGQGTKLEIKR 서열번호 2
SF757 중쇄
가변영역		 VKLQESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFS DYDMS WIRQAPGKGLEWVS GILGGSERSYYRDSVKG RSTISRDNSRKTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR HSWGAYVQYGM DV WGQGTTVTVSS 서열번호 3
경쇄
가변영역		 DIQMTQSPASLAVSPGQRATITC RASESVSNYGINFIN WFQQKPGQPPKLLIY TASNKGT GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYFCQQTKEVPYTFGGGTKLEIKR 서열번호 4
(밑줄 및 굵게 표시된 부분은 CDR 부분을 의미한다.)
2-2. 항체- 금입자 중합체의 제조
항체-금입자 중합체를 제조하기 위해, 먼저 40 nm 골드 콜로이드를 0.1M carbonate buffer를 첨가하여 접합에 적합한 pH 8.0으로 조절하였다. 그 다음, 인플루엔자 H1, H3, H5, A, B형 각각에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 10 mM borate buffer로 0.1 mg/mL농도로 희석하였다. 그 다음, 금입자 용액 1 mL에 2-2번의 0.1 mg/mL 농도의 100 uL를 각각 첨가하여 상온에서 30분간 mild shaking 하면서 반응시켰고, 30분간 반응시킨 항체-금입자 용액에 10% BSA (bovine serum albumin)를 최종농도 1%가 되도록 100 μL를 첨가하여 30분간 mild shaking 하면서 반응시켰다.
형성된 항체-금입자 접합체를 얻기 위해 4℃에서 13,000 rpm으로 5분 동안 원심분리 한 후, 상층액을 1 mL 제거하고 남은 상층액으로 침전물 (항체-금입자 접합체)을 resuspension시킨 후 하나의 tube로 합치고 1% BSA/10 mM borate를 1 mL 첨가하고 다시 4℃에서 13,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리 하였다. 마지막으로, 상층액을 완전히 제거하고 침전물(항체-금입자 접합체)을 20×로 농축하기 위해 1% BSA/10 mM borate 50 μL로 rehydration시켰다. 그 결과, 항체-금입자 접합체를 얻을 수 있었다.
실시예 3: 제1 스트립 및 제2 스트립의 제작 및 조립
3-1. 제1 스트립 및 제2 스트립의 신호패드 제작
원하는 농도를 검출할 수 있는 항체 농도를 설정하여 신호패드에 물리흡착법으로 고정화하기 위해, 제1 스트립 신호패드의 0.9cm 부분, 1.3cm 부분, 1.7cm 부분에 각각 인플루엔자 H3 아형, A형, B형과 특이적으로 결합하는 단일클론항체를, 2.1cm 부분에는 시료가 위로 전개되었다는 것을 확인하기 위한 control로 마우스 항체와 특이적으로 결합하는 항체를 Dispenser를 이용하여 신호패드에 각각의 정해진 간격과 일정한 굵기로 그은 후 37℃에서 overnight동안 반응시켜 신호패드에 고정시킨다.
마찬가지로, 제2 스트립 신호패드의 0.9 cm 부분, 1.5 cm 부분에 각각 인플루엔자 H1, H5 아형과 특이적으로 결합하는 단일클론항체를, 2.1 cm 부분에는 시료가 위로 전개되었다는 것을 확인하기 위한 control로 마우스 항체를 인지하는 항체를 Dispenser를 이용하여 신호패드에 각각의 정해진 간격과 일정한 굵기로 그은 후 37℃에서 overnight동안 반응시켜 신호패드에 고정시킨다.
신호패드에 고정되고 각각의 인플루엔자와 특이적으로 결합하는 구체적인 단일클론 항체의 종류는 다음 표 2와 같다.
신호패드에 고정된 단일클론 항체
Name 수득원 Catalogue Number
H1 자체생산 -
H3 질병관리본부 NCCP. 76024
H5 Hytest 3H5N-15A6
A Biospacific A60010044P
B Fitzgerald 10-I55B
3-2. 제1 스트립 및 제2 스트립의 접합체패드 제작
항체-금입자 접합체가 포함된 접합체패드를 만들기 위해, 접합체 용액에 완전히 적셔 제조하는 soaking method를 이용한다. 제1 스트립 접합체패드의 경우, 인플루엔자 H3 아형, A형, B형과 각각 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 40nm 골드 콜로이드를 결합시킨 접합체와 trehalose를 최종 5% 농도가 되도록 섞어 제1 스트립의 접합체패드에 적신 후 1 시간 동안 동결 건조시켜, 항체-금입자 접합체를 접합체패드에 증착시켰다.
제2 스트립 접합체패드의 경우, 인플루엔자 H1 아형, H5 아형과 각각 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 40nm 골드 콜로이드를 결합시킨 접합체와 trehalose를 최종 5% 농도가 되도록 섞어 제2 스트립의 접합체패드에 적신 후 1 시간 동안 동결 건조시켜, 항체-금입자 접합체를 접합체패드에 증착시켰다.
골드 콜로이드와 결합하여 접합체를 형성하고 각각의 인플루엔자와 특이적으로 결합하는 구체적인 단일클론 항체의 종류는 다음 표 3과 같다.
골드 콜로이드와 결합하여 접합체를 형성하는 단일클론 항체
Name 수득원 Catalogue Number
H1 자체생산 -
H3 질병관리본부 NCCP. 76024
H5 Hytest 3H5N-15A6
A Medix 7307 SPTN-5
B Medix 9901 SPTNE-10
3-3. 제1 스트립 및 제2 스트립의 조립
제1 스트립과 제2 스트립은 흡수패드, 신호패드, 접합체패드 그리고 검체패드로 구성되는데, 신호패드의 하단부에 접합체패드를 부착하고 부착된 접합체패드 위에 다시 검체패드를 부착한다. 신호패드의 상단부엔 흡수패드를 부착하여 각 스트립을 조립한다 (도 3, 도 4). 조립된 스트립은 3.9 mm 간격으로 전용 cutter를 이용하여 정확히 cutting 하고, cutting된 스트립은 전용 cassette (도 5)에 접합체패드와 검체패드가 포함된 부분이 노출되도록 방향에 주의하여 조립한다. 제1 스트립과 제2 스트립은 긴 축이 서로 평행하도록 나란히 배치한다.
실시예 4: 항체 농도에 따른 민감도
각각의 표준항원 (H1, H3, H5, A, B)을 검체 추출액으로 희석하여 180 μL를 조립된 스트립의 시료 투입구에 첨가하고 15분 동안 기다린 후, 항원-항체 반응에 따른 신호를 관찰했다. 각각의 H1, H3, H5, A, B 항원 농도에서 실험을 수행한 결과, 50 ng/mL 농도까지 신호가 관찰되었다 (도 6).
실시예 5: 제네디아® 멀티 인플루엔자 항원 래피드 테스트((주)녹십자 MS ) 급속진단시약의 민감도 및 특이도
국내 개발 인플루엔자 검출 시약들의 민감도는 현재까지 보고된 바로는 31.3%-91.4%로 다양한 실정이다.
이 임상시험에서는 아형의 분류가 가능하도록 새롭게 개발된 본 발명의 인플루엔자 검출용 키트를 상품화 중인 제네디아® 멀티 인플루엔자 항원 래피드 테스트((주)녹십자 MS)를, 국내외에서 개발된 다양한 급속항원검사 및 인플루엔자의 확진법이라고 알려진 PCR 검사와 비교하여 그 성능을 평가해 보고, 기존에 널리 사용되고 있는 외국 제품의 성능과 동시에 비교해 보았다.
아래 표 4는 녹십자 MS사의 제네디아® 멀티 인플루엔자 항원 래피드 테스트의 인플루엔자 A/B형 typing 예민도를 타사의 시약과 비교한 것으로, 이로부터 녹십자 MS사의 제네디아® 멀티 인플루엔자 항원 래피드 테스트 급속진단시약은 현재 상용화된 제품의 민감도(평균54.22%) 대비 약 15% 향상된 것을 알 수 있었다.
타사 인플루엔자 진단 시약과 녹십자 MS사 제네디아® 멀티 인플루엔자 항원 래피드 테스트의 인플루엔자 검출 예민도 비교
Real-time PCR 급속진단키트
Seegene SD Humasis Alere 녹십자 MS
Anyplex TM II RV16 Detection Assay (n) Influenza Ag A/B/A (H1N1/2009) (n) Influenza A/B
Antigen Test (n)		 BinaxNOW
A&B Card (n)		 GENEDIA® Multi Influenza Ag
Rapid Test (n)
Influenza A (75)
Influenza A (40/75)
Influenza A (31/75) Influenza A (42/75)
Influenza A (55/75)
Influenza A&B (1/75)

Influenza B (75) 		Influenza B (49/75)
Influenza B (44/75) Influenza B (38/75) Influenza B (49/75)
InfluenzaA&B (1/75) Influenza A&B (5/75) Influenza A&B (1/75)
Negative (100)
Negative (100/100)
Negative (100/100)
Negative (100/100)
Negative (99/100)
Influenza A (1/100)
민감도 59.33%
(A 53.33%, B 65.33%)
특이도 100%		 민감도 50.00%
(A 41.33%, B 58.67%)
특이도 100%		 민감도 53.33%
(A 56.00%, B 50.67%)
특이도 100%		 민감도 69.33%
(A 73.33%, B 65.33%)
특이도 99%
n=검체수
또한, 아래 표 5는 인플루엔자 A형 subtyping 예민도를 비교한 것으로, 이로부터 녹십자 MS사 제네디아® 멀티 인플루엔자 항원 래피드 테스트의 H1의 민감도는 타제품 Influenza Ag A/B/A (H1N1/2009) (SD, 26.92%) 비교 65.38%로 우세하고, H3의 민감도는 시판된 제품이 없어 비교 불가하지만 70.83%로 양호하며, H1 및 H3의 특이도는 각각 99.32% 및 98.41%로 양호함을 알 수 있었다.
타사 인플루엔자 진단 키트와 녹십자 MS사 제네디아® 멀티 인플루엔자 항원 래피드 테스트의 인플루엔자 아형 검출 예민도 비교
Reverse Transcriptase PCR 신속진단키트
Seegene SD 녹십자 MS
Seeplex® Influenza
A/B Onestep Typing		 Influenza Ag A/B/A (H1N1/2009) (n) GENEDIA® Multi Influenza
Ag Rapid Test (n)
Influenza A/H1 (26) Influenza A/H1 (7/26) Influenza A/H1 (15/26)
Influenza H1 (2/26)
Influenza A/H3 (1/26)
Influenza A/H3 (48) 테스트 불가
(현재 H3 판독 시판 래피드 제품은 없음)		 Influenza A/H3 (33/48)
Influenza A/H1 (2/48)
Influenza H3 (1/48)
Negative (100) Negative (100/100) Negative (99/100)
Influenza A/H3 (1/100)
H1 민감도 26.92% H1
민감도 65.38%(17/26)
특이도 99.32%(147/148)
H3
민감도 70.83%(34/48)
특이도 98.41%(124/126)
n=검체수
실시예 6: 인플루엔자 H5 항원 검사에 대한 제네디아® 멀티 인플루엔자 항원 래피드 테스트 키트의 임상학적 유용성 평가
6-1. H5 아형 검출에 대한 진단키트의 민감도
H5 아형(subtype) 조류인플루엔자 바이러스에 대한 개발 키트의 검출한계를 알아보기 위하여 두 종의 H5 아형(H5N3 및 H5N2)을 대상으로 민감도 검사를 실시하였다. 민감도 검사는 혈구응집단위(hemagglutinating unit; HA unit)와 비교하는 방법으로 실시하였다. 즉 128 HA units 함량의 H5N3 혹은 H5N2 아형의 인플루엔자 바이러스를 1/2에서 1/256배, 혹은 1/4에서 1/128배까지 이진 희석하여 키트와 반응하였다.
H5N3 아형 바이러스를 사용한 실험결과 개발된 키트는 H 아형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 반응에서는 1 HA unit 이하 바이러스 농도에서는 음성이었으나 2 HA units 이상의 바이러스 농도에서는 모두 양성반응을 보였다 (표 6, 도 7). 또한 A 형(type) 인플루엔자 바이러스를 검출하는 반응에서도 H 아형 검출시험에서의 유사하게 2 HA units 이상의 바이러스 함량에서는 모두 양성반응을 보였다. 그러나 B 형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 반응과 H1 아형과 H3 아형을 검출하는 반응에서는 바이러스 함량이 64 HA units에서도 모두 음성으로 나타났다.
H5 아형 검출에 대한 진단키트의 검출 한계 시험 (H5N3 아형 바이러스 사용 결과)
바이러스 함량 희석배수 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
검사결과 HA units 64 32 16 8 4 2 1 0.5
A + + + + + + - -
B - - - - - - - -
H1 - - - - - - - -
H3 - - - - - - - -
H5 + + + + + + - -
H5N2 아형 바이러스를 사용한 실험결과도 H5N3 아형 인플루엔자 바이러스를 사용한 실험결과와 유사하였다. 즉, H5N2 아형 인플루엔자 바이러스를 사용한 실험결과 개발된 키트는 H 아형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 반응에서는 2 HA units 이상의 바이러스 농도에서는 모두 양성반응을 보였다. 또한 A 형(type) 인플루엔자 바이러스를 검출하는 반응에서도 H 아형 검출시험에서의 유사하게 2 HA units 이상의 바이러스 함량에서는 모두 양성반응을 보였다(표 7, 도 8). 그러나 B 형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 반응과 H1 아형과 H3 아형을 검출하는 반응에서는 바이러스 함량이 64 HA units에서도 모두 음성으로 나타났다.
H5 아형 검출에 대한 진단키트의 검출 한계 시험 (H5N2 아형 바이러스 사용 결과)
바이러스 함량 희석배수 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
검사결과 HA units 64 32 16 8 4 2 1 0.5
A + + + + + + - -
B - - - - - - - -
H1 - - - - - - - -
H3 - - - - - - - -
H5 + + + + + + - -
H5 아형 검출한계에 대한 실험결과 H5N3 및 H5N2 아형 바이러스 모두에서 바이러스 함량이 1 HA unit 이하에서는 음성이었으나 2 HA units 이상에서는 모두 양성으로 나타나는 것으로 보아 바이러스 함량이 2 HA unit 이상일 경우 본 키트 반응에서는 모두 양성 확인이 가능할 것으로 판단되었다.
6-2. 다른 H 아형 바이러스에 대한 교차반응 검사
H5 아형(subtype) 검출 키트가 다른 H 아형 바이러스와 교차반응 여부를 조사하기 위하여 A 형(type) 인플루엔자 바이러스에 속하는 다양한 아형 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 조사하였다. 검사에 사용된 인플루엔자 바이러스는 조류에서 분리된 다양한 아형 46주의 바이러스를 대상으로 하였다. 사용 바이러스의 아형은 H 아형 기준으로 H1(2주), H4(1주), H5(6주), H6(12주), H7(12주), H9(10주), H11(2주) 및 H12(1주)로 총 8종 46주 바이러스를 대상으로 하였으며 검사 바이러스 역가는 16~ 64 HA 정도인 바이러스를 사용하였다.
시험결과 개발된 키트는 H5 아형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 반응에서는 다양한 아형의 인플루엔자바이러스중 H5 아형에 속하는 2번(H5N2), 14번(H5N2), 20번(H5N3), 23번(H5N3), 33번(H5N2) 및 44번(H5N3) 등 총 6주에서는 양성반응을 보였으나 기타 아형 바이러스들에 대하여는 반응하지 않았다. 또한 A 형 인플루엔자 바이러스를 검출하는 반응에서는 검사에 사용된 모든 아형의 조류인플루엔자 바이러스들이 양성반응을 보였다. H1 아형을 검출하는 반응에서는 H1 아형인 1번(H1N1), 11번(H1N1) 바이러스만 양성반응을 보였고 기타 아형 바이러스들은 반응하지 않았다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 개발된 키트중 H5 아형을 검출하는 반응은 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스 중 H5 아형 바이러스에서만 반응하고 다른 아형 바이러스와 교차반응이 없는 것으로 나타나 H5 아형에 대한 특이성이 있는 것으로 판단되었다 (표 8, 도 9).
다양한 아형에 대한 H5 아형 검출 키트의 교차반응 시험결과
시료 번호 인플루엔자 바이러스 아형 검사결과
A B H1 H3 H5
1 양평 2-2 H1N1 + - + - -
2 야-춘천 10-F2 H5N2 + - - - +
3 파주 3-5 H6N8 + - - - -
4 야-춘천 9-F2 H6N?* + - - - -
5 김포 3-2 H11N9 + - - - -
6 재-송우리장-닭TR, CT H9N2 + - - - -
7 재-송우리장-오골계 TR, CT H9N2 + - - - -
8 재-광적시장-오골계 TR, CT H9N2 + - - - -
9 재-광적시장-토종닭 TR, CT H9N2 + - - - -
10 재-덕포장-오리TR H9N2 + - - - -
11 재-와수장-닭TR, CT H9N2 + - - - -
12 야-제주용수리3-②-F2 H1N1 + - + - -
13 야-제주하도리3-②-F6 H4N6 + - - - -
14 야-제주용수리4-①-F1 H5N2 + - - - +
15 야-청호초4-①-F1 H7N7 + - - - -
16 야-청호초4-①-F2 H7N7 + - - - -
17 야-청호초10-③-F3 H6N8 + - - - -
18 야-청호초9-①-F2 H12N5 + - - - -
19 야-청호초9-①-F3 H6N? + - - - -
20 야-청호초10-③-F1 H5N3 + - - - +
21 야-경호포12-②-F3 H7N? + - - - -
22 야-제주용수리2-②-F4 H11N? + - - - -
23 야-제주용수리12-②-F2 H5N3 + - - - +
24 야-토교저수지11-①-F2 H6N? + - - - -
25 야-토교저수지11-①-F3 H6N? + - - - -
26 야-토교저수지11-①-F4 H6N? + - - - -
27 야-제주하도리11-②-F1 H6N? + - - - -
28 야-제주하도리11-②-F2 H6N? + - - - -
29 야-제주하도리11-②-F4 H6N? + - - - -
30 야-제주하도리11-②-F6 H6N? + - - - -
31 야-제주용수리11-②-F4 H7N1 + - - - -
32 야-토교저수지11-①-F1 H9N? + - - - -
33 야-제주용수리12-①-F4 H5N2 + - - - +
34 야-청호초10-③-F3 H9N? + - - - -
35 야-제주용수리-1-①F5 H7N? + - - - -
36 야-제주하도리-1-①F2 H7N? + - - - -
37 야-제주하도리-1-①F3 H7N? + - - - -
38 야-제주용수리-1-②F2 H7N1 + - - - -
39 야-제주하도리-1-②F3 H7N? + - - - -
40 야-제주하도리-1-②F5 H7N? + - - - -
41 야-제주용수리1-③-F3 H7N1 + - - - -
42 야-경포호3-④-F2 H7N? + - - - -
43 집-춘천10-②-F1 H6N2 + - - - -
44 SYG06 H5N3 + - - - +
45 MS96 H9N2 + - - - -
46 07033 CT H9N2 + - - - -
음성 control - - - - -
*? 표시는 아형이 정확하게 동정되지 못한 바이러스임.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (12)

  1. 제1 스트립 및 제2 스트립으로 이루어진 멀티 인플루엔자 검출용 키트에 있어서, 상기 제1 스트립 및 제2 스트립은 각각 검체패드, 접합체패드, 신호패드, 및 흡수패드를 포함하고,
    상기 제1 스트립의 접합체패드 및 신호패드에는 인플루엔자 H3 아형, 인플루엔자 A형, 인플루엔자 B형과 각각 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체가 포함되어 있고,
    상기 제2 스트립의 접합체패드 및 신호패드에는 인플루엔자 H1 아형, 인플루엔자 H5 아형과 각각 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체가 포함되어 있는 멀티 인플루엔자 검출용 키트;
    여기서, 상기 제2 스트립의 접합체패드에는 인플루엔자 H1 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체; 및 인플루엔자 H5 아형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 3H5N-15A6 단일클론항체가 포함되고,
    상기 제2 스트립의 신호패드에는 인플루엔자 H1 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는, 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체; 및 인플루엔자 H5 아형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 3H5N-15A6 단일클론항체가 포함되어 있음.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 스트립의 접합체패드 및 신호패드에 포함되어 있고 인플루엔자 H3 아형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 H3 아형의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하고, 인플루엔자 A형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 A형의 핵단백질에 특이적으로 결합하고, 인플루엔자 B형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 B형의 핵단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하고,
    상기 제2 스트립의 접합체패드 및 신호패드에 포함되어 있고 인플루엔자 H1 아형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 H1의 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하고, 인플루엔자 H5 아형에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 인플루엔자 H5 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 멀티 인플루엔자 검출용 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 스트립의 접합체패드에는 인플루엔자 H3 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는 NCCP. 76024 단일클론항체; 인플루엔자 A형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 7307 SPTN-5 단일클론항체; 및 인플루엔자 B의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 9901 SPTNE-10 단일클론항체가 포함되고,
    상기 제1 스트립의 신호패드에는 인플루엔자 H3 아형의 헤마글루티닌과 특이적으로 결합하는 NCCP. 76024 단일클론항체; 인플루엔자 A형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 A60010044P 단일클론항체; 및 인플루엔자 B형의 핵단백질과 특이적으로 결합하는 10-I55B 단일클론항체가 포함되는 것을 특징으로 하는 멀티 인플루엔자 검출용 키트.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 스트립과 제2 스트립의 긴 축이 서로 평행하게 놓여져 있는 것을 특징으로 하는 멀티 인플루엔자 검출용 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 스트립 및 제2 스트립의 접합체패드에는 각각의 단일클론항체가 표지물질과 결합된 접합체 형태로 존재하고, 신호패드에는 각각의 단일클론항체가 검사선 형태로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 멀티 인플루엔자 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 접합체패드에 포함된 단일클론항체와 결합된 표지물질은 금입자(colloidal gold)인 것을 특징으로 하는 멀티 인플루엔자 검출용 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 제1 스트립 신호패드의 검사선은 검체패드와 가까운 쪽에서부터 인플루엔자 H3 아형 검사선, 인플루엔자 A형 검사선, 인플루엔자 B형 검사선의 순으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 제1 스트립; 및
    상기 제2 스트립 신호패드의 검사선은 검체패드와 가까운 쪽에서부터 인플루엔자 H1 아형 검사선, 인플루엔자 H5 아형 검사선의 순으로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 제2 스트립으로 구성되어 있는 멀티 인플루엔자 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1 스트립 및 제2 스트립의 신호패드는 시료의 전개를 확인하기 위한 대조군(control)인 마우스항체 C와 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티 인플루엔자 검출용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 마우스항체 C와 특이적으로 결합하는 항체는 검체패드와 가장 먼 쪽에 검사선의 형태로 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 멀티 인플루엔자 검출용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1 스트립 신호패드의 인플루엔자 H3 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 0.7~1.1cm, 인플루엔자 A형 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.1~1.5cm, 인플루엔자 B형 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.5~1.9cm, 마우스항체 C 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.9~2.3cm 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 제1 스트립; 및 상기 제2 스트립 신호패드의 인플루엔자 H1 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 0.6~1.2cm, 인플루엔자 H5 아형 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.2~1.8cm, 마우스항체 C 검사선은 신호패드 하단부로부터 1.8~2.4cm 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 제2 스트립으로 구성되어 있는 인플루엔자 검출용 키트.
  12. 제1항의 멀티 인플루엔자 검출용 키트를 이용하는 인플루엔자 검출방법.
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