CN202599960U - 一种快速检测o型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的胶体金测试试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种快速检测O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的胶体金测试试纸条，包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜I、II及III、包被膜和吸水纸，其中包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜I和吸水纸，在该玻璃纤维膜I远离包被膜一端的上面粘贴玻璃纤维膜II，在玻璃纤维膜II远离包被膜一端的上面粘贴玻璃纤维膜III，在玻璃纤维膜III远离包被膜一端的上面粘贴样品垫；在包被膜上面设有检测线I、II、III和质控线，所述检测线I、II及III分别包被抗O型口蹄疫病毒、抗猪瘟病毒及抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体，质控线包被抗鼠抗体。该试纸条特异性好、灵敏度高、检测速度快。

Description

一种快速检测O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的胶体金测试试纸条

技术领域

本实用新型属于兽类疫病检测技术领域，具体涉及一种能同时对O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒进行检测的胶体金三联检测试纸条，可用于动物疫病流行病的检测与调查。

背景技术

口蹄疫、猪瘟和猪蓝耳病都是流行于兽类中的烈性传染病，严重威胁畜牧业的正常发展，养殖场的兽类一旦感染这些病毒，将造成严重的经济损失。

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种传染性疫病，对偶蹄动物，如猪、牛、羊，危害严重，是OIE法定报告的动物疫病，也是我国一类动物疫病。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。目前，有三分之二的 OIE 成员国流行 FMD，时刻威胁着无 FMD 国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。其最大颗粒直径为23纳米，最小颗粒直径为7—8纳米。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型c A、O、C、南非1、南非2、南非3 和亚洲1型，以及65个以上亚型。其中O型口蹄疫病毒为全世界流行最广的一个血清型。

猪瘟（classical swine fever，CSF）是对养猪业危害最为严重的疫病之一。在危害级别上，它是我国一类动物疫病，OIE法定报告的动物疫病；按照OIE以前的疫病分类方法，是OIE A类动物疫病。猪瘟是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性。1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲，中国大部分省都有发生。其主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。

猪蓝耳病，正式名称为猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是由猪蓝耳病病毒引起以妊娠母猪繁殖障碍及各种年龄猪，特别是仔猪的呼吸道疾病为特征的一种严重的传染性疫病。1987年，美国首次发现此病，由于当时难以确定病原，便称之为猪神秘病、猪不育及呼吸综合征。1990~1991年冬，西欧出现本病，蔓延迅速。在此期间，PRRS在各发达国家养猪场引发了空前的“流产风暴”，造成了巨大的经济损失。我国首先于1995年底在华北地区规模化猪场开始发现PRRS疫情。其后，数年间我国大部分养猪地区都有此病的发生和流行。PRRS现已遍布于全世界主要养猪国家和地区，已经成为威胁养猪业健康发展的主要疫病之一。

由此可见，O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒会对畜牧业造成严重的危害，这也间接导致了肉类市场供求关系混乱、肉类产品出口受阻、政府财政负担加重和公众恐慌，因此对兽类是否被O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒感染进行检测具有非常重大的意义。

目前，对O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的诊断方法主要有病原学检测、血清学试验诊断等方法。但病原学检测方法因其病毒分离时间长，要求条件高，分离率低等因素的影响，很难对样品进行大批量检测；而采集样品进行血清学试验，对仪器设备和操作人员有较高的要求，不易于在基层的推广。因此，上述两种方法在使用中受到很大的限制。

实用新型内容

本实用新型目的在于提供一种操作方便、快速、有效地检测O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的胶体金测试试纸条。

为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：

一种快速检测O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的胶体金测试试纸条，试纸条包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜I、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜II、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜III、包被膜和吸水纸，其中，包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜I和吸水纸，在该玻璃纤维膜I远离包被膜的一端的上面粘贴玻璃纤维膜II，在玻璃纤维膜II远离包被膜的一端的上面粘贴玻璃纤维膜III，在玻璃纤维膜III远离包被膜的一端的上面粘贴样品垫；在所述包被膜的上面设有检测线I、检测线II、检测线III和质控线，所述检测线I包被抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体，检测线II包被抗猪瘟病毒的单克隆抗体，检测线III包被抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体，质控线包被抗鼠抗体。所述玻璃纤维膜I为涂覆胶体金颗粒标记抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜I，所述玻璃纤维膜II为涂覆胶体金颗粒标记抗猪瘟病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜II，所述玻璃纤维膜III为涂覆胶体金颗粒标记抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜III。

具体的，抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体、抗猪瘟病毒的单克隆抗体、抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体及抗鼠抗体分别固定于包被膜上并呈四条线平行排列，形成所述的检测线I、检测线II、检测线III和质控线。

上述的O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒抗体均为高纯度的单克隆抗体，按照本领域的常规技术即可制得，故此处不再赘述。底板可以用PVC材料制成，包被膜可以是硝酸纤维素膜。

本实用新型采用双抗体夹心法检测抗原，通过对金标记抗体pH、浓度以及包被膜上包被抗体浓度的调整，使其能够产生特异条带，从而满足农户、基层及个人对于O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒检测的需求。

本实用新型在对一份样品进行检测时，能同时检测出该样品是否含有O型口蹄疫病毒和/或猪瘟病毒和/或猪蓝耳病病毒，其具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需要使用仪器设备，操作简单，能广泛地用于农户、基层以及个人对于O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测。

附图说明

图1为本实用新型的侧面结构示意图，图中，1为PVC底板；2为样品垫；3为金标记抗体玻璃纤维膜III；4为金标记抗体玻璃纤维膜II；5为金标记抗体玻璃纤维膜I；6为硝酸纤维素包被膜；7为吸水纸，下同；

图2为图1的俯视图示意图，图中，8为检测线I；9为检测线II；10为检测线III；11为质控线；

图3为本实用新型检测结果为O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒均阳性的示意图（即包被膜6表面的检测线I 8、检测线II 9、检测线III 10和质控线11均显色）；

图4为本实用新型检测结果为O型口蹄疫病毒阳性的示意图（即包被膜6表面的检测线I 8和质控线11显色而检测线II 9和检测线III 10不显色）；

图5为本实用新型检测结果为猪瘟病毒阳性的示意图（即包被膜6表面的检测线II 9和质控线11显色而检测线I 8和检测线III 10不显色）；

图6为本实用新型检测结果为猪蓝耳病病毒阳性的示意图（即包被膜6表面的检测线III 10和质控线11显色而检测线I 8和检测线II 9不显色）；

图7为本实用新型检测结果为O型口蹄疫病毒和猪瘟病毒阳性的示意图（即包被膜6表面的检测线I 8、检测线II 9和质控线11显色而检测线III 10不显色）；

图8为本实用新型检测结果为O型口蹄疫病毒和猪蓝耳病病毒阳性的示意图（即包被膜6表面的检测线I 8、检测线III 10和质控线11显色而检测线II 9不显色）；

图9为本实用新型检测结果为猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒阳性的示意图（即包被膜6表面的检测线II 9、检测线III 10和质控线11显色而检测线I 8不显色）；

图10为本实用新型检测结果为阴性的示意图（即包被膜6表面的质控线11显色而检测线I 8、检测线II 9和检测线III 10均不显色）；

图11为试纸条无效的示意图（即包被膜6表面的检测线I 8、检测线II 9、检测线III 10和质控线11均不显色）。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型做进一步详细说明，但本实用新型的保护范围不限于此。

如图1和图2所示，一种快速检测O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的胶体金测试试纸条，试纸条包括PVC底板1、样品垫2、涂覆（每毫升金标记抗体溶液涂覆10平方厘米的玻璃纤维素膜）胶体金颗粒标记（金标）抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜I 5、涂覆（每毫升金标记抗体溶液涂覆10平方厘米的玻璃纤维素膜）胶体金颗粒标记（金标）抗猪瘟病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜II 4、涂覆（每毫升金标记抗体溶液涂覆10平方厘米的玻璃纤维素膜）胶体金颗粒标记（金标）抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜III 3、包被膜6和吸水纸7，其中，包被膜6的底面粘贴在PVC底板1上面，在该包被膜6两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜I 5和吸水纸7，在该玻璃纤维膜I 5远离包被膜6的一端的上面粘贴玻璃纤维膜II 4，在玻璃纤维膜II 4远离包被膜6的一端的上面粘贴玻璃纤维膜III 3，在玻璃纤维膜III 3远离包被膜6的一端的上面粘贴样品垫2；在所述包被膜6的上面设有检测线I 8、检测线II 9、检测线III 10和质控线11，所述检测线I 8包被抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体，检测线II 9包被抗猪瘟病毒的单克隆抗体，检测线III 10包被抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体，质控线11包被抗鼠抗体。包被膜6为硝酸纤维素膜。

所述检测线I 8包被抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体，检测线II 9包被抗猪瘟病毒的单克隆抗体，检测线III 10包被抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体；抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体、抗猪瘟病毒的单克隆抗体、抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体及抗鼠抗体分别固定于包被膜6上并呈四条线平行排列，形成所述的检测线I 8、检测线II 9、检测线III 10和质控线11。通过检测线I 8、检测线II 9、检测线III 10和质控线11的显色来进行定性。

本实用新型所述试纸条采用四条带显色的胶体金层析法制备，显带颜色为红色线条，具体制备工艺如下：

（1）胶体金溶液的制备：将双蒸水置磁力搅拌器上搅拌加热至沸腾，按终浓度为万分之二的量迅速加入浓度为1%的氯金酸溶液，煮沸5分钟；再按所加入氯金酸溶液1.8倍的体积量加入浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，煮沸10分钟后，冷却至室温，用双蒸水定容至氯金酸终浓度为万分之二，常温避光保存备用。

（2）金标抗体玻璃纤维膜I 5的制备：用5M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7.5，按25μg抗体/毫升胶体金溶液的比例浓度加入抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体，混匀，静置5分钟；再按5%体积量加入浓度为10%的BSA溶液，混匀，静置5分钟；10000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤一次，离心后弃上清，沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，然后按每毫升溶液铺10平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜I 5上，真空干燥3小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

上述10%BSA溶液、标记洗涤液和金标抗体保存液的具体组分配比如下：

10%BSA溶液：每1000mL双蒸水中含牛血清白蛋白100g。

标记洗涤液：每1000mL双蒸水中含牛血清白蛋白4g，2g聚乙二醇8000，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖2g，Tris 1.211g，并调节pH至8.1。

金标抗体保存液：每1000mL双蒸水中含牛血清白蛋白25g，5g聚乙二醇8000，Tris 10.2g，氢氧化钠2.5g，7.5mL吐温-20，并调节pH至8.5。

（3）金标抗体玻璃纤维膜II 4的制备：用5M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7.5，按25μg抗体/毫升胶体金溶液的比例浓度加入抗猪瘟病毒的单克隆抗体，混匀，静置5分钟；再按5%体积量加入浓度为10%的BSA溶液，混匀，静置5分钟；10000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤一次，离心后弃上清，沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，然后按每毫升溶液铺10平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜II 4上，真空干燥3小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

（4）金标抗体玻璃纤维膜III 3的制备：用5M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7.5，按25μg抗体/毫升胶体金溶液的比例浓度加入抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体，混匀，静置5分钟；再按5%体积量加入浓度为10%的BSA溶液，混匀，静置5分钟；10000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤一次，离心后弃上清，沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标抗体保存液溶解，然后按每毫升溶液铺10平方厘米的量涂覆在玻璃纤维膜III 3上，真空干燥3小时后，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

（5）硝酸纤维素包被膜6的制备：在硝酸纤维素膜上分别喷涂抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体、抗猪瘟病毒的单克隆抗体、抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体及抗鼠IgG抗体，并呈四条线平行排列，分别形成所述的检测线I 8、检测线II 9、检测线III 10和质控线11，37℃烘干处理2小时，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。

检测线I 8：调试喷膜仪，喷液量为1μl/cm，用包被缓冲液稀释抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体，浓度为2.0mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。

检测线II 9：调试喷膜仪，喷液量为1μl/cm，用包被缓冲液稀释抗猪瘟病毒的单克隆抗体，浓度为2.0mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。

检测线III 10：调试喷膜仪，喷液量为1μl/cm，用包被缓冲液稀释抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体，浓度为2.0mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。

质控线11：调试喷膜仪，喷液量为1μl/cm，用包被缓冲液稀释抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为2mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。

上述包被缓冲液的具体组分配比为：每1000mL双蒸水中含牛血清白蛋白0.01g，十二水合磷酸氢二钠30.072g，磷酸二氢钾2.176g。

包被膜上所划四条线应细致均匀，相邻两线间隔0.3cm。

（6）大板组条

大板组条各组分规格（长×宽）：PVC底板1：30cm×7.6cm；样品垫2：30cm×3.0cm；金标记抗体玻璃纤维膜I 5：30cm×0.7cm；金标记抗体玻璃纤维膜II 4：30cm×0.7cm；金标记抗体玻璃纤维膜III 3：30cm×0.7cm；硝酸纤维素包被膜6：30cm×2.0cm；吸水纸7：30cm×3.2cm。

各组分按如下方法进行组条：将硝酸纤维素包被膜6的底面粘贴在PVC底板1上，在该包被膜6两端的上面分别粘贴金标记抗体玻璃纤维膜I 5和吸水纸7，在该金标记抗体玻璃纤维膜I 5远离包被膜6的一端的上面粘贴金标记抗体玻璃纤维膜II 4，在金标记抗体玻璃纤维膜II 4远离包被膜6的一端的上面粘贴金标记抗体玻璃纤维膜III 3，在金标记抗体玻璃纤维膜III 3远离包被膜6的一端的上面粘贴样品垫2；即在PVC底板1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、金标记抗体玻璃纤维膜III 3 、金标记抗体玻璃纤维膜II 4、金标记抗体玻璃纤维膜I 5、包被膜6和吸水纸7，组成大板。组装车间的湿度要控制在30%以下。

（7）切条

用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度为4毫米，随机抽检，灵敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“+”号，无非特异性条带。

（8）封袋与组盒

将1份已切好的试纸条、一包干燥剂和一根塑料滴管装在铝箔袋内，用封口机密封，密封完毕后放入试剂盒中，常温干燥保存。

本实用新型采用高纯度的抗O型口蹄疫病毒、抗猪瘟病毒和抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体作为包被抗体进行特异的O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒检测。其原理是：试纸条中含均匀分布的胶体金标记抗O型口蹄疫病毒、抗猪瘟病毒和抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体，抗O型口蹄疫病毒、抗猪瘟病毒和抗猪蓝耳病病毒的抗体以及抗鼠IgG抗体分别固定在硝酸纤维素膜6上并呈四条平行线排列，抗鼠IgG在最上方为质控线11（阴性对照），抗猪蓝耳病病毒抗体在第二条为检测线III 10，抗猪瘟病毒抗体在第三条为检测线II 9，抗O型口蹄疫病毒抗体在最下方为检测线I 8。

当待检样品中仅含有O型口蹄疫病毒时，O型口蹄疫病毒与金标记的抗O型口蹄疫病毒抗体结合形成抗原抗体免疫复合物，随样品从包被膜6上流过，包被膜6上的抗O型口蹄疫病毒抗体与之结合，检测线I 8上形成红色带，检测结果为O型口蹄疫病毒阳性（如图4所示）。当待检样品中仅含有猪瘟病毒时，猪瘟病毒与金标记的抗猪瘟病毒抗体结合形成抗原抗体免疫复合物，随样品从包被膜6上流过，包被膜6上的抗猪瘟病毒抗体与之结合，检测线II 9上形成红色带，检测结果为猪瘟病毒阳性（如图5所示）。当待检样品中仅含有猪蓝耳病病毒时，猪蓝耳病病毒与金标记的抗猪蓝耳病病毒抗体结合形成抗原抗体免疫复合物，随样品从包被膜6上流过，包被膜6上的抗猪蓝耳病病毒抗体与之结合，检测线III 10上形成红色带，检测结果为猪蓝耳病病毒阳性（如图6所示）。当待检样品中含其中任意两种病毒时，其在包被膜6上相对应的检测区形成红色带，其他检测区不能形成红色带，检测结果为其对应的病毒阳性（如图7、图8、图9所示）。当待检样品中同时含有O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒时，O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒分别与金标记的抗O型口蹄疫病毒抗体、抗猪瘟病毒抗体和抗猪蓝耳病病毒抗体相结合形成抗原抗体免疫复合物，随样品从包被膜6上流过，包被膜6上的抗O型口蹄疫病毒抗体、抗猪瘟病毒抗体和抗猪蓝耳病病毒抗体分别与之结合，检测线I 8、检测线II 9和检测线III 10上均形成红色带，检测结果为O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒均为阳性（如图3所示）。当待测样品中未含有O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒时，金标记的抗O型口蹄疫病毒抗体、抗猪瘟病毒抗体和抗猪蓝耳病病毒抗体无法与包被膜6上的抗O型口蹄疫病毒抗体、抗猪瘟病毒抗体和抗猪蓝耳病病毒抗体结合，致使金标记的抗O型口蹄疫病毒抗体、抗猪瘟病毒抗体和抗猪蓝耳病病毒抗体无法在膜上滞留，检测区不能形成红色带（即检测线I 8、检测线II 9和检测线III 10上均不显色），检测结果为阴性（如图10所示）。质控区如有红色带形成标志该试纸条的检测结果有效；否则，该试纸条的检测结果无效（如图11所示）。

本实用新型具有特异性好、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需要使用仪器设备，操作简单，能广泛地用于农户、基层以及个人对于O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测。

Claims (2)

1.一种快速检测O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于，试纸条包括底板、样品垫、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜I、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜II、涂覆胶体金颗粒标记抗体的玻璃纤维膜III、包被膜和吸水纸，其中，包被膜的底面粘贴在底板上面，在该包被膜两端的上面分别粘贴玻璃纤维膜I和吸水纸，在该玻璃纤维膜I远离包被膜的一端的上面粘贴玻璃纤维膜II，在玻璃纤维膜II远离包被膜的一端的上面粘贴玻璃纤维膜III，在玻璃纤维膜III远离包被膜的一端的上面粘贴样品垫；在所述包被膜的上面设有检测线I、检测线II、检测线III和质控线，所述检测线I包被抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体，检测线II包被抗猪瘟病毒的单克隆抗体，检测线III包被抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体，质控线包被抗鼠抗体；所述玻璃纤维膜I为涂覆胶体金颗粒标记抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜I，所述玻璃纤维膜II为涂覆胶体金颗粒标记抗猪瘟病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜II，所述玻璃纤维膜III为涂覆胶体金颗粒标记抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体的玻璃纤维膜III。

2.如权利要求1所述快速检测O型口蹄疫病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的胶体金测试试纸条，其特征在于，抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体、抗猪瘟病毒的单克隆抗体、抗猪蓝耳病病毒的单克隆抗体及抗鼠抗体分别固定于包被膜上并呈四条线平行排列，形成所述的检测线I、检测线II、检测线III和质控线。

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