CN104531715A - 人降钙素原重组表达、单、多克隆抗体的制备及elisa检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人降钙素原重组表达、单、多克隆抗体的制备及ELISA检测方法，包括以下步骤：(1)引物合成；(2)目的基因的重组表达及鉴定；(3)抗体制备及鉴定。本发明通过设计4条引物应用PCR扩增特定PCT该片段，构建了真核酵母表达载体和原核大肠杆菌表达载体，诱导表达了两种重组PCT融合蛋白，成功获得了高特异性鼠抗人N-PCT单克隆抗体和兔抗人全长PCT多克隆抗体，尝试建立了ELISA检测方法。

Description

人降钙素原重组表达、单、多克隆抗体的制备及ELISA检测方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种人降钙素原重组表达、单、多克隆抗体的制备及ELISA检测方法。

背景技术

降钙素原(procalcitonin，PCT)是降钙素(calcitonin，CT)的前肽物质，是含116个氨基酸的糖蛋白。生理条件下，血中的降钙素原主要由甲状旁腺的C细胞合成。在胞内，PCT会被逐步水解成为CT、抗钙素(katacalcin)、N-端残基三部分被分泌出细胞外。故血清PCT的浓度极低，且无较大波动(＜50ng/L)，一般难以检测。在系统炎症反应综合症、浓毒血症、败血症等严重细菌感染疾病条件下，患者身体其他部位的多种细胞均能大量合成PCT，并以蛋白原的形式分泌至胞外，导致血清中PCT显著升高，其浓度可达正常水平的几倍甚至上万倍，研究还发现PCT浓度和感染严重程度成正相关，因而，相较于传统的C-反应蛋白、细胞因子、补体测定等检测指标，PCT蛋白凭借其自身早期性、稳定性、特异性、正相关性的主要特点，已经发展成为快速诊断严重细菌感染、判断细菌感染性疾病病情与预后及其疗效观察的可靠标记物。

因此，不论在感染性疾病的基础研究领域还是在其防治领域，建立一种敏感、特异的PCT定量检测方法，都具有重要的实用价值和十分广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种人降钙素原重组表达、单、多克隆抗体的制备及ELISA检测方法，该方法利用大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达 系统分别重组表达出了全长的人PCT蛋白和N端PCT蛋白(N-PCT)作为免疫原，制备兔抗全长PCT多克隆抗体和鼠抗N-PCT单克隆抗体；设计当以原核表达的PCT作为免疫原制备多克隆抗体时，则用真核表达的N-PCT作为抗原来检测与评价多克隆血清的效价与特异性。反之，当以真核表达的N-PCT作为免疫原制备单克隆抗体时，则用原核表达的PCT作为抗原来检测与评价单克隆抗体的效价与特异性，以消除多抗和单抗在筛选和评价过程中出现非特异反应。并将获得的抗体、抗原(重组PCT)通过组合配对实验，初步建立了能够定量PCT蛋白的ELISA检测方法，为PCT生物医学诊断试剂盒研制和蛋白功能的深入研究奠定实验基础。其具体技术方案为：

一种人降钙素原重组表达、单、多克隆抗体的制备及ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1；基因的合成 

依据人源PCT基因序列，设计合成特异引物，应用PCR扩增全长PCT和N-PCT基因，并在全长PCT上下游引入HindIII、BamH I酶切位点，在N-PCT上下游引入Spe I、Xho I酶切位点；

引物序列如下：

全长PCT引物序列5’-3’

全长F TA GGATCC ATGGGCTTCCAAAAGTTCTCCC

全长R1

CTGCCTGCCTGCAACAGGACCAAGATGCTGAGAGCCAGGAAGGGGGAGAACTTTTGG

全长F1

CTGAGCGTGGCCGGGTCTGCTGGGCTGCTCTCCAGGGCAGACCTGAATGGTGCTGCAT

全长R2

TATGTGCCCAGCATGCAAGTACTCAGATTACCGCACCGCTTAGATCTGGGGCTGTC

全长F2

CCGGCCACGCTCAGTGAGGACGAAGCGCGCCTCCTGCTGGCTGCACTGGTGCAGGACT

全长R3

TCTCTTGCTCCTGCTCCAGCTCACTGGCCTTCATCTGCACATAGTCCTGCACCAGT

全长F3

CAGGAGCAAGAGAGAGAGGGCTCCAGCCTGGACAGCCCCAGATCTAAGCGGTGCGGTA

全长R4

ATGCTGGGCACATACACGCAGGACTTCAACAAGTTTCACACGTTCCCCCAAACTGCAA

全长F4

TCGCTGGACATATCCCTTTTCTTTCCAGGTGCTCCAACCCCAATTGCAGTTTGGGGG

全长R

ATATGTCCAGCGACTTGGAGAGAGACCATCGCCCTCATGTTAGCATGCCCCAGAATGC

N-PCT引物序列5’-3’

N-PCT-F1

ATCTCGAGAAAAGAGCACCATTCAGGTCTGCCCTGGAGAGCAGCCCAGCAGACCCGGCC

N-PCT-R2

CCAGTGCAGCCAGCAGGAGGCGCGCTTCGTCCTCACTGAGCGTGGCCGGGTCTGCTGG

N-PCT-R3

TCCTGCTCCAGCTCACTGGCCTTCATCTGCACATAGTCCTGCACCAGTGCAGCCAGCA

N-PCT-R4

ATACTAGTCCGCTTAGATCTGGGGCTGTCCAGGCTGGAGCCCTCTCTCTCTTGC

(1)全长PCT基因的合成：取合成的10条互补引物各10μl混合均匀，共获得100μl的引物混合液；从中再分别各取10μl、20μl、30μl混合液进行PCR反应获取模板DNA；并以此作为全长基因合成的DNA模板，加入两端特异引物，经PCR合成获得全长PCT基因；

(2)N-PCT基因合成：取引物PCT F1与PCT R1进行PCR获得片段1的双链DNA(96bp)片段1再与PCT R2进行退火延伸，获得片段2双链DNA(139bp)；片段2再与PCT R3进行退火延伸，获得片段3双链DNA(193bp)，即PCT76-252的双链DNA基因片段，以此片段为N-PCT合成模板，加入两端特异引物进行PCR扩增反应，合成N-PCT基因；

步骤2：目的基因的重组表达及鉴定

(1)全长PCT扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的凝胶，切下约425左右处的特异明亮条带凝胶，放入EP管中，进行DNA的回收纯化；取回收的产物15μl和已备pQE30载体15μl分别进行双酶切，并过夜连接；酶切体系为50μl：限制性内切酶HindIII1μl，限制性内切酶BamH I 1μl，10x K buffer 5μl，DNA(PCT或pQE30)15μl，无菌水28μl；连接体系为T4连接酶1μl，目的基因(全长PCT)10μl，载体(pQE30)5μl，10x ligation buffer2μl，无菌水3μl；连接产物转化DH5a感受态细胞，筛选阳性菌落，并进行菌液PCR和测序鉴定；阳性菌经IPTG诱导，表达重组全长PCT蛋白；

(2)同样方法回收获得的N-PCT基因与‘pPIC9K-ALB(白蛋白)’质粒载体分别进行酶切、连接；50μl酶切体系为：限制性内切酶Spe I 1μl，限制性内切酶Xho I 1μl，10xbuffer5μl，质粒15μl，无菌水28μl；连接体系为：T4连接酶1μl，无菌水3μl，目的基因10μl， 10xligation buffer 2μl，连接载体5μl；14℃连接过夜处理，连接产物转化DH5a大肠杆菌，筛选阳性克隆；提取重组质粒经序列测定确认后电穿孔法转化毕赤酵母菌感受态；G418抗性筛选高表达阳性菌株，甲醇诱导重组蛋白表达，取样经12％SDS电泳及免疫印迹鉴定；

步骤：3：抗体制备及鉴定

(1)将重组表达的全长PCT融合蛋白作为免疫原免疫家兔，背部皮下多点注射完成一次免疫，一共免疫4-5次，每次免疫的蛋白量为400μg；第1次免疫与第二次免疫的时间间隔为12d，此后的免疫时间间隔为7d；第三次免疫完成后的3-4d，耳缘静脉采血约2ml，4℃过夜放置，1200rpm/min离心5min收集血清，标准抗原包被酶标板；间接ELISA法检测效价；

(2)N-PCT蛋白按常规方法免疫balb/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞5∶1比例混合，PEG2000诱导细胞融合，经HAT培养基筛选，ELISA检测有限稀释法克隆化，免疫印迹鉴定，获得一株稳定分泌抗N-PCT抗体的杂交瘤细胞株；

常规方法制备抗体腹水，利用商品化试剂盒PCT标准品抗原(福建洪诚生物公司提供)包被酶标板，进行腹水效价测定。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过设计4条引物应用PCR扩增特定PCT该片段，构建了真核酵母表达载体和原核大肠杆菌表达载体，诱导表达了两种重组PCT融合蛋白，成功获得了高特异性鼠抗人N-PCT单克隆抗体和兔抗人全长PCT多克隆抗体，尝试建立了ELISA检测方法。且所制备的PCT抗体及其建立的ELISA检测方法最低检出值可以达到0.33ng/ml以上，较于严重细菌感染患者体内50-100ng/ml左右的PCT浓度水平，已经处于标准曲线的线性范围之内，检测值可信度较高，且操作简便易行，为研制PCT检测试剂盒提供重要的实验基础，也为进行PCT与感染免疫方面研究提供必要支持。

附图说明

图1为全长PCT基因经1％琼脂糖凝胶电泳，M为DNAmarker，1号泳道为全长PCT基因的PCR扩增产物；

图2为多步PCR扩增获得的PCT 76-252基因片段经1％琼脂糖凝胶电泳的结果，3号泳道样品为基因片段3的PCR扩增产物，2号泳道样品为基因片段2的PCR扩增产物，1号泳道样品为基因片段1的PCR扩增产物；

图3为全长PCT质粒双酶切和PCR鉴定电泳分析结果，图3a为双酶切鉴定结果，tu 3b为菌液PCR结果。M为DNAmarker，左图1号泳道样品为全长PCT重组载体的双酶切产物，右图1号泳道为菌液PCR产物；

图4为pPIC9k-白蛋白-PCT重组质粒双酶切和PCR鉴定电泳分析结果。图4a为双酶切鉴定结果，图4b为菌液PCR结果；左图1号泳道为DNA Marker，2号泳道样品为pPIC9k-白蛋白-PCT重组质粒双酶切产物，右图M为DNAmarker，1号泳道为菌液PCR产物；

图5为SDS电泳结果，M为蛋白marker，1号泳道为重组阳性菌体裂解后的上清液样品，箭头所指为纯化出的目的蛋白；

图6为SDS电泳结果，箭头所示表达的重组白蛋白-PCT融合蛋白的分子量为75kD，与预期大小相符，1泳道为蛋白Marker；2-5泳道分别为浓缩液、48h、36h、24h的发酵液；6泳道为诱导前的发酵液；

图7为Western blot结果，泳道1和泳道2均为重组表达全长PCT蛋白；

图8为表达产物的免疫印迹鉴定。浓缩发酵液和诱导72h发酵液上清经SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，并用PCT单抗进行免疫印迹鉴定。1：浓缩发酵液；2：诱导表达72h的发酵液上清；

图9为标准曲线图；原灰色曲线为绘制的标准曲线，蓝色曲线为各点坐标的连接曲线；纵坐标为A490值，横坐标为抗原浓度。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法 

1.1材料

1.1.1质粒  菌株

GS115毕赤酵母菌购自Invitrogen公司；预克隆人白蛋白基因的毕赤酵母表达载体‘pPiC9k-ALB’质粒以及预克隆人胸腺素α1(Thα1)四串体的原核表达载体‘4×Thα1-PQE30’均由本实验室构建；大肠杆菌DH5a以及SP2/0骨髓瘤细胞本实验室保存；

1.1.2主要试剂

引物由南京金斯瑞生物技术公司合成；PCR试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶、质粒提取和凝胶回收试剂盒等从TaKaRa公司购得；LB，YPD，MD，YNB，BMGY等培养基均按常规配方配制；HAT、HT为Gibco公司购得；Balb/c小鼠购自第四军医大学实验动物中心；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂为Sigama公司产品；

1.2方法

1.2.1基因的合成 

依据人源PCT基因序列，设计合成特异引物，应用PCR扩增全长PCT和N-PCT基因，并在全长PCT上下游引入HindIII、BamH I酶切位点，在N-PCT上下游引入Spe I、Xho I酶切位点。

引物序列如下：

(1)全长PCT基因的合成：取合成的10条互补引物各10μl混合均匀，共获得100μl的引物混合液。从中再分别各取10μl、20μl、30μl混合液进行PCR反应获取模板DNA。并以此作为全长基因合成的DNA模板，加入两端特异引物，经PCR合成获得全长PCT基因。

(2)N-PCT基因合成：取引物PCT F1与PCTR1进行PCR获得片段1的双链DNA(96bp)片段1再与PCTR2进行退火延伸，获得片段2双链DNA(139bp)；片段2再与PCT R3进行退火延伸，获得片段3双链DNA(193bp)，即PCT76-252的双链DNA基因片段，以此片段为N-PCT合成模板，加入两端特异引物进行PCR扩增反应，合成N-PCT基因。

1.2.2目的基因的重组表达及鉴定

(1)全长PCT扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的凝胶，切下约425左右处的特异明亮条带凝胶，放入EP管中，进行DNA的回收纯化。取回收的产物15μl和已备pQE30载体15μl分别进行双酶切，并过夜连接。酶切体系为50μl：限制性内切酶HindIII1μl，限制性内切酶BamH I 1μl，10x K buffer 5μl，DNA(PCT或pQE30)15μl，无菌水28μl。连接体系为T4连接酶1μl，目的基因(全长PCT)10μl，载体(pQE30)5μl，10x ligation buffer 2μl，无菌水3μl。连接产物转化DH5a感受态细胞，筛选阳性菌落，并进行菌液PCR和测序鉴定。阳性菌经IPTG诱导，表达重组全长PCT蛋白。

(2)同样方法回收获得的N-PCT基因与‘pPIC9K-ALB(白蛋白)’质粒载体分别进行酶切、连接。50μl酶切体系为：限制性内切酶Spe I 1μl，限制性内切酶Xho I 1μl，10xbuffer 5μl，质粒15μl，无菌水28μl。连接体系为：T4连接酶1μl，无菌水3μl，目的基因10μl，10xligation buffer 2μl，连接载体5μl。14℃连接过夜处理，连接产物转化DH5a大肠杆菌，筛选阳性克隆。提取重组质粒经序列测定确认后电穿孔法转化毕赤酵母菌感受态。G418抗性筛选高表达阳性菌株，甲醇诱导重组蛋白表达^[16]，取样经12％SDS电泳及免疫印迹鉴定。

1.2.3抗体制备及鉴定

(1)将重组表达的全长PCT融合蛋白作为免疫原免疫家兔，背部皮下多点注射完成一次免疫，一共免疫4-5次，每次免疫的蛋白量为400μg；第1次免疫与第二次免疫的时间间隔为12d，此后的免疫时间间隔为7d。第三次免疫完成后的3-4d，耳缘静脉采血约2ml，4 ℃过夜放置，1200rpm/min离心5min收集血清，标准抗原包被酶标板。间接ELISA法检测效价。

(2)N-PCT蛋白按常规方法免疫balb/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞5∶1比例混合，PEG2000诱导细胞融合，经HAT培养基筛选，ELISA检测有限稀释法克隆化，免疫印迹鉴定，获得一株稳定分泌抗N-PCT抗体的杂交瘤细胞株。

常规方法制备抗体腹水，利用商品化试剂盒PCT标准品抗原(福建洪诚生物公司提供)包被酶标板，进行腹水效价测定。

1.2.4ELISA检测方法初步验证

(1)实验制备的两种抗体性质有较大差异，有必要通过大量的ELISA检测试验对抗体组合方式和浓度进行初步的优化选择。

(2)鼠抗人N-PCT单克隆抗体为包被抗体，商品化试剂盒PCT标准品系列稀释为抗原，实验室预先制备的兔抗人全长PCT多克隆抗体为一抗，检测ELISA方法的灵敏度。

2.1琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增的目的基因片段

(1)全长PCT基因经1％琼脂糖凝胶电泳(图1所示)，在大约425bp处的特异条带出现，分子量大小与预期的基因大小一致，清晰完整。

(2)多步PCR扩增获得的PCT 76-252基因片段经1％琼脂糖凝胶电泳的结果(图2，清晰显示在与预期目的基因大小相符的180bp的位置有明亮特异的条带出现，说明实验成功的特异性扩增出了N-PCT目的基因片段。

2.2重组质粒的双酶切鉴定

(1)全长PCT质粒酶切和菌液PCR电泳结果显示在450bp处有符合预期大小的目的条带出现(图3)；

(2)将pPIC9k-白蛋白-PCT重组质粒用Xho I和Spe I限制性内切酶进行双酶切和菌液PCR鉴定，1％琼脂糖电泳分析结果显示PCT的目的DNA片段为174bp，与预期大小相符(见图4)。

2.3重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析

(1)经鉴定筛选的全长PCT阳性表达菌株扩大培养后，加入1mmol/L的IPTG诱导蛋白表达5h。将诱导前与诱导后的菌体样品常规处理后进行12％SDS蛋白电泳，考马斯亮蓝染色(图5)，结果显示在分子量大小约为26KD处有与预期大小相符的明显蛋白条带出现，说明pQE30-PCT重组基因被成功的诱导表达出来。

(2)不同诱导时间发酵液经SDS-PAGE电泳分析白蛋白-PCT在酵母中的表达。结果可见有 与预期重组蛋白大小相符的蛋白条带(分子量为75kD，见图6)。

2.4重组表达蛋白的免疫印迹鉴定

(1)重组表达全长PCT蛋白12％SDS蛋白电泳，转膜后，使用鼠抗N-PCT单克隆抗体作为抗体进行免疫印迹鉴定(图7)。结果显示：单克隆抗体腹水能与全长PCT蛋白特异性结合并无杂带产生，有着很强的特异性。

(2)浓缩发酵液和诱导培养72h的发酵液上清经SDS-PAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上，并用兔抗全长PCT多抗进行免疫印迹鉴定。结果显示PCT单抗结合的蛋白条带的大小与预期相符(见图8)。

2.5抗体特异性的检测

(1)重组全长PCT蛋白免疫的家兔的两组血清样品100倍稀释：血清1(第3次免疫后，耳缘静脉收集的血清)；血清2(所有免疫完成后，后劲动脉取血采集的血清)，利用PCT合成肽和N-PCT蛋白过饱和包被，购买的HRP标记的羊抗兔lgG(1∶20000稀释)作为酶标二抗，TMB显色进行间接ELISA检测(阴性对照为免疫前正常兔血清，空白对照为ELISA稀释液)。)

表4-1.第三次免疫后采集家兔血清间接ELISA检测结果

表4-2.全部免疫完成后采集家兔血清间接ELISA检测结果

(2)初步筛选鉴定的杂交瘤细胞株，进行有限稀释法克隆化，收集传代培养的三份细胞培养液上清，进行间接ELISA检测，获得细胞株C7G5C6，冻存处理2个月，复苏并收集3份传代培养的细胞培养液上清进行间接ELISA检测。两次检测结果如表1所示(免疫的小鼠阳性血清为阳性对照组，正常小鼠血清为阴性对照组，样品1、2、3为三次传代细胞培养上清)。结果显示经过克隆化和冻存复苏的杂交瘤细胞培养上清能够与试剂盒标准抗原发生明显阳性反应，与阴性血清和空白对照几乎不发生反应。说明该杂交瘤细胞是能够稳定均一 的分泌鼠抗人PCT抗体的细胞株。

表1.细胞克隆化和冻存处理的ELISA测定结果

2.6多抗及单抗腹水效价测定

(1)多抗阳性血清作一系列倍比稀释，进行间接ELISA检测获得其血清效价为1∶80000。

(2)间接ELISA方法测定的单抗腹水效价达到1∶80万，SP2/0细胞培养上清和免疫前小鼠血清效价则远远小于腹水效价。(见表2)

表2.小鼠腹水效价检测结果。

2.7ELISA方法初步验证。

(1)检测方法的初步优化

对不同抗体组合方式和抗体浓度进行ELISA检测试验数据进行分析，可知单抗作为包被抗体，多抗作为一抗的方式为最佳组合方式；一抗稀释倍数确定为80倍，酶标抗体的稀释倍数为20000倍为最佳工作浓度。

(2)按照筛选的ELISA方法，对标准抗原系列稀释，ELISA检测结果如表3所示，以此为基础做出标准曲线如图5所示。可知检测浓度在1.0-100ng/ml时，得出其线性方程为y＝0.357x+0.731，系数R²为0.993，达到0.99以上，表明横纵坐标值线性关系良好，可以作为检测PCT浓度的标准曲线。取10个阴性孔的A490平均值为0.0454，标准差为0.00648，X+2SD的值为0.058，其对应的抗原浓0.75ng/ml即为该检测方法的灵敏度。与严重感染病人血清中50-100ng/ml左右的浓度相比，说明检测方法的可信度较强。

表3不同浓度抗原的ELISA检测结果

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种人降钙素原重组表达、单、多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：基因的合成

依据人源PCT基因序列，设计合成特异引物，应用PCR扩增全长PCT和N-PCT基因，并在全长PCT上下游引入HindIII、BamH I酶切位点，在N-PCT上下游引入Spe I、XhoI酶切位点；

引物序列如下：

全长PCT引物序列5’-3’

全长F TA GGATCC ATGGGCTTCCAAAAGTTCTCCC

全长R1

CTGCCTGCCTGCAACAGGACCAAGATGCTGAGAGCCAGGAAGGGGGAGAACTTTTGG

全长F1

CTGAGCGTGGCCGGGTCTGCTGGGCTGCTCTCCAGGGCAGACCTGAATGGTGCTGCAT

全长R2

TATGTGCCCAGCATGCAAGTACTCAGATTACCGCACCGCTTAGATCTGGGGCTGTC

全长F2

CCGGCCACGCTCAGTGAGGACGAAGCGCGCCTCCTGCTGGCTGCACTGGTGCAGGACT

全长R3

TCTCTTGCTCCTGCTCCAGCTCACTGGCCTTCATCTGCACATAGTCCTGCACCAGT

全长F3

CAGGAGCAAGAGAGAGAGGGCTCCAGCCTGGACAGCCCCAGATCTAAGCGGTGCGGTA

全长R4

ATGCTGGGCACATACACGCAGGACTTCAACAAGTTTCACACGTTCCCCCAAACTGCAA

全长F4

TCGCTGGACATATCCCTTTTCTTTCCAGGTGCTCCAACCCCAATTGCAGTTTGGGGG

全长R

ATATGTCCAGCGACTTGGAGAGAGACCATCGCCCTCATGTTAGCATGCCCCAGAATGC

N-PCT引物序列5’-3’

N-PCT-F 1

ATCTCGAGAAAAGAGCACCATTCAGGTCTGCCCTGGAGAGCAGCCCAGCAGACCCGGCC

N-PCT-R2

CCAGTGCAGCCAGCAGGAGGCGCGCTTCGTCCTCACTGAGCGTGGCCGGGTCTGCTGG

N-PCT-R3

TCCTGCTCCAGCTCACTGGCCTTCATCTGCACATAGTCCTGCACCAGTGCAGCCAGCA

N-PCT-R4

ATACTAGTCCGCTTAGATCTGGGGCTGTCCAGGCTGGAGCCCTCTCTCTCTTGC

(1)全长PCT基因的合成：取合成的10条互补引物各10μl混合均匀，共获得100μl的引物混合液；从中再分别各取10μl、20μl、30μl混合液进行PCR反应获取模板DNA；并以此作为全长基因合成的DNA模板，加入两端特异引物，经PCR合成获得全长PCT基因；

(2)N-PCT基因合成：取引物PCT F1与PCT R1进行PCR获得片段1的双链DNA(96bp)片段1再与PCT R2进行退火延伸，获得片段2双链DNA(139bp)；片段2再与PCT R3进行退火延伸，获得片段3双链DNA(193bp)，即PCT76-252的双链DNA基因片段，以此片段为N-PCT合成模板，加入两端特异引物进行PCR扩增反应，合成N-PCT基因；

步骤2：目的基因的重组表达及鉴定

(1)全长PCT扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的凝胶，切下约425左右处的特异明亮条带凝胶，放入EP管中，进行DNA的回收纯化；取回收的产物15μl和已备pQE30载体15μ1分别进行双酶切，并过夜连接；酶切体系为50μl：限制性内切酶HindIII1μl，限制性内切酶BamH I 1μl，10x K buffer 5μl，DNA(PCT或pQE30)15μl，无菌水28μl；连接体系为T4连接酶1μl，目的基因(全长PCT)10μl，载体(pQE30)5μl，10x ligation buffer2μl，无菌水3μl；连接产物转化DH5a感受态细胞，筛选阳性菌落，并进行菌液PCR和测序鉴定；阳性菌经IPTG诱导，表达重组全长PCT蛋白；

(2)同样方法回收获得的N-PCT基因与‘pPIC9K-ALB(白蛋白)’质粒载体分别进行酶切、连接；50μl酶切体系为：限制性内切酶Spe I 1μl，限制性内切酶Xho I 1μl，10xbuffer5μl，质粒15μl，无菌水28μl；连接体系为：T4连接酶1μl，无菌水3μl，目的基因10μl，10xligation buffer 2μl，连接载体5μl；14℃连接过夜处理，连接产物转化DH5a大肠杆菌，筛选阳性克隆；提取重组质粒经序列测定确认后电穿孔法转化毕赤酵母菌感受态；G418抗性筛选高表达阳性菌株，甲醇诱导重组蛋白表达，取样经12％SDS电泳及免疫印迹鉴定；

步骤：3：抗体制备及鉴定

(1)将重组表达的全长PCT融合蛋白作为免疫原免疫家兔，背部皮下多点注射完成一次免疫，一共免疫4-5次，每次免疫的蛋白量为400μg；第1次免疫与第二次免疫的时间间隔为12d，此后的免疫时间间隔为7d；第三次免疫完成后的3-4d，耳缘静脉采血约2ml，4℃过夜放置，1200rpm/min离心5min收集血清，标准抗原包被酶标板；间接ELISA法检测效价；

(2)N-PCT蛋白按常规方法免疫balb/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞5∶1比例混合，PEG2000诱导细胞融合，经HAT培养基筛选，ELISA检测有限稀释法克隆化，免疫印迹鉴定，获得一株稳定分泌抗N-PCT抗体的杂交瘤细胞株；

常规方法制备抗体腹水，利用商品化试剂盒PCT标准品抗原(福建洪诚生物公司提供)包被酶标板，进行腹水效价测定。