CN112574969A - G6pdh突变体及其应用 - Google Patents
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及G6PDH突变体及其应用。本发明提供了G6PDH的突变体，其在具有SEQID.No.1所示的氨基酸序列的葡萄糖6磷酸脱氢酶中的365位谷氨酰胺、218位亮氨酸或61位丝氨酸突变为半胱氨酸。与野生型G6PDH相比，本发明提供的突变体可以通过半胱氨酸上的巯基与小分子待检物定向偶联，精确保证G6PDH与待检物的投放比例。同时本发明提供了突变型G6PDH的制备方法，可作为CG等小分子检测试剂的原料，不仅维持G6PDH活性，还提高试剂稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及G6PDH突变体及其应用。
背景技术
在临床检验领域，小分子激素以及药物等待检物的浓度低、分子量小，无法直接测定，所以将其与某些可以测定的媒介物进行关联，将信号转换为媒介物的易于检测、稳定的信号，实现对该待检物的定性、定量分析。检测方法主要有RIA，Elisa，化学发光、质谱、均相酶免技术等。RIA有两个缺点：放射性元素有害、有污染；分开未与抗体结合的标记待检物，使操作步骤繁琐，降低了自动化程度，并且增加了检测结果的随机性、波动性，降低了精密度。Elisa虽无放射性污染，但整个过程为非均相模式，需要多次洗板，操作误差大，检测时间久；化学发光技术和质谱技术准确度高，但仪器成本高，国内开展的医院并不多。
EMIT技术由Syva公司在1972年开发成功。该技术为全液相反应，无需分离步骤，同时结合了抗原抗体反应的特异性、酶促反应的高效性、专一性，从而实现了检测的高特异性和高灵敏性。EMIT技术是以酶标记抗原为基础的标记免疫分析经典技术。酶相对于放射性元素，无放射性污染；与抗体结合的酶-待检物失去酶活性，因此不需要将与抗体结合的酶-待检物和游离的酶-待检物分离，即可直接测定酶活性，操作简便易行，易与自动化仪器融合、推广使用。同时酶作为标记物，酶促反应不断转化底物生成产物，极大地提高了检测信号强度，增强了试剂检测的敏感性。
即便如此，基于EMIT技术的试剂盒往往稳定性不够理想，表现为G6PDH纯化复杂导致酶活不稳定，G6PDH热稳定性不够，G6PDH小分子偶联物自身稳定性差，批间差异大等问题。但目前，G6PDH的与小分子偶联的效果仍不理想。研究表明，G6PDH通过氨基与小分子偶联，G6PDH-小分子偶联物为混合物，不单一，且K21、K182、K183、K343、K386等位置对它的活性至关重要，而如果小分子偶联到这些氨基酸，会降低G6PDH的活性，因此导致试剂盒开发难度大。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供G6PDH突变体及其应用，以在维持G6PDH活性的基础上，提高G6PDH与小分子偶联的效果，保证其稳定性。
本发明提供了G6PDH突变体，其包括Q365C、L218C、S61C突变中的至少一种。
所述G6PDH突变体的野生型序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述的三个突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、3、4所示。
本发明所提供的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，具有比酶活高，可与小分子定向偶联等特点，适合应用于基于均相酶免疫试剂盒的开发。并且经验证，本发明所述的突变体与CG(甘胆酸)进行偶联后，性质稳定，37℃加速7d后，酶活降幅在10％以内。
本发明还提供了编码所述G6PDH突变体的核酸。
其中，编码野生型G6PDH的DNA序列如SEQ ID NO:5所示，编码突变体Q365C的DNA序列如SEQ ID NO:6所示，编码突变体L218C的DNA序列如SEQ ID NO:7所示，编码突变体S61C的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明还提供了包含所述核酸的表达载体。
本发明中，所述表达载体的骨架载体为pET系列载体，一些实施例中，采用pET-28a作为骨架载体。
本发明还提供了表达所述G6PDH突变体的重组宿主。
所述重组宿主采用原核表达系统或者真核表达系统。优选采用原核表达系统。本申请中采用大肠杆菌作为表达所述G6PDH突变体的宿主。所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
所述重组宿主的构建方法包括，将构建的表达载体转化入大肠杆菌DH5α中扩大培养，然后提取阳性克隆的质粒转化入BL21(DE3)感受态，复苏获得重组宿主。
所述G6PDH突变体的制备方法，其包括：表达所述G6PDH突变体的重组宿主经培养、诱导表达后，破碎菌体，经硫酸铵沉淀后，以含有咪唑的缓冲液上样至金属螯合层析柱进行纯化，获得所述G6PDH突变体。所述诱导表达采用IPTG。
本发明所述制备方法中的纯化步骤，可以缩短纯化时间，最大限度保证酶活稳定性；同时提高酶纯度，获得比酶活高的酶。
本发明所述G6PDH突变体与小分子化合物的偶联物；
所述小分子化合物包括甘胆酸(CG)、茶碱、苯妥因、巴比妥类、霉酚酸中至少一种，或上述化合物中任一种的衍生物或类似物。
例如，所述偶联物由G6PDH突变体与小分子化合物制得，所述小分子化合物为甘胆酸、甘胆酸的衍生物或甘胆酸的类似物。
所述偶联物由G6PDH突变体与小分子化合物制得，所述小分子化合物为茶碱、茶碱的衍生物或茶碱的类似物。
所述偶联物由G6PDH突变体与小分子化合物制得，所述小分子化合物为苯妥因、苯妥因的衍生物或苯妥因的类似物。
所述偶联物由G6PDH突变体与小分子化合物制得，所述小分子化合物为巴比妥类化合物、巴比妥类化合物的衍生物或巴比妥类化合物的类似物。
所述偶联物由G6PDH突变体与小分子化合物制得，所述小分子化合物为霉酚酸、霉酚酸的衍生物或霉酚酸的类似物。
以CG为例，所述G6PDH与小分子化合物偶联物的制备方法包括：
以PBS缓冲液溶解G6PDH至G6PDH浓度为0.1mg/mL，
以DMSO溶解CG衍生物至CG衍生物浓度为0.1mg/mL，
G6PDH溶液与等体积的CG衍生物溶液混合，室温振荡反应3h，制得G6PDH与CG的偶联物。
其中，所述CG衍生物为含有马来酰亚胺基团的甘胆酸衍生物，其结构简图为
通过超滤脱盐纯化偶联的酶标抗原，得到6磷酸葡萄糖脱氢酶-甘胆酸衍生物偶联物，于-20℃储存。
本发明还提供了一种小分子化合物的检测试剂，其包括本发明所述G6PDH突变体与小分子化合物的偶联物；所述小分子化合物包括甘胆酸(CG)、茶碱、苯妥因、巴比妥类、霉酚酸中至少一种，或上述化合物中任一种的衍生物或类似物。
所述检测试剂中还包括适用于均相酶免疫分析的试剂。
本发明还提供了一种小分子化合物的检测方法，其采用所述的检测试剂，通过均相酶免疫分析法进行检测；
所述小分子化合物包括甘胆酸(CG)、茶碱、苯妥因、巴比妥类、霉酚酸中至少一种，或上述化合物中任一种的衍生物或类似物。
本发明提供了G6PDH的突变体，其在具有SEQID.No.1所示的氨基酸序列的葡萄糖6磷酸脱氢酶中的365位谷氨酰胺、218位亮氨酸或61位丝氨酸突变为半胱氨酸。与野生型G6PDH相比，本发明提供的突变体可以通过半胱氨酸上的巯基与小分子待检物定向偶联，精确保证G6PDH与待检物的投放比例。同时本发明提供了突变型G6PDH的制备方法，可作为CG等小分子检测试剂的原料，不仅维持G6PDH活性，还提高试剂稳定性。
附图说明
图1 G6PDH野生型及突变体SDS-PAGE结果。
具体实施方式
本发明提供了G6PDH突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1突变株文库构建
对于SEQID.No.5所示的序列，利用全基因合成的方法进行合成，并直接合成到pET-28a载体上，以此得到的质粒G6PDH-pET28a为以下突变PCR的模板。
突变PCR反应体系50μl，包括：
表1
| 名称 | 体积(ul) |
| 10×PCR buffer | 5 |
| dNTPmixture(各2.5mM) | 5 |
| 引物(10mM，正向和反向) | 4 |
| Pfu酶(5U/ul) | 1 |
| 模板(10ng/ul) | 2 |
| 水 | 33 |
PCR反应条件：预变性，95℃5分钟；变性，95℃30秒；退火，55℃30秒；延伸，68℃，时间按1kb/分钟计算；终延伸，72℃10分钟；降温至16℃取出，进行后续实验。
DpnI酶切消化PCR产物中加入2μLDpnI酶和5μL10×DpnI buffer，振动混匀并离心，放入37℃培养箱酶切过夜。
模板纯化，感受态转化由于PCR扩增产物是质粒，不需要普通PCR流程中的连接步骤，模板回收后直接取2μL转化DH5α感受态菌株，涂布到氨苄抗性的LB平板上，37℃培养箱倒置过夜培养。单克隆鉴定挑取单克隆进行扩大培养，取质粒送到华大基因测序。
实施例2突变文库的筛选
阳性克隆转入BL21DE3宿主细胞，野生型克隆作为对照；经IPTG，16℃诱导过夜，4000rpm离心收菌，去掉培养基。菌体经超声破碎、离心，上清酶粗品进行酶活测定。
具体检验原理为：
G6PD在NADP存在条件下催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖醛酸和NADPH。在340nm处测定NADPH的生成速率，即可测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性。
本发明通过对50株突变株的筛选，最终选取3个比酶活高的突变株，为G6PDH-Q365C(βK)、G6PDH-L218C(βG-αh)和G6PDH-S61C(αb)。
实施例3酶突变体的纯化
本发明中突变体酶的N端带有His标签，可经过金属螯合层析进行纯化。菌体使用0.02M Tris+0.15M NaCl pH 7.5缓冲液复溶，复溶比例1:20，超声破碎后1000rpm 4度离心30min，取离心上清，冰浴条件下缓慢加入固体硫酸铵，终浓度为50％，搅拌30min后高速离心去除沉淀，上清缓冲液置换到Ni柱上样缓冲液0.02M Tris+0.15M NaCl pH 7.5+0.02M咪唑中，200mM咪唑解离；解离样品透析到0.02M Tris+0.15M NaCl pH 7.5缓冲液。简单的两步纯化酶纯度可达97％左右。如图1所示。
上述纯化的酶进行酶活测定，如表2所示，上述3个突变体的酶活和野生型的接近。
表2突变体酶活测定
通过简单的两步纯化，缩短纯化时间，对酶活起到保护作用，且获得高纯度酶。通过此种方法纯化的酶，酶活稳定，分别于-20℃、37℃放置7天，以-20℃放置的样品为对照，使用HITACHI7060型全自动生化分析检测37℃样品的酶活。结果如表3所示，酶活几乎无损失。图中P20、P33代表生化仪在特定时间点读取的吸光度值(其中P20是生化仪在第6min读取的吸光值，P33是生化仪在第10min读取的吸光值)，ΔP代表吸光度增加值，直接反应酶活。
表3突变体G6PDH-S218C和Q365C加速稳定性
剩余酶活＝ΔP(37℃)/ΔP(-20℃)*100％
实施例4
取G6PDH-Q365C突变体进行验证。通过酶突变体的半胱氨酸巯基与小分子CG实现定向偶联，方法如下：
1)G6PDH-Q365C用0.05mol/L Tris pH7.4溶解成0.5mg/ml，b.称取适量的CG衍生物，用二甲基亚砜(DMSO)溶解成5mg/ml，c.在G6PDH-Q365C溶液中缓慢均匀的加入相应体积的CG衍生物溶液，置于室温震荡反应2h。
2)通过超滤脱盐纯化偶联的酶标抗原，得到6-磷酸葡萄糖脱氢酶-甘胆酸衍生物偶联物，于-20摄氏度储存。
G6PDH-Q365C-CG偶联物置于37℃考核其稳定性，结果如表4所示：
表4 G6PDH-Q365C-CG偶联物稳定性
由图4的实验结果可以看出，G6PDH突变体-CG偶联物放置于37℃，加速7d后，酶活稳定性降幅在10％以内，稳定性满足试剂盒开发需求。
实施例5
甘胆酸(CG)抗体抑制率检测：原理基于样本中的甘胆酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)偶联物之间对于特异性抗体结合位点的竞争。该抗体与酶复合物的结合后，可部分抑制G6PDH的活性。通过比较抗体添加前后的酶活差异，评估抗体对G6PDH的抑制能力。一般来说抑制率越高，G6PDH突变体效果越好。CG抗体(1:3000)或酶稀释液与G6PDH-CG偶联物等体积混合，37℃孵育5-10min，340nm处测定G6PDH酶活性：
抑制率％＝(1-(R1+Ab)/R1)×100％
检测结果如表5
| R1 | R1+Ab | 抑制率 | |
| G6PDH-Q365C-CG | 0.4445 | 0.2136 | 52％ |
| G6PDH-S61C-CG | 0.4413 | 0.2731 | 38％ |
| G6PDH-L218C-CG | 0.446 | 0.2438 | 45％ |
如表5所示，Q365C突变体的抑制效果更高，因此，选用G6PDH-Q365C-CG偶联物，作为甘胆酸检测试剂盒进行吸光度定标梯度反应。
结果见表6
因此基于本发明所提供的葡萄糖6磷酸脱氢酶突变体，可应用于均相酶免技术，实现G6PDH与小分子药物的定向偶联，高稳定性试剂盒的开发。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司
<120> G6PDH突变体及其应用
<130> MP2002790
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Ser Glu Ile Lys Thr Leu Val Thr Phe Phe Gly Gly Thr Gly Asp
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Pro Ser Val Phe Asn Leu Tyr Lys Lys
20 25 30
Gly Tyr Leu Gln Lys His Phe Ala Ile Val Gly Thr Ala Arg Gln Ala
35 40 45
Leu Asn Asp Asp Glu Phe Lys Gln Leu Val Arg Asp Ser Ile Lys Asp
50 55 60
Phe Thr Asp Asp Gln Ala Gln Ala Glu Ala Phe Ile Glu His Phe Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Ala His Asp Val Thr Asp Ala Ala Ser Tyr Ala Val Leu Lys
85 90 95
Glu Ala Ile Glu Glu Ala Ala Asp Lys Phe Asp Ile Asp Gly Asn Arg
100 105 110
Ile Phe Tyr Met Ser Val Ala Pro Arg Phe Phe Gly Thr Ile Ala Lys
115 120 125
Tyr Leu Lys Ser Glu Gly Leu Leu Ala Asp Thr Gly Tyr Asn Arg Leu
130 135 140
Met Ile Glu Lys Pro Phe Gly Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Ala Glu Leu
145 150 155 160
Gln Asn Asp Leu Glu Asn Ala Phe Asp Asp Asn Gln Leu Phe Arg Ile
165 170 175
Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Met Val Gln Asn Ile Ala Ala Leu Arg
180 185 190
Phe Gly Asn Pro Ile Phe Asp Ala Ala Trp Asn Lys Asp Tyr Ile Lys
195 200 205
Asn Val Gln Val Thr Leu Ser Glu Val Leu Gly Val Glu Glu Arg Ala
210 215 220
Gly Tyr Tyr Asp Thr Ala Gly Ala Leu Leu Asp Met Ile Gln Asn His
225 230 235 240
Thr Met Gln Ile Val Gly Trp Leu Ala Met Glu Lys Pro Glu Ser Phe
245 250 255
Thr Asp Lys Asp Ile Arg Ala Ala Lys Asn Ala Ala Phe Asn Ala Leu
260 265 270
Lys Ile Tyr Asp Glu Ala Glu Val Asn Lys Tyr Phe Val Arg Ala Gln
275 280 285
Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Ala Asp Phe Lys Pro Tyr Leu Glu Glu Leu
290 295 300
Asp Val Pro Ala Asp Ser Lys Asn Asn Thr Phe Ile Ala Gly Glu Leu
305 310 315 320
Gln Phe Asp Leu Pro Arg Trp Glu Gly Val Pro Phe Tyr Val Arg Ser
325 330 335
Gly Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gln Thr Arg Val Asp Ile Val Phe Lys
340 345 350
Ala Gly Thr Phe Asn Phe Gly Ser Glu Gln Glu Ala Gln Glu Ala Val
355 360 365
Leu Ser Ile Ile Ile Asp Pro Lys Gly Ala Ile Glu Leu Lys Leu Asn
370 375 380
Ala Lys Ser Val Glu Asp Ala Phe Asn Thr Arg Thr Ile Asp Leu Gly
385 390 395 400
Trp Thr Val Ser Asp Glu Asp Lys Lys Asn Thr Pro Glu Pro Tyr Glu
405 410 415
Arg Met Ile His Asp Thr Met Asn Gly Asp Gly Ser Asn Phe Ala Asp
420 425 430
Trp Asn Gly Val Ser Ile Ala Trp Lys Phe Val Asp Ala Ile Ser Ala
435 440 445
Val Tyr Thr Ala Asp Lys Ala Pro Leu Glu Thr Tyr Lys Ser Gly Ser
450 455 460
Met Gly Pro Glu Ala Ser Asp Lys Leu Leu Ala Ala Asn Gly Asp Ala
465 470 475 480
Trp Val Phe Lys Gly
485
<210> 2
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Tyr Tyr Asp Thr Ala Gly Ala Leu Leu Asp Met Ile Gln Asn His
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Thr Met Gln Ile Val Gly Trp Leu Ala Met Glu Lys Pro Glu Ser Phe
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Thr Asp Lys Asp Ile Arg Ala Ala Lys Asn Ala Ala Phe Asn Ala Leu
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Lys Ile Tyr Asp Glu Ala Glu Val Asn Lys Tyr Phe Val Arg Ala Gln
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Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Ala Asp Phe Lys Pro Tyr Leu Glu Glu Leu
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Gly Lys Arg Leu Ala Ala Lys Gln Thr Arg Val Asp Ile Val Phe Lys
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Gly Tyr Leu Gln Lys His Phe Ala Ile Val Gly Thr Ala Arg Gln Ala
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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115 120 125
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165 170 175
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225 230 235 240
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245 250 255
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tgggtgttta aaggttaa 1458
Claims (9)
1.G6PDH突变体，其包括Q365C、L218C、S61C突变中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的G6PDH突变体，其野生型序列如SEQ ID NO:1所示。
3.编码权利要求1或2所述G6PDH突变体的核酸。
4.包含权利要求3所述核酸的表达载体。
5.表达权利要求1或2所述G6PDH突变体的重组宿主。
6.权利要求1或2所述G6PDH突变体的制备方法，其包括：表达权利要求1或2所述G6PDH突变体的重组宿主经培养、诱导表达后，破碎菌体，经硫酸铵沉淀后，以含有咪唑的缓冲液上样至金属螯合层析柱进行纯化，获得权利要求1或2所述G6PDH突变体。
7.权利要求1或2任一项所述G6PDH突变体与小分子化合物的偶联物；
所述小分子化合物包括甘胆酸、茶碱、苯妥因、巴比妥类、霉酚酸中至少一种，或上述化合物中任一种的衍生物或类似物。
8.一种小分子化合物的检测试剂，其特征在于，包括权利要求1或2任一项所述G6PDH突变体与小分子化合物的偶联物；
所述小分子化合物包括甘胆酸、茶碱、苯妥因、巴比妥类、霉酚酸中至少一种，或上述化合物中任一种的衍生物或类似物。
9.一种小分子化合物的检测方法，其特征在于，采用权利要求8所述的检测试剂，通过均相酶免疫分析法进行检测；
所述小分子化合物包括甘胆酸、茶碱、苯妥因、巴比妥类、霉酚酸中至少一种，或上述化合物中任一种的衍生物或类似物。
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2020
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