CN202583207U

CN202583207U - 一种快速检测h1亚型和h5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条

Info

Publication number: CN202583207U
Application number: CN 201220219064
Authority: CN
Inventors: 张如民; 曾小宇; 任宝红; 赵林萍; 魏卓; 李丹
Original assignee: ZHENGZHOU ZHONGDAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHENGZHOU ZHONGDAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2022-05-16

Abstract

本实用新型涉及一种快速检测H1亚型和H5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条，其包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜I、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜II、包被膜和吸水纸，其中包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜I和吸水纸，在该玻璃纤维膜I远离包被膜的一端的上面粘贴玻璃纤维膜II，在玻璃纤维膜II远离包被膜的一端的上面粘贴样品垫；在所述包被膜的上面设有检测线I、检测线II和质控线，检测线I和检测线II均包被抗禽流感病毒的抗体，质控线包被抗鼠抗体。该试纸条能同时检测出该样品是否含有H1和/或H5亚型禽流感病毒，具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点。

Description

一种快速检测H1亚型和H5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条

技术领域

本实用新型属于禽类疫病检测技术领域，具体涉及一种能同时对H1亚型和H5亚型禽流感病毒进行检测的胶体金二联检测试纸条，可用于免疫接种效果的监控、个体免疫状态的确定。

背景技术

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒（AIV）引起的一种重要的禽类传染病。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟均可感染，发病情况轻重不一，有的急性死亡，有的无症状带毒。禽流感大致可以分为低致病性禽流感和高致病性禽流感，后者往往是一种毁灭性的疾病，有时引起人感染、发病甚至死亡。这间接导致了肉类市场供求关系混乱、禽产品出口受阻、政府财政负担加重和公众恐慌，因此对禽类是否被禽流感病毒感染进行检测具有非常重大的意义。

目前，对禽流感病毒的诊断方法主要有病原学检测、血清学试验诊断等方法。但病原学检测方法因其病毒分离时间长，要求条件高，分离率低等因素的影响，很难对样品进行大批量检测；而采集样品进行血清学试验，对仪器设备和操作人员有较高的要求，不易于在基层的推广。因此，上述两种方法在使用中受到很大的限制。

实用新型内容

本实用新型目的在于提供一种操作方便、快速、有效地检测H1亚型和H5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条。

为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：

一种快速检测H1亚型和H5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条，试纸条包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜I、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜II、包被膜和吸水纸，其中，包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜I和吸水纸，在该玻璃纤维膜I远离包被膜的一端的上面粘贴玻璃纤维膜II，在玻璃纤维膜II远离包被膜的一端的上面粘贴样品垫；在所述包被膜的上面设有检测线I、检测线II和质控线，所述检测线I和检测线II均包被抗禽流感病毒的抗体，质控线包被抗鼠抗体。

具体的，所述玻璃纤维膜I为涂覆胶体金颗粒标记抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜I，所述玻璃纤维膜II为涂覆胶体金颗粒标记抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜II。

所述检测线I包被抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，检测线II包被抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体；抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体、抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体及抗鼠抗体分别固定于包被膜上并呈三条线平行排列，形成所述的检测线I、检测线II和质控线。

上述的抗H1亚型和抗H5亚型禽流感病毒抗体均为高纯度的单克隆抗体，按照本领域的常规技术即可制得，故此处不再赘述。底板可以用PVC材料制成，包被膜可以是硝酸纤维素膜。

本实用新型采用双抗体夹心法检测抗原，通过对金标记抗体pH、浓度以及包被膜上包被抗体浓度的调整，使其能够产生特异条带，从而满足农户、基层及个人对于H1亚型和H5亚型禽流感病毒检测的需求。

本实用新型在对一份样品进行检测时，能同时检测出该样品是否含有H1亚型或H5亚型禽流感病毒，其具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需要使用仪器设备，操作简单，能广泛地用于农户、基层以及个人对于H1亚型和H5亚型禽流感病毒的检测。

附图说明

图1为本实用新型的侧面结构示意图，图中，1为PVC底板；2为样品垫；3为金标记抗体玻璃纤维膜II；4为金标记抗体玻璃纤维膜I；5为硝酸纤维素包被膜；6为吸水纸，下同；

图2为图1的俯视图示意图；图中，7为检测线I；8为检测线II；9为质控线.；

图3为本实用新型检测结果为H1亚型和H5亚型禽流感病毒均阳性的示意图（即包被膜5表面的检测线I 7、检测线II 8和质控线9均显色）；

图4为本实用新型检测结果为H1亚型禽流感病毒阳性的示意图（即包被膜5表面的检测线I 7和质控线9显色而检测线II 8不显色）；

图5为本实用新型检测结果为H5亚型禽流感病毒阳性的示意图（即包被膜5表面的检测线II 8和质控线9显色而检测线I 7不显色）；

图6为本实用新型检测结果为阴性的示意图（即包被膜5表面的质控线9显色而检测线I 7和检测线II 8均不显色）；

图7为试纸条无效的示意图（即包被膜5表面的检测线I 7、检测线II 8和质控线9均不显色）。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型做进一步详细说明，但本实用新型的保护范围不限于此。

如图1和图2所示，一种快速检测H1亚型和H5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条，试纸条包括PVC底板1、样品垫2、涂覆胶体金颗粒标记（金标）抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜I 4、涂覆胶体金颗粒标记（金标）抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜II 3、包被膜5和吸水纸6，其中，包被膜5的底面粘贴在PVC底板1上面，在该包被膜5两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜I 4和吸水纸6，在该玻璃纤维膜I 4远离包被膜5的一端的上面粘贴玻璃纤维膜II 3，在玻璃纤维膜II 3远离包被膜5的一端的上面粘贴样品垫2；在所述包被膜5的上面设有检测线I 7、检测线II 8和质控线9，所述检测线I 7和检测线II 8均包被抗禽流感病毒的抗体，质控线9包被抗鼠抗体。包被膜5为硝酸纤维素膜。

所述检测线I 7包被抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，检测线II 8包被抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体；抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体、抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体及抗鼠抗体分别固定于包被膜5上并呈三条线平行排列，形成所述的检测线I 7、检测线II 8和质控线9。通过检测线I 7、检测线II 8和质控线9的显色来进行定性。

本实用新型所述试纸条采用三条带显色的胶体金层析法制备，显带颜色为红色线条，具体制备工艺如下：

（1）胶体金溶液的制备：将双蒸水置磁力搅拌器上搅拌加热至沸腾，按终浓度为万分之二的量迅速加入浓度为1%的氯金酸溶液，煮沸5分钟；再按所加入氯金酸溶液1.8倍的体积量加入浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，煮沸10分钟后，冷却至室温，用双蒸水定容至氯金酸终浓度为万分之二，常温避光保存备用。

（2）金标抗体玻璃纤维膜I 4的制备：用5M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7.5，按30μg抗体/毫升胶体金溶液的比例浓度加入抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，混匀，静置5分钟；再按5%体积量加入浓度为10%的BSA溶液，混匀，静置5分钟；10000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤一次，离心后弃上清，沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，然后按每毫升溶液铺10平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜I 4上，真空干燥3小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

上述10%BSA溶液、标记洗涤液和金标抗体保存液的具体组分配比如下：

10%BSA溶液：每1000mL超纯水中含牛血清白蛋白100g。

标记洗涤液：每1000mL超纯水中含牛血清白蛋白4g，聚乙二醇8000 2g，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖2g，Tris 1.211g，并调节pH至8.1。

金标抗体保存液：每1000mL超纯水中含牛血清白蛋白25g，聚乙二醇8000 5g，Tris 10.2g，氢氧化钠2.5g，吐温-20 7.5mL，并调节pH至8.5。

（3）金标抗体玻璃纤维膜II 3的制备：用5M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7.5，按30μg抗体/毫升胶体金溶液的比例浓度加入抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体，混匀，静置5分钟；再按5%体积量加入浓度为10%的BSA溶液，混匀，静置5分钟；10000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤一次，离心后弃上清，沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，然后按每毫升溶液铺10平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜II 3上，真空干燥3小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

（4）硝酸纤维素包被膜5的制备：在硝酸纤维素膜上分别喷涂抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体、抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体及抗鼠IgG抗体，并呈三条线平行排列，分别形成所述的检测线I 7、检测线II 8和质控线9，37℃烘干处理2小时，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

检测线I：调试喷膜仪，喷液量为1μl/cm，用包被缓冲液稀释抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，浓度为2.5mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。

检测线II：调试喷膜仪，喷液量为1μl/cm，用包被缓冲液稀释抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体，浓度为2.5mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。

质控线：调试喷膜仪，喷液量为1μl/cm，用包被缓冲液稀释抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为2mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。

上述包被缓冲液的具体组分配比为：每1000mL超纯水中含牛血清白蛋白0.01g，十二水合磷酸氢二钠30.072g，磷酸二氢钾2.176g。

包被膜上所划三条线应细致均匀，相邻两线间隔0.4cm。

（5）大板组条

大板组条各组分规格（长×宽）：PVC底板1：30cm×7.6cm；样品垫2：30cm×3.0cm；金标记抗体玻璃纤维膜I 4：30cm×0.7cm；金标记抗体玻璃纤维膜II 3：30cm×0.7cm；硝酸纤维素包被膜5：30cm×2.0cm；吸水纸6：30cm×3.2cm。

各组分按如下方法进行组条：将硝酸纤维素包被膜5的底面粘贴在PVC底板1上，在该包被膜5两端的上面分别粘贴金标记抗体玻璃纤维膜I 4和吸水纸6，在该金标记抗体玻璃纤维膜I 4远离包被膜5的一端的上面粘贴金标记抗体玻璃纤维膜II 3（金标记抗体玻璃纤维膜II 3与金标抗体玻璃纤维膜I 4上下叠加在一起），在玻璃纤维膜II 3远离包被膜5的一端的上面粘贴样品垫2；即在PNC底板1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、金标记抗体玻璃纤维膜II 3 、金标记抗体玻璃纤维膜I 4、包被膜5和吸水纸6，组成大板。组装车间的湿度要控制在30%以下。

（6）切条

用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度为4毫米，随机抽检，灵敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“+”号，无非特异性条带。

（7）封袋与组盒

将1份已切好的试纸条、一包干燥剂和一根塑料滴管装在铝箔袋内，用封口机密封，密封完毕后放入试剂盒中，常温干燥保存。

本实用新型采用高纯度的抗H1亚型和H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体作为包被抗体进行特异的H1亚型和H5亚型禽流感病毒检测。其原理是：试纸条中含均匀分布的胶体金标记H1亚型和H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体，抗H1亚型和H5亚型禽流感病毒的抗体以及抗鼠IgG抗体分别固定在硝酸纤维素膜5上并呈三条平行线排列，抗鼠IgG在最上方为质控线9（阴性对照），抗H1亚型禽流感病毒抗体在最下方为检测线I 7，抗H5亚型禽流感病毒抗体在中间为检测线II 8。

当待检样品中仅含有H1亚型禽流感病毒时，H1亚型禽流感病毒与金标记的抗H1亚型禽流感病毒抗体结合形成抗原抗体免疫复合物，随样品从包被膜5上流过，包被膜5上的抗H1亚型禽流感病毒抗体与之结合，检测线I 7上形成红色带，检测结果为H1亚型禽流感病毒阳性（如图4所示）。当待检样品中仅含有H5亚型禽流感病毒时，H5亚型禽流感病毒与金标记的抗H5亚型禽流感病毒抗体结合形成抗原抗体免疫复合物，随样品从包被膜5上流过，包被膜5上的抗H5亚型禽流感病毒抗体与之结合，检测线II 8上形成红色带，检测结果为H5亚型禽流感病毒阳性（如图5所示）。当待检样品中同时含有H1亚型和H5亚型禽流感病毒时，H1亚型和H5亚型禽流感病毒分别与金标记的抗H1亚型和抗H5亚型禽流感病毒抗体相结合形成抗原抗体免疫复合物，随样品从包被膜5上流过，包被膜5上的抗H1亚型和抗H5亚型禽流感病毒抗体分别与之结合，检测线I 7和检测线II 8上均形成红色带，检测结果为H1亚型和H5亚型禽流感病毒均为阳性（如图3所示）。当待测样品中未含有H1亚型和H5亚型禽流感病毒时，金标记的抗H1亚型和抗H5亚型禽流感病毒抗体无法与包被膜5上的抗H1亚型和抗H5亚型禽流感病毒抗体结合，致使金标记的抗H1亚型和抗H5亚型禽流感病毒抗体无法在膜上滞留，检测区不能形成红色带（即检测线I 7和检测线II 8上均不显色），检测结果为阴性（如图6所示）。质控区如有红色带形成标志该试纸条的检测结果有效；否则，该试纸条的检测结果无效（如图7所示）。

本实用新型具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需要使用仪器设备，操作简单，能广泛地用于农户、基层以及个人对于H1亚型和H5亚型禽流感病毒的检测。

Claims

1.一种快速检测H1亚型和H5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于，试纸条包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜I、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜II、包被膜和吸水纸，其中，包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜I和吸水纸，在该玻璃纤维膜I远离包被膜的一端的上面粘贴玻璃纤维膜II，在玻璃纤维膜II远离包被膜的一端的上面粘贴样品垫；在所述包被膜的上面设有检测线I、检测线II和质控线，所述检测线I和检测线II均包被抗禽流感病毒的抗体，质控线包被抗鼠抗体。

2.如权利要求1所述快速检测H1亚型和H5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维膜I为涂覆胶体金颗粒标记抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜I，所述玻璃纤维膜II为涂覆胶体金颗粒标记抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜II。

3.如权利要求1所述快速检测H1亚型和H5亚型禽流感病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于，所述检测线I包被抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体，检测线II包被抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体；抗H1亚型禽流感病毒的单克隆抗体、抗H5亚型禽流感病毒的单克隆抗体及抗鼠抗体分别固定于包被膜上并呈三条线平行排列，形成所述的检测线I、检测线II和质控线。