CN103777010B - 猪流行性腹泻病毒elisa检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒及其制备方法。所述猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒包括：酶标板、检测抗体和酶标二抗，其中所述酶标板上包被有抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体，所述检测抗体为抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，所述酶标二抗为酶标记且抗检测抗体的抗体。所述猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒以腹泻猪的呕吐物和粪便中的PEDV为检测对象，能够及早发现PEDV感染猪，同时降低检测的操作难度。

Description

猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及猪流行性腹泻病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测试剂盒及其制备方法，特别涉及一种猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
猪病毒性腹泻的病原包括猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）和猪轮状病毒（Porcinerotavirus，PRV），其中PEDV在我国呈现爆发趋势。猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea，PED）是由PEDV引起的一种高致死率、急性、高度传播性的肠道疾病，该病以急性肠炎、呕吐、伴有脱水的水样腹泻为主要特征，各年龄猪均易感，尤其是哺育仔猪，发病率为100%，死亡率为80%-100%。近几年来，由猪流行性腹泻引起的爆发性疾病日渐增多，在2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后爆发了由流行性腹泻病毒引起的腹泻，该次发病流行范围广，流行时间长，死亡率高，给各地养殖户均带来重大的经济损失。
目前猪流行性腹泻疾病尚缺乏有效的针对性的根治手段，主要靠预防监控和隔离处理。在检测猪流行腹泻病毒方面目前主要通过病毒分离培养、间接免疫荧光、原位杂交以及聚合酶链式反应（PCR）等。这些方法都存在不同程度的耗时时间长、所需仪器昂贵等缺点，不便于普遍开展监测工作。目前基于免疫吸附原理的检测试剂盒由于具有方便快捷、操作简单和所需仪器简单的特点越来越受到研究者重视。现有的商品化检测试剂盒（我国尚无商品化检测试剂盒）以及相关专利均是以抽血检测抗体为共同特点，这种检测一方面存在从病原侵袭到抗体产生的滞后性，另一方面抽血也在一定程度上存在复发感染和传染的可能性，同时会对猪产生一定的应急，也会增加一定程度上的操作难度。另外，目前较多猪场均有针对性地进行灭活苗的免疫措施，这也会导致体内抗体的检测并不能说明是免疫后产生的抗体还是因为感染病毒后产生的抗体。
流行性腹泻病毒存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结，主要随呕吐物和粪便排出体内，因此本领域需要一种针对流行性腹泻猪的呕吐物和粪便中的PEDV病原进行检测的试剂盒产生，以能够方便的从呕吐物和粪便中检测到PEDV，以便及早发现PEDV感染猪，同时降低检测的操作难度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒及其制备方法，该ELISA检测试剂盒以腹泻猪的呕吐物和粪便中的PEDV病原为检测对象，特异性卵黄多克隆抗体提高检测灵敏度，能够及早发现PEDV感染猪，避免PEDV抗体检测试剂盒的假阳性现象，同时降低检测的操作难度。
本发明提供以下技术方案：
在第一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，包括：酶标板、检测抗体和酶标二抗，其中所述酶标板上包被有抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体，所述检测抗体为抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，所述酶标二抗为酶标记且抗检测抗体的抗体。
本发明的ELISA检测试剂盒包括酶标板、检测抗体和酶标二抗，酶标板上包被有抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体用于特异性捕获腹泻猪的呕吐物和粪便中的PEDV；检测抗体为抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，用于与被捕获的PEDV结合，并提供酶标二抗的结合位点；酶标二抗为酶标记且抗检测抗体的抗体，用于与检测抗体结合，并通过酶促发光显示信号。
作为ELISA检测试剂盒，酶标板、检测抗体和酶标二抗是其核心成分，只要有这三种成分就能实现基本的抗原-抗体结合反应。至于辅助成分，比如样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照，可以与上述三种成分配套组装在一个ELISA检测试剂盒中，也可以单独提供，因此本发明中ELISA检测试剂盒可以包括这些辅助成分，也可以不包括，本发明优选包括这些辅助成分，以方便使用。
本发明中，检测抗体可以是来源于各种哺乳动物的抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，比如来源于兔、鼠、羊、马或驴的抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，优选鼠抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体。
本发明中制备多克隆抗体的方法，是目前比较成熟的技术，具体地，可以用纯化的病毒或者重组表达的病毒蛋白免疫动物，分离血清或卵黄，并通过沉淀离心、层析等方法从血清或卵黄中提取抗体。本发明中的特异性卵黄抗体是将PEDV病原免疫蛋鸡后通过硫酸铵沉淀法和亲和层析方法得到。
本发明中，在亲和层析柱上偶联的猪流行性腹泻病毒蛋白有多种，包括但不限于M蛋白、N蛋白和S1蛋白，本发明优选S1蛋白。因此，本发明的酶标板上包被的抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体是利用偶联了猪流行性腹泻病毒的S1蛋白的亲和层析柱纯化得到的特异性抗体。
本发明中，对酶标二抗不作特别限定，具体根据所使用的检测抗体的来源确定。当检测抗体来源于鼠时，酶标二抗可以是羊抗鼠抗体、兔抗鼠抗体或马抗鼠抗体等；当检测抗体来源于兔时，可以是鼠抗兔抗体或羊抗兔抗体等。本发明优选酶标记的羊抗鼠抗体。
本发明中，所述酶标二抗中的标记酶可以是本领域常用的各种标记酶，比如：辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP），本发明优选采用辣根过氧化物酶标记酶标二抗。
本发明中，所述ELISA检测试剂盒还可以包括：样品稀释液，用于稀释猪呕吐物或粪便等样品。本发明的样品稀释液可以是各种适宜的缓冲液，比如Tris-Cl缓冲液、磷酸盐缓冲液、氨基酸缓冲液或硼酸盐缓冲液等，也可以是生理盐水，但是优选pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液。
本发明中，所述ELISA检测试剂盒还可以包括：洗涤液，用于样品与酶标板反应后的清洗及检测抗体反应后的清洗，也用于酶标二抗反应后的清洗。本发明的洗涤液可以是添加各种表面活性剂的适宜的缓冲液，比如添加Tween-20、NP-40或Brij-35等的磷酸盐缓冲液，本发明优选含0.05%（v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液。
本发明中，所述ELISA检测试剂盒还可以包括：酶底物溶液，用于提供酶标二抗的反应底物。当标记酶为辣根过氧化物酶时，酶底物溶液可以包含邻苯二胺（o-Phenylenediamine，OPD）或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB），优选3,3’,5,5’-四甲基联苯胺；当标记酶为碱性磷酸酶时，酶底物溶液可以包含对硝基酚磷酸二钠（p-NitrophenylPhosphateDisodium，pNPP）。
本发明中，所述ELISA检测试剂盒还可以包括：终止液，用于终止反应。本发明中，所述终止液优选为硫酸溶液。
本发明中，所述ELISA检测试剂盒还可以包括：阳性对照和阴性对照；其中，所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪流行性腹泻病毒的溶液；所述阴性对照为牛血清白蛋白溶液。
在第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒的方法，包括：
（1）用猪流行性腹泻病毒免疫蛋鸡后提取抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体；
（2）用所述特异性卵黄抗体包被空白酶标板，得到包被的酶标板；
（3）将所述包被的酶标板与检测抗体和酶标二抗组合成ELISA检测试剂盒；
任选地，还包括将样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照组合到ELISA检测试剂盒中。
本发明中，所述步骤（1）具体包括：
（1a）培养并纯化猪流行性腹泻病毒；
（1b）用所述猪流行性腹泻病毒免疫蛋鸡；
（1c）分离蛋黄，然后通过硫酸铵沉淀法粗提抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体；
（1d）通过猪流行性腹泻病毒蛋白偶联的亲和层析柱亲和层析纯化得到抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体。
优选地，所述猪流行性腹泻病毒蛋白选自M蛋白、N蛋白和S1蛋白，更优选S1蛋白。
本发明的有益效果为：本发明的ELISA检测试剂盒以猪流行性腹泻病毒抗原作为检测对象，采用猪的呕吐物和粪便作为检测样本，相比检测血清中的抗体的方法，其操作简单；并且由于抗原出现早于抗体，因此能够及早发现PEDV感染猪。此外，本发明采用抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体包被酶标板用于捕获PEDV，通过亲和层析分离得到的特异性卵黄抗体作为包被抗体有利于避免PEDV以外蛋白在酶标板结合，从而避免了酶标二抗与一些杂蛋白的结合，减少假阳性发生率，提高最终检测结果的特异性；检测抗体采用鼠抗PEDV的多克隆抗体，通过HRP标记的羊抗鼠酶标二抗来进一步增加反应的灵敏度，同时降低检测抗体的用量和成本。
附图说明
图1为PEDV病毒免疫蛋鸡并提取抗PEDV特异性卵黄抗体的工艺流程图。
图2为纯化的抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体的SDS-PAGE电泳检测结果图。
图3为使用PEDV检测试剂盒检测样本的操作方法流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1：PEDV病毒免疫蛋鸡后提取抗PEDV特异性卵黄抗体
按照图1所示的流程制备抗PEDV特异性卵黄抗体：
（1）PEDV培养及纯化：商购的非洲绿猴肾（vero）细胞用含10%新生牛血清的DMEM生长液（PH值为7.2）于37℃培养，待细胞培养48h铺满培养瓶后，轻轻倒掉上清，用不含血清的DMEM维持液洗细胞3次，接种1/50体积的PEDV病毒（PEDVCV777株（由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心惠赠）），吸附细胞1h，再补加10mL无新生牛血清（FBS）、无胰酶的维持液，将细胞培养瓶置于37℃，含5%CO2孵箱中继续培养。待80％以上细胞出现病变时，-20℃至37℃反复冻融三次，3000rpm离心15min，取上清，然后再8000rpm高速离心30分钟后取上清。27000rpm超速离心2h，将沉淀用少量STE溶液（0.1MNaCl，10mMTris-Cl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0））溶解。在超速离心管中加入5-8mL的超速离心所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30%、45%、60%的蔗糖，27000rpm离心2.5h，用长针头将30%与45%以及45%与60%之间的明亮带吸取至离心管中，用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后27000rpm离心3h，去上清，用少量PBS（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，-20℃保存备用。
（2）免疫蛋鸡：测定纯化后PEDV的浓度，用PBS将纯化后的PEDV的浓度调整至0.01～0.1mg/mL，将调整后的病毒液与佐剂按照1:1比例相混合后免疫蛋鸡，蛋鸡品种为白莱杭鸡，免疫程序见表1：
表1蛋鸡免疫程序
（3）卵黄抗体的初步分离：分离蛋清和蛋黄，将卵黄液与醋酸-醋酸钠缓冲液按1：10混合，4℃静置过夜，至分层明显时，10000rpm离心20min，取上清液备用。取上清液80mL，缓慢加入饱和硫酸铵43mL至终浓度为35%，4℃静置至明显分层。将混合液10000g离心20min，去上清，沉淀用30mLPBS溶解。缓慢加入饱和硫酸铵16.2mL至终浓度为35%，4℃静置至明显分层。10000g离心20min，取1mL上清，沉淀用4mLPBS溶解。
（4）抗PEDV特异性卵黄抗体的免疫亲和层析：将10mg流行性腹泻病毒的重组表达S1蛋白（购自北京索莱宝科技有限公司）与GE公司的偶联亲和层析介质（CNBr-activatedSepharose4FF货号：17061805）相结合后进行亲和层析纯化。最后用洗脱液洗下挂在柱上的抗PEDV特异性卵黄抗体，经离心后用PBS重悬抗体沉淀得到抗PEDV特异性卵黄抗体液。通过SDS-PAGE电泳检测获取的抗PEDV特异性卵黄抗体，结果如图2所示。
实施例2：PEDV检测试剂盒组装
包被酶标板：将抗PEDV特异性卵黄抗体稀释至浓度为5μg/mL，取100μL稀释的特异性卵黄抗体液包被96孔酶标板，4℃包被过夜。次日取出后以PBST洗板3次，每次3min。以PBST溶液配制的1%BSA作为封闭液，每孔加入封闭液100μL，37℃封闭1h。封闭结束后用PBST洗板3次，每次3min。装入96孔酶标板专用包装袋，用封口机封口后4℃保存。
检测抗体（PEDV多克隆抗体）：PEDV多克隆抗体抗体和酶标二抗可通过技术服务外包获得或商购，也可通过本领域常规方法制备，制备已知抗原的抗体的方法是本领域公知的；本发明中使用的鼠抗PEDV多克隆抗体和羊抗鼠酶标二抗均购自北京索莱宝科技有限公司。
酶标二抗：羊抗鼠酶标二抗，商品化产品，可购买。
试剂盒其它溶液配制：
①样品稀释液pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)；
②包被液（pH9.6的碳酸盐缓冲液）：Na2CO31.59g，NaHCO32.39g定容至1000mL；
③洗涤液（25×PBST）：NaCl100.0g，KCl0.2g，MgCl2·6H2O2.5g，KH2PO45.0g，Na2HPO428.5g，Tween-2012.5mL，硫柳汞2.5g，用蒸馏水定容至1000mL，加入0.02%叠氮钠作为防腐剂，除菌过滤后分装；
④封闭液（1%BSA）：1.0g牛血清白蛋白溶于100mL洗涤液；
⑤酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液：i)底物A液（100×）：称取TMB100mg加入10mL二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得100×TMB底物浓缩液；ii)底物B液（100×）：称取乙酸钠1g溶于10mL纯化水，用乙酸调pH值为5.0，加入浓度为30％的H2O2400μL即得；
⑥终止液：取54.3mL浓度为95％浓硫酸加蒸馏水至1000mL即可；
⑦阳性对照：用PBS溶液将纯化后的PEDV病毒调整至浓度为2μg/mL，每毫升加入1000IU青霉素和链霉素，除菌过滤后粉状，作为阳性对照；
⑧阴性对照：称量适量BSA于PBS溶液中配置成浓度为2μg/mL，每毫升加入1000IU青霉素和链霉素，除菌过滤后粉状，作为阳性对照。
组建的PEDV检测试剂盒包括以下几个方面：96孔酶标板、检测抗体、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照、阴性对照及产品说明书。
本发明的检测试剂盒采用双抗体夹心法检测PEDV。本检测试剂盒包被抗体采用抗PEDV的特异性卵黄抗体作为包被抗体。卵黄抗体用来检测哺乳动物病原具有灵敏度高、价格便宜、具有动物福利保护的特点。通过亲和层析分离得到的特异性卵黄抗体作为包被抗体有利于避免PEDV以外蛋白在酶标板结合，从而避免了酶标二抗与一些杂蛋白的结合，减少假阳性发生率，提高最终检测结果的特异性。酶标二抗的应用虽然在一定程度上增加了整个检测时间，但由于酶标二抗的规模性商品化有利于降低酶标反应一抗（检测抗体）使用的成本，而且不使用酶标的反应一抗活性更高。在显色过程中通过两次多克隆抗体的级联效应，有利于信号的放大，进一步提高监测的灵敏度。整个检测试剂盒在体现多克隆抗体价格优势和灵敏度优势的同时，通过特异性多克隆卵黄抗体的包被保证了最终结果的精确度。
实施例3：使用PEDV检测试剂盒检测样本的操作方法
按照图3所示的方法进行操作：
（1）现场用一次性取样勺取新鲜的猪呕吐物或粪便装入无菌采样管中置于冰盒保存；
（2）称取待检呕吐物或粪便样品1g溶于10mL样品稀释液中，4℃3000rpm离心15分钟取上清；
（3）在抗原检测酶标板中加入上清100μL/孔，置37℃温育30分钟，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干；
（4）每孔加反应一抗100μL，置37℃温育30分钟，洗涤3次，方法同步骤（3）；
（5）每孔中加入酶标二抗100μL，置37℃温育30分钟，洗涤3次，方法同步骤（3）；
（6）每孔中加入加显色液A、显色液B各一滴50μL，混匀，室温避光显色10分钟，每孔加2M硫酸一滴50μL终止反应，15分钟内用酶标仪测定每孔OD630nm读值。
实施例4：PEDV检测试剂盒试验结果分析
（1）临界值及检测限确定
采用24份5%牛血清白蛋白溶液作为阴性样本，用建立的双抗体夹心ELISA方法检测在酶标仪上严格按照程序操作，记录检测结果，见表2。计算20次结果的均值与标准差SD。以空白均值加三倍标准差作为报告方法的检测限其OD490值中最小值为0.178，最大值为0.364，为标准差为0.256，SD为0.048，即当检测样本的OD490≥0.4时判为阳性。
表2阴性样本检测OD值
检测样本 OD值 检测样本 OD值 检测样本 OD值
1 0.212 9 0.21 17 0.287
2 0.228 10 0.198 18 0.321
3 0.275 11 0.206 19 0.318
4 0.309 12 0.178 20 0.296
5 0.288 13 0.185 21 0.276
6 0.279 14 0.212 22 0.241
7 0.247 15 0.269 23 0.235
8 0.364 16 0.283 24 0.238
将纯化后的浓度为100ng/mL的PEDV按照8个梯度进行稀释后分成10份进行ELISA检测（50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.12ng/mL、1.58ng/mL、0.79ng/mL和0.39ng/mL）。结果显示PEDVELISA检测结果8份最低检出量在0.79ng/mL，2份最低检测量在1.58ng/mL，证明本检测试剂盒具有较高灵敏度，其最底检测限在1.58ng/mL。
（2）交叉反应检测
将由深圳出入境动植物检验检疫中心提供的猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌K88、K99、987P、F18、F41以及猪流行性腹泻病毒的粗提样品，对其进行100倍稀释后使用该试剂盒作特异性检测。根据所检测得到的OD450比较待检样品P/N值的变化，确定所建立方法的特异性。检测结果表明猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌K88、K99、987P、F18、F41的检测OD450值均小于判断标准的0.4，且同时被检测抗原P/N值均小于2.1，而阳性对照组OD450值为2.568，P/N值为10.79（参见表3）。表明该检测试剂盒与其他腹泻病原均无交叉反应。
表3ELISA检测试剂盒交叉检验结果
待测抗原 OD450 P/N值
猪传染性胃肠炎病毒 0.292 1.21
猪轮状病毒 0.276 1.16
K88 0.248 1.04
K99 0.261 1.11
987P 0.239 1.05
F18 0.263 1.05
F41 0.241 1.01
猪流行性腹泻病毒 2.568 10.79
阴性对照 0.238 1.13
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (21)

1.一种猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，包括：酶标板、检测抗体和酶标二抗，其中所述酶标板上包被有抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体，所述检测抗体为抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体，所述酶标二抗为酶标记且抗检测抗体的抗体，
其中，所述包被有抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体是通过硫酸铵沉淀法粗提并利用偶联了猪流行性腹泻病毒的S1蛋白的亲和层析柱纯化得到的特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体为鼠抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为酶标记的羊抗鼠抗体。
4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗是用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的酶标二抗。
5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：样品稀释液。
6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：洗涤液。
8.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为Tween-20，其含量为0.05％(v/v)。
10.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：酶底物溶液。
11.根据权利要求10所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液包含邻苯二胺或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。
12.根据权利要求11所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。
13.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：终止液。
14.根据权利要求13所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液。
15.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：阳性对照和阴性对照。
16.根据权利要求15所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为包含灭活纯化后的猪流行性腹泻病毒的溶液。
17.根据权利要求15所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为牛血清白蛋白溶液。
18.一种制备如权利要求1-17任一项所述的猪流行性腹泻病毒ELISA检测试剂盒的方法，包括：
(1)用猪流行性腹泻病毒免疫蛋鸡后提取抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体；
(2)用所述特异性卵黄抗体包被空白酶标板，得到包被的酶标板；
(3)将所述包被的酶标板与检测抗体和酶标二抗组合成ELISA检测试剂盒；
任选地，还包括将样品稀释液、洗涤液、酶底物溶液、终止液、阳性对照和阴性对照组合到ELISA检测试剂盒中。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：
(1a)培养并纯化猪流行性腹泻病毒；
(1b)用所述猪流行性腹泻病毒免疫蛋鸡；
(1c)分离蛋黄，然后通过硫酸铵沉淀法粗提抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体；
(1d)通过猪流行性腹泻病毒蛋白偶联的亲和层析柱亲和层析纯化得到抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒蛋白选自M蛋白、N蛋白和S1蛋白。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒蛋白为S1蛋白。
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