CN105542014B - Tp重组抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TP重组抗原及其制备方法和应用，该TP重组抗原包括依次连接的嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15‑TPN17‑TPN47嵌合表达多肽。这种TP重组抗原通过引入有助于可溶性表达的柔性链接肽对TPN15‑TPN17‑TPN47嵌合表达多肽进行修饰，相对于传统的TP抗原，这种TP重组抗原的蛋白活性较好。

Description

TP重组抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，特别是涉及一种TP重组抗原及其制备方法和应用。
背景技术
梅毒是一种性传播疾病，其病原体是梅毒螺旋体，也叫苍白螺旋体(Treponemapallidum，TP)，主要通过性接触和血液传播，并产生多种多样的症状和体征，且时隐时显，病程可持续很长，几乎可侵犯全身各器官。是仅次于艾滋病的严重危害我国人民身体健康的性传播疾病，近年来在我国有上升的趋势，据2014年梅毒重点疫情报告，2009年以来梅毒位于乙类传染病报告发病数的第三位；尤其是在产前门诊筛查出的梅毒抗体阳性的孕妇显著增加，给我国的公共卫生带来新的问题。
国内外对梅毒的发病机制和诊断方式进行了大量的研究，梅毒的诊断和治疗后效果评价一直是利用体液免疫学指标，目前国内对血源筛选还有部分采用RPR和TRUST方法，其主要缺点是敏感性和特异性不高，许多非梅毒性疾病，包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性迁延性肝炎等均可呈阳性反应。而荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验和梅毒螺旋体血凝试验虽大大改善了检测的特异性，但是需制备大量病原体，且质量难以控制，也不利于大规模的血液筛查工作。因此，研制快速、简便、灵敏且特异的诊断试剂是当前的主要任务。
目前应用比较广泛的梅毒螺旋体血清检测方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体金或乳胶快速检测。此方法以抗原-抗体的特异性识别为基础。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏度高、特异性好的优势，已经成为梅毒检测的主流方法。而胶体金或乳胶法具有快捷、方便的优势，已经应用得越来越广泛。
免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛的应用，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试纸条的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在硝酸纤维素膜上层析，再被包被的抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测线(T线)，通过检测线的有无实现对结果的判定。
从方法学上讲，目前梅毒ELISA和胶体金检测用的都是标记物和标记抗原直接标记的双抗原夹心法，其存在的固有缺陷如下：
1、当标记物为酶、发光物质、放射性物质等小标记物时，为了提高灵敏度，需要提高标记比例，但是比例过高会使标记抗原被标记物所包裹，使得抗原表位被包埋而导致抗原活性降低；
2、当标记物为较大的纳米颗粒如使用胶体金、乳胶或其他纳米颗粒类标记物时，理论上最佳的灵敏度状态是标记比例越低灵敏度越高，摩尔比为1：1时灵敏度最高，但由于直接标记过程中，标记抗原用量过低会导致标记沉淀等不易标记因素而使标记比例无法降得过低，从而导致灵敏度偏低，同时标记抗原使用量的提高也会导致特异性降低。因此，急需在现有梅毒双抗原夹心法试剂盒的上面做出进一步的改进，提高试剂盒的灵敏度的同时改善特异性。
80年代初，随着分子生物学技术的发展，特别是基因工程(DNA重组)技术的出现使梅毒螺旋体的研究进入一个新的阶段，梅毒螺旋体的全部基因组DNA序列己经被解析。通过重组梅毒螺旋体DNA的克隆以及在大肠杆菌中的表达，制备出多种重组TP抗原，为梅毒的研究提供了一条新的途径。但原核表达缺乏翻译后修饰功能，有时需要特殊蛋白伴侣一起表达并进一步的进行复性处理或保存缓冲液的摸索才能使其蛋白活性较好的表现出来。
发明内容
基于此，有必要提供一种蛋白活性较好的TP重组抗原及其制备方法和应用。
一种TP重组抗原，包括依次连接的嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽。
在一个实施例中，还包括GST标签，所述GST标签、所述嵌合表达多肽以及所述柔性链接肽依次连接。
在一个实施例中，所述TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原为(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施例中，所述柔性链接肽为(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
一种上述的TP重组抗原的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、提供基因表达载体，所述基因表达载体用于表达TP重组抗原，所述TP重组抗原包括嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽；
步骤二、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞；
步骤三、对转化了所述基因表达载体的所述宿主细胞进行诱导表达，分离得到表达液；
步骤四、对所述表达液中进行饱和硫酸铵梯度分析，确定沉杂蛋白和沉目的蛋白的硫酸铵浓度，加入相应的沉杂的硫酸铵终浓度，充分静止后收集上清，接着在所述上清中加入饱和硫酸铵沉目的蛋白的终浓度，充分静止后收集沉淀，将所述沉淀重新溶解，得到粗产物；以及
步骤五、利用亲和柱纯化所述粗产物，再进行亲和柱及离子交换纯化，得到所述TP重组抗原。
一种梅毒检测试剂，所述梅毒检测试剂含有上述的TP重组抗原的溶液；
所述TP重组抗原的溶液中含有质量百分浓度为0.1％～0.3％的吐温20或质量百分浓度为0.1％～0.3％的Triton X-100。
一种梅毒检测试纸，包括包被抗原、标记抗原、GST单克隆抗体及标记物；
所述标记抗原包括依次连接的GST标签、嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽；
所述包被抗原包括依次连接的所述嵌合表达多肽以及所述柔性链接肽；
所述标记物通过所述GST单克隆抗体与所述标记抗原间接结合。
在一个实施例中，所述TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原为(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；
所述柔性链接肽为(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
一种梅毒检测试剂盒，包括上述的梅毒检测试剂，或者包括上述的梅毒检测试纸。
上述的TP重组抗原，在制备梅毒检测试剂领域或制备梅毒检测设备领域的应用。
这种TP重组抗原通过引入有助于可溶性表达的柔性链接肽对TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽进行修饰，相对于传统的TP抗原，这种TP重组抗原的蛋白活性较好。
附图说明
图1为一实施方式的TP重组抗原的制备方法的流程图；
图2为一实施方式的梅毒检测试纸的正面示意图；
图3为如图2所示的梅毒检测试纸的截面示意图；
图4为一实施方式的梅毒检测试剂盒的结构示意图；
图5为实施例1中包被抗原和标记抗原的SDS-PAGE胶纯度电泳图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对TP重组抗原及其制备方法和应用做进一步的解释说明。
一实施方式的TP(苍白螺旋体)重组抗原，包括嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽。
这种TP重组抗原可以用作包被抗原和标记抗原，应用到梅毒检测领域。
作为标记抗原时，这种TP重组抗原还包括GST标签，GST标签、嵌合表达多肽以及柔性链接肽依次连接。
具体的，TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原为：(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
具体的，柔性链接肽为：(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
GST标签为由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。
由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。
功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。
一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述核苷酸序列编码的到的蛋白或上述氨基酸序列组成的多肽，如果大肠杆菌周质蛋白没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。
这种TP重组抗原通过引入有助于可溶性表达的柔性链接肽对TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽进行修饰，相对于传统的TP抗原，这种TP重组抗原的蛋白活性较好。
这种TP重组抗原可以应用于制备梅毒检测试剂领域或制备梅毒检测设备领域。
如图1所示的上述的TP重组抗原的制备方法，包括如下步骤：
S10、提供基因表达载体。
基因表达载体用于表达TP重组抗原，TP重组抗原包括嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽。
优选的，这种TP重组抗原作为标记抗原时还包括GST标签，GST标签、嵌合表达多肽以及柔性链接肽依次连接。
具体的，TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原为：(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
具体的，柔性链接肽为：(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
一般的，基因表达载体的构建过程可以为：选取一段辅助蛋白的基因片段，设计引物，引物上带有酶切位点，PCR扩增辅助蛋白基因片段，连接到用相应酶切处理后的表达载体中，得到重组质粒。选取一段梅毒检测抗原的基因片段，设计引物，引物上带有酶切位点，PCR扩增梅毒检测抗原基因片段，连入到用相应酶切好的重组质粒中，得到可表达融合蛋白的基因表达载体。
基因表达载体可以选择双顺反子表达的质粒，例如，pET-24a(Novagen公司，货号：69864-3)、pET-30a，等。其中，柔性链接肽的表达序列作为第二顺反子。
S20、将S10得到的基因表达载体转化到宿主细胞中。
宿主细胞可以为原核细胞，例如：大肠杆菌。
一般的，基因表达载体转化操作参见试剂盒生产厂家推荐的方法实现，宿主细胞为感受态细胞，例如大肠杆菌感受态细胞，将构建好的基因表达载体加入感受态细胞，热激处理，使感受态细胞的细胞膜结构扰动，细胞膜上出现空隙以便基因表达载体进入细胞，之后恒温培养，使宿主细胞复苏。
一般的，基因表达载体转化到宿主细胞后，还需要对转化后的宿主细胞进行抗性筛选，如在培养基中加入氨苄西林钠或卡那霉素。
S30、对S20得到的转化了基因表达载体的宿主细胞进行诱导表达，分离得到表达液。
S40、对S30得到的表达液中进行饱和硫酸铵梯度分析，确定沉杂蛋白和沉目的蛋白的硫酸铵浓度，加入相应的沉杂的硫酸铵终浓度，充分静止后收集上清，接着在上清中加入饱和硫酸铵沉目的蛋白的终浓度，充分静止后收集沉淀，将沉淀重新溶解，得到粗产物。
S40中还包括向表达液中加入吐温20或TritonX-100的操作。吐温20或TritonX-100的质量百分浓度为0.1％～0.3％。优选的，吐温20或TritonX-100的质量百分浓度为0.15％。
原核表达的TP重组抗原中往往含有较多的聚体结构，在纯化过程中加入一定量的吐温20或TritonX-100较好的解决了该问题。
S50、利用亲和柱纯化S40得到的粗产物，再进行亲和柱及离子交换纯化，得到TP重组抗原。
一实施方式的梅毒检测试剂，含有上述的TP重组抗原的溶液。
TP重组抗原的溶液中含有吐温20或TritonX-100。吐温20或TritonX-100的质量百分浓度为0.1％～0.3％。优选的，吐温20或TritonX-100的质量百分浓度为0.15％。
原核表达的TP重组抗原中往往含有较多的聚体结构，在使用过程中加入一定量的吐温20或TritonX-100较好的解决了该问题。
一实施方式的梅毒检测试纸，包括包被抗原、标记抗原、GST单克隆抗体及标记物。
标记抗原包括依次连接的GST标签、嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽。
包被抗原包括依次连接的上述嵌合表达多肽以及上述柔性链接肽；
标记物通过GST单克隆抗体与标记抗原间接结合。
嵌合表达多肽以及柔性链接肽的序列前文已经给出，在此不在赘述。
优选的，标记物可以为胶体金、胶体硒、胶体银或乳胶等较大的纳米颗粒。
一实施方式的梅毒检测试剂盒，包括上述的梅毒检测试剂，或者包括上述的梅毒检测试纸。
具体的，如图2、图3和图4所示的一实施方式的梅毒检测试剂盒，包括梅毒检测试纸100、壳体200以及其他检测试剂。
梅毒检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、检测线160及质控线170。样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片110上。样品垫120与金标垫130部分重叠，金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠，硝酸纤维素膜140与吸收垫150部分重叠。检测线160及质控线170设在硝酸纤维素膜上，且检测线160设在靠近金标垫130的一端，质控线170设在靠近吸收垫150的一端。支撑薄片110采用不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。抗GST单克隆单体包附胶体金颗粒并与标记抗原偶联后均匀涂覆在金标垫130上。包被抗原包被在硝酸纤维素膜140上。
标记抗原包括依次连接的GST标签、嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽。包被抗原包括依次连接的上述嵌合表达多肽以及上述柔性链接肽。检测线160为亲和纯化的抗梅毒抗原，质控线170为羊抗鼠IgG抗体。
本实施方式中，金标垫130上的标记物为胶体金，可以理解，在其他实施方式中，标记物还可以为胶体硒、胶体银或乳胶等较大的纳米颗粒。本实施方式中，所用到的抗梅毒抗原为梅毒螺旋体抗原。
结合图4，检测试纸100可置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测线160及质控线170裸露于观察窗220中，方便观察。
其他检测试剂可以根据需要直接在实验室制备。
上述检测试剂盒利用双抗原夹心法来检测被检材料中的是否含有梅毒螺旋体抗体。检测时，样品中所有的梅毒螺旋体抗体先和胶体金间接标记的标记抗原结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有梅毒螺旋体抗体，到达检测线160时，遇到包被在硝酸纤维素膜140上的包被抗原，就会形成包被抗原-待测梅毒螺旋体抗体-标记抗原-标记物复合物，从而富集在检测线160上，形成红色沉淀线；未结合梅毒螺旋体抗体的金标记梅毒抗原则通过检测线160，被羊抗鼠单抗捕获，富集在质控线170上，形成红色沉淀线。当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有梅毒螺旋体抗体，反应复合物到达检测线160时，遇到包被抗原就不会形成包被抗原-待测梅毒螺旋体抗体-标记抗原-标记物复合物，反应复合物通过检测线160，仅富集在质控线170上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载体。
实施例1
包被、标记抗原、免疫源和杂交瘤细胞筛选抗原的制备。
通过文献查阅及生物信息学分析梅毒螺旋体TpN17(GeneBank No：M74825)、TpN15(GeneBank No：U73115.1)、TpN47(GeneBank No：NC_000919.1)基因优势表位，设计重叠PCR引物人工合成TpN17(23aa-106aa)、TpN15(31aa-109aa)、TpN47(185aa-410aa)所对应活性区段，通过桥式PCR扩增并引入有助于可溶性表达的柔性链接肽TRX，获得嵌合基因，将该基因和pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，PCR鉴定正确的阳性质粒，提取质粒酶切鉴定。将PCR鉴定和酶切鉴定都正确的质粒送测序，结果和设计序列完全一致。将测序正确的质粒用设计在其两端的酶切位点相应的酶进行酶切，切出的目的序列连入表达载体pET-24a中。包被抗原的重组质粒为pET-24a-TPAG-TRX(含HIS tag)，该质粒为双顺反子表达的质粒，其中TRX为第二顺反子；标记抗原的重组质粒为PET30a-GST-TPAG-TRX(含HIStag及GST peptide)，该质粒为双顺反子表达的质粒，其中TRX为第二顺反子。
TPAG为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原的表达序列，序列如SEQ ID No.1所示；TRX为嵌合表达多肽的表达序列，序列如SEQ ID No.2所示。
免疫源和杂交瘤细胞筛选抗原使用PGEX-2T、PGEX-6P-1、PGEX-5X-1、pET-41a质粒转化表达宿主菌ER2566。
取适量转化后宿主菌涂布于带抗性的LB固体培养平板上，37℃，培养过夜，第二天挑取7株在抗性培养平板上能生长的菌落，接种于3mL带抗性的LB液体培养基中，37℃培养5h，同时取转化有空载体的宿主菌做对照。加入终浓度为0.25mM的IPTG，30℃，180rpm诱导培养6h。离心收集菌体，用40μL 20mM PBS缓冲液重悬菌体，加入20μL 3×loadingBuffer，沸水煮10分钟后，SDS-PAGE电泳。考马斯亮兰染色，转化进重组质粒的菌株在预测的分子量位置有一条明显的蛋白表达带，而只转化进空质粒的菌株没有该条带。。
将1微升的转化宿主菌接种于500mL加有抗性的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，第二天早上加入IPTG至终浓度为0.25mM，30℃，180rpm诱导4h。离心收集菌体，加入适量裂解缓冲液，超声破碎后离心取上清。分别进行硫酸铵梯度分析，经分析包被抗原用10％饱和硫酸铵进行沉杂蛋白，用20％硫酸铵沉目的蛋白；标记抗原用35％直接沉淀目的蛋白；免疫源和杂交瘤细胞筛选抗原用15％饱和硫酸铵进行沉杂蛋白，用30％硫酸铵沉目的蛋白。经硫酸铵处理后得到粗抗原。包被抗原经NI亲和介质纯化和SP离子交换层析获得目的蛋白并保证平衡液和洗脱缓冲液中含有0.15％吐温20或Triton X-100；标记抗原经NI亲和介质纯化和谷胱甘肽亲和介质纯化获得目的蛋白；两种抗原最终纯度均达到90％以上(见图5，包被抗原和标记抗原SDS-PAGE胶纯度电泳图：泳道1蛋白Marker；泳道2纯化后包被抗原；泳道3纯化后标记抗原)，-20℃保存备用。免疫源和杂交瘤细胞筛选抗原经谷胱甘肽亲和介质纯化获得目的蛋白，-20℃保存备用。
实施例2
GST单克隆抗体的制备。
将以上获得的重组GST蛋白溶液用PBS透析之后，用PBS稀释到1.0mg/mL，与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化，得到油状乳液。将该乳液以0.2mL的剂量皮下施给6周龄雌性BALB/c小鼠背部位点。第一次免疫14天后腹腔增强免疫，即等量抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合，增强免疫到四针后，采尾血，分离血清，用间接ELISA法测定效价，效价高于1∶10000即可用于融合。融合前3天，用相同剂量抗原与等体积0.9％氯化钠注射液混合腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，计数。
将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次，1，200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL 50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1，000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板(已铺饲养细胞)，50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养液)两次。
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释不同的GST重组蛋白(分别是：PGEX-2T、PGEX-6P-1、PGEX-5X-1、pET-41a、PET30a-GST-TPAG-TRX),同时pET-24a-TPAG作为阴性对照，使其终浓度为1μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃2小时或4℃过夜。次日，用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.02M pH7.2 PBS，0.15mL/孔，37℃封闭2小时，用于检测。重组融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37℃ 30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，37℃ 30分钟同上洗后，加TMB显色剂显色15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。PRMI 1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值得比≧2.0为阳性细胞孔。共检测有杂交瘤细胞的378孔，其中同时对上述五个含GST的蛋白有反应的阳性孔为77个。经过三次有限稀释克隆，最后获得12株稳定分泌抗GST蛋白的细胞株。
选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。
取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱。然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280nm下的吸附值达到基线为止。再用0.2M的甘氨酸洗脱液(pH2.5)洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0.1M TRIS(pH8.8)中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，-20℃冻存。
实施例3
GST单克隆抗体的胶体金标记工艺、TP间接标记检测系统的摸索。
取1mL胶体金放小玻璃杯中，搅拌加入10μL、15μL、20μL的0.2M K2CO3调节pH至7.0，继续搅拌60秒；分别加入10μg、15μg不同株系GST单抗，继续搅拌60秒；加入20μL 10％BSA，继续搅拌60秒；5000g离心10分钟，弃掉上清，用多次尝试摸索的胶体金稀释液100u l(20mMPB，150mM NaCl，1％BSA，0.1％TritonX-100，2％Sucrose，0.01％Proclin300)复溶；最后在该100微升胶体金标记GST单抗复合物中加入0.15μg、0.25μg、0.3μg PET30a-GST-TPAG-TRX，充分混匀后4℃保存。该间接标记金标复合物命名为PET30a-GST-TPAG-TRX-GSTAb-AU。将上述金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维，冻干，即制成金标垫。我们通过尝试发现1mL胶体金加15μL的0.2M K2CO3标记10μg、GSTAb258单抗时，产品灵敏度、特异性最高。
用检测线稀释液(10mM PBS+2％蔗糖+0.15％吐温20或Triton X-100)稀释pET-24a-TPAG-TRX至0.8mg/mL制成检测线工作液，调整点膜仪，将其划到硝酸纤维素膜的相应位置上即为检测线(T线)，T线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm；用同一稀释液稀释羊抗鼠单抗到0.5mg/mL制成对照线工作液，调整点膜仪，划线为C线，即为控制线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。两线距离5～8mm，37℃烘干，封装备用。
将包被好的硝酸纤维素膜、金标垫、吸收垫、样品垫、聚酯板按图依次层叠起来，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装。4～30℃保存。
加100μL待测样品到样品垫处，室温放置20分钟之后判定结果，当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阴性；当试纸条同时出现肉眼可见的紫红色质控线和紫红色检测线，结果判为阳性；检测线颜色越深说明被检测样品的抗体水平越高；当试纸条没有出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果都判为检测试纸条失效，应废弃。
实施例4
TP间接标记的胶体金试剂盒的应用。
使用上述实施例3的间接标记双抗原夹心法金标检测系统用于检测TP抗体，其灵敏度、特异性、重复性、稳定性、精密性等指标均优于现有商品化试剂盒。
(1)灵敏度和特异性：250例血清标本经梅毒螺旋体核酸检测为阳性样本，2000例检出阴性样本，分别采用目前市售的梅毒检测试剂盒A与实施例4试剂盒B进行检测，20分钟内观察结果，结果见表1。
表1快速诊断梅毒试剂盒的比较
Figure GDA0002184554050000141
由表1可以看出，试剂盒A的灵敏度为98.4％，试剂盒B灵敏度为100％，特异性试剂盒A为99.75％，试剂盒B为99.9％。说明本实施例的试剂盒在灵敏度和特异性两项指标上均优于现有的产品，完全可以用于常规的梅毒快速诊断。
(3)重复性：对阴、阳性待测样品各20份，采用不同时不同批次不同操作者进行10次检测，考查试剂盒的重复性，结果显示本实施例的金标检测试剂盒对阴、阳性判定结果的重复性为100％，表明试剂盒的再现性好，重复性高。
(4)稳定性：将本实施例间接标记制成的成品试剂盒分别37℃考核7天，取出后与同时4℃存放的成品试剂盒在同一条件下检测相同的20份阴性参考品和10份阳性参考品，计算其符合率，其结果见表2。
表2 TP间接标记试剂盒稳定性实验结果
由表2可以看出，本实施例的成品试剂盒稳定性好。
(5)精密性：在用本实施例的金标检测试剂盒检测同一份已知阳性标本，多次平行做10次重复检测，得到各检测条的结果均为阳性，且各检测条的显色程度也无显著差异，说明试剂盒精密性较好。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure IDA0000889576730000011
Figure IDA0000889576730000021
Figure IDA0000889576730000031
Figure IDA0000889576730000041
Figure IDA0000889576730000051
Figure IDA0000889576730000061

Claims (9)

1.一种TP重组抗原，其特征在于，包括依次连接的嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽；所述TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽为由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。
2.根据权利要求1所述的TP重组抗原，其特征在于，所述TP重组抗原为标记抗原，所述TP重组抗原还包括GST标签，所述GST标签、所述嵌合表达多肽以及所述柔性链接肽依次连接。
3.根据权利要求1所述的TP重组抗原，其特征在于，所述柔性链接肽为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。
4.一种权利要求1～3中任一项所述的TP重组抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、提供基因表达载体，所述基因表达载体用于表达TP重组抗原，所述TP重组抗原包括嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽；
步骤二、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞；
步骤三、对转化了所述基因表达载体的所述宿主细胞进行诱导表达，分离得到表达液；
步骤四、对所述表达液中进行饱和硫酸铵梯度分析，确定沉杂蛋白和沉目的蛋白的硫酸铵浓度，加入相应的沉杂的硫酸铵终浓度，充分静止后收集上清，接着在所述上清中加入饱和硫酸铵沉目的蛋白的终浓度，充分静止后收集沉淀，将所述沉淀重新溶解，得到粗产物；以及
步骤五、利用亲和柱纯化所述粗产物，再进行亲和柱及离子交换纯化，得到所述TP重组抗原。
5.一种梅毒检测试剂，其特征在于，所述梅毒检测试剂含有如权利要求1或3所述的TP重组抗原的溶液；
所述TP重组抗原的溶液中含有质量百分浓度为0.1％～0.3％的吐温20或质量百分浓度为0.1％～0.3％的Triton X-100。
6.一种梅毒检测试纸，其特征在于，包括包被抗原、标记抗原、GST单克隆抗体及标记物；
所述标记抗原包括依次连接的GST标签、嵌合表达多肽以及有助于可溶性表达的柔性链接肽，所述嵌合表达多肽为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽，所述TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达多肽为由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；
所述包被抗原包括依次连接的所述嵌合表达多肽以及所述柔性链接肽；
所述标记物通过所述GST单克隆抗体与所述标记抗原间接结合。
7.根据权利要求6所述的梅毒检测试纸，其特征在于，所述柔性链接肽为由SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽。
8.一种梅毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的梅毒检测试剂，或者包括如权利要求6或7所述的梅毒检测试纸。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的TP重组抗原在制备梅毒检测试剂中或制备梅毒检测设备中的应用。
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