CN110305927B - 利用重组大肠杆菌发酵制备包被tp抗原的方法 - Google Patents

利用重组大肠杆菌发酵制备包被tp抗原的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110305927B
CN110305927B CN201910723759.5A CN201910723759A CN110305927B CN 110305927 B CN110305927 B CN 110305927B CN 201910723759 A CN201910723759 A CN 201910723759A CN 110305927 B CN110305927 B CN 110305927B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
antigen
escherichia coli
culture
recombinant escherichia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910723759.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110305927A (zh
Inventor
刘梁涛
李新乐
尚朋林
潘芳芳
张玉莉
李艳姣
张文婧
邓娟
李桂林
赵巧辉
付光宇
吴学炜
杨增利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Original Assignee
Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd filed Critical Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Priority to CN201910723759.5A priority Critical patent/CN110305927B/zh
Publication of CN110305927A publication Critical patent/CN110305927A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110305927B publication Critical patent/CN110305927B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，包括以下步骤：第一步，培养种子液；第二步，将种子液依次发酵培养和诱导培养，第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原。本发明在培养过程中对发酵培养基进行合理的补料调控，准确将发酵培养基的溶氧浓度控制在预设范围内，实现了菌株的高密度发酵培养，单批次菌体产能为传统工艺的4倍以上，大大提高了包被TP抗原的得率，其得率可高达11.23mg/g以上，包被TP抗原的纯度提高了18%；经验证本发明可重复性好，单批次产能高，降低了大规模生产包被TP抗原的成本。

Description

利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域，尤其是涉及一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema Pallidum，即TP）引起的慢性传播疾病，其临床表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潜伏梅毒等，人们感染梅毒后的头两年最具有传染性，如孕妇梅毒病期越早，对胎儿感染的机会就越大。因而，早期诊断对临床预防和治疗梅毒具有重大意义。
酶联免疫吸附试验（即ELISA）是酶免疫测定技术中应用最广的技术，具有灵敏度高和特异性高等优点而被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。ELISA包括双抗体夹心法和间接法，双抗体夹心法是临床上诊断梅毒的首选方法。对于双抗体夹心法检测梅毒来说，酶标记抗原质量的好坏是影响诊断结果的关键性因素，抗原的纯度越高，诊断结果就越可靠。
传统包被梅毒抗原的制备工艺是将TP表达的菌株直接接种到培养基中培养3～5天，TP表达耗时时间长，在培养过程中菌株死亡较多，单批次菌体产量很低，在制备包被TP抗原时需要多批次培养，不仅增加了成本，还延长了包被TP抗原获取周期，并且最终得到的包被TP抗原纯度较低，使得梅毒检测灵敏度较低，存在误诊。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，该方法通过补料控制发酵培养基的溶氧量及诱导时间，实现了重组大肠杆菌的高密度培养，降低菌株死亡率，将单批次菌体产能提高为传统工艺的4倍以上，大大提高了包被TP抗原的表达量和得率。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
本发明所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，包括以下步骤：
第一步，挑取重组大肠杆菌菌株接种在LB培养基中培养15～16h，得一级种子；将得到的一级种子接种到LB培养基内扩大培养2～3h，得到二级种子液；
第二步，将第一步得到的二级种子液接种到发酵培养基中发酵培养，发酵培养2～3h后，取样检测发酵培养基中重组大肠杆菌菌株的OD600值，当OD600值为5～7时，降温，向发酵培养基内加入诱导剂诱导培养60～72h；
其中，在发酵培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥40%；在诱导培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥30%；
第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，重悬，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原。
所述第一步中的重组大肠杆菌表达载体为pGEX4T-3，表达菌株为Arctic。
将所述第二步中发酵培养基的溶氧浓度控制在30%及其以上或40%及其以上的方法为：向发酵培养基内按照0.5mL/min的速度补加补料培养基，所述补料培养基的配方为：葡萄糖125g/L、酵母粉50g/L、蛋白胨50g/L、MgSO4·7H2O 5g/L，补料培养基的pH为6.8～7.0。
所述第二步中的发酵培养温度控制在35～38℃，诱导培养温度控制在15～17℃。
所述第二步中的诱导剂IPTG，其浓度为0.4～0.6mmol/L。
所述发酵培养基的配方为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉12g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖13.7 g/L，KH2PO4 1.5g/L，K2HPO42.3g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，发酵培养基的pH为7.0～7.2。
所述第二步中二级种子液接种量为5%。
所述第二步中，发酵培养阶段的发酵培养基溶氧浓度为40%；诱导培养阶段的发酵培养基溶氧浓度为30%。
所述第三步中层析分离时层析柱的平衡液为纯化水、0.1mm柠檬酸和pH为7.6的0.2mm Na2HPO4，层析分离液为50mm Tris-HCl、10mm GSH和2mm EDTA等的混合液。
所述第三步得到的包被TP抗原的分子量为98.5KDa、纯度≥72.16%，得率为11.36mg/g。
与传统发酵工艺相比，本发明优点在于对种子液依次进行发酵和诱导培养，在培养过程中对发酵培养基进行合理的补料调控，准确将发酵培养基的溶氧浓度控制在预设范围内，实现了菌株的高密度发酵培养，单批次菌体产能为传统工艺的4倍以上，大大提高了包被TP抗原的得率，其得率可高达11.23mg/g以上，包被TP抗原的纯度提高了18%。经验证，本发明可重复性好，单批次产能高，降低了大规模生产包被TP抗原的成本。
附图说明
图1是本发明发酵培养基中重组大肠杆菌菌体湿重与诱导时间的关系图。
图2是本发明重组大肠杆菌菌体在不同诱导时期的电泳图。
图3是本发明包被TP抗原的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更加详细的说明。
本发明的化学试剂均为市售产品，本发明所用的检测仪器均为常规仪器，本发明所用的纯化水为用0.25μm滤膜过滤后的纯化水，本发明用到的水溶液均采用纯化水配置。
实施例1 制备大量表达TP抗原的重组大肠杆菌
第一步，经对梅毒螺旋体蛋白分析和免疫效果比对，选取膜蛋白TP15、TP17和TP47序列，利用同源克隆技术合成一个全长为2076bp的TP基因，该TP基因序列SEQ ID No:1为：
1 TGTGTCTCGT GCACAACCGT GTGTCCGCAC GCCGGGAAGG CCAAAGCGGA AAAGGTAGAG
61 TGCGCGTTGA AGGGAGGTAT CTTTCGGGGT ACGCTACCTG CGGCCGATTG CCCGGGAATC
121 GATACGACTG TGACGTTCAA CGCGGATGGC ACTGCGCAAA AGGTAGAGCT TGCCCTTGAG
181 AAGAAGTCGG CACCTTCTCC TCTTACGTAT CGCGGTACGT GGATGGTACG TGAAGACGGA
241 ATTGTCGAAC TCTCGCTTGT GTCCTCGGAG CAATCGAAGG CACCGCACGA GAAAGAGCTG
301 TACGAGCTGA TAGACAGTAA CTCCGTTCGC TACATGGGCG CTCCCGGCGC AGGAAAGCCT
361 TCAAAGGAGA TGGCGCCGTT TTACGTGCTC AAAAAAACAA AGAAAGGCTC GTCTCATCAT
421 GAGACGCACT ATGGCTATGC GACGCTAAGC TATGCGGACT ACTGGGCCGG GGAGTTGGGG
481 CAGAGTAGGG ACGTGCTTTT GGCGGGTAAT GCCGAGGCGG ACCGCGCGGG GGATCTCGAC
541 GCAGGCATGT TCGATGCAGT TTCTCGCGCA ACCCACGGGC ATGGCGCGTT CCGTCAGCAA
601 TTTCAGTACG CGGTTGAGGT ATTGGGCGAA AAGGTTCTCT CGAAGCAGGA GACCGAAGAC
661 AGCAGGGGAA GAAAAAAGTG GGAGTACGAG ACTGACCCAA GCGTTACTAA GATGGTGCGT
721 GCCTCTGCGT CATTTCAGGA TTTGGGAGAG GACGGGGAGA TTAAGTTTGA AGCAGTCGAG
781 GGTGCAGTAG CGTTGGCGGA TCGCGCGAGT TCCTTCATGG TTGACAGCGA GGAATACAAG
841 ATTACGAACG TAAAGGTTCA CGGTATGAAG TTTGTCCCAG TTGCGGTTCC TCATGAATTA
901 AAAGGGATTG CAAAGGAGAA GTTTCACTTC GTGGAAGACT CCCGCGTTAC GGAGAATACC
961 AACGGCCTTA AGACAATGCT CACTGAGGAT AGTTTTTCTG CACGTAAGGT AAGCAGCATG
1021 GAGAGCCCGC ACGACCTTGT GGTAGACACG GTGGGTACCG TCTACCACAG CCGTTTTGGT
1081 TCGGACGCAG AGGCTTCTGT GATGCTGAAA AGGGCTGATG GCTCTGAGCT GTCGCACCGT
1141 GAGTTCATCG ACTATGTGAT GAACTTCAAC ACGGTCCGCT ACGACTACTA CGGTGATGAC
1201 GCGAGCTACA CCAATCTGAT GGCGAGTTAT GGCACCAAGC ACTCTGCTGA CTCCTGGTGG
1261 AAGACAGGAA GAGTGCCCCG CATTTCGTGT GGTATCAACT ATGGGTTCGA TCGGTTTAAA
1321 GGTTCAGGGC CGGGATACTA CAGGCTGACT TTGATTGCGA ACGGGTATAG GGACGTAGTT
1381 GCTGATGTGC GCTTCCTTCC CAAGTACGAG GGGAACATCG ATATTGGGTT GAAGGGGAAG
1441 GTGCTGACCA TAGGGGGCGC GGACGCGGAG ACTCTGATGG ATGCTGCAGT TGACGTGTTT
1501 GCCGATGGAC AGCCTAAGCT TGTCAGCGAT CAAGCGGTGA GCTTGGGGCA GAATGTCCTC
1561 TCTGCGGATT TCACTCCCGG CACTGAGTAC ACGGTTGAGG TTAGGTTCAA GGAATTCGGT
1621 TCTGTGCGTG CGAAGGTAGT GGCCCAGATG GTGAAAAGAG GTGGCGCGTT CGCGCTGTGT
1681 CTTGCGGTGT TGCTTGGGGC GTGTTCATTT AGTTCTATCC CGAATGGCAC GTACCGGGCG
1741 ACGTATCAGG ATTTTGATGA GAATGGTTGG AAGGACTTTC TCGAGGTTAC TTTTGATGGT
1801 GGCAAGATGG TGCAGGTGGT TTACGATTAT CAGCATAAAG AAGGGCGGTT TAAGTCCCAG
1861 GACGCTGACT ACCATCGGGT CATGTATGCA TCCTCGGGCA TAGGTCCTGA AAAGGCCTTC
1921 AGAGAGCTCG CCGATGCTTT GCTTGAAAAG GGTAATCCCG AGATGGTGGA TGTGGTCACC
1981 GGTGCAACTG TTTCTTCCCA GAGTTTCAGG AGGTTGGGTG CTGCGCTTCT GCAGAGTGCG
2041 CGGCGCGGCG AGAAGGAAGC CATTATTAGC AGGTAG
第二步，根据第一步得到的TP基因序列和表达载体pGEX4T-3的多克隆酶切位点设计上游引物TP-F1（含有EcoR I酶切位点，即CCGGAATTC）和下游引物TP-R1（含有Not I酶切位点，即ACGTCTAGA），上游引物TP-F1 的序列为：5’-CCGGAATTCTGTGTCTCGTGCACAACC-3’，下游引物TP-R1的序列为：5’-ACGTCTAGACTACCTGCTAATAATGGCTT-3’，然后以第一步得到的TP基因为模板，以TP-F1、TP-R1为引物进行PCR扩增，扩增条件为95℃，5min 预变性；变性94℃，1min，退火58℃，30s，延伸72℃，2min，共35个循环；72℃延伸10min，胶回收得到扩增片段；
第三步，将第二步得到的扩增片段与pGEX4T-3载体连接，转化至Arctic表达菌株中，挑取阳性转化子，提取质粒经酶切鉴定后测序，最终得到重组产TP抗原的大肠杆菌。
实施例2 利用实施例1得到的重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，包括以下步骤：
第一步，种子液制备
挑取实施例1得到的重组大肠杆菌菌株接种到50mL LB培养基（LB培养基中含有50μg/mL氨苄青霉素）中培养15～16h（培养条件为：摇床内晃动培养，晃动速度为230rpm，培养温度为37℃），得一级种子液；
三角瓶（容积为250mL）内加入LB培养基，将得到的一级种子按照10%的接种量接种到三角瓶内进行扩大培养3h（培养条件：摇床内晃动培养，晃动速度为230rpm，培养温度为37℃），得到二级种子液；
第二步，发酵、诱导培养
a）、在发酵培养前预先配置发酵培养基、补料培养基，其中发酵培养基的配方为：蛋白胨20g，酵母浸粉12g，NaCl 10g，葡萄糖13.7g，KH2PO4 1.5g，K2HPO4 2.3g，MgSO4·7H2O0.25g，用滤纯水定容至1L，使得发酵培养基的pH为7.0～7.2；补料培养基的配方为：葡萄糖125g、酵母粉50g、蛋白胨50g、MgSO4·7H2O 5g，用滤纯水定容至1L，使得补料培养基的pH为6.8～7.0；
b）、对生物反应器（Eppendorf NBS Bioflo510，其总体积为20L、培养体积为6L）进行空消灭菌处理，空消结束后，向生物反应器的罐体内注入6L发酵培养基进行实消，实消结束后，将发酵培养基温度设置为37℃自动控制，并向罐体内充入无菌空气使罐体压力维持在0.05MPa；
c）、 向生物反应器的罐体内加入发酵培养基，将第一步得到的二级种子液按5%接种量接种到罐体内的发酵培养基中发酵培养，发酵培养阶段，若发酵培养基的溶氧浓度小于40%，以0.5mL/min的速度补加补料培养基，将发酵培养基的溶氧浓度控制在40%；
发酵培养2h后，每隔15min取样，测定发酵培养基内重组大肠杆菌的OD600；当OD600值为5.0时，对发酵培养基降温，发酵培养基的温度下降至16℃时，向发酵培养基中加入3mL诱导剂IPTG（浓度为0.5mm）开始诱导培养，在诱导培养过程中每隔12h取样，测定OD600值和菌体得率，当培养基中大肠杆菌的菌体得率不再增加时，停止诱导培养（整个诱导培养过程需60～72h）；在诱导培养阶段，若发酵培养基的溶氧浓度小于30%，以0.5mL/min的速度补加补料培养基，将发酵培养基的溶氧浓度控制在30%；
在诱导培养阶段，重组大肠杆菌的菌体得率随着诱导时间的延长而增加，当诱导时间大于60h时，菌体得率增加缓慢并趋于恒定，具体如图1所示；在诱导培养阶段，随着诱导时间的延长，菌体中目标包被TP抗原的表达量越来越大，具体如图2所示；
第三步，分离纯化
a）、诱导培养结束后，收菌，离心分离得469.83g菌体，用pH为7.2的0.1mm磷酸盐缓冲液（即PBS缓冲液）按照1:20（体积比）重悬菌体，混匀后于4℃、10000rpm条件下离心10min，收集菌体，完成菌体的一次洗涤；再次用pH为7.2的0.1mm PBS缓冲液按1:10体积比重悬菌体，混匀后于4℃、10000rpm条件下离心10min，收集菌体，完成菌体的二次洗涤；
b）、用pH为7.6的0.1mm柠檬酸+0.2mm Na2HPO4重悬菌体，混匀后用高压均质机（工作压力为850～950bar）将菌体破碎，菌体破碎（高压均质机破碎三次）后于4℃、10000rpm条件下离心1h，弃沉淀得上清液，用孔径为用0.45μm滤膜对上清液继续过滤除杂，得到纯化菌液；
c）、依次用纯化水（用0.25μm滤膜过滤后的纯化水）、0.1mm柠檬酸、pH为7.6的0.2mm PBS缓冲液平衡GST层析柱，平衡完成后再依次用0.1mm柠檬酸、pH为7.6的0.2mm PBS缓冲液对GST层析柱二次平衡，平衡完成后将纯化后的菌液添加至层析柱内，用pH为8.0的50mm Tris-HCl+10mm GSH+2mm EDTA分离菌液，点样、经薄层色谱分析确定目标物质（即包被TP抗原），用试管收集包被TP抗原；
d）、层析分离完成后，从高浓度到低浓度合并包被TP抗原，直至包被TP抗原的终浓度为2.5mg/mL时停止合并，然后向包被TP抗原内添加20%甘油稀释包被TP抗原，将包被TP抗原浓度稀释至2.0mg/mL，分装置于-20℃下保存。
实施例3 本发明方法的重复性验证
1、对实施例1中纯化得到的包被TP抗原（平行八个样）电泳分析，纯化后的包被TP抗原均能在98.5KDa获得醒目的条带，表明纯化成功，具体如图3所示。
经计算，实施例2纯化后包被TP抗原的得率为11.36mg/g（即每克菌体可表达得到11.36mg包被TP抗原）；经检测，实施例2中纯化后的包被TP抗原纯度为73.14%。
2、重复本发明实施例2所有步骤进行重复验证试验，其结果见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
结果显示，本发明利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法具有很好的重现性。

Claims (8)

1.一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步，挑取重组大肠杆菌菌株接种在LB培养基中培养15～16h，得一级种子；将得到的一级种子接种到LB培养基内扩大培养2～3h，得到二级种子液；
第二步，将第一步得到的二级种子液接种到发酵培养基中，发酵培养2～3h后，取样检测发酵培养基中重组大肠杆菌菌株的OD600值，当OD600值为5～7时，降温，向发酵培养基内加入诱导剂诱导培养60～72h；
其中，在发酵培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度为40%，发酵培养温度控制在35～38℃；在诱导培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度为30%，诱导培养温度控制在15～17℃；
第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原；
其中，所述抗原TP的基因序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：所述第一步中的重组大肠杆菌表达载体为pGEX4T-3，表达菌株为Arctic。
3.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：将所述第二步中发酵培养基的溶氧浓度控制在30%或40%的方法为：向发酵培养基内按照0.5mL/min的速度补加补料培养基，所述补料培养基的配方为：葡萄糖125g/L、酵母粉50g/L、蛋白胨50g/L、MgSO4·7H2O 5g/L，补料培养基的pH为6.8～7.0。
4.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：所述第二步中的诱导剂IPTG，其浓度为0.4～0.6mm。
5.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉12g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖13.7 g/L，KH2PO4 1.5g/L，K2HPO4 2.3g/L，MgSO4 ·7H2O 0.25g/L，发酵培养基的pH为7.0～7.2。
6.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：所述第二步中二级种子液接种量为5%。
7.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：所述第三步中层析分离时层析柱的平衡液为纯化水、0.1mm柠檬酸和pH为7.6的0.2mmNa2HPO4，层析分离液为50mm Tris-HCl、10mm GSH和2mm EDTA的混合液。
8.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：所述第三步得到的包被TP抗原的分子量为98.5KDa、纯度≥72.16%，得率为11.36mg/g。
CN201910723759.5A 2019-08-07 2019-08-07 利用重组大肠杆菌发酵制备包被tp抗原的方法 Active CN110305927B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910723759.5A CN110305927B (zh) 2019-08-07 2019-08-07 利用重组大肠杆菌发酵制备包被tp抗原的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910723759.5A CN110305927B (zh) 2019-08-07 2019-08-07 利用重组大肠杆菌发酵制备包被tp抗原的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110305927A CN110305927A (zh) 2019-10-08
CN110305927B true CN110305927B (zh) 2023-03-28

Family

ID=68082081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910723759.5A Active CN110305927B (zh) 2019-08-07 2019-08-07 利用重组大肠杆菌发酵制备包被tp抗原的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110305927B (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2663642B1 (en) * 2011-01-13 2017-03-01 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Treponema pallidum triplet antigen
CN105542014B (zh) * 2015-12-24 2020-01-17 菲鹏生物股份有限公司 Tp重组抗原及其制备方法和应用
WO2017107131A1 (zh) * 2015-12-24 2017-06-29 菲鹏生物股份有限公司 Tp重组抗原及其制备方法和应用
CN105543144A (zh) * 2016-02-02 2016-05-04 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用
CN107937459A (zh) * 2017-12-06 2018-04-20 慎东 一种可规模化产trim72蛋白的高密度发酵方法
CN109679979B (zh) * 2019-01-11 2023-03-17 四川吉晟生物医药有限公司 表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α-酮戊二酸的生产方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
antigen [Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols;GenBank;《GenBank Database》;19950830;AAA75017.1 *
Treponema pallidum 17 kDa lipoprotein gene, complete cds;GenBank;《GenBank Database》;19930616;M74825.1 *
Treponema pallidum subsp. pallidum 15kD lipoprotein TpN15 gene, complete cds;GenBank;《GenBank Database》;20010320;U73115.1 *
Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols complete genome;GenBank;《GenBank Database》;20150812;NC_000919.1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110305927A (zh) 2019-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111153991A (zh) 一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用
CN109777785B (zh) 杂交瘤细胞株及其应用
CN110305927B (zh) 利用重组大肠杆菌发酵制备包被tp抗原的方法
CN114672447B (zh) 一种具有自絮凝能力的菌株及其制备方法与应用
WO2009107682A1 (ja) ヒト型Ｆｃレセプターをコードするポリヌクレオチド、およびそれを利用したヒト型Ｆｃレセプターの製造方法
CN112574969A (zh) G6pdh突变体及其应用
CN112661820A (zh) 天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用
CN108795891B (zh) 一种葡萄糖氧化酶CnGODA及其基因与应用
CN113564064A (zh) 一种提高毕赤酵母碳源转化率的基因工程改进方法
CN110819609B (zh) 一种热稳定性提高的突变脂肪酶及其制备方法与应用
CN109852652B (zh) 重组尘螨Ⅰ型变应原Der p1和Der f1蛋白的制备与应用
CN110066741B (zh) 一种通过形态优化定向提高丝状真菌代谢产量的突变菌株构建方法
CN109852653B (zh) 重组尘螨II型变应原Der p2和Der f2蛋白的制备与应用
CN102533841B (zh) 一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法
CN110205336A (zh) 一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用
CN111909916A (zh) 一种来源于南极磷虾的双链特异性核酸酶及其制备方法
CN109609481B (zh) 一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的制备方法
CN111978382B (zh) 一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用
CN111004812A (zh) 溶血性曼氏杆菌lkta蛋白原核表达载体的构建方法及检测溶血性曼氏杆菌的试剂盒
CN111909949B (zh) 一种球形孢子丝菌hsp70_5重组蛋白的制备方法及其应用
CN117568349B (zh) 真菌来源启动子元件p22及其应用
CN116179569A (zh) 编码弓形虫sag抗原的核酸及其应用、该抗原的制备方法
CN115197306B (zh) 一种诱导培养基及利用该诱导培养基对mpt64蛋白进行诱导表达的方法
CN116789766B (zh) 一种用于载脂蛋白ai的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白ai的纯化方法
CN116622784B (zh) 一种大麻二酚酸合成酶的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant