CN203101397U

CN203101397U - 猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN203101397U
Application number: CN 201320091005
Authority: CN
Inventors: 赵林萍; 曾小宇; 张如民; 任宝红; 李丹; 孙强; 苗银萍; 王鹏; 李慧英; 王集美; 鲁龙; 孙帅岭; 魏卓; 王思敏; 杨阳; 岳峥
Original assignee: ZHENGZHOU ZHONGDAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Henan Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention; Zhengzhou Zhongdao Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2023-02-27

Abstract

本实用新型涉及一种猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体，其中，所述盒体内设有抗原包被反应板、猪瘟抗体阳性对照血清、猪蓝耳病抗体阳性对照血清、猪伪狂犬病抗体阳性对照血清、猪瘟抗体阴性对照血清、猪蓝耳病抗体阴性对照血清、猪伪狂犬病抗体阴性对照血清、20×浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。该试剂盒能同时批量检测出待检样品是否含有猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体，具有灵敏度高、特异性好、快速检测大批量样品等优点。

Description

猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的ELISA检测试剂盒

技术领域

本实用新型属于兽类疫病检测技术领域，具体涉及一种能同时对猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体进行批量检测的ELISA检测试剂盒，可用于动物疫病流行病的检测与调查。

背景技术

猪瘟、猪蓝耳病和猪伪狂犬病都是流行于兽类中的烈性传染病，严重威胁畜牧业的正常发展，养殖场的兽类一旦感染这些病毒，将造成严重的经济损失。

猪瘟（classical swine fever，CSF）是对养猪业危害最为严重的疫病之一。在危害级别上，它是我国一类动物疫病，OIE法定报告的动物疫病。猪瘟是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性。1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲，中国大部分省都有发生。其主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病，消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。

猪蓝耳病是由猪蓝耳病病毒引起以妊娠母猪繁殖障碍及各种年龄猪，特别是仔猪的呼吸道疾病为特征的一种严重的传染性疫病，PRRS现已遍布于全世界主要养猪国家和地区，已经成为威胁养猪业健康发展的主要疫病之一。

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的一种猪类传染性病。猪发生伪狂犬病后，其临诊症状因日龄而异，成年猪一般呈隐性感染，怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊胎和种猪不育等综合症侯群。15日龄以内的仔猪发病死亡率可达100%，断奶仔猪发病率可达40%，死亡率20%左右。伪狂犬病的发生具有一定的季节性，多发生在寒冷的季节，但其他季节也有发生。

由此可见，猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒和伪狂犬病毒的侵入会对畜牧业造成严重的危害，这也间接导致了肉类市场供求关系混乱、肉类产品出口受阻、政府财政负担加重和公众恐慌，因此，使用猪瘟、猪蓝耳病、猪伪狂犬病的相关疫苗进行免疫注射，并对免疫效果进行在线监测以确定其是否产生相应的抗体保护水平具有非常重大的意义。

实用新型内容

本实用新型目的在于提供一种同时、批量、有效地检测猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的ELISA检测试剂盒。

为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：

一种猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体，其中，所述盒体内设有抗原包被反应板、猪瘟抗体阳性对照血清、猪蓝耳病抗体阳性对照血清、猪伪狂犬病抗体阳性对照血清、猪瘟抗体阴性对照血清、猪蓝耳病抗体阴性对照血清、猪伪狂犬病抗体阴性对照血清、20×浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。

具体的，所述抗原包被反应板的规格为96孔（96T），从左至右被均分为检测区I、检测区II和检测区III三个区域，每个区域有32T；所述检测区I包被猪瘟病毒蛋白抗原，检测区II包被猪蓝耳病病毒蛋白抗原，检测区III包被猪伪狂犬病病毒蛋白抗原。

所述的酶标结合物为酶标记的抗猪IgG。

上述的猪瘟病毒蛋白抗原、猪蓝耳病病毒蛋白抗原和猪伪狂犬病病毒蛋白抗原均为高纯度的原核表达蛋白，可按照本领域常规技术制备或购买市售产品均可。盒体内可分为抗原包被反应板和试剂反应体系两部分；抗原包被反应板可以用PS材质的酶标板制成，试剂反应体系的包装瓶可以是聚丙烯瓶。

本实用新型采用酶联免疫间接法，将猪瘟病毒蛋白抗原、猪蓝耳病病毒蛋白抗原、猪伪狂犬病病毒蛋白抗原分别包被到包被反应板的三个检测区域内，所包抗原可分别与待检样品中的特异性抗体反应，形成抗原-抗体复合物被吸附到固相包被反应板上，再加入酶标结合物（酶标记的抗猪IgG），形成固相病毒抗原-病毒抗体-抗猪抗体-HRP免疫复合物。如果待检样品中含有相应的抗体，加入显色剂后即为酶催化显色，为阳性，反之为阴性。

本实用新型所述试剂盒通过对包被反应板的抗原包被浓度和酶标记结合物浓度的调整，使其能够产生特异性显色，从而进行猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的检测。该试剂盒能同时对猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体进行批量检测，具有灵敏度高、特异性好、快速检测大批量样品等优点，可用于动物疫病流行病的检测与调查。

附图说明

图1为本实用新型所述试剂盒的横切面剖视图，即盒体内设置的组成及位置示意图；图中，1为抗原包被反应板；5为1mL猪瘟抗体阳性对照血清；6为1mL猪蓝耳病抗体阳性对照血清；7为1mL猪伪狂犬病抗体阳性对照血清；8为1mL猪瘟抗体阴性对照血清；9为1mL猪蓝耳病抗体阴性对照血清；10为1mL猪伪狂犬病抗体阴性对照血清；11为50mL 20×浓缩洗涤液；12为11mL样品稀释液；13为11mL酶标结合物；14为6mL显色剂A；15为6mL显色剂B；16为6mL终止液；17为盒体；

图2为图1中的抗原包被反应板的结构示意图，图中，1为抗原包被反应板；2为检测区I；3为检测区II；4为检测区III。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型做进一步详细说明，但本实用新型的保护范围不限于此。

如图1和2所示，一种猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体17，其中，所述盒体17内设有抗原包被反应板1、猪瘟抗体阳性对照血清5、猪蓝耳病抗体阳性对照血清6、猪伪狂犬病抗体阳性对照血清7、猪瘟抗体阴性对照血清8、猪蓝耳病抗体阴性对照血清9、猪伪狂犬病抗体阴性对照血清10、20×浓缩洗涤液11、样品稀释液12、酶标结合物13、显色剂A 14、显色剂B 15和终止液16。所述抗原包被反应板1的规格为96T，从左至右被均分为检测区I 2、检测区II 3和检测区III 4三个区域，每个区域有32T；所述检测区I 2包被猪瘟病毒蛋白抗原，检测区II 3包被猪蓝耳病病毒蛋白抗原，检测区III 4包被猪伪狂犬病病毒蛋白抗原。抗原包被反应板1为PS材质的酶标板。

本实用新型所述试剂盒采用酶联免疫间接法制备，具体制备工艺如下：

（1）抗原包被反应板1的制备：将96T酶标板从左至右均分为检测区I 2、检测区II 3和检测区III 4共三个检测区（见图2）。其中，用抗原稀释液稀释猪瘟病毒蛋白抗原使其终浓度为2μg/mL，按100μL/孔包被检测区I 2；用抗原稀释液稀释猪蓝耳病病毒蛋白抗原使其终浓度为1.2μg/mL，按100μL/孔包被检测区II 3；用抗原稀释液稀释猪伪狂犬病毒蛋白抗原使其终浓度为1.5μg/mL，按100μL/孔包被检测区III 4；然后用封板膜封板2―8℃过夜。次日，洗板1次，按150μL/孔加入封闭液，37℃封闭2h；然后吸出孔内液体，置37℃烘箱中烤干，最后用铝箔袋热封装袋保存。上述抗原稀释液、封闭液的具体组分配比如下：

A 抗原稀释液：每1000mL纯化水中含碳酸钠1.70g和碳酸氢钠2.86g。

B 封闭液：每1000mL纯化水中含牛血清白蛋白6g、蔗糖40g、胰蛋白胨10g和proclin300 1mL。

（2）猪瘟抗体阳性对照血清5的制备：将猪瘟抗体阳性血清0.5mL加入到浓度0.01mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液中，最终定容至100mL，然后按1mL/瓶的规格进行分装。

（3）猪蓝耳病抗体阳性对照血清6的制备：将猪蓝耳病抗体阳性血清0.5mL加入到浓度0.01mol/L、pH 7.2的PBS缓冲液中，最终定容至100mL，然后按1mL/瓶的规格进行分装。

（4）猪伪狂犬病抗体阳性对照血清7的制备：将猪伪狂犬病抗体阳性血清0.5mL加入到浓度0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液中，最终定容至100mL，然后按1mL/瓶的规格进行分装。

（5）猪瘟抗体阴性对照血清8的制备：将猪瘟抗体阴性血清1mL加入到浓度0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液中，最终定容至100mL，然后按1mL/瓶的规格进行分装。

（6）猪蓝耳病抗体阴性对照血清9的制备：将猪蓝耳病抗体阴性血清1mL加入到浓度0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液中，最终定容至100mL，然后按1mL/瓶的规格进行分装。

（7）猪伪狂犬病抗体阴性对照血清10的制备：将猪伪狂犬病抗体阴性血清1mL加入到浓度0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲液中，最终定容至100mL，然后按1mL/瓶的规格进行分装。

（8）20×浓缩洗涤液11的制备：将4g磷酸二氢钾、58g十二水磷酸氢二钠、160g氯化钠、10mL吐温-20和1mL Proclin 300加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按50mL/瓶的规格进行分装。

（9）样品稀释液12的制备：将1.28磷酸二氢钠g、0.41g磷酸氢二钠、20.09g氯化钠、1mL吐温-20、50mL新生牛血清、0.2g指示剂、1mL曲拉通X-100和1mL Proclin 300加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按11mL/瓶的规格进行分装。

（10）酶标结合物13的制备：将2.42g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、0.8g酶稳定剂、100mL新生牛血清、1.5mL曲拉通X-100、8.5g氯化钠、1mL Proclin 300、1g红色染料、1.65mL浓盐酸和0.5mL HRP-抗猪IgG抗体加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按11mL/瓶的规格进行分装。

（11）显色剂A 14的制备：将柠檬酸2.10g，结晶乙酸钠12.25g，过氧化脲0.6g加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按6mL/瓶的规格进行分装。

（12）显色剂B 15的制备：将柠檬酸2.10g，EDTA 0.3g，TMB-HCl 0.6g加入到纯化水中，最终定容至1L，然后按6mL/瓶的规格进行分装。

（13）终止液16的制备：将浓硫酸108.5mL缓慢溶于纯化水中，定容至1000ml，然后按6mL/瓶的规格进行分装。

（14）组盒：每个试剂盒配备1块抗原包被反应板、1瓶猪瘟抗体阳性对照血清、1瓶猪瘟抗体阴性对照血清、1瓶猪蓝耳病抗体阳性对照血清、1瓶猪蓝耳病抗体阴性对照血清、1瓶猪伪狂犬病抗体阳性对照血清、1瓶猪伪狂犬病抗体阴性对照血清，1瓶20×浓缩洗涤液、样品稀释液1瓶，1瓶酶标结合物、1瓶显色剂A、1瓶显色剂B和1瓶终止液，组成一个试剂盒。

本实用新型采用高纯度的猪瘟病毒蛋白、猪蓝耳病病毒蛋白和猪伪狂犬病病毒蛋白作为包被抗原进行特异性的猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的检测。其原理是：将猪瘟病毒蛋白抗原、猪蓝耳病病毒蛋白抗原、猪伪狂犬病病毒蛋白抗原分别包被到抗原包被反应板1的检测区I 2、检测区II 3和检测区III 4中，所包抗原可分别与待检样品中的特异性抗体反应，形成抗原-抗体复合物被吸附到固相包被反应板上，再加入酶标记的抗猪IgG，形成固相病毒抗原-病毒抗体-抗猪抗体-HRP免疫复合物。如果待检样品中含有相应的抗体，加入显色剂后即为酶催化显色，为阳性；反之为阴性。

该试剂盒的使用说明，其具体操作步骤如下：

（1）配洗液：将50ml的20×浓缩洗涤液加纯化水稀释至1000ml，充分摇匀后备用。

（2）编号：每次试验应在抗原包被反应板的检测区I、检测区II和检测区III上分别设空白对照孔1孔，阴性对照孔2孔，阳性对照孔2孔，其余为待检样品孔。

（3）加样品稀释液：用加样器在抗原包被反应板的待检样品孔中加入样品稀释液，每孔100μl；空白对照孔、阴性对照孔及阳性对照孔不加样品稀释液。

（4）加样：分别于各待检样品孔加入待检样品10μl，检测区I上的阴性对照孔加入猪瘟抗体阴性对照血清100μl，阳性对照孔加入猪瘟抗体阳性对照血清100μl。检测区II上的阴性对照孔加入猪蓝耳病抗体阴性对照血清100μl，阳性对照孔加入猪蓝耳病抗体阳性对照血清100μl。检测区III上的阴性对照孔加入猪伪狂犬病抗体阴性对照血清100μl，阳性对照孔加入猪伪狂犬病抗体阳性对照血清100μl。空白对照孔不加样。

（5）温育（一）：充分混匀，贴上封板膜，37±2℃温育30分钟。

（6）洗板（一）：洗板机洗或手洗5次。

（7）加酶标结合物：除空白对照孔以外，各孔中加入酶标结合物100μl。

（8）温育（二）：贴上封板膜，37±2℃温育30分钟。

（9）洗板（二）：洗板机洗或手洗5次。

（10）加显色剂：每孔加入显色剂A 50μl，全部加完后再在每孔中加入显色剂B 50μl，混匀。

（11）温育（三）： 37±2℃显色10分钟。

（12）终止：显色完毕后立即于每孔加50μl终止液，混匀。

（13）测定：终止后应在10分钟内完成判读。对空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长处测定吸光值OD。或使用双波长测定吸光值，测定波长为450nm，参考波长可选630nm或655nm。

（14）结果判定：试剂盒阈值=0.1+阴性对照OD平均值。若阴性对照OD平均值≥0.05则按实际值计算；若阴性对照OD平均值＜0.05则按0.05计算。若待检样品OD值<试剂盒阈值，结果判为阴性；若待检样品OD值≥试剂盒阈值，结果判为阳性。按照各个检测区的阴性对照OD平均值分别计算出相对应的阈值，即可通过各个检测区待检样品孔的OD值与该检测区的阈值进行比较，判定各样品的结果。

本实用新型试剂盒能同时对猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体进行批量检测，具有灵敏度高、特异性好、快速检测大批量样品等优点，可用于动物疫病流行病的检测与调查。

Claims

1.一种猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的ELISA检测试剂盒，该试剂盒有一个盒体，其特征在于，所述盒体内设有抗原包被反应板、猪瘟抗体阳性对照血清、猪蓝耳病抗体阳性对照血清、猪伪狂犬病抗体阳性对照血清、猪瘟抗体阴性对照血清、猪蓝耳病抗体阴性对照血清、猪伪狂犬病抗体阴性对照血清、20×浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。

2.如权利要求1所述猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述抗原包被反应板的规格为96孔，从左至右被均分为检测区I、检测区II和检测区III三个区域，每个区域有32孔；所述检测区I包被猪瘟病毒蛋白抗原，检测区II包被猪蓝耳病病毒蛋白抗原，检测区III包被猪伪狂犬病病毒蛋白抗原。

3.如权利要求1所述猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病病毒抗体和猪伪狂犬病病毒抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标结合物为酶标记的抗猪IgG。