CN205246667U - 一种副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供一种副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，包括塑料基板、吸收垫、硝酸纤维素膜、胶体金垫和样本垫各层状结构，所述吸收垫固定在塑料基板的上端部，硝酸纤维素膜固定在吸收垫的下部、塑料基板的中间部分，其特征在于：硝酸纤维素膜分为质控区和检测区，质控区设有质控C线，检测区设有检测T1线、检测T2线，质控C线上包被羊抗鼠多抗，检测T1线上包被有副溶血弧菌抗体，检测T2线上包被有无乳链球菌抗体；所述样本垫包括样本垫M2、M3两层结构，本实用新型提供的副溶血弧菌--无乳链球菌联合快速检测试剂条样本垫为两层，提高了试剂条的层析速度，缩短反应时间，可一次操作实现副溶血弧菌—无乳链球菌两种细菌的快速检测。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种体外诊断类医疗器械，尤其涉及一种副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，属于生物工程技术领域。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，又称为肠炎弧菌，属于弧菌科，弧菌属，革兰氏阴性菌。副溶血弧菌常在海洋及河口环境生存，存在于鱼、虾、贝类等海水养殖动物的体表或肠道内，是海产动物的条件致病菌，主要引起鱼类败血症、对虾红腿病等海产动物疾病。除了感染海产动物外，副溶血弧菌也是一种常见的引起食源性疾病的病原菌。进食含有该菌的食物，如鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品可致食物中毒。近年来,全球所有已被确诊的腹泻性肠胃炎病例中,有50%-70%的感染者是由于食用未煮熟的海产品而导致的，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。目前,全球对水产品安全性越来越关注，及时的对副溶血弧菌进行鉴定，对实现生产预防和治疗由该菌引起的疾病都具有重要意义。
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)亦称为B组链球菌，为兼性厌氧革兰氏阳性的链状球菌，在自然界广泛存在,是人类的重要病原之一,也是鱼类的重要病原菌。无乳链球菌所引起的水产动物疾病通常在26℃以上水温发生,对水产动物感染性很强，可引起罗非鱼、虹鳟、海鲤和鲻鱼等鱼类败血症和脑膜炎，具有较高的致病率和致死率。近年来，由无乳链球菌引起的罗非鱼爆发性疾病时有发生，且爆发范围广，死亡率极高，常造成严重的经济损失，危害着水产养殖业的健康发展。
目前副溶血弧菌、无乳链球菌的检测方法主要有以下两种：
1、传统微生物学方法，采用微生物学分离、培养和生化试验等进行鉴定，耗时长，不利于临床快速诊断；操作过程繁杂，易出现交叉污染，造成结果的不准确；
2、分子生物学方法，该法较传统微生物学方法特异性更高、灵敏度强，但需要专业的操作人员及设备，成本较高、耗时较长。
发明内容
为了克服现有副溶血弧菌和无乳链球菌检测方法中只能进行单一成分检测，无法实现两种致病原菌的同时检测的不足，本发明提供了一种新型副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，该试剂条可通过一次试验检测副溶血弧菌、无乳链球菌两种病菌，且操作简单，普通人员阅读说明书后即可完成操作；不需要匹配专业的仪器设备；耗时短，20分钟内可完成检测；其检测特异性和灵敏度均高于传统微生物鉴别方法，结果准确。
为解决上述缺陷本实用新型提供的技术方案是：
一种副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，包括塑料基板、吸收垫、硝酸纤维素膜、胶体金垫和样本垫各层状结构，所述吸收垫固定在塑料基板的上端部，硝酸纤维素膜固定在吸收垫的下部、塑料基板的中间部分，其特征在于：硝酸纤维素膜分为质控区和检测区，在硝酸纤维素膜上质控区设有质控C线，检测区设有检测T1线、检测T2线，质控C线上包被羊抗鼠多抗，检测T1线上包被有副溶血弧菌抗体，检测T2线上包被有无乳链球菌抗体；所述样本垫包括样本垫M2、M3两层结构；胶体金垫固定在塑料基板的下端部、硝酸纤维素膜下部，与硝酸纤维素膜紧靠但不重叠；样本垫M2位于胶体金垫外层中下部，下端部长于胶体金垫至塑料基板下端；样本垫M3位于样本垫M2的外层，箭头指示胶下端位于样本垫M3外层、并且一直到达塑料基板最下端，其上端黏附于硝酸纤维素膜的下端。本实用新型提供的副溶血弧菌--无乳链球菌联合快速检测试剂条在硝酸纤维素膜上设有质控C线、检测T1线、检测T2线三条线，质控C线上包被羊抗鼠多抗，检测T1线上包被有副溶血弧菌抗体，检测T2线上包被有无乳链球菌抗体。
本实用新型提供的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条样本垫为两层，提高了试剂条的层析速度，缩短反应时间。
进一步的，本实用新型提供的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：样本垫M2上端与胶体金垫平齐，下端长于胶体金垫但略短于塑料基板下端，样本垫M3上端距离胶体金垫上端0.5-1cm，样本垫M3下端与塑料基板下端平齐。
进一步的，为了增强纤维素膜的性能，本实用新型提供的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜为高蛋白亲和性的高分子纤维素膜。
进一步的，为了增强胶体金垫的吸附能力，本实用新型提供的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述胶体金垫为无纺布。
进一步的，为了增强样本垫的吸水能力，本实用新型提供的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述样本垫为无纺布或玻璃纤维。
进一步的，为了增强吸收垫的吸收剩余样本的能力，本实用新型提供的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述吸收垫为高吸水性吸水纸。
进一步的，为了将本申请试剂条的各层状结构固定牢固，本实用新型提供的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述塑料基板、吸收垫、硝酸纤维素膜、胶体金垫和样本垫M2、M3各层状结构之间通过双面胶带固定。
本申请副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条由以下结构部分组成：
硝酸纤维素膜：高蛋白亲和性的高分子纤维素膜，经预处理后包被抗特异性副溶血弧菌抗体，制备为反应膜用来作为系统反应的载体和显示反应结果。
M2，M3：样本垫，选用有较强吸水能力的玻璃纤维、无纺布，经特殊处理后，为反应系统提供适合的反应条件，并帮助吸取样本。
胶体金垫：吸附力较强的无纺布，作为胶体金标记抗体的固相载体。
吸收垫：吸收检测后的样本。
塑料基板：作为反应体系的支撑物。
双面胶带：用于固定各反应膜和吸水材料于塑料基板上
箭头指示胶：固定和保护样本垫和胶体金垫
本实用新型通过将抗体喷于胶体金垫6上，包被于硝酸纤维素膜8上，通过增加样本垫层数，由传统的1层加厚为样本垫M2、M3两层，提高了样本的爬行速度和反应时间。
本申请的核心组件是硝酸纤维素膜和胶体金垫，为免疫反应发生的主要反映材料。
硝酸纤维素膜：使用高分子纤维膜作为固相载体。该高分子纤维膜具有很强的蛋白吸附功能，副溶血弧菌抗体、无乳链球菌抗体包被于膜并经干燥处理后即作为固相，可与液相中的相应抗原-胶体金标记抗体复合物快速结合。本发明将反应膜硝酸纤维素膜分为质控区和检测区。在质控区包被羊抗鼠IgG形成质控C线，在检测区分别包被副溶血弧菌抗体、无乳链球菌抗体形成反应检测线T1和检测线T2。
胶体金垫：使用无纺布作为固相载体，胶体金颗粒标记的副溶血弧菌单抗、无乳链球菌单抗溶液吸附在无纺布表面。胶体金标记，是蛋白质（抗体）大分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。吸附机理是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，属于物理吸附。胶体金标记抗体通过高度特异的抗原抗体反应（双抗体夹心法：抗体－抗原－抗体），实现对转基因产物的特异检测。在湿润状态下，液相中的抗原-胶体金标记抗体复合物可因“灯芯引流现象”作快速定向泳动并与固相膜上的特异抗体结合，形成特异的金标记抗体－抗原－抗体沉积线。
本实用新型的有益效果是，可一次操作实现副溶血弧菌--无乳链球菌两种细菌的快速检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明：
图1是本实用新型副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条示意图
图中标记为：1.质控C线，2-1.检测T1线，2-2.检测T2线，3.塑料基板，4.样本垫M2，5.样本垫M3，6.胶体金垫，7.箭头指示胶，8.硝酸纤维素膜，9.吸收垫。
具体实施方式
如图1所示，本实用新型包括塑料基板3、吸收垫9、硝酸纤维素膜8、胶体金垫6和样本垫4、5的层状结构，各结构由上到下，由左到右的具体装配如下所述：
所述吸收垫9，长度22mm，通过双面胶带固定在塑料基板3的上端部，与塑料基板3的上端对齐；硝酸纤维素膜8，长度18mm，通过双面胶带固定在吸收垫9的下部、塑料基板3的中间部分，硝酸纤维素膜8的上端与吸收垫9的下端相交1mm。
胶体金垫6，长度10mm，固定在塑料基板3的下端部、硝酸纤维素膜8下部，与硝酸纤维素膜8紧靠但不重叠。
样本垫包括样本垫M24、样本垫M35两层结构，可以提高样本的爬行速度和反应时间。
样本垫M24位于胶体金垫6外层中下部，下端部长于胶体金垫6。
优选的，样本垫M24上端与胶体金垫6平齐，其下端长于胶体金垫6但略短于塑料基板3下端。
样本垫M35位于样本垫M24的外层，样本垫M35上端距离胶体金垫6上端0.5-1cm，样本垫M35下端与塑料基板5下端平齐。
箭头指示胶7下部位于样本垫M35外层、一直到塑料基板的下端，其上部黏附于硝酸纤维素膜8的下端，箭头指示胶7用于将硝酸纤维素膜8与样本垫M35、胶体金垫6固定住。
在硝酸纤维素膜8上设有质控C线1、检测T1线2-1和检测T2线2-2，便于观察判定检测结果，质控C线上包被羊抗鼠多抗，检测T1线上包被有副溶血弧菌抗体，检测T2线上包被有无乳链球菌抗体。
在吸收垫9外层附有彩色标记胶带，其下端与硝酸纤维素膜上端外层相交1mm,另一端翻过塑料基板3上缘,贴于塑料基板被面，作为该检测试条的特征标识。
将组装成型的试剂条用全自动切条机切成3.5mm规格。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
1.副溶血弧菌单抗/无乳链球菌单抗的制备
小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml，1周后，将副溶血弧菌、无乳链球菌单抗杂交瘤细胞分别注射于以上预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1～3×106。10天后收获腹水，以上过程皆在无菌条件下完成。腹水经DEAE离子交换层析及SephacrylS300分子筛对单抗进行纯化；SDS－PAGE平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；测定各单抗效价（要求大于1：5000）。
2.羊抗DOAT高效价免疫抗血清的制备和纯化
1）纯化好的上述单抗＋完全佐剂→免疫山羊→加强免疫二次，每次间隔一月→第二次加强后10天左右取血→离心取血清→硫酸铵沉淀→DEAE离子交换层析纯化；
2）效价测定：ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1:256；
3）蛋白浓度测定：紫外分光法测定OD279，计算蛋白浓度。
3.胶体金及金标抗体制备
1）胶体金的制备：以柠檬酸盐还原法制备40－60nm的胶体金。将0.01%HauCl4加热至沸，加入一定量的1%柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O），继续加热煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由兰→紫→红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入0.02%NaN3。
2）将胶体金液500ml用0.1MNaOH调pH7-8,磁力搅拌下缓慢加入副溶血弧菌单抗、无乳链球菌单抗各2ml，搅拌20分钟。7000rpm离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗体沉淀，沉淀溶于10ml保存液中，用0.45μm微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4℃保存。
4.膜反应体系硝酸纤维素膜的制备
1）将副溶血弧菌单抗、无乳链球菌抗体及纯化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约0.2-2mg/ml。
2）纯化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，浓度为2.0mg/ml；
3）硝酸纤维素膜大小：10cm×27cm,每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；
4）将以上三种溶液分别加入Biodot点膜仪的三个喷头储存瓶中；
5）设置喷速为2μl/cm，NC膜的移行速度为50mm/s。以副溶血弧菌单抗（2mg/ml）在NC膜上包被反应检测线T1，以单无乳链球菌单抗（2mg/ml）在NC膜上包被反应检测线T2，以1.0mg/ml兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线T1、T2的距离为4－4.5mm；
6）完成包被后，置37℃干燥箱24小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液抽洗一次；
7）37℃干燥箱干燥备用；
8）切制备好的硝酸纤维素膜：1.8cm×27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置室温保存备用。
5.膜反应体系胶体金垫的制备
1）取胶体金-单抗复合物加稀释液，混匀配成工作浓度；
2）将溶液加入喷涂机Biodot的Airjet喷头储存瓶中；
3）设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s；
4）喷制规格为0.5-1.5cm×25cm/条，每条喷2遍；
5）于37℃烘干12小时，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。
使用时，将试剂条放入相应的塑料卡的固定卡槽中固定，试剂条的样本垫区域对应加样孔位置，试剂条质控C线1、检测T线2-1和2-2区域对应观察窗口位置，将样本滴入加样孔中，在毛细管作用下，向上层析，经过样本垫M24、样本垫M35两层样本垫。
样本中的特异性检测目标物与胶体金垫6中的金颗粒-特异性抗体复合物结合，形成金颗粒-抗体-特异性检测目标物复合物。
为了增强胶体金垫6的吸附能力，胶体金垫6材料优选采用吸附力较强的无纺布。
样本继续向上层析，通过箭头指示胶7，与预先包被在硝酸纤维素膜8上的抗副溶血弧菌特异性抗体结合，形成金颗粒-抗体-副溶血弧菌抗原-抗体复合物，金颗粒聚集在硝酸纤维素膜8检测区，形成检测T线2-1和2-2，继续向上层析，与预先包被在硝酸纤维素膜8上的多抗体结合，形成质控C线1，在配合使用的塑料卡的观察窗口中通过观察质控C线1、检测T线2-1和2-2显色，来判定检测结果。
剩余样本继续向上层析，被吸收垫9吸收。
为了增强吸收垫的吸收剩余样本的能力，吸收垫9材料优选采用高吸水性吸水纸材料。
以上所述实施例，对本实用新型的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本实用新型的具体实施例，并不用于限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，对本实用新型的修改或替换，均应在本实用新型的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，包括塑料基板（3）、吸收垫（9）、硝酸纤维素膜（8）、胶体金垫（6）和样本垫各层状结构，所述吸收垫（9）固定在塑料基板（3）的上端部，硝酸纤维素膜（8）固定在吸收垫（9）的下部、塑料基板（3）的中间部分，其特征在于：硝酸纤维素膜（8）分为质控区和检测区，质控区设有质控C线（1），检测区设有检测T1线（2-1）、检测T2线（2-2），质控C线（1）上包被羊抗鼠多抗，检测T1线（2-1）上包被有副溶血弧菌抗体，检测T2线（2-2）上包被有无乳链球菌抗体；所述样本垫包括样本垫M2、M3两层结构；胶体金垫（6）固定在塑料基板（3）的下端部、硝酸纤维素膜（8）下部，与硝酸纤维素膜（8）紧靠但不重叠；样本垫M2（4）位于胶体金垫（6）外层中下部，下端部长于胶体金垫（6）至塑料基板（3）下端；样本垫M3（5）位于样本垫M2（4）的外层，箭头指示胶（7）下端位于样本垫M3（5）外层、并且一直到达塑料基板（3）最下端，其上端黏附于硝酸纤维素膜（8）的下端。
2.根据权利要求1所述的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：样本垫M2（4）上端与胶体金垫（6）平齐，下端长于胶体金垫（6）但略短于塑料基板（3）下端，样本垫M3（5）上端距离胶体金垫（6）上端0.5-1cm，样本垫M3（5）下端与塑料基板（3）下端平齐。
3.根据权利要求1所述的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜（8）为高蛋白亲和性的高分子纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述胶体金垫（6）为无纺布。
5.根据权利要求1所述的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述样本垫为无纺布或玻璃纤维。
6.根据权利要求1所述的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述吸收垫（9）为高吸水性吸水纸。
7.根据权利要求1-6其中任一项权利要求所述的副溶血弧菌—无乳链球菌联合快速检测试剂条，其特征在于：所述塑料基板（3）、吸收垫（9）、硝酸纤维素膜（8）、胶体金垫（6）和样本垫M2、M3各层状结构之间通过双面胶带固定。
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| CN107356749A (zh) * | 2017-08-06 | 2017-11-17 | 潘金文 | 一种水产品中有害污染物免疫层析快速检测试剂盒 |
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