CN104820095A - 一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡及制备方法,胶体金试纸条主要由支持板、NC膜、金标抗体垫、样品垫和吸收垫组成,所述的NC膜设置在支持板的中部,NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标鸡新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体垫,NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫,所述NC膜的中部有一条含有兔源新城疫病毒强毒株多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠IgG二抗的质控线。该试纸卡具有特异性强、灵敏度高、检测快速的优点,且不需要使用仪器设备,成本低廉,操作方便,能广泛应用于大型养鸡场及散养户对鸡新城疫病毒强毒株的诊断,为区分鸡新城疫病毒强毒株、弱毒株奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及畜禽病毒病检测、诊断领域,具体是涉及一种检测鸡新城疫病毒强毒株的胶体金试纸卡的制备方法和应用。
背景技术
新城疫是由新城疫病毒引起一种禽的急性、高度传染性疾病,主要侵害鸡和火鸡,亦可感染其他禽类、鸟类及人类,是世界公认的两大最重要的禽类传染病之一。近年来,新城疫的流行趋势发生了变化,以发病率低、临床症状不明显、死亡率低、蛋用鸡产蛋量下降为特征的非典型新城疫,使得新城疫的防治变得更加复杂和棘手,也为NDV的检测提出了更高的要求。随着新城疫弱毒疫苗的广泛应用,单纯对NDV检测已不能满足生产的需要。亟须建立一种快速区分NDV强毒株和弱毒株的检测技术,以便有针对性地采取相应的防治措施。因此,对NDV强弱毒株的诊断鉴定十分有必要。
胶体金免疫层析技术是结合胶体金技术和免疫层析技术而建立的一种快速免疫学检测技术,其优点是快速、简单、特异、灵敏、直观和成本低等,近年来逐渐广泛应用于兽医学领域。单克隆抗体用于NDV诊断,具有快速、灵敏和特异性强的优点,并可用于强毒和弱毒的鉴别诊断,这是传统的血清学方法所达不到的。
发明内容
本发明的目的是为解决上述技术问题的不足,提供一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡及其制备方法,可以临床快速检测新城疫病毒强毒株,用于区分新城疫病毒强毒株、弱毒株的临床诊断。
本发明为解决上述技术问题的不足,所采用的技术方案如下:
1、一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡,其特征在于:
所述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡包括胶体金试纸条和扣板式卡槽;扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔,且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区;胶体金试纸条主要由支持板、NC膜(硝酸纤维素膜)、金标单克隆抗体垫、样品垫和吸收垫组成;
所述的NC膜设置在支持板的中部,NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标单克隆抗体垫和样品垫,NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫;
所述NC膜的中部有一条含有新城疫病毒强毒株多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线;
胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内;卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区,加样孔对应胶体金试纸条的样品垫。
所述样品垫中金标单克隆抗体为鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体;所述NC膜中新城疫病毒强毒株抗体为兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体;所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
2、一种制备上述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)制备NC膜
兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体的制备:采用致病因子剔除、抗原表位保留的浓缩的新城疫病毒强毒株作为免疫原,提取IgG抗体,制备多克隆抗体;
检测线的制备:采用三维喷膜仪,调整喷液量为45~50dots/mL/cm,用包被缓冲液稀释兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体,浓度为56~60μg/mL,在NC膜中适当位置划线,即为检测线,晾干备用;所述的包被缓冲液为经过0.40~0.45uL滤膜过滤的0.05~0.07M、pH9.6的CBS缓冲液(碳酸盐缓冲液);
质控线的制备:采用三维喷膜仪,调整喷液量为45~48dots/mL/cm,用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体,浓度为1.6~1.8mg/mL,在NC膜上与检测线平行的位置划线,与检测线间隔4~5mm,即为质控线;
NC膜组装制备:晾干检测线和质控线,得到含有检测线和质控线的NC膜;用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干,封存备用;所述的封闭工作液为含质量百分比的2.5%BSA、2.5~3.0%脱脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS缓冲液混合后,用0.45~0.48μL滤膜过滤得到的封闭工作液。
(2)制备涂覆金标单克隆抗体垫
鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体的制备:以原核表达并纯化的新城疫病毒强毒株F蛋白进行小鼠免疫,ELSIA鉴定抗体效价及活性后,选取合适小鼠进行单克隆抗体的制备。用20mM含质量百分比为1.5%BSA和0.1%NaN3、3%四硼酸钠的稀释缓冲液(水溶液)将金标单克隆抗体稀释至终浓度0.05mg/ml;裁取规格为300×7mm的玻璃纤维棉,将金标单克隆抗体溶液用单向喷点仪,以5μL/cm的速度(大约20ng/条),均匀喷洒于玻璃纤维棉上,56℃干燥1h,加入干燥剂真空密封后,室温保存备用。
(3)组装新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡
将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部,在NC膜的一侧依次粘贴含有金标单克隆抗体的玻璃纤维棉和样品垫,在NC膜的另一侧粘贴吸收垫,得到试纸板,将试纸板切割成不同宽度的试纸条,将试纸条安放于卡槽中即为新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡。
(4)新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡使用及判定
新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡在诊断新城疫病毒强毒株中应用,用棉签采集病鸡眼、气管、肛门分泌物,在稀释液中反复挤压棉签让分泌物充分溶解。将所得的稀释液样本滴加在本试纸卡的样品垫中,在试纸卡的检测线、质控线位置均出现红色条带时,新城疫病毒强毒株检测为阳性;仅质控线出现一条红色条带时,为阴性结果;在试纸卡的质控线未出现红色条带时为无效结果。
进一步地,步骤(1)中检测线和质控线的线宽为1mm,两线相距4mm,位于膜的中间,距NC膜的边距6~7mm。
有益效果
本发明所述的胶体金试纸卡利用胶体金免疫层析技术,通过试纸卡中NC膜上分别喷涂含兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体的检测线和含羊抗鼠IgG抗体的质控线,能够临床检测新城疫病毒强毒株,为养殖企业提供一种临床诊断新城疫病毒强毒株的试纸卡,该试纸卡具有特异性强、灵敏度高、检测快速的优点,且不需要使用仪器设备,成本低廉,操作方便,能广泛应用于新城疫病毒强毒株的诊断,为区分新城疫病毒强毒株、弱毒株奠定了基础。
附图说明
图1是本发明的胶体金试纸卡的结构示意图;
图中:1、扣板式卡槽2、支持板,3、加样孔4、样品垫5、金标抗体垫6、NC膜7、观察区8、吸收垫
具体实施方式
实施例1
一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡,所述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡包括胶体金试纸条和扣板式卡槽;扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔,且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区;胶体金试纸条主要由支持板、NC膜(硝酸纤维素膜)、金标单克隆抗体垫、样品垫和吸收垫组成;
所述的NC膜设置在支持板的中部,NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标单克隆抗体垫和样品垫,NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫;
所述NC膜的中部有一条含有新城疫病毒强毒株多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线;
胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内;卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区,加样孔对应胶体金试纸条的样品垫。
所述样品垫中金标单克隆抗体为鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体;所述NC膜中新城疫病毒强毒株抗体为兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体;所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
实施例2
一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备NC膜
兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体的制备:采用致病因子剔除、抗原表位保留的浓缩的新城疫病毒强毒株作为免疫原,提取IgG抗体,制备多克隆抗体;
检测线的制备:采用三维喷膜仪,调整喷液量为45~50dots/mL/cm,用包被缓冲液稀释兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体,浓度为56~60μg/mL,在NC膜中适当位置划线,即为检测线,晾干备用;所述的包被缓冲液为经过0.40~0.45uL滤膜过滤的0.05~0.07M、pH9.6的CBS缓冲液(碳酸盐缓冲液);
质控线的制备:采用三维喷膜仪,调整喷液量为45~48dots/mL/cm,用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体,浓度为1.6~1.8mg/mL,在NC膜上与检测线平行的位置划线,与检测线间隔4~5mm,即为质控线;
NC膜组装制备:晾干检测线和质控线,得到含有检测线和质控线的NC膜;用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干,封存备用;所述的封闭工作液为含质量百分比的2.5%BSA、2.5~3.0%脱脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS缓冲液混合后,用0.45~0.48μL滤膜过滤得到的封闭工作液。
(2)制备涂覆金标单克隆抗体垫
鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体的制备后,用20mM含质量百分比为1.5%BSA和0.1%NaN3、3%四硼酸钠的稀释缓冲液将金标单克隆抗体稀释至终浓度0.05mg/ml;裁取规格为300×7mm的玻璃纤维棉,将金标单克隆抗体溶液用单向喷点仪,以5μL/cm的速度(大约20ng/条),均匀喷洒于玻璃纤维棉上,56℃干燥1h,加入干燥剂真空密封后,室温保存备用。
(3)组装新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡
将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部,在NC膜的一侧依次粘贴含有金标单克隆抗体的玻璃纤维棉和样品垫,在NC膜的另一侧粘贴吸收垫,得到试纸板,将试纸板切割成不同宽度的试纸条,将试纸条安放于卡槽中即为新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡。
实施例3
一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡的制备方法,包括以下步骤:
1、兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体的制备:采用致病因子剔除、抗原表位保留的浓缩的新城疫病毒强毒株作为免疫原,提取IgG抗体,制备多克隆抗体;
2、鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体的制备
利用生物学软件设计新城疫病毒强毒株F蛋白基因引物,原核表达新城疫病毒强毒株F蛋白并鉴定其生物活性。取小鼠脾脏淋巴细胞和用含10%犊牛血清的DMEM培养基培养的SP2/0细胞按10:1比例加聚乙二醇2000进行融合,将融合孔中的上清液用ELISA方法进行检测,确定阳性孔。将检测到的阳性孔中的杂交瘤细胞采用有限稀释法进行亚克隆,直至杂交瘤细胞上清液的阳性率达到100%,建立杂交瘤细胞系。将建系的杂交瘤细胞扩大培养,提取并浓缩上清液中的抗体,即得单克隆抗体。
3、NC膜制备
3.1检测线试剂的准备
将兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体从-80℃冰箱中取出,室温平衡20min,用灭菌生理盐水将其配制成1.3mg/ml,用0.22μm微孔滤膜过滤备用。
3.2质控线试剂的准备
购买商品化的羊抗鼠IgG二抗,-80℃冰箱保存。使用前用0.22μm微孔滤膜过滤。
3.3检测线和质控线的制备
将300×25mm的的NC膜,放于三维喷膜仪平台上,放上压条将其固定;将浓度为1.3mg/ml的兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体放于贮存池A,浓度为0.6mg/ml的羊抗鼠IgG二抗放于贮存池B;打开三维喷膜仪电源,启动机器,将兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体和羊抗鼠IgG二抗分别点射于膜上,约50dots/ml/cm,形成两条线,分别为检测线(T线)和质控线(C线),线宽约1mm,两线相距4mm,位于膜的中间,距膜的边距约7mm。室温自然干燥72h后,加入干燥剂密封,室温保存备用。
4制备金标单克隆抗体垫
4.1标记前处理:将待标鼠抗新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体溶液装入透析袋中,用生理盐水做透析液,在4℃数控层析冷柜中,磁力搅拌器搅拌透析48~72h,每间隔6h更换1次透析液,取出透析后的鼠抗新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体溶液,10000r/min离心20min,除去杂质,生理盐水调整浓度至1.3mg/ml,-20℃冻存备用。胶体金用0.1mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH至7.5,室温保存备用。
4.2胶体金标记鼠抗新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体
向100mL pH 7.5的胶体金溶液中缓慢地加入适量的鼠抗新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体溶液,混匀后,室温温育40min;缓慢加入10%BSA至其终浓度为1%(W/V),混匀后,室温孵育15min;12000r/min,4℃,离心25min,弃上清;沉淀用2%的BSA重悬,12000r/min,4℃离心25min,弃上清;沉淀用TB缓冲液调整金标抗体至0.2mg/mL,充分吹打后,4℃保存备用。
4.3制备涂覆金标抗体垫
用20mM含1.5%BSA、0.1%NaN3和3%四硼酸钠稀释缓冲液将金标抗体稀释至终浓度0.05mg/ml;裁取规格为300×7mm的玻璃纤维棉,将金标抗体溶液用单向喷点仪,以4.6ul/cm的速度(大约18ng/条),均匀喷洒于玻璃纤维棉上,56℃干燥1h,加入干燥剂真空密封后,RT保存备用。
5制备新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡
将含有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部,在NC膜的一侧依次粘贴含有金标抗体的玻璃纤维膜和样品垫,在NC膜的另一侧粘贴吸收垫,得到试纸板将组装的半成品试纸放入切割机槽内进行切割成4.08mm宽的试纸条,将每根试纸分别装入塑料试纸卡中,压壳机将壳封闭,制备成成品检测试纸卡,试纸卡装入避光的铝箔袋中,封口机封口,打上生产时间和批次,室温保存备用。
本试纸卡可用来检测鸡新城疫病毒强毒株,操作时用棉签采集病鸡眼、气管、肛门分泌物,在稀释液中反复挤压棉签让分泌物充分溶解。将所得的稀释液样本滴加在本试纸卡的载样垫1中,在试纸卡的检测线4、质控线5位置均出现红色条带时,鸡新城疫病毒强毒株检测为阳性;仅质控线5出现一条红色条带时,为阴性结果;在试纸卡的质控线未出现红色条带时为无效结果。该试纸卡具有特异性强、灵敏度高、检测快速的优点,且不需要使用仪器设备,成本低廉,操作方便,能广泛应用于鸡新城疫病毒强毒株的诊断,为区分鸡新城疫病毒强毒株、弱毒株奠定了基础。
Claims (3)
1.一种鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡,其特征在于:所述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡包括胶体金试纸条和扣板式卡槽;扣板式卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔,且扣板式卡槽上设置有观察区和加样区;胶体金试纸条主要由支持板、NC膜、金标单克隆抗体垫、样品垫和吸收垫组成;
所述的NC膜设置在支持板的中部,NC膜一侧的支持板上依次粘贴有含有金标单克隆抗体垫和样品垫,NC膜另一侧的支持板上粘贴有吸收垫;
所述NC膜的中部有一条含有新城疫病毒强毒株多克隆抗体的检测线和一条含有羊抗鼠二抗的质控线;
胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内;卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区,加样孔对应胶体金试纸条的样品垫。
所述样品垫中金标单克隆抗体为鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体;
所述NC膜中新城疫病毒强毒株抗体为兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体;所述NC膜中羊抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体。
2.如权利要求1所述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)制备NC膜
兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体的制备:采用致病因子剔除、抗原表位保留的浓缩的新城疫病毒强毒株作为免疫原,提取IgG抗体,制备兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体;
检测线的制备:采用三维喷膜仪,调整喷液量为45~50dots/mL/cm,用包被缓冲液稀释兔抗新城疫病毒强毒株多克隆抗体,浓度为56~60μg/mL,在NC膜中适当位置划线,即为检测线,晾干备用;所述的包被缓冲液为经过0.40~0.45uL滤膜过滤的0.05~0.07M、pH9.6的CBS缓冲液;
质控线的制备:采用三维喷膜仪,调整喷液量为45~48dots/mL/cm,用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG抗体,浓度为1.6~1.8mg/mL,在NC膜上与检测线平行的位置划线,与检测线间隔4~5mm,即为质控线;所述的包被缓冲液为经过0.40~0.45μl滤膜过滤的0.03M、pH9.4的CBS缓冲液;
NC膜组装制备:晾干检测线和质控线,得到含有检测线和质控线的NC膜;用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干,封存备用;所述的封闭工作液为含质量百分比的2.5%BSA、2.5~3.0%脱脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS缓冲液混合后,用0.45~0.48μL滤膜过滤得到的封闭工作液。
(2)制备涂覆金标单克隆抗体垫
鼠源新城疫病毒强毒株F蛋白单克隆抗体的制备后,用20mM含质量百分比为1.5%BSA、0.1%NaN3和3%四硼酸钠的稀释缓冲液将金标单克隆抗体稀释至终浓度0.05mg/ml;裁取规格为300×7mm的玻璃纤维棉,将金标单克隆抗体溶液用单向喷点仪,以5μL/cm的速度(大约20ng/条),均匀喷洒于玻璃纤维棉上,56℃干燥1h,加入干燥剂真空密封后,室温保存备用。
(3)组装新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡
将涂有检测线和质控线的NC膜粘贴在支持板的中部,在NC膜的一侧依次粘贴含有金标单克隆抗体的玻璃纤维棉和样品垫,在NC膜的另一侧粘贴吸收垫,得到试纸板,将试纸板切割成不同宽度的试纸条,将试纸条安放于卡槽中即为新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡。
(4)新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡使用及判定
新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡在诊断新城疫病毒强毒株中应用,用棉签采集病鸡眼、气管、肛门分泌物,在稀释液中反复挤压棉签让分泌物充分溶解;将所得的稀释液样本滴加在本试纸卡的样品垫中,在试纸卡的检测线、质控线位置均出现红色条带时,新城疫病毒强毒株检测为阳性;仅质控线出现一条红色条带时,为阴性结果;在试纸卡的质控线未出现红色条带时为无效结果。
3.如权利要求2所述的鸡新城疫病毒强毒株胶体金检测试纸卡的制备方法,其特征在于:步骤(1)中检测线和质控线的线宽为1mm,两线相距4mm,位于膜的中间,距NC膜的边距6~7mm。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150805 |