CN112899253B

CN112899253B - 具有dna聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112899253B
Application number: CN202011411677.6A
Authority: CN
Inventors: 尚午; 艾力克斯·诺维科夫
Original assignee: Nanjing Puji Biology Co ltd
Current assignee: Nanjing Puji Biology Co ltd
Priority date: 2020-12-05
Filing date: 2020-12-05
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2040-12-05
Also published as: CN112899253A

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及具有DNA聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用。本发明的DNA聚合酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:2所示和SEQ ID NO:3所示；编码所述DNA聚合酶的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示。同时，本发明提供一种包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的重组载体及其编码的DNA聚合酶、重组载体的制备方法和应用方法。本发明提供的DNA聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用，可在血清或土壤等样本中进行直接的聚合酶链式反应时，对样本溶液中抑制物的耐受性大幅度提高，可在样本溶液中直接有效地完成聚合酶链式反应，检测目标基因序列。

Description

具有DNA聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及具有DNA聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用。

背景技术

DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA合成的酶。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在体外，DNA聚合酶在有金属活化剂存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在聚合酶链式扩增反应中，DNA聚合酶是不可缺少的组分。DNA聚合酶在扩增反应中的作用很关键，被广泛应用于分子诊断、大规模平行测序等检测应用中。DNA聚合酶性能会直接影响扩增效率、灵敏度、保真性等。由于聚合酶链式反应方便、快捷、准确地大规模复制目的基因片段的能力，在生命科学研究与相关领域，如医学检测、感染性疾病检测、法医学检测等，成为了无法取代的技术手段。但是，这些研究应用于体液时，多是基于将样本中的DNA提取纯化之后，然后才能进行后续的PCR扩增反应。因此，如何在体液中直接进行目标DNA序列的直接扩增和鉴定，这一类的DNA聚合酶是行业亟需开发的一类产品。

对于传统的聚合酶链式反应，其将样本中的DNA提取纯化之后进行扩增，这种扩增技术并不适用于一些场景的实际应用，譬如在血清或土壤等样本，这些应用场景涉及的血液或土壤等样本，需要对样本的DNA直接测定，而非提取DNA后进行聚合酶链式反应，而且提取纯化DNA消耗大量的时间，同时可能导致目的基因的丢失的现象；但是，未经DNA提取纯化的样本中含有很多抑制剂会严重抑制聚合酶链式反应，通过降低酶的延伸速度。因此，亟需开发一种能够用于直接扩增样本存在的DNA的DNA聚合酶。

因此，有必要提供改进的技术方案以克服现有技术中存在的技术问题。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种具有DNA聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用，可在血清或土壤等样本中进行直接的聚合酶链式反应时，对样本溶液中抑制物的耐受性大幅度提高，可在样本溶液中直接有效地完成聚合酶链式反应，检测目标基因序列。对血清或土壤等样本溶液浓度的检测耐受度可达到60％以上，远高于行业内最好的检测耐受性为30％。

本发明第一方面提供一种具有DNA聚合酶活性的多肽，所述多肽具有如下所示的氨基酸序列：

(1)氨基酸序列包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列；或

(2)氨基酸序列包括序列A和序列B，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有至少70％序列同一性，序列B与(1)中SEQ ID NO：3序列具有至少70％序列同一性。

优选地，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有至少80％序列同一性，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有至少80％序列同一性。更优选地，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有至少90％序列同一性，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有至少90％序列同一性。更优选地，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有至少95％序列同一性，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有至少95％序列同一性。更优选地，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有至少98％序列同一性，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有至少98％序列同一性。

优选地，所述具有DNA聚合酶活性的多肽能在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中发挥DNA聚合酶功能。

本发明第二方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述的具有DNA聚合酶活性的多肽。

本发明第三方面提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有本发明所述的多核苷酸。

优选地，所述重组表达载体被设计用于真核细胞或原核细胞中表达。

本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组表达载体、或所述宿主细胞基因组中整合有外源的权利要求5或6所述的多核苷酸。

优选地，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。

本发明第五方面提供一种使用本发明所述的宿主细胞产生的DNA聚合酶。

本发明第六方面提供一种制备本发明所述的具有DNA聚合酶活性的多肽的方法，包括如下步骤：培养所述的宿主细胞，使之表达所述具有DNA聚合酶活性的多肽。

本发明第七方面提供一种本发明所述的具有DNA聚合酶活性的多肽的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(i)将表达目的蛋白的宿主细胞离心，重悬后用溶菌酶进行处理；

(ii)水浴，离心，弃沉淀，收集上清液一；

(iii)去除上清液一中的核酸和其他杂质，离心，收集上清液二；

(iv)加入离子交换柱缓冲液，过滤，过离子交换柱，梯度洗脱除杂，收集不同的洗脱峰段，进行蛋白质的分离，得到目的蛋白。

本发明第八方面提供一种本发明所述的具有DNA聚合酶活性的多肽在扩增靶核酸中的用途，所述靶核酸包含在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中。

本发明第九方面提供一种扩增靶核酸的方法，扩增时采用的DNA聚合酶为本发明所述的具有DNA聚合酶活性的多肽。

本发明第十方面提供一种用于扩增靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)本发明权利要求1至4任一权项所述的具有DNA聚合酶活性的多肽和

(ii)一种或多种选自下组的试剂：缓冲液、金属阳离子、延伸核苷酸、引物、探针、去污剂、检测剂、染料、荧光分子、抗凝剂和细胞裂解剂。

本发明第十一方面提供一种本发明所述的多肽、所述的多核苷酸编码的多肽、所述的重组表达载体编码的多肽、所述的宿主细胞表达的发酵液、浓缩液或多肽、所述的DNA聚合酶作为DNA聚合酶的用途。

本发明第十二方面提供一种如本发明所述的多肽、或所述的多核苷酸编码的多肽、或所述的重组表达载体编码的多肽、或所述的宿主细胞表达的发酵液、浓缩液或多肽、或所述的DNA聚合酶在制备DNA聚合酶中的用途。

本发明创造的有益效果：

本发明提供一种具有DNA聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用，可在血清或土壤等样本溶液中直接进行聚合酶链式反应，无需将血清或土壤等样本溶液中的DNA提取纯化之后进行扩增，可广泛应用于诊断和法医分析，比如在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中目标DNA检测，在遗传病的诊断、微生物和病毒感染的诊断、血型分析、环境检测、人类DNA鉴定等方面具有良好的应用效果。本发明提供的具有DNA聚合酶活性的多肽，对样本溶液中抑制物的耐受性大幅度提高，可在样本溶液中直接有效地完成聚合酶链式反应，进行目标基因序列的检测；对血清或土壤等样本溶液浓度的检测耐受度可达到60％以上，远高于行业内最好的检测耐受性为30％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为重组质粒质谱图；

图2为重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图3为Gn DNA聚合酶的扩增实验结果图；

图4为Gn DNA聚合酶的多重引物扩增实验结果图；

图5为Gn DNA聚合酶的全血耐受性实验结果图；

图6为Gn DNA聚合酶的扩增结果Buffer对比图；

图7为Gn DNA聚合酶的高盐耐受的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本文中使用了国际通用的氨基酸的单字母或三字母缩写。

本文所用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，表示多个氨基酸通过肽键连接形成的聚合物。氨基酸可以是天然存在的或人工合成的类似物。

本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，包括但不限于DNA、RNA等。核苷酸可以是天然存在的或人工合成的类似物。

本文中的细胞可以是真核细胞或原核细胞，例如，但不限于细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。

本文中，同源性，例如序列同一性，用于描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。可使用本领域周知的方法来计算序列相同性。例如，可使用EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等，2000，遗传学趋势，16:276-277)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch，1970，分子生物学杂志，48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。或者，可使用NCBI上的BLASTP来计算两条氨基酸序列之间的序列同一性。

本文中，术语“聚合酶”是包括但不限于如酶命名法所定义的EC2.7.7.7类中的一种酶。

本文所述的具有DNA聚合酶活性的多肽是指在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或在其基础上进行突变而获得的多肽。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴定多肽中的必需氨基酸。在丙氨酸扫描诱变中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的DNA聚合酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。

本发明包括多核苷酸序列，该多核苷酸序列为本文所述多肽的编码序列或其互补序列。本文中，编码序列指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种SEQ ID NO:1所示的氨基酸或其突变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始，并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

本发明的表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是整合载体，即，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

本发明的表达载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，本发明的表达载体可以依靠编码本文所述多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，本发明的表达载体可以进一步包括使该载体能够在感兴趣的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。例如，细菌复制起点的例子包括允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。在酵母宿主细胞中使用的复制起点的例子包括2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。用于丝状真菌细胞中的复制起点包括AMA1和ANS1。

可以将本文所述的多核苷酸的一个以上的拷贝插入到宿主细胞中，以增加感兴趣多肽的产生。

在本文中，如果没有特殊说明，本文所提到的特殊样本包括但不限于粪便、血液、血清、唾液、或体液等。

本文还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本文所述多肽的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导所述多肽的表达。在某些实施方案中，本文所述的重组宿主细胞表达本文所述的多肽。将包括本文所述的多核苷酸的核酸构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该核酸构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

本文还涉及宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。

可采用本领域周知的方法将核酸构建体或载体引入宿主细胞，这些方法包括但不限于原生质体转化、感受态细胞转化、电穿孔、接合或转导等。可根据宿主细胞的不同而选择核实的引入方法。

本文还提供一种本文所述多肽的制备方法，该方法包括：在适合于所述多肽表达的条件下培养本文所述的宿主细胞，和回收所述多肽。

可使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许所述多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对这些多肽特异的方法可以检测该多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。

可以使用本领域已知的方法回收本文所述的多肽。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收本文所述的多肽，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化本文所述的多肽以获得基本上纯的所述多肽，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取。

本发明的DNA聚合酶可以在宿主细胞中重组制备并从其分离和纯化。因此，本发明的DNA聚合酶可以被认为是重组酶，特别是分离的重组酶。在某些实施例中，DNA聚合酶是通过重组技术在宿主细胞中制备的，所述宿主细胞不是或不是来自与所述DNA聚合酶来源的生物相同的生物。

本发明的DNA聚合酶可以使用重组DNA技术来产生。可替代地，无细胞表达系统可以用于制备DNA聚合酶。可替代地，可以使用化学合成来产生本发明的DNA聚合酶，从而通过一次一个氨基酸的逐步延伸来产生DNA聚合酶。此类化学合成技术(例如固相合成)在蛋白化学中是众所周知的。

本发明的另一方面提供制备本发明的DNA聚合酶的方法，其包含培养本发明的宿主细胞的步骤。优选的方法包含以下步骤：(i)在适合于表达编码的DNA聚合酶或蛋白的条件下，培养包含一种或多种重组表达载体或一种或多种本发明的核酸分子的宿主细胞；以及任选地(ii)从宿主细胞或从生长培养基/上清液中分离或获得DNA聚合酶或蛋白。此类制备方法还可包含纯化DNA聚合酶或蛋白产物和/或将DNA聚合酶或产物配制成包括至少一种另外的组分例如可接受的缓冲剂或载体的组合物的步骤。

可以使用本领域已知的并且在文献中广泛描述的蛋白的任何纯化技术或其任何组合从宿主细胞/培养基中分开或分离DNA聚合酶。此类技术可以包括例如沉淀，超滤，渗析，各种层析技术，例如，尺寸排阻层析、离子交换层析、亲和层析、电泳、离心分离等。如上所述，可以对本发明的DNA聚合酶进行修饰以携带氨基酸基序或其它蛋白或非蛋白标签，例如聚组氨酸标签(例如His6-标签)，以帮助分离、增溶和/或纯化或鉴定。

在另一方面，本发明提供本发明的DNA聚合酶用于核苷酸(例如dNTP)聚合的用途。因此，本发明的DNA聚合酶可用于将核酸(DNA)链延伸一个或多个核苷酸。

在另一方面，本发明提供本发明的DNA聚合酶在核酸(DNA)扩增或测序反应中的用途。

在另一方面，本发明提供本发明的DNA聚合酶在分子信标测定或链置换测定中的用途，例如，如本文所述。

优选地，在本发明的用途和方法中，本发明的DNA聚合酶在恒定温度下，即在没有热循环的情况下使用。因此，在等温反应中使用本发明的DNA聚合酶是特别优选的。

在等温扩增反应中使用本发明的DNA聚合酶是特别优选的。等温反应在恒定温度下进行。多种等温扩增技术是本领域已知的，包括环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和交叉引物扩增(CPA)。

另一方面，本发明提供使用本发明的DNA聚合酶进行核苷酸聚合的方法。优选地，所述方法包含提供反应混合物，其包含本发明的DNA聚合酶、模板核酸分子、能够退火至模板核酸分子的一部分的寡核苷酸引物和一种或多种核苷酸(例如，三磷酸脱氧核糖核苷，dNTP)；并在寡核苷酸引物退火至模板核酸分子且所述DNA聚合酶通过使一个或多个核苷酸聚合而延伸所述寡核苷酸引物的条件下温育所述反应混合物。合适的条件是本领域众所周知的。优选地，使用恒定温度，并且优选的温度在本文其它地方列出。可选地，检测多核苷酸产物的产生(例如，通过凝胶电泳)。

另一方面，本发明提供使用本发明的DNA聚合酶扩增核酸(DNA)的方法。通常，所述方法包含提供反应混合物，其包含本发明的DNA聚合酶、模板核酸分子、能够退火至模板核酸分子的一部分的寡核苷酸引物(例如2个或更多个引物，例如2、3、4、5或6个引物)和核苷酸(例如三磷酸脱氧核糖核苷，dNTP)；并在寡核苷酸引物退火至模板核酸分子和所述DNA聚合酶通过聚合一个或多个核苷酸以产生多核苷酸来延伸所述寡核苷酸引物的条件下温育所述反应混合物。合适的条件是本领域众所周知的。核酸扩增的优选的方法是等温扩增方法。本发明的等温扩增方法在恒定温度下进行，并且优选的温度在本文其它地方列出。可选地，检测多核苷酸产物的产生(例如，通过凝胶电泳)。

示例性的等温扩增方法包括环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)、多置换扩增(MDA)和交叉引物扩增(CPA)。

在一些实施例，特别是那些使用基于DNA聚合酶功能序列的DNA聚合酶的实施例中，在本发明的方法和用途中使用的恒定温度是低至中等的温度，例如选自0℃至约42℃的范围内，优选选自约10℃至约40℃、或约20℃至约40℃、或约25℃至约40℃、或约30℃至约40℃、或约35℃至约40℃、或约37℃至约40℃的范围内。在一些实施例中，恒定温度选自约10℃至约15℃，或约10℃至约20℃的范围内。在一些实施例中，恒定温度选自约10℃至约30℃的范围内。在一些实施例中，恒定温度选自约20℃至约30℃的范围内。在一些实施例中，恒定温度选自约10℃至约25℃的范围内。在一些实施例中，恒定温度选自约20℃至约25℃的范围内。约25℃的恒定温度是优选的。在一些实施例中，恒定温度为25℃。

对于本发明的其它DNA聚合酶，例如那些基于来自嗜热生物体的序列的聚合酶，恒定温度可以是中等温度至高温，例如选自25℃至65℃，优选40℃至65℃的范围内。

当在反应过程中没有采取任何主动步骤来改变温度时，例如没有热循环时，可以认为温度是恒定的。在此方法期间，“恒”温可能仍会导致例如至多约为5℃，通常不超过3℃或2℃的温度波动。

本发明的DNA聚合酶可用于全基因组扩增。

本发明的DNA聚合酶可用于下一代测序方法中。所谓的“下一代”或“第二代”测序方法(参考作为“第一代”方法的桑格(Sanger)双脱氧核苷酸方法)已经普及。这些较新的技术的特征在于产出量高，例如由于使用并行，例如大规模并行测序反应，或通过耗时较少的步骤。各种高产出量测序方法可提供单分子测序，并采用诸如焦磷酸测序、可逆终止子测序、通过结扎的可切割的探针测序、通过结扎的不可切割的探针测序、DNA纳米球和实时单分子测序的技术。

本文中对本发明的DNA聚合酶的引用包括活性片段，除非上下文另有明确说明。

本发明的用途和方法通常在体外进行。

本发明还提供包含本发明的DNA聚合酶的组合物。此类组合物优选包含缓冲剂。任选地，本发明的组合物进一步包含用于进行核酸扩增反应(例如等温扩增反应)的一种或多种必要的试剂，例如能够退火至待扩增的模板DNA的区域的寡核苷酸引物和/或核苷酸(例如dNTP)。通常，组合物将是水性的，并用标准缓冲剂(例如Tris、HEPES等)缓冲。

本发明进一步包括试剂盒，其包含一种或多种本发明的DNA聚合酶、或一种或多种本发明的组合物、或一种或多种本发明的核酸分子、或一种或多种本发明的表达载体、或一种或多种本发明的宿主细胞或病毒。优选地，所述试剂盒用于本文所述的方法和用途，例如，用于核酸扩增方法，例如等温扩增反应。优选地，所述试剂盒包含用于使用试剂盒组分，例如用于核酸扩增的说明书。

根据本技术领域的惯例，所有核苷酸序列在本文中以5'至3'记载。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域周知和常规的方法和试剂。

实施例1：pET-28a-Gn DNA聚合酶重组表达载体构建

1.高耐受性Gn-DNA聚合酶基因全长的克隆与分析

(1)设计样本浓度高耐受性的DNA聚合酶序列：根据GenBank已公开的一个DNA序列(GenBank登录号：KXB03331)，设计本实施例所述的样本浓度高耐受性的Gn-DNA聚合酶序列，如SEQ ID NO：1所示的序列。样本浓度高耐受性的Gn-DNA聚合酶序列全长，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2)重组质粒pET-28a-Gn的构建

1)酶切：

a)Gn DNA聚合酶片段在37℃酶切2h，并用DNA产物纯化试剂盒(磁珠法)回收酶切产物。酶切体系为：

b)pET-28a载体在37℃酶切2h，并用DNA产物纯化试剂盒(磁珠法)回收酶切产物。酶切体系为：

2)连接：用T4 ligase连接步骤1)酶切后的Gn-DNA聚合酶和pET-28a片段，16℃连接12-16小时。连接体系为：

3)转化：200μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞在冰上解冻后，将步骤2)的连接产物(50ng)加进感受态细胞，混匀。冰上作用30min。42℃热激90s，冰上作用2min。然后加800μl LB液体培养基，37℃摇床180rpm振荡1h。培养物5000rpm离心5min。吸弃部分上清，约留100μl，混匀后，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

4)挑取步骤3)的pET-28a-gn DNA聚合酶菌落若干个，进行质粒DNA小量提取。

5)将提取好的重组质粒一代测序技术测序，验证得到目标DNA序列，重组质粒质谱图如图1所示。

实施例2：重组蛋白的原核表达及体外纯化

1)将实施例1测序验证的阳性重组表达质粒pET-28a-Gn DNA聚合酶转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃摇床培养过夜(16-20小时)。

2)挑取步骤1)中的单个菌落接种5ml含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃摇床培养过夜(16-20小时)。

3)取5ml步骤2)中的培养物接种至500ml含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD600值达到0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导。同时以未加入IPTG的大肠杆菌培养液作阴性对照。20℃诱导表达16h后，5000rpm离心10min，收集菌体称重。

4)1g步骤3)中的菌体加入10ml破菌缓冲液(50mM Tis-HCl，pH 8.0，500mM NaCl)重悬菌体沉淀，超声破碎后，12000rpm离心20min，收集上清即为可溶性总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，如图2所示(泳道1)。

5)第一步纯化：将步骤4)中的上清至于70℃水浴锅加热15min后，12000rpm离心20min，取上清。此步骤可去除大量不耐高温的杂质蛋白，使下一步亲和层析能收集到较单一的洗脱峰产物。

6)第二步纯化：亲和层析，利用AKTA蛋白纯化系统，Ni亲和层析柱(NiSepharose6Fast Flow)，对目的蛋白进行亲和纯化，上样缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH 7.4)，洗脱缓冲液(20mM Na₃PO₄，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)，并收集目标蛋白洗脱峰产物。具体操作步骤如下：

平衡：用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑)平衡柱子，平衡缓冲液及样品中不可有EDTA、Arg等物质，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5-10个柱体积，检测调零后上样；

上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出；

平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

预洗：用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，50mM咪唑)预洗，收集洗脱组分；

洗脱：用洗脱液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，200mM咪唑)洗脱目标蛋白，收集洗脱组分；

洗柱：用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl，500mM咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分。

7)第三步纯化：离子交换层析，将亲和层析得到的目标蛋白，过阴离子柱纯化(QSepharose Fast Flow)，目的是去除蛋白中微量的但会影响后期实验的宿主残留DNA或质粒DNA，进一步提高酶纯度。用不同盐浓度缓冲液分步洗脱，收集各个洗脱组分。因为残留DNA一般在高盐组分中，所以收集低盐洗脱的蛋白质样品，得到目标产物Gn DNA聚合酶。具体步骤如下：

平衡：用缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0)平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5-10个柱体积，检测调零后上样；

上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出；

平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

洗脱：用不同盐浓度缓冲液分步洗脱，经验证，采用缓冲液20mM Tris-HCl，pH8.0，300mM NaCl的洗脱产物为目标产物。

8)收集目标产物，进行SDS-PAGE电泳，如图2所示(泳道2)。

9)将目标产物加入Gn DNA聚合酶储存溶液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mM KCl，0.5％(v/v)NP-40，0.5％(v/v)Tween-20，50％(v/v)甘油，保存于-80℃。

将目标产物进行测序得到氨基酸序列，目标产物测定序列包括SEQ ID NO：2和SEQID NO：3所示的序列。目标产物的测定序列还包括(SEQ ID NO：15)所示的序列，用于依次连接SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列，进一步地增加DNA聚合酶的特殊样本检测的耐受性。

实验过程中，发明人发现，当目标产物的氨基酸序列包括序列A和序列B，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有70％序列同一性，序列B与(1)中SEQ ID NO：3序列具有70％序列同一性。目标产物依然可以发挥DNA聚合酶的功能。大量实验的表明，序列A与(1)中SEQID NO：2序列具有的同一性越高，越有利于发挥DNA聚合酶的酶活功能和各种恶劣的DNA检测环境，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有的同一性越高，越有利于发挥DNA聚合酶的酶活功能和各种恶劣的DNA检测环境。优选地，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有至少80％序列同一性，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有至少80％序列同一性。更优选地，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有至少90％序列同一性，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有至少90％序列同一性。更优选地，序列A与(1)中SEQ ID NO：2序列具有至少95％序列同一性，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有至少95％序列同一性。更优选地，序列A与(1)中SEQ IDNO：2序列具有至少98％序列同一性，序列B与(2)中SEQ ID NO：3序列具有至少98％序列同一性。

实施例3：DNA聚合酶酶活性与扩增效率测试

本实施例中测试了Gn DNA聚合酶的活性；同时比较了Gn DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶(采购自北京索莱宝科技有限公司，货号M1665S)的对目标产物的扩增效率，使用的模板为人的基因组DNA，扩增产物大小分别为424bp、932bp、2685bp。

扩增产物为424bp体系的引物序列：

S-F：CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGCA(SEQ ID NO：4)；

S-R：ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTA(SEQ ID NO：5)；

扩增产物为932bp体系的引物序列：

M-F：GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAACTG(SEQ ID NO：6)；

M-R：TTGTGCCTCTGTAAGCATGTAGCT(SEQ ID NO：7)；

扩增产物为2685bp体系的引物序列：

L-F：TCTCTTGTGTCAGACCCTGTTCTA(SEQ ID NO：8)；

L-R：CAGGAGGTACAGGTGTCTTAGAAT(SEQ ID NO：9)；

PCR反应体系为：

扩增产物为424bp体系的PCR热循环条件为：95℃，30s；

30cycles*(95℃，15s；58℃，15s；72℃，30s)；72℃，5min。

扩增产物为932bp体系的PCR热循环条件为：95℃，30s；

30cycles*(95℃，30s；58℃，30s；72℃，45s)；72℃，5min。

扩增产物为2685bp体系的PCR热循环条件为：95℃，30s；

30cycles*(95℃，60s；58℃，30s；72℃，60s)；72℃，5min。

琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，实验结果通过比对扩增产物条带亮度来体现。

结果表明，使用Gn DNA聚合酶能成功扩增出3种大小不同的DNA片段，条带大小分别为424bp、932bp、2685bp。说明Gn DNA聚合酶具有延伸活性。

Gn DNA聚合酶的扩增条带亮度明显高于Taq DNA聚合酶，说明Gn DNA聚合酶对目标产物具有更高的的扩增效率，通过Image Lab软件分析电泳图，得出Gn DNA聚合酶扩增效率比野生型Taq DNA聚合酶高至少4.5倍。

实施例4：DNA聚合酶保真性测试

以蓝白斑的方法测试实施例2所制备得的Gn DNA聚合酶的保真性能，以pUC19质粒为模板，用实施例2的Gn DNA聚合酶、市售Taq DNA聚合酶(采购自北京索莱宝科技有限公司，货号M1665S)分别扩增全长质粒，测定各酶的扩增倍数。

扩增产物的长度为L，扩增倍数D，符合公式：D＝PCR产物量/起始模板量。

Dpn I消化模板质粒并酶切、连接后转化DH5a细胞，涂布含IPTG和显色底物X-Gal的平板，并计数蓝白斑。突变频率MF，符合公式MF＝白斑数/菌落总数。以公式ER＝MF/(L×D)计算不同DNA聚合酶扩增错误率，DNA聚合酶的保真性为1/ER，错误率越低，其保真性越好。结果如表1所示，表明：Gn DNA聚合酶保真性能良好，其保真性为Taq聚合酶的5.2倍。

表1

实施例5：多重PCR引物对数测试

以人基因组DNA为模板，设计引物(引物总浓度5μM)变量的对数分别为1对(实施例3中的S-F、S-R)、3对(XS-F：GCGCCGTTCCGAAAGTT(SEQ ID NO：10所示的序列)，XS-R：CGGCGGATCGGCAAA(如SEQ ID NO：11所示的序列)；实施例3中的S-F、S-R和M-F、M-R)、24对(采购自ThermoFisher公司，货号：4476135)、207对(采购自ThermoFisher公司，货号：4475346)、1600对(采购自ThermoFisher，货号：4477685)，分别使用实施例2的Gn DNA聚合酶、市售Taq DNA聚合酶(采购自北京索莱宝科技有限公司，货号M1665S)进行扩增，其他反应条件相同。扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果显示是否扩增成功。

PCR反应体系如下：特异引物混合物2μL(5μM)；DNA模板/质控品50ng；2×Gn DNA聚合酶工作液(Gn DNA聚合酶用量为0.5U)12.5μL；无核酸酶水将体积补足至25μL。

PCR反应条件：

(1)98℃，激活5min；循环1次；

(2)98℃，变性15s；62℃，退火30s-10min；72℃，延伸2min；(循环30次)；

(3)72℃，延伸10min；循环1次。

注：退火时间随着引物对数增加而增加

表2

酶	1对	3对	24对	207对	1600对
						退火时间	30s	1min	2min	6min	10min
Gn DNA聚合酶	成功	成功	成功	成功	成功
						Taq DNA聚合酶	成功	失败	失败	失败	失败

从表2中结果可以看出，在引物对数只有3对时，Taq DNA聚合酶的扩增效果开始变差，当引物对数为24对时，Taq DNA聚合酶已经无法扩增，而Gn DNA聚合酶能够在1600对引物条件下扩增成功，如图4所示。

实施例6：血液耐受性能

使用新鲜采集的人全血在PCR反应中测试Gn-DNA聚合酶扩增不同长度PCR扩增子的能力。在含有20mM Tris-HCl(pH 8.4)和20mM KCl的缓冲液中进行反应。反应组分如表3所示，其中Gn DNA聚合酶的加入量分别为60、40和20ng。该测定的PCR循环过程如表4所示。

表3.PCR检测体系，总体积50μL

组分	浓度	体积(μL)
			人全血	-	10
Gn DNA聚合酶	20ng/μL	1.0,2.0,3.0
			dNTPs	10mM each	1.0
Primer-L	10μM	2.0
			Primer-R	10μM	2.0
Tris-HCl(pH 8.4)	2M	0.5
			MgCl<sub>2</sub>	25mM	4.0
KCl	1M	1.0
			Triton X-100	1％	5.0
water	/	21.5,22.5,23.5

引物序列如下：

Primer-L：TAGTGGTGGCTGACCTGTTCTCT(SEQ ID NO.12)；

Primer-R：TCGTCGATCTCCTGTTGGACA(SEQ ID NO.13)；

表4、PCR循环参数

将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，并评估产物是否存在，以及正确片段大小的条带强度。测试结果显示在图5中。从图5中可看出，实施例2所制备得的Gn DNA聚合酶对全血的耐受性，可以高达60％的全血比例，Gn DNA聚合酶的扩增效率依然没有受到影响，甚至在80％的全血比例，Gn DNA聚合酶仍有功能。

从图6中可看出，采用针对Gn DNA聚合酶的Buffer B，相比一般的Buffer R(购自北京索莱宝科技有限公司)更能够降低PCR反应中非特异性扩增的产生。进一步地，可看出应用实施例2所制备得的Gn DNA聚合酶扩增目标基因的产物长度可高达2kb。

实施例8高盐耐受性能

在存在高或低浓度KCl的情况下，在PCR反应中以γDNA(购买自上海泽叶生物科技有限公司)为模板测试Gn DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶扩增1.46kb PCR扩增子的能力。反应在含有20mM Tris-HCl(pH8.4)的缓冲液中进行。示例性反应组分显示在表5中。该测定的PCR循环过程显示在表6中。

引物序列如下：

Primer-1：TACACGAACCTGATGAACA(SEQ ID NO.14)；

Primer-2：TCTAACTATTACCTGCGAACT(SEQ ID NO.15)；

表3PCR检测体系示例。总体积为50μL表5.PCR检测体系，总体积50μL

组分	浓度	体积(μL)
			γDNA	100ng/μL	0.1
Gn DNA聚合酶	20ng/μL	1.0,2.0,3.0
			dNTPs	10mM each	1.0
Primer-L	10μM	2.0
			Primer-R	10μM	2.0
Tris-HCl(pH 8.4)	2M	0.5
			MgCl<sub>2</sub>	25mM	4.0
KCl	2.5M	1.0,3.0
			Triton X-100	1％	5.0
water	/	36.9,34.9

表6、PCR循环参数

将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，并评估产物是否存在，以及正确片段大小的条带强度，实验结果显示在图7中。

Taq DNA聚合酶在含有50mM KCl的10mM Tris-HCl缓冲液中可以扩增，但产量低于Gn-DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶在含有150mM KCl的PCR体系中没有扩增，而Gn-DNA聚合酶可以扩增，且产物量相较于50mM KCl体系没有明显变化，表明Gn-DNA聚合酶比Taq DNA聚合酶更耐盐。

实施例9：Gn DNA聚合酶对检测样本浓度的耐受性

与实施例6不同的是，使用的样本为土壤，实施例2所制备得的Gn DNA聚合酶对样本的浓度耐受范围为至少为40～80％。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 南京普济生物有限公司

<120> 具有DNA聚合酶活性的多肽、重组载体及其制备方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6456

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 1

cctatggtgg aagcgctgga gcgggctctg ggtcagagaa taagggttta gaattactta 60

ggtttgctaa tagggcaccc ctcatattta atcaaggtgg ttgtgcggtc acatctgctg 120

ctagagatat agattggcgt agatataacg tgaatccaga aaagacccca ataacactct 180

tcatcaacgt ggtttcagtg cacgttccat atacctcggc tggcaagcaa tccgtcgcag 240

aggagcctga aatttacgaa gaaattagac aggcaatcat ggaatcaact agaaatctta 300

agagtttcct ccgcagaaag ataaaaagga gagaacgtaa agagagggcg ggaatatttg 360

agaaatacat accaataatc gcccgaagag cagcagccct cactgacaag aaggttcctg 420

atgctgaacc tctcattaaa gagataacag gtgttgatga tgccaaagaa aaagaagact 480

aaagatccga gaaaggaagc caaaaagaag cttgtagaat tcggctcgga agtcttagag 540

tccatcaaga agacagaacc accaaggatg aaagtcccct cacgaagcac ctccaacata 600

ttatatgacg ataaaaatcg attttacacc ctcggcgaaa aagtgggcac taggacagca 660

gcaaacatga ggcaagtgaa aaaattcgca caaacaatgt gcgccgcaga attctgcagg 720

agtttaattg acgccgataa gactgcaacc ctccgggaaa tgtattacac ttccgaagga 780

tgggagactg gaggcttctc agatcaaggt cgctcagaca aggtagttga agacctcgaa 840

tccgccttcg gcgtaaaacg agaagacctt ggactcctcc ccgaagagga tggagcatcc 900

atctttggag aattagtagt ggatgaaggg ggaatggaag tgaatgcaac agaagctggc 960

cgagccggct atacgatccc accaacaatg aatgatgtag aatttcttga atgcgacgcc 1020

aagaaagtgt tagccgtaga aaccatgggc atgtaccacc gattagtaca ggaagaagct 1080

tgggatcaat ttgatgcact cgtagtcgca ttaaagggac aaccagctcg agcaactcga 1140

agattcctca aacgtgcaaa cgaagaatta ggcttaccaa tacacttgtt tacagatgga 1200

gatccattcg gattccatat cgcaatggtc gtaatctctg gaagtgcaaa actcgcttac 1260

atcaatcacg agttagcagt tcccgacgcc aaattcatag gcgtgactgc gagtgacatc 1320

gaggattatg acctacccac agacaagctt cgagaaacag atgtcaagag actaaagcag 1380

ctcttagacg atccccgata cagcgatgac acttggcaat ccgaaatcaa aaaaatgttg 1440

aaaataggaa agaaggcaga gcaacaggcc ttctctaaat acggtttaga ttacgtggtc 1500

aatgagtact tgccatcaaa actcagttaa tgactaaaaa ttacttagag agattcacga 1560

cttgatactc tccatcttca agaccagcca tagttgcagc cttttcaaca gcattattgt 1620

agtctccaag gttatcaacc aatccgtaag ttaaagcatc agaaccgtag acaatcgagc 1680

catctttaag atcgcttatc ctattctcaa actcctcttt attatcagga actttcccag 1740

cacgattatt aattatccgc tcaaacaact cgttagcata atcatcaacc aaattctcta 1800

ttttagcaat ctcattttca gtggggtcac gccaaggtgc aaaccagtcc ttttgctcgc 1860

cactcttcca aataaaatag tcgattccct tattctcata gtagtcctcg taactcaccc 1920

acttagccat gactcctaat ccggcagtga ctgtctgtga atgtgcgtaa atatagtccg 1980

aagcagaagc tatgagataa gctccagaag cagcgtattc ttcaagatca gccactaccg 2040

gtttttctgc tactaatgta gagagtgatt cttcagtttg aaagcacgca ttagcagaac 2100

ctccagggct cctgaacttg acgacgaccg cctttatgct atcgtcgtca agtgcgtctt 2160

ctatctggtg aacatattca aaattgtaga cagtatcgtc tatcgtgact acccctactt 2220

tggcggatgg tggggccaga tagatattgt atgcaaaggc tccggcggtt gataaacccc 2280

cgataatgac tatgagtatt attaagcgcg ttaactctcg ggaaaggccc tcttcatcag 2340

aaatgaatct cctcattact gcataacccc aaccatgcta atcttttgaa actaaaatag 2400

gttcccatat gaaaatttta acttatggca aatcagacaa caaatggtga tcatatggaa 2460

ggcctgctcc tagatagcga ttatctcaaa actcgcaaac ccccagcaat gagactattc 2520

atcaaaaaag atgggggaat agtcaccgtc ctagatccac atttcactca ttatttttat 2580

gtagaatctg aaaatcctca aaaaatagct aaagcgatag agagggtcga agcggaaaag 2640

tatgggaaaa aagtaagccc aaagtcaact aaggttgtcg aacgcaagtt tctcggtgaa 2700

gagaagaaag tcattaaagt cctagcagac agtccccgag atataactcc attaagaaaa 2760

gaaatcaaag attttcctga agtcaaggga ttttacgagc acgacattcc tccagccaga 2820

cgatacctca tagaacacga attaacccca atgagcgggg taaaggcaga gggagaatca 2880

caaaaaggtg attatggcga ggaattagta ctcaccaaac cgcctgagtc aatcgaagga 2940

gcagacgaag aactcaatat cctcgccttt gacatagaaa cctacagtcc cacaggcaat 3000

cctcgcgccg aaaaagatcc aatagtaatg ataagtgttt cagataatca aggcttagag 3060

aagatcctta catggaaaga ttttgaccta aatctagatt atgtggaagt tttagatgat 3120

gaaaaatcaa tgattgagag atttatccaa ttagttcaag aatgcgatgc agacatcata 3180

atgggctaca acacagacct ctttgacttc ccatacctaa ctcaacgagc agaaaaacta 3240

gacatcaagc tagaactcgg tagagacggt tcagaaccct caactaagaa aaggcgattc 3300

gctacagtaa ccaaaattgc tggcagagtc cacgcggacg tttatgcaat ggtcgaattc 3360

ctttcgcgaa ttggagcaat tagattgata gattacaccc ttgaaaatgt ttacaagcac 3420

gtgataggga aggaaaaacc cgatttagaa tacagtgaca ttccaaaagc ttgggatgaa 3480

ggaggggaaa aagctagaga gttagtagag tactcgttat ctgacgctaa ggcaactcta 3540

gagctaggca ctgaaatact tccattattc actgaactga gtcgaaccgt gaaacaatca 3600

ctctttgatg tttcgcgaat gactccaggc caattggtag agtggctcct aatcttcaat 3660

gctcataaga tcaacgaact catcctcccg cgcccgctag gacgagaata caagagacgg 3720

cgtggtgaga cttatattgg tggttatgta aaggaaccga cgccaggtct tcatgaggat 3780

ctcgtagtct ttgattttcg ctctctatac ccgaccataa tcattactca caatattgat 3840

ccagcgacac tcgatgggga gcgttgtccc tcagaagaaa ctgtgacagc tccagatctt 3900

gaatacgagt tctgtcaaga tcggaagggt ttcattccgg agacattgaa agggcttgtt 3960

gaaggaagag caaaattaaa gcaggagatg agtcaacttg atgaggagag tagagaatac 4020

caatccctct ataatagaca atgggcactc aagatcatag cgaactcatt ctatgggatg 4080

cttggatacc ctcgagccag atggtattct aaagaatgtg cagaaagcgt tacgagcttc 4140

ggccgtcact atattaaaga cacgattgag atggcgaaag acgaaggatt tgaagtcatc 4200

tatggggata ccgattccct cttcgctaag ctcaatggga aaagtcgaga agatgtcgaa 4260

aatttcctga ataaggtcaa tgagagcttg ccagggataa tgaaactcga gctggaggat 4320

tactacaagc gaggagtatt cgtcaccaaa aaaagatacg caatgatcag cgaggatgac 4380

aaaatagtcg ttaagggact cgagttcgtc aggcgtgact gggcagctct ggcgaaaaga 4440

actcaagagc aagtcatcga agcaatccta cacgacgctt ctccagaaaa agcagcgaaa 4500

attgttctcg aaactaccaa agccatcaag caaggagagg tagatttaga tgacctagta 4560

attcacactc aactcaaaaa accactagat gaatacaagg ccagaggccc tcacgtggct 4620

gccgctgaga ggctccaaaa attgggtgaa gaagtagaac caggaatgac gataacctac 4680

atagttgaaa aaggatctgg aagcataagt gatcgagcca ttcccccatc cgattttgaa 4740

ggaagagatt acgatccaga ttattacgtt gagaatcaag tactcccagc agtgatgcgc 4800

atcatggaag tcctagatta tggtgaagaa gatttacgtc atgaggaaac gcgacaagta 4860

aaactcggaa aattcaaata atggattatg agatcatgac atccccgtca gaagtcaaga 4920

ccaaacttat cttctcagag gctatccgcc catcaagctt ttctccagct tgagtcttaa 4980

tctccgaaac caatcccgga gtatctagtg aaaccttgag atctgcacca tctgcagcct 5040

taaaaaggcg ttttgcagcg tctaaaatgt cttccccagc ctctatcatt attgacgctg 5100

gtgccttaat cttctcagcg agcgctaatg tctctttcgc gcgcttgatg ttgcgttttg 5160

ctcgctgctc aatcgaacaa atgtttgcgc gtgaggtccc tagtttccgc gcgatttctg 5220

cttgggttaa tccgctgttc ctgagcttga gtatttttac ttgagtctcg gtcaggaacg 5280

tgttctcacc agtcatcgtg tttaacctca ccttgtttac aaatgaattt ttattatgac 5340

catctactta cttagaggaa cctaacaata gtgtttcccc actaaagaat atggtagtga 5400

taagtgtgtt gaatgatgaa aaactcaaga cttaccgaaa ggtcggaaaa ctcacaggtg 5460

aaattagaga taccatccaa gagaaggtga agctaggcga aacactccta aacattgctg 5520

aaacaaccga agaattgatt cgagacaagg gagccgaacc agcattcccc tgcaatgtgt 5580

ccgttaacga gtttgccgcc cactatagcc cacctgaagg cgacgaaacc gaaatcaagg 5640

agggagatct agtaaaggtg gatattggcg cccacataga cggatatatc gcggatacag 5700

ccatttcaat tgcgaccgat gagaaaggcg agaaactagt gaatgcagtt aatcaagtcc 5760

tagaaaaagc catccaggca gttaaaccag gagtcaacgt gggagagatt ggagcagtta 5820

tcgagaatac ggctaatgaa gcaggattca aaccaataga aaacctcacc ggccatagcc 5880

tcgcgcgttg gtcactccac tccggaatca caatcccaaa cgtcgaaaaa gacacggaag 5940

acgaattaaa ggaagacgac gttattgccc tagaaccctt cattactgat ggtgcgggag 6000

aagttgaaga tcaacccgaa gtctatatat tcagatacct gagcagcgag ccggtttccg 6060

gaagaatggc tagacaaacc atccgacgaa tctcaaaaaa atatgggaaa ctccccttcg 6120

cagaaagatg gctagctaga gacatgtcca aaataagatt acaaatgact ctacgcgaac 6180

tcttaacctc tggagcaatc cacccatact acgtcctcaa agaaatcgaa gatggaatgg 6240

tagcccaagc agaacacacc ctaatagtca ccaaagacgg atgtgaagta acaacgcaat 6300

aatgcaaaat tctggctctg ttgatgggat gatagaattc tccgactaga catgcttaac 6360

ttgcttcgcc tccaaaccaa ctatggaggc tcaaattgct acctcgcctt gtcgagcgga 6420

actcgtcttt cagaggctcg gttctcgccc ctgcca 6456

<210> 2

<211> 805

<212> PRT

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 2

Met Leu Leu Asp Ser Asp Tyr Leu Lys Thr Arg Lys Pro Pro Ala Met

1 5 10 15

Arg Leu Phe Ile Lys Lys Asp Gly Gly Ile Val Thr Val Leu Asp Pro

20 25 30

His Phe Thr His Tyr Phe Tyr Val Glu Ser Glu Asn Pro Gln Lys Ile

35 40 45

Ala Lys Ala Ile Glu Arg Val Glu Ala Glu Lys Tyr Gly Lys Lys Val

50 55 60

Ser Pro Lys Ser Thr Lys Val Val Glu Arg Lys Phe Leu Gly Glu Glu

65 70 75 80

Lys Lys Val Ile Lys Val Leu Ala Asp Ser Pro Arg Asp Ile Thr Pro

85 90 95

Leu Arg Lys Glu Ile Lys Asp Phe Pro Glu Val Lys Gly Phe Tyr Glu

100 105 110

His Asp Ile Pro Pro Ala Arg Arg Tyr Leu Ile Glu His Glu Leu Thr

115 120 125

Pro Met Ser Gly Val Lys Ala Glu Gly Glu Ser Gln Lys Gly Asp Tyr

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Val Leu Thr Lys Pro Pro Glu Ser Ile Glu Gly Ala

145 150 155 160

Asp Glu Glu Leu Asn Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr Tyr Ser Pro

165 170 175

Thr Gly Asn Pro Arg Ala Glu Lys Asp Pro Ile Val Met Ile Ser Val

180 185 190

Ser Asp Asn Gln Gly Leu Glu Lys Ile Leu Thr Trp Lys Asp Phe Asp

195 200 205

Leu Asn Leu Asp Tyr Val Glu Val Leu Asp Asp Glu Lys Ser Met Ile

210 215 220

Glu Arg Phe Ile Gln Leu Val Gln Glu Cys Asp Ala Asp Ile Ile Met

225 230 235 240

Gly Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Thr Gln Arg Ala

245 250 255

Glu Lys Leu Asp Ile Lys Leu Glu Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro

260 265 270

Ser Thr Lys Lys Arg Arg Phe Ala Thr Val Thr Lys Ile Ala Gly Arg

275 280 285

Val His Ala Asp Val Tyr Ala Met Val Glu Phe Leu Ser Arg Ile Gly

290 295 300

Ala Ile Arg Leu Ile Asp Tyr Thr Leu Glu Asn Val Tyr Lys His Val

305 310 315 320

Ile Gly Lys Glu Lys Pro Asp Leu Glu Tyr Ser Asp Ile Pro Lys Ala

325 330 335

Trp Asp Glu Gly Gly Glu Lys Ala Arg Glu Leu Val Glu Tyr Ser Leu

340 345 350

Ser Asp Ala Lys Ala Thr Leu Glu Leu Gly Thr Glu Ile Leu Pro Leu

355 360 365

Phe Thr Glu Leu Ser Arg Thr Val Lys Gln Ser Leu Phe Asp Val Ser

370 375 380

Arg Met Thr Pro Gly Gln Leu Val Glu Trp Leu Leu Ile Phe Asn Ala

385 390 395 400

His Lys Ile Asn Glu Leu Ile Leu Pro Arg Pro Leu Gly Arg Glu Tyr

405 410 415

Lys Arg Arg Arg Gly Glu Thr Tyr Ile Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro

420 425 430

Thr Pro Gly Leu His Glu Asp Leu Val Val Phe Asp Phe Arg Ser Leu

435 440 445

Tyr Pro Thr Ile Ile Ile Thr His Asn Ile Asp Pro Ala Thr Leu Asp

450 455 460

Gly Glu Arg Cys Pro Ser Glu Glu Thr Val Thr Ala Pro Asp Leu Glu

465 470 475 480

Tyr Glu Phe Cys Gln Asp Arg Lys Gly Phe Ile Pro Glu Thr Leu Lys

485 490 495

Gly Leu Val Glu Gly Arg Ala Lys Leu Lys Gln Glu Met Ser Gln Leu

500 505 510

Asp Glu Glu Ser Arg Glu Tyr Gln Ser Leu Tyr Asn Arg Gln Trp Ala

515 520 525

Leu Lys Ile Ile Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Met Leu Gly Tyr Pro Arg

530 535 540

Ala Arg Trp Tyr Ser Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ser Phe Gly

545 550 555 560

Arg His Tyr Ile Lys Asp Thr Ile Glu Met Ala Lys Asp Glu Gly Phe

565 570 575

Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Leu Phe Ala Lys Leu Asn Gly

580 585 590

Lys Ser Arg Glu Asp Val Glu Asn Phe Leu Asn Lys Val Asn Glu Ser

595 600 605

Leu Pro Gly Ile Met Lys Leu Glu Leu Glu Asp Tyr Tyr Lys Arg Gly

610 615 620

Val Phe Val Thr Lys Lys Arg Tyr Ala Met Ile Ser Glu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Ile Val Val Lys Gly Leu Glu Phe Val Arg Arg Asp Trp Ala Ala Leu

645 650 655

Ala Lys Arg Thr Gln Glu Gln Val Ile Glu Ala Ile Leu His Asp Ala

660 665 670

Ser Pro Glu Lys Ala Ala Lys Ile Val Leu Glu Thr Thr Lys Ala Ile

675 680 685

Lys Gln Gly Glu Val Asp Leu Asp Asp Leu Val Ile His Thr Gln Leu

690 695 700

Lys Lys Pro Leu Asp Glu Tyr Lys Ala Arg Gly Pro His Val Ala Ala

705 710 715 720

Ala Glu Arg Leu Gln Lys Leu Gly Glu Glu Val Glu Pro Gly Met Thr

725 730 735

Ile Thr Tyr Ile Val Glu Lys Gly Ser Gly Ser Ile Ser Asp Arg Ala

740 745 750

Ile Pro Pro Ser Asp Phe Glu Gly Arg Asp Tyr Asp Pro Asp Tyr Tyr

755 760 765

Val Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Met Arg Ile Met Glu Val Leu

770 775 780

Asp Tyr Gly Glu Glu Asp Leu Arg His Glu Glu Thr Arg Gln Val Lys

785 790 795 800

Leu Gly Lys Phe Lys

805

<210> 3

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 3

Met Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp

1 5 10 15

Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe

20 25 30

Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu

35 40 45

Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys

50 55 60

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 4

ccctgggctc tgtaaagaat agca 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 5

atcagagctt aaactgggaa gcta 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 6

gggggtctaa gagcttgtaa actg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 7

ttgtgcctct gtaagcatgt agct 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 8

tctcttgtgt cagaccctgt tcta 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 9

caggaggtac aggtgtctta gaat 24

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 10

gcgccgttcc gaaagtt 17

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 11

cggcggatcg gcaaa 15

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 12

tagtggtggc tgacctgttc tct 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 13

tcgtcgatct cctgttggac a 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 14

tacacgaacc tgatgaaca 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 15

tctaactatt acctgcgaac t 21

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列("人工序列")

<400> 16

Thr Val Thr Ala Pro Asp Leu Glu

1 5

Claims

1.一种具有DNA聚合酶活性的多肽，其特征在于，所述多肽的N端至C端依次由SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：15编码的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的具有DNA聚合酶活性的多肽。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的重组表达载体、或所述宿主细胞基因组中整合有外源的权利要求2所述的多核苷酸；所述宿主细胞不是植物品种和动物品种。

5.一种权利要求1所述的具有DNA聚合酶活性的多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养权利要求4所述的宿主细胞，使之表达所述具有DNA聚合酶活性的多肽。

6.一种权利要求1所述的具有DNA聚合酶活性的多肽在扩增靶核酸中的用途，其特征在于，所述靶核酸包含在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中；所述用途为非疾病诊断方法。

7.一种扩增靶核酸的方法，其特征在于，扩增时采用的DNA聚合酶为权利要求1所述的具有DNA聚合酶活性的多肽；所述方法为非疾病诊断方法。

8.一种用于扩增靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)本发明权利要求1所述的具有DNA聚合酶活性的多肽和

9.一种根据权利要求1所述的多肽、或权利要求2所述的多核苷酸编码的多肽、或权利要求4所述的宿主细胞表达的发酵液、浓缩液或多肽作为DNA聚合酶的用途。