CN101135686A - 检测诱骗受体3的双抗体夹心elisa方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测诱骗受体3的双抗体夹心ELISA方法。构建DcR3基因，表达纯化DcR3蛋白并进行鉴定，以高纯度的His－DcR3融合蛋白为免疫原，制备并纯化抗人DcR3多克隆抗体及单克隆抗体，以抗人DcR3多克隆抗体为捕获抗体，以生物素化的抗人DcR3单克隆抗体为检测抗体，建立检测DcR3多抗和单抗双抗体夹心ELISA方法，以抗DcR3多克隆抗体为捕获抗体可以捕获更多抗原，因此具有更好的灵敏度，为肿瘤及自身免疫疾病等DcR3相关疾病的诊断、疗效观察及预后判断提供一种简便、经济的检测方法，为研究DcR3蛋白功能及其在组织细胞表达分布等奠定基础。

Description

检测诱骗受体3的双抗体夹心ELISA方法

技术领域

本发明公开一种检测诱骗受体3的双抗体夹心ELISA方法，用于恶性肿瘤及自身免疫疾病等DcR3相关疾病的临床辅助诊断，属于生物基因工程及疾病检测诊断试剂方法技术领域。

背景技术

诱骗受体3(decoy receptor 3，DcR3，又称TR6)为近年新发现的一种可溶性肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，可与Fas、HVEM、DR3竞争性结合其相应配体FasL、LIGHT及TL1A(Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，etal.Genomic amplification ofa decoyreceptor for Fas ligand in lung and colon cancer[J].Nature，1998，396(6712)：699-703；Yu KY，Kwon B.Ni J，etal.A newly identified member of tumor necrosis factor receptor superfamily(TR6)suppresses LIGHT-mediated apoptosis[J].J Biol Chem，1999，274(20)：13733-13736；Migone TS，Zhang J，Luo X，TL1A is a TNF-like ligand for DR3 and TR6/DcR3 andfunctions as a T cell costimulator[J].Immunity.2002；16(3)：479-92)，但并不介导细胞凋亡，在细胞的生长、分化、死亡以及免疫调节等方面发挥重要作用，与肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥等密切相关。研究表明DcR3在恶性肿瘤如肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠腺癌、EBV相关淋巴瘤、神经胶质瘤组织以及自身免疫病如系统性红斑狼疮、矽肺、进行性系统性硬化病的外周血单个核细胞中存在高表达，而在正常组织不表达或低表达，因而，DcR3有望作为一种新的标志物用于恶性肿瘤和自身免疫病的临床辅助诊断。DcR3属分泌性蛋白，有研究表明肝癌、胃癌等血清中DcR3表达水平与肿块大小、分期及浸润、转移等相关，肿瘤切除治疗后，DcR3水平急剧下降，经过随访，发现与DcR3表达正常的胃癌患者相比，DcR3高表达的患者生存期明显缩短(Takahama Y，YamadaY，Emoto K，etal.The prognostic significance of overexpression of the decoyreceptor for Fas ligand(DcR3)in patients with gastric carcinomas[J]GastricCancer，2002，5(2)：61-68)，因此，术后检测血清DcR3水平有助于观察肿瘤是否切除完全或有无复发及预后判断。

发明内容

本发明公开一种检测诱骗受体3的双抗体夹心ELISA方法，用于恶性肿瘤及自身免疫疾病等DcR3相关疾病的临床辅助诊断。

本发明还提供了一种诱骗受体3基因的构建及蛋白制备工艺。

本发明还提供了一种检测诱骗受体3的单克隆和多克隆抗体的制备工艺，适用于工业化生产。

本发明的技术解决方案如下：

以纯化的多克隆抗体为捕捉抗体，以生物素化的单克隆抗体为检测抗体，建立检测可溶性DcR3含量的双抗体夹心ELISA法。

应用重叠PCR方法获得DcR3基因，构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21菌株，IPTG诱导表达His-DcR3融合蛋白，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE及Western blot分析表达产物。

构建DcR3基因，表达并纯化DcR3蛋白，以DcR3蛋白为抗原制备高效价和高特异性抗人DcR3单克隆抗体和多克隆抗体，并进行鉴定。以纯化的多克隆抗体为捕捉抗体，以生物素化的单克隆抗体为检测抗体，建立检测可溶性DcR3含量的双抗体夹心ELISA法，为肿瘤及自身免疫疾病等DcR3相关疾病的诊断、疗效观察及预后判断提供一种简便、经济的检测方法，为研究DcR3蛋白功能及其在组织细胞表达分布等奠定基础。

具体制备工艺包括以下步骤：

应用重叠PCR方法获得DcR3基因，构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21菌株，IPTG诱导表达His-DcR3融合蛋白，镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，SDS-PAGE及Western blot分析表达产物。采用纯化的His-DcR3融合蛋白免疫BALB/c鼠，共腹腔免疫四次，待小鼠血清抗体达理想效价时，取免疫的小鼠脾脏淋巴细胞和SP2/0骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行融合，以HAT培养基选择培养，间接ELISA法筛选阳性孔，将有限稀释法克隆后的杂交瘤细胞接种入小鼠腹腔产生腹水，收集的腹水经过预处理后采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法、ProteinA亲和层析法进行纯化，制备抗人DcR3单克隆抗体。SDS-PAGE、Western blot和间接ELISA法等鉴定单克隆抗体的纯度、特异性和效价等。同时，采用高纯度的His-DcR3融合蛋白免疫家兔，采集兔血清，制备并纯化抗人DcR3多克隆抗体，以该抗人DcR3多克隆抗体为捕获抗体，以生物素化的抗人DcR3单克隆抗体为检测抗体，建立检测DcR3含量的双抗体夹心ELISA方法。

本发明的积极效果在于：以高纯度的His-DcR3融合蛋白为免疫原，制备并纯化抗人DcR3多克隆抗体及单克隆抗体，以抗人DcR3多克隆抗体为捕获抗体，以生物素化的抗人DcR3单克隆抗体为检测抗体，建立多抗和单抗双抗体夹心ELISA方法，以兔抗DcR3多克隆抗体为捕获抗体可以捕获更多抗原，因此具有更好的灵敏度，为肿瘤及自身免疫疾病等DcR3相关疾病的诊断、疗效观察及预后判断提供一种简便、经济的检测方法，为研究DcR3蛋白功能及其在组织细胞表达分布等奠定基础。

附图说明

图1为重叠PCR方法构建的DcR3基因电泳图。

1为DcR3基因，2为DL2000 marker。

图2为pET-28a(+)/DcR3重组体酶切鉴定电泳图。

1为λ-HindIII DNA Marker，2为BamHI单酶切，3为BamHI和HindIII双酶切，4为DL2000 marker。

图3为纯化前后的His-DcR3融合蛋白电泳图。

1为蛋白低分子量marker，2为纯化前表达的全菌蛋白，3为纯化后的His-DcR3融合蛋白。

图4为纯化的His-DcR3融合蛋白特异性鉴定的Western blot分析图。

1纯化的His-DcR3融合蛋白，2为阴性对照，3为蛋白低分子量marker。

图5为多克隆抗体及1B1细胞株抗人DcR3单抗纯化后SDS-PAGE电泳分析图。

1为纯化后兔抗人DcR3多克隆抗体，2为纯化后1B1细胞株抗人DcR3单抗，3为蛋白低分子量marker。

图6为1B1细胞株抗人DcR3单抗特异性鉴定的Western blot分析图。

1为His-DcR3融合蛋白，2为诱导后的pET28a(+)空载体菌蛋白，3为蛋白低分子量marker。

图7为双抗体夹心ELISA的标准曲线。

横坐标为不同稀释度的标准品DcR3蛋白，纵坐标为相应的OD492nm值。

具体实施例

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

DcR3基因的构建、表达及纯化

1方法

1.1DcR3基因的构建

根据Genbank中所提供的人DcR3mRNA序列，去除N末端29个信号肽，设计合成下列8个引物片段，分别命名为P1-P8，由大连宝生物公司合成。

P1：ggatccatggcagaaacacccacctacccctggcgggacgcagagacaggggagcggctggtgtgcgcccagtgccccccaggcacctttgtgcagcggccgtgc

P2：ctccccgcagaggacgttgcagtagcggcagcgctccaggtagttccagaactgcgtgtagtggcgcggtggacacgggccacacgtcgtggggctgtctcggcggcacggccgctgcaca

P3：cgtcctctgcggggagcgtgaggaggaggcacgggcttgccacgccacccacaaccgtgcctgccgctgccgcaccggcttcttcgcgcacgctggtttctgcttggagcacgcatcgtgt

P4：ctgctctgagctggagctgctggctgagaaggtgcctggggggcacggctggcactgcgtgttctggctgggggtgcccggggcaatcacgccggcaccaggtggacacgatgcgtgctcc

P5：ctccagctcagagcagtgccagccccaccgcaactgcacggccctgggcctggccctcaatgtgccaggctcttcctcccatgacaccctgtgcaccagctgcactggcttccccctcagc

P6：ctcgagggcctgcagcagccgctgcagcctcttgatggagatgtcctggaaagccacaaagtccatgacggcacgctcacactcctcagctcctggtaccctggtgctgagggggaagcca

P7：gctgcaggccctcgaggccccggagggctggggtccgacaccaagggcgggccgcgcggccttgcagctgaagctgcgtcggcggctcacggagctcctgggggcgcaggacggggcgctg

P8：aagcttgtgcacagggaggaagcgctgacggacgctccgctccagcccgggcatcctggccacgcgcagcgcctgcagcagccgcaccagcagcgccccgtcctgc

在P1和P8的5’端分别引入BamH I和Hind III酶切位点，重叠PCR方法构建人DcR3基因。第一轮PCR反应将P1和P2、P3和P4、P5和P6、P7和P8配对，分别生成产物P1-2(210bp)、P3-4(226bp)、P5-6(226bp)、P7-8(211bp)；第二轮PCR反应将P1-2和P3-4、P5-6和P7-8配对，分别生成产物P1-4(420bp)、P5-8(421bp)；第三轮PCR反应将P1-4和P5-8连接生成产物P1-8(825bp)。PCR反应条件均为94℃预变性5min，94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃终止延伸5min。

1.2pET28a(+)/DcR3重组质粒的构建及鉴定

产物P1-8与原核表达载体pET28a(+)分别用Hind III和BamH I双酶切，凝胶回收的产物P1-8与载体按5∶1摩尔比混合后，在T₄DNA连接酶作用下16℃过夜连接，构建重组质粒。重组质粒转化E.coli BL21后，在含卡那霉素的LB平板上随机挑取20个菌落，少量扩菌，小量抽提质粒，BamH I或(及)Hind III酶切鉴定，阳性重组质粒送由大连宝生物进行测序。

1.3 DcR3蛋白的诱导表达

挑取转化有正确重组质粒的E.coli BL21表达菌单个菌落，接种于含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按1∶50比例转种于含卡那抗性的LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.4~0.6时，在不同终浓度IPTG(0.01、0.1、1、5、10mM/L)、不同温度(28℃、37℃)下诱导蛋白表达，行SDS-PAGE分析蛋白表达情况，摸索最佳诱导条件。

1.4 DcR3蛋白表达形式分析及纯化

离心收集诱导后的菌体，超声波裂解，离心收集沉淀，用2％脱氧胆酸钠、1M、3M尿素分别洗涤一次，沉淀重悬于8M尿素(含50mM/L β-巯基乙醇)，4℃搅拌过夜，变性蛋白取上清流经Ni²⁺亲合层析柱，通过不同pH值洗脱液洗脱目的蛋白，纯化产物透析复性。用SDS-PAGE和Western blot进行目的蛋白分析，采用Bradford法测定目的蛋白浓度。

1.5间接ELISA鉴定特异性

以纯化后的目的蛋白(5μg/ml)为固相包被酶标板，同时设立阴性对照和空白对照，各三复孔。1∶5000鼠抗人DcR3单克隆抗体为一抗，1∶10000HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，OPD为底物，测定492nm的OD值，以P/N≥2.1为阳性。

1.6 Western blot鉴定特异性

将纯化的DcR3蛋白与诱导后的pET28a(+)空载体蛋白SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，以鼠抗人DcR3单克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，通过ECL显色系统进行Western blot检测。

2结果

2.1 DcR3基因的构建

经过三轮PCR，最终生成825bp的PCR产物(含酶切位点)，与预期值相符(图1)。

2.2 pET-28a(+)/DcR3重组体的构建及酶切鉴定

通过亚克隆构建的重组质粒经BamHI单酶切，琼脂糖凝胶电泳可见大小为6182bp的单条带，经BamHI和HindIII双酶切后可见5369bp及813bp两条带，与预期相符。阳性重组质粒测序结果正确(图2)。

2.3 DcR3的原核表达的动力学分析

将通过亚克隆方法构建的pET-28a(+)/DcR3重组质粒转化入BL21感受态细胞中，尝试了不同终浓度IPTG(0.01、0.1、1、5、10mM)、不同温度(28℃和37℃)及不同时间段(0、1、2、3、4、5h)蛋白表达情况，结果显示诱导后在33KD左右较诱导前有明显蛋白表达带，28℃蛋白的表达量较37℃表达量增多，3h蛋白表达量达到高峰，再增加表达时间蛋白量无明显增多，而在不同终浓度的IPTG诱导下蛋白表达量无明显差异。

2.4目的蛋白的纯化及复性

28℃终浓度为0.01mM的IPTG诱导表达3h，凝胶薄层扫描显示目的蛋白表达量约占菌蛋白总量的38％。离心收集菌体，沉淀悬浮于裂解缓冲液中，经超声波破碎后，收集破菌的上清与沉淀进行SDS-PAGE，组分主要集中于超声破菌的沉淀中，说明为包涵体形式表达。包涵体经洗涤、8M尿素溶解、Ni²⁺亲合层析方法纯化后，SDS-PAGE电泳显示33KD左右有单一条带，与预期值相符，凝胶薄层扫描显示蛋白纯度达98％(图3)。

2.5间接ELISA特异性鉴定

纯化后的目的蛋白可与抗DcR3单克隆抗体特异性结合，三复孔P/N值分别为3.5，3.43，3.47，表明所纯化的蛋白为DcR3蛋白。

2.6 Western blot特异性鉴定

转印至PVDF膜上的DcR3融合蛋白与抗DcR3单克隆抗体在分子量约33kD处出现一特异条带，说明DcR3目的蛋白得以成功表达，表达的蛋白具有抗原性(图4)。

2.7间接ELISA效价测定

将兔多抗血清和初步纯化的多抗分别倍比稀释，纯化前多抗效价为1∶2560000，纯化后效价为1∶1280000，表明获得高效价的多克隆抗体，抗体浓度为9mg/ml。

实施例2

单克隆抗体的研制和鉴定

1方法

1.1动物免疫

纯化的His-DcR3融合蛋白免疫BALB/c鼠，初次免疫取100μl(约50μg)抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔注射，第14d取100μl(约50μg)加等量弗氏不完全佐剂加强免疫，以后每隔两周等量抗原不加佐剂腹腔免疫两次，测定小鼠血清抗体效价达1∶10⁶以上时准备融合，融合前三天取效价最高的小鼠腹腔注射抗原100μg。

1.2杂交瘤细胞株的建立及单克隆抗体的制备

1.2.1细胞融合

无菌条件下，取对数生长的SP2/0细胞，1000rpm离心8分钟，弃上清，用RPMI1640不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数。制备免疫小鼠脾细胞悬液，将SP2/0细胞与脾细胞按1∶5的比例混合，37℃水浴50％PEG4000作用下进行融合，融合后1000rpm离心8分钟，弃上清，用含有饲养细胞的HAT完全培养液轻轻混悬，接种在96孔细胞培养板中，置37℃、5％CO₂培养箱培养。第10天换HT选择培养基，第14天换含20％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基。

1.2.2筛选及克隆化

2-3周后当杂交瘤细胞长至孔底面积1/5以上时，分别包被His-DcR3融合蛋白与His蛋白，同时设立阴、阳性及空白对照，应用间接ELISA方法检测培养上清液。以P/N≥2.1为阳性，选取与His-DcR3融合蛋白反应阳性而与His蛋白反应阴性孔的细胞通过有限稀释法连续克隆2-3次，直至所有单个克隆细胞阳性孔率为100％时扩大培养，进行细胞冻存和腹水制备。

1.2.3腹水制备及纯化

每只BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡500μl，7天后每只鼠腹腔接种杂交瘤细胞5～7×10⁵个，14天左右采集腹水。二氧化硅吸附法对腹水进行预处理，采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法、ProteinA亲和层析进行纯化。SDS-PAGE分析纯度，紫外分光光度计测定纯化后单克隆抗体含量后，过滤除菌后分装，-70℃冻存。

1.3单克隆抗体的鉴定

1.3.1效价的测定

将纯化前后的单克隆抗体倍比稀释，以1∶200稀释的正常小鼠血清作为阴性对照，应用间接ELISA方法测定A492nm值，以P/N≥2.1为阳性，测定单抗效价。

1.3.2免疫球蛋白类和亚类的鉴定

按操作说明将杂交瘤上清1∶200稀释，取150ul稀释液加入含有亚类定性试剂的试管底部，30s后将试纸条插入管底，5-10min后观察结果，判读轻链、重链。

1.3.3杂交瘤细胞染色体核型分析

生长良好的杂交瘤细胞悬液10ml加入秋水仙素，使其终浓度为0.1μg/ml，继续培养3h，1000rpm离心10min，重蒸水室温低渗处理20min，离心弃上清，细胞固定后Gimsa染色，油镜下观察染色体计数。

1.3.4相对亲和力鉴定

采用非竞争ELISA方法确定单克隆抗体的亲和力。分别以不同浓度(1μg/μl、5μg/μ、10μg/μl)的纯化的DcR3融合蛋白为固相，纯化的单抗为起始浓度进行倍比稀释，根据OD值计算抗体亲和力的大小。

1.3.5 Western blot鉴定抗体特异性

将纯化的DcR3蛋白及pET-28a(+)空载体蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，以1∶5000稀释的小鼠腹水为一抗，以1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，通过ECL显色系统进行Western blot检测。

2结果

2.1杂交瘤细胞株的建立

HAT选择培养第三天可见融合的细胞克隆，融合率为93.0％(269/288)，阳性克隆率为85.0％(246/288)，经有限稀释法对阳性克隆进行2-3次克隆，共获得5株能稳定分泌特异性抗DcR3的McAb杂交瘤细胞株，分别命名为1A9、1B1、1F5、1G4及2H6。

2.2腹水单克隆抗体的纯化

腹水经proteinA层析柱纯化后，进行SDS-PAGE凝胶电泳扫描，鉴定其纯度为95％(图5)。相对分子质量为146kD(轻链为23kD，重链为50kD)。紫外分光光度计测定纯化蛋白的浓度为15mg/ml。

2.3单抗效价、亚类、染色体及亲和常数的鉴定

杂交瘤细胞株	效价	亚类	染色体条数	亲和力常数(M-1)
					1A9	1×105	IgG1 κ 链	102	5.11×109
1B1	1×107	IgG1 κ 链	102	9.62×1010
					1F5	1×104	IgG1 κ 链	104	1.62×108
1G4	1×104	IgG1 κ 链	104	5.62×109
					2H6	1×106	IgG1 κ 链	102	6.3×1010

2.4 Western blot鉴定

五株杂交瘤细胞株分泌的抗DcR3单克隆抗体均能与转印至PVDF膜上的DcR3融合蛋白在分子量约为33kD处形成单一的阳性染色带，并且与pET载体蛋白无交叉反应(图6)。

实施例3

DcR3多克隆抗体的制备

1方法

1.1动物免疫

取纯化后的His-DcR3蛋白500μl(约500μg)与等量弗氏完全佐剂混合，充分乳化后采用背部多点注射法免疫家兔。2周后取DcR3抗原加弗氏不完全佐剂同法加强免疫，免疫抗原量约200μg，以后每两周免疫一次，全程共免疫5次，末次免疫后7天于耳缘静脉取血，试血后颈动脉放血，收集血清，-20℃冻存。

1.2多克隆抗体的纯化及效价鉴定

采用饱和硫酸铵沉淀法及ProteinA亲和层析法进行兔血清的纯化。间接ELISA方法测定纯化前后血清效价、SDS-PAGE分析纯度，紫外分光光度计测定纯化后多克隆抗体含量，过滤除菌后分装，-70℃冻存。

2结果

兔血清经proteinA层析柱纯化后，进行SDS-PAGE凝胶电泳扫描，鉴定其纯度为90％(图5)。将兔多抗血清和初步纯化的多抗分别倍比稀释，纯化前多抗效价为1∶2560000，纯化后效价为1∶1280000，表明获得高效价的多克隆抗体，抗体浓度为9mg/ml。

实施例4

双抗体夹心ELISA方法的建立

1方法

1.1单克隆抗体生物素化

将生物素-羟醛琥酰亚胺酯(BNHS)用二甲基甲酰胺(DMF)配成1mg/ml溶液，纯化的单克隆抗体稀释成2mg/ml溶液，按BNHS：单抗为1∶8的体积比将两者混匀，反应2-4h后4℃透析过夜，透析结束后加入等体积甘油，小量分装，-20℃保存备用。

1.2 DcR3标准曲线的绘制

纯化的适当浓度(0.5ug/ml)稀释的多克隆抗体包被酶标板,100ul/孔，37℃包被3h；PBST洗涤3次，每次5min；3％的BSA溶液封闭，100ul/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次，每次5min；加入梯度稀释的标准品DcR3蛋白，100ul/孔，37℃孵育1h，同时设立阴性对照和空白对照；PBST洗涤3次，每次5min；加入适当稀释(1∶10000)的生物素化单克隆抗体，100ul/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次5min；加入1∶5000稀释的链酶亲和素-HRP，100ul/孔，37℃孵育20min，PBST洗涤3次，每次5min；加入OPD底物溶液，100ul/孔，避光反应10-20min；2M硫酸溶液终止反应，50ul/孔，酶标仪测定OD492nm值。以不同梯度稀释的标准品DcR3蛋白含量为横坐标，以相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程，并计算阴性对照的OD492nm值均数和标准差(S)，以均数+2S的OD492nm值在标准曲线上所对应的DcR3浓度为该法的最小检出量，即灵敏度。

1.3正常人和不同患者血清DcR3含量检测

5ug/ml纯化的DcR3多克隆抗体包被酶标板，100ul/孔，37℃包被3h；弃包被液，250ul/孔洗涤液，洗涤三次，每次5min；200ul/孔封闭液，37℃封闭2h；弃封闭液,250ul/孔洗涤液，洗涤三次，每次5min；加入待检血清，100ul/孔，37℃孵育1h，阴性对照为等体积抗体稀释液，空白对照不加DcR3；250ul/孔洗涤液，洗涤三次，每次5min；加入1∶10000稀释的生物素化的1B1 mAb,100ul/孔，37℃孵育lh；250ul/孔洗涤液，洗涤三次，每次5min；加1∶5000稀释的Avidin-HRP，37℃孵育20min；250ul/孔洗涤液，洗涤五次，每次5min；加入OPD底物缓冲液，100ul/孔，避光显色10-20min；加入50ul/孔2M硫酸终止反应，酶标仪测定OD 492nm值。

1.4统计学处理t检验

2结果

2.1 DcR3标准曲线的建立

将标准品DcR3蛋白倍比稀释成浓度0.15，0.3125，0.625，1.25，2.5，5.0，10ng/ml，采用双抗体夹心ELISA方法重复检测三次，结果表明，其具有良好线性关系的检测区间为0.3125-10ng/ml。计算阴性对照的OD492nm值均数和标准差(S)，以均数十2S的OD492nm值在标准曲线上所对应的DcR3浓度为该方法最小检出量，即灵敏度。标准曲线线性方程为y＝0.1899x+0.1506(R²＝0.9931)，阴性对照的OD值均数为0.145，标准差为0.011，均数十2S＝0.186，对照曲线得出最小检出量为86pg/ml(图7)。

2.2健康对照和不同患者血清DcR3含量检测的统计学处理

肺间质病和恶性肿瘤患者血清中DcR3含量明显高于正常人，差异具有统计学意义(p<0.01)。而肺间质病与恶性肿瘤患者比较，血清中DcR3含量差异无统计学意义(p>0.05)。

Claims (4)

1.一种检测诱骗受体3的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：

以纯化的多克隆抗体为捕捉抗体，以生物素化的单克隆抗体为检测抗体，建立检测可溶性DcR3含量的双抗体夹心ELISA法。

2.诱骗受体3基因的构建及蛋白制备工艺，其特征在于：

应用重叠PCR方法获得DcR3基因，构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21菌株，IPTG诱导表达His-DcR3融合蛋白，镍柱亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE及Western blot分析表达产物。

3.抗人诱骗受体3单克隆抗体的制备工艺，包括以下步骤：

采用纯化的His-DcR3融合蛋白免疫BALB/c鼠，共腹腔免疫四次，待小鼠血清抗体达理想效价时，取免疫的小鼠脾脏淋巴细胞和SP2/0骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行融合，以HAT培养基选择培养，间接ELISA法筛选阳性孔，将有限稀释法克隆后的杂交瘤细胞接种入小鼠腹腔产生腹水，收集的腹水经过预处理后采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法、ProteinA亲和层析法进行纯化，制备单克隆抗体。

4.抗人诱骗受体3多克隆抗体的制备工艺，其特征在于：

采用高纯度的His-DcR3融合蛋白免疫家兔，制备并纯化兔血清，制备多克隆抗体。

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