CN112899254B

CN112899254B - 一种用于恒温直接扩增核酸的dna聚合酶及其应用方法

Info

Publication number: CN112899254B
Application number: CN202011412256.5A
Authority: CN
Inventors: 尚午; 艾力克斯·诺维科夫
Original assignee: Nanjing Puji Biology Co ltd
Current assignee: Nanjing Puji Biology Co ltd
Priority date: 2020-12-05
Filing date: 2020-12-05
Publication date: 2023-01-13
Anticipated expiration: 2040-12-05
Also published as: CN112899254A

Abstract

本申请涉及酶工程技术领域，特别涉及一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶，本发明的DNA聚合酶的氨基酸序列包括一段氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽。同时，本发明提供一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶的应用方法，其可作为DNA聚合酶直接在样本溶液中对靶核酸进行恒温扩增。本申请一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶具有对样本中PCR抑制物耐受性高、能实现恒温扩增靶核酸且能直接对RNA进行扩增的优点。

Description

一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶及其应用方法

技术领域

本申请涉及酶工程技术领域，特别涉及一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶及其应用方法。

背景技术

聚合酶链式反应最早源自Khorana等人提出的关于核酸体外扩增的设想，后来Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片段，并于1985年发明了PCR技术并申请了相关专利，从此PCR技术成为了全球生命科学研究以及相关领域的热门技术，直至今日，PCR技术已发展到了第三代技术。

PCR技术最大的特点是能通过对DNA片段或RNA片段进行扩增，将微量的DNA片段或RNA片段加以放大。因此，PCR技术被运用在多个不同领域的多种研究中，例如复原、鉴定古生物的DNA序列，用于进行医学领域的分子诊断，用于大规模平行测序，用于法医提取犯罪嫌疑人的DNA进行比对等等，PCR技术为世界生命科学的发展提供了巨大的推动力。

由于PCR技术具有方便、快捷、准确、大规模地复制目的基因片段的能力，在生命科学研究与相关领域，如医学检测、感染性疾病检测、法医学检测等，PCR技术成为了难以取代的检测用技术手段。

DNA聚合酶是生物体细胞中广泛存在的蛋白酶，在真核细胞内主要分布于细胞核、线粒体和叶绿体内，也有少量分布于细胞质中；在原核细胞内均分布于细胞质中。DNA聚合酶通过将游离的碱基聚合为完整的DNA序列，或将碱基片段进行连接，在细胞中参与一系列的DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。

在PCR技术中，DNA聚合酶是不可缺少的重要一环，这是因为DNA聚合酶在有金属活化剂存在的情况下，能以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸，从而能实现体外基因片段的扩增。然而，由于PCR极大依赖于DNA聚合酶，因此DNA聚合酶的性能会直接影响PCR的扩增效率、灵敏度、保真性等。

当将PCR技术应用于如体液、血清、粪便和土壤等具有复杂环境的样本时，由于这类样本中含有大量破坏DNA聚合酶的物质或影响DNA聚合酶表达活性的物质，一般的DNA聚合酶对此类具有复杂环境的样本的耐受性差，无法直接在样本中有效地完成PCR过程以检测目标DNA序列或RNA序列，因此在相关技术中通常会对样本进行预处理，即将样本中的DNA或RNA提取并纯化之后，再进行后续的PCR扩增反应。然而，对样本进行预处理不仅耗费时间长，且存目标基因序列缺失的风险，因此急需一种能直接在样本中完成PCR过程的DNA聚合酶。

发明内容

提供以下描述以帮助本领域技术人员理解本发明。

本文中使用了国际通用的氨基酸的单字母或三字母缩写。

本文中公开的所有的核苷酸序列均以5'至3'记载。

本文中公开的所有的氨基酸序列均以N端至C端记载。

在本文中 “多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，表示多个氨基酸通过肽键连接形成的聚合物。

在本文中“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，其包括但不限于DNA、RNA等。

在本文中“聚合酶”，是指包括但不限于如酶命名法所定义的EC2.7.7.7类中的一种酶。

关于序列同一性，在本文中序列同一性是指用于描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性的百分比值。序列同一性可使用本领域周知的方法来计算，例如，可使用EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等，2000，遗传学趋势，16:276-277)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch，1970，分子生物学杂志，48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性；或者，可使用NCBI上的BLASTP来计算两条氨基酸序列之间的序列同一性。

关于鉴定检测多肽中的必需氨基酸，在本领域中存在多种已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变。在丙氨酸扫描诱变中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的DNA聚合酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。酶或者其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由如下技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变，还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。

关于编码序列，在本文中的编码序列是指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种氨基酸或其突变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、GTG或TTG）开始，并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA）结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

关于重组表达载体，在本文中的重组表达载体是指包括目的基因与运载体，目的基因是指人工设计的或者天然存在的一种与运载体同源或非同源的多核苷酸，其能够进行表达或发挥特定作用；运载体是指表达载体，目前常用的表达载体在经过人工修饰后，能稳定存在并具有特异性标签。

关于宿主细胞，在本文中的宿主细胞涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

关于培养细胞的方法，培养细胞是本领域中公知的程序，是在一种适合营养培养基中发生的，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成（如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）制备。如果一个变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有被分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

关于等温扩增反应，在本文中，等温扩增反应是指在恒定温度下进行的聚合酶链式反应。本领域中存在公知的多种等温扩增技术，包括环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、链置换扩增（SDA）、多重置换扩增（MDA）和交叉引物扩增（CPA）。在本文中，当在反应过程中没有采取任何主动步骤来改变温度时（例如没有进行热循环时），认为温度是恒定的，但由于现有技术中仪器与环境条件的因素影响，“恒”温实际上仍可能存在至多约5℃，通常不超过3℃或2℃的温度波动。

关于通过聚合酶链式反应进行核苷酸聚合或核酸扩增的方法，是本领域公知的方法，包括采用合适的DNA聚合酶、模板核酸分子、能够退火至模板核酸分子的一部分的寡核苷酸引物（例如两个或更多个引物）和一种或多种核苷酸（例如三磷酸脱氧核糖核苷，dNTP），在合适的条件下寡核苷酸引物退火至模板核酸分子，DNA聚合酶通过使一个或多个核苷酸聚合而延伸所述寡核苷酸引物。一般来说，合适的条件是本领域公知的。

关于下一代测序，在本文中的下一代测序，也叫第二代测序方法（参考作为第一代方法的桑格（Sanger）双脱氧核苷酸方法），在本领域已经普及。这些较新的技术的特征在于产出量高，例如由于使用并行，例如大规模并行测序反应，或通过耗时较少的步骤。各种高产出量测序方法可提供单分子测序，并采用诸如焦磷酸测序、可逆终止子测序、通过结扎的可切割的探针测序、通过结扎的不可切割的探针测序、DNA纳米球和实时单分子测序的技术。

关于多肽的检测、回收以及纯化方法，在本文中均为本领域公知的技术手段。多肽的检测方法，包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失；多肽的回收方法，包括但不限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀；多肽的纯化方法，包括但不限于色谱法（如离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、尺寸排阻色谱）、电泳程序（如制备型等电点聚焦）、差别溶解度（如硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE或萃取。

在本文中对本申请的DNA聚合酶的引用包括其活性多肽，除非上下文另有明确说明。

为了让DNA聚合酶在体液和粪便等样本中具有足够的耐受性，使其在样本溶液中能直接有效地完成聚合酶链式反应，本申请提供一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶及其应用方法，所述用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶既可以对体液和粪便等样本中的DNA片段进行扩增，也可以对体液和粪便等样本中的RNA片段进行扩增，极大地提高核酸检测的效率准确性。

第一方面，本申请提供一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶，采用如下的技术方案：

一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶，包含一段多肽，所述多肽的氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少60%的序列同一性。

通过采用上述技术方案，获得的DNA聚合酶具有以下四个方面的功能：

第一，具有DNA聚合酶的活性；第二，在血液、体液、粪便和土壤等具有复杂环境的样本中具有良好的耐受性；第三，能对血液、体液、粪便和土壤等具有复杂环境的样本中的DNA片段进行扩增；第四，能对血液、体液、粪便和土壤等具有复杂环境的样本中的RNA片段进行扩增。

本领域技术人员应该理解，氨基酸可以是天然存在的，也可以是人工合成的类似物，因此，本申请公开的多肽既可以包含天然氨基酸，也可以包含人工合成的氨基酸类似物。此外，在本申请公开的多肽的必需氨基酸之间插入无活性的肽段或在其基础上进行突变而获得的多肽，能在不影响本申请公开的多肽的活性的同时，改变其氨基酸序列，但此类多肽与本申请公开的多肽并无实质性的区别，若某段多肽的氨基酸序列与本申请公开的如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少60%序列同一性，应当视作落入本申请的保护范围之内。

可选的，所述多肽的氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性。

可选的，所述多肽的氨基酸序列与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少99%的序列同一性。

可选的，所述多肽由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

可选的，由编码所述多肽的多核苷酸转录翻译得到；或由含有编码所述多肽的多核苷酸的重组表达载体表达得到；或由宿主细胞表达产生，所述宿主细胞含有重组表达载体，所述重组表达载体含有编码所述多肽的多核苷酸。

本领域技术人员应该理解，当多肽的氨基酸序列与所设计的目的氨基酸序列越接近，该多肽的活性越强，当多肽与所设计的目的氨基酸序列完全相同时，多肽拥有最大活性。然而，多肽在转录翻译的过程中有概率出现突变，导致氨基酸序列与所设计的目的氨基酸序列存在差异，因此一般情况下很难保证制备所得的氨基酸的氨基酸序列与本申请公开的如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有100%序列同一性。此外，在多肽段中插入无活性表达的肽段，能在不影响多肽活性的情况下改变多肽的氨基酸序列的长度或内容，从而使得该多肽的氨基酸序列与本申请公开的氨基酸序列具有不足60%的序列同一性，此行为属于恶意规避本申请的保护范围，因此该多肽也应视作落入本申请的保护范围之内。

第二方面，本申请提供一种应用上述DNA聚合酶的方法，采用如下的技术方案：

一种应用上述DNA聚合酶的方法，包括作为DNA聚合酶直接在样本溶液中对靶核酸进行恒温扩增的方法。

本领域技术人员应该理解，所述靶核酸包括DNA和RNA以及其他人工合成的核酸类似物。

可选的，作为COVID-19试剂盒中使用的DNA聚合酶对含有COVID-19的样本溶液直接进行恒温扩增。

通过采用上述技术方案，该试剂盒能用于在恒温条件下对样本溶液中的COVID-19进行检测。

可选的，所述样本溶液为咽拭子样本溶液。

可选的，所述样本溶液为粪便样本溶液。

本申请公开的DNA聚合酶能直接在咽拭子样本溶液或粪便样本溶液中对靶核酸进行恒温扩增。

综上所述，本申请公开的一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶具有以下优点：

（1）能在恒温下对靶核酸进行扩增；

（2）能在具有复杂环境的样本溶液中对靶核酸进行扩增；

（3）既能扩增DNA片段，也能扩增RNA片段。

附图说明

图1是本申请实施例中相关DNA聚合酶的SDS-PAGE电泳结果图。

图2是本申请实施例中DNA模板和RNA模板恒温扩增的结果图。

图3是本申请实施例中咽拭子样本扩增结果数据图。

图4是本申请实施例中10倍稀释粪便样本扩增结果数据图。

图5是本申请实施例中1000万倍稀释粪便样本扩增结果数据图。

具体实施方式

提供以下描述以帮助本领域技术人员理解本发明。

本申请中的NEB Buffer3，Xho I，Bgl II，Ligase Buffer 3均采购自NEB公司，NEBBuffer3为限制性内切酶Xho I和Bgl II的通用缓冲液，Ligase Buffer 3为T4连接酶的缓冲液，10×为十倍稀释的原液。

本申请中的pET-28A载体，是一种采购自默克公司的大肠杆菌空白质粒。

本文中的“T4连接酶”，是指T4 DNA连接酶，能用于催化粘性末端或平末端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，购自北京索莱宝科技有限公司，货号T1410-60U。

本文中的“TaqDNA聚合酶”购自北京索莱宝科技有限公司，货号M1665S。

本文中的“DNA产物纯化试剂盒（磁珠法）”用于回收提取酶切产物，购自北京索莱宝科技有限公司，货号D1300-50T。

本文中的“LB液体培养基”和“LB固体培养基”均是根据《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著）中记载的LB液体培养基和LB固体培养基的配方自行配置而得。

本文中的“TE缓冲液”是根据《分子克隆实验指南》中记载的TE缓冲液的配方自行配置而得。

本文中的“溶菌酶”，是指一种能溶解细菌细胞壁或破坏细胞膜的一类酶的总称，购自北京索莱宝科技有限公司，货号L8120-5g。

本文中的“蛋白酶K”是指一种从白色念珠菌中分离得到的强力蛋白溶解酶，该酶在较广的pH范围内及高温下均有活性，是DNA提取的关键试剂，用于酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中，购自北京索莱宝科技有限公司，货号P1120-1mL。

本文中的“CTAB抽提缓冲液”是根据《分子克隆实验指南》中记载的CTAB抽提缓冲液的配方自行配置而得。

以下结合附图1-5和实施例对本申请作进一步详细说明。

实施例

一、构建dr DNA聚合酶重组表达载体

dr DNA聚合酶重组表达载体通过以下步骤进行构建：

S1、根据设计好的高耐受性dr DNA聚合酶的氨基酸序列，反翻译为对应的DNA序列，采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA序列。其中，高耐受性dr DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。由于高耐受性dr DNA聚合酶的DNA序列较长，因此先合成若干段约100bp长度的DNA片段，然后使用T4连接酶将DNA片段连接形成完整的高耐受性dr-DNA聚合酶的DNA片段。

本领域技术人员应该理解，本领域技术人员根据密码子表按照氨基酸序列逐个进行反翻译即能得到对应的DNA序列，但同一段氨基酸序列可反翻译为不同的DNA序列，这是由于一个氨基酸能对应多个密码子的性质决定的，本实施例仅提供其中一种DNA序列。但本申请强调，但凡能翻译得到本申请公开的氨基酸序列的多肽或蛋白的DNA序列，应视作落入本申请的保护范围之内。

S2、将dr DNA聚合酶的DNA片段在37℃下酶切2h，并用DNA产物纯化试剂盒（磁珠法）回收酶切产物，得到gn DNA聚合酶片段。其中，酶切体系如表1-1所示。

表1-1 dr DNA聚合酶的DNA片段的酶切体系

原料	用量
		10×NEB Buffer 3	5μL
Xho I	2U
		Bgl II	2U
dr DNA聚合酶的DNA片段	总量1μg
		ddH2O	补足50μL

S3、将pET-28a载体在37℃下酶切2h，并用DNA产物纯化试剂盒（磁珠法）回收酶切产物，得到pET-28a片段。其中，酶切体系如表1-2所示。

表1-2 pET-28a载体的酶切体系

原料	用量
		10×NEB Buffer 3	5μL
Xho I	1U
		Bgl II	1U
pET-28a载体	总量200ng
		ddH2O	补足50μL

S4、用T4连接酶将gn DNA聚合酶片段和pET-28a片段连接，在16℃下反应12-16h，本实施例优选反应12h，得到dr DNA聚合酶重组表达载体。其中，连接体系如表1-3所示。

表1-3 dr DNA聚合酶重组表达载体的连接体系

原料	用量
		10×Ligase Buffer 3	5μL
T4连接酶	5U
		gn DNA聚合酶片段	500ng
pET-28a片段	100ng
		ddH<sub>2</sub>O	补足50μL

二、转化、诱导、表达DNA聚合酶

通过以下步骤诱导、表达DNA聚合酶：

S1、转化宿主细胞，通过以下步骤进行：

S1.1、取dr DNA聚合酶重组表达载体50ng，加入至200μL的感受态细胞大肠杆菌BL21（DE3）中并混匀，冰上作用20min，然后立即进行42℃热激90s，接着立即进行冰上作用3min，得到含重组载体的感受态细胞。

本领域技术人员应该理解，感受态细胞的复苏必须在低温条件下进行，而非必须在冰上作用，感受态细胞的复苏可以在零下温度的环境中进行，也可以在冰库内进行，本实施例仅提供了其中一种感受态细胞复苏的方法，而非对其进行限定。

S1.2、将含重组载体的感受态细胞转移至800μL LB液体培养基中培养1h，得到活性感受态细胞悬浮液，培养条件如下：培养温度37℃，摇床180rpm。

S1.3、将活性感受态细胞悬浮液在5000rpm下离心8min，弃去2/3上清液，将沉淀与上清液混匀，然后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃下培养16h，得到活性感受态细胞的菌落。

本领域技术人员应该理解，离心转速、离心时长、弃去上清液的量、卡那霉素的浓度、平板培养时间均非重要的技术特征，只要能将细胞与培养液分离的离心转速、离心时长均可采用，本实施例优选5000rpm的离心转速和8min的离心时长，能相对减少离心时长，保证活性载体宿主细胞的活性；弃去部分上清液是为了将细胞悬浮液进行浓缩，以便于后面的涂布平板，弃去的量可以是本实施例中的2/3，也可以是4/5，也可以是1/2；卡那霉素的浓度过低容易造成菌种污染，卡那霉素的浓度过高容易造成活性载体宿主细胞的生长受限，根据《分子克隆实验指南（第四版）》，卡那霉素的浓度一般采用30μg/mL，然而可根据实际使用的宿主细胞的种类进行调整，在本实施例中采用50μg/mL的浓度；平板培养时间以菌落分布适量为准，培养12-20h均可，在本实施例中优选培养16h。

S2、挑取单个活性感受态细胞的菌落接种至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃下培养至OD600值达到0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，20℃下诱导16h后，得到含有已经表达DNA聚合酶的宿主细胞的培养液。

本领域技术人员应该理解，当OD600的数值位于0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，此时均可对宿主细胞进行诱导表达，而基于对诱导效率的考虑，本实施例优选当OD600值达到0.6时即进行诱导表达。

S3、将含有已经表达DNA聚合酶的宿主细胞的培养液5000rpm离心10min，弃去上清液后加入10mL破菌缓冲液重悬，得到浓缩液。

S4、向浓缩液中加入30mg溶菌酶后进行超声破碎，然后12000rpm离心30min，收集上清液，得到粗提取DNA聚合酶溶液，其中超声破碎在42℃水浴中进行，破碎时间为30min；粗提取DNA聚合酶溶液的SDS-PAGE电泳结果如图1中的泳道1所示，破菌缓冲液配方如下：50mmol/L Tris-HCL、500mmol/L NaCl，pH为8.0。

在本实施例中，由于选用感受态细胞BL21作为宿主细胞，因此选用LB培养基以及大肠杆菌敏感的卡那霉素；另外，目的蛋白可能由宿主细胞分泌到培养基中，因此在培养基中也能回收得到目的蛋白，只是在本实施例中并未有对培养基中可能存在的目的蛋白进行收集，并不代表无需进行收集。

S5、DNA聚合酶的体外纯化与收集

S5.1、将粗提取DNA聚合酶溶液在70℃中加热20min后，12000rpm离心15min，取上清液，得到初纯DNA聚合酶提取液。

加热可去除大量不耐高温的杂质蛋白，以便于下一步的亲和层析收集较单一的洗脱峰产物。

S5.2、利用AKTA蛋白纯化系统以及Ni亲和层析柱将初纯DNA聚合酶提取液进行亲和纯化，收集目的蛋白洗脱液，得到第一DNA聚合酶提取液，具体步骤如下：

S5.2.1、平衡：用平衡缓冲液平衡Ni亲和层析柱，直至pH达到8.0，且紫外检测读数稳定，检测调零后向Ni亲和层析柱加入初纯DNA聚合酶提取液进行上样；上样结束后，再次用平衡缓冲液平衡Ni亲和层析柱，直至紫外检测读数回到基线或相对稳定；

S5.2.2、预洗：用500mL预洗缓冲液预洗Ni亲和层析柱；

S5.2.3、洗脱：用500mL洗脱液洗脱目标蛋白，收集洗脱组分,得到第一DNA聚合酶提取液；

S5.2.4、洗柱：用500mL洗柱缓冲液冲洗Ni亲和层析柱；

其中，平衡缓冲液组分如下：Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 500mmol/L，咪唑20mmol/L，pH8.0；预洗缓冲液组分如下：Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 500mmol/L，咪唑50mmol/L，pH8.0；洗脱液组分如下：Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 500mmol/L，咪唑200mmol/L，pH8.0；洗柱缓冲液组分如下：Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 500mmol/L，咪唑500mmol/L，pH8.0。

经过AKTA蛋白纯化系统以及Ni亲和层析柱进行纯化后，样品中大部分的核酸和其他如糖、醇等杂质均得到去除。

S5.3、将第一DNA聚合酶提取液过离子交换柱纯化，样品中离子强度低于5ms/cm，依次进行平衡、上样、平衡、洗脱，在本实施例中，离子交换柱优选为阴离子柱；在洗脱时，采用不同盐浓度缓冲液分步洗脱，由于残留DNA一般溶解于高盐组分中，因此收集流出的低盐洗脱的蛋白质样品洗脱液，得到含DNA聚合酶的缓冲液；其中平衡缓冲液配方与步骤S3.2的平衡缓冲液配方相同。

经验证，采用如下浓度的洗脱缓冲液时，蛋白质样品洗脱液中含有的蛋白质记为本申请所需的DNA聚合酶蛋白。洗脱缓冲液组分如下：Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 300mmol/L，pH8.0。

将含本申请DNA聚合酶的溶液进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图1中的泳道2所示。

S5.4、将含本申请DNA聚合酶的溶液浓缩后，保存至-80℃的储存溶液中，得到drDNA聚合酶。其中，储存溶液通过以下步骤制得：

取Tris-HCL溶液，加入DTT、EDTA和KCL，定容使得Tris-HCL浓度为20mmol/L、DTT浓度为1mmol/L、EDTA浓度为0.1mmol/L、KCL浓度为100mmol/L，按溶液体积，加入体积分数如下的物质：NP-40 0.5%、Tween-20 0.5%、甘油50%，得到储存溶液。

采用三级纯化，能使得到的dr DNA聚合酶具有更高的纯度，不仅能除去杂质蛋白，而且能除去杂质DNA分子，提高了检测的精准度。

三、dr DNA聚合酶酶活性与扩增效率测试

使用dr DNA聚合酶对一段DNA模板与一段RNA模板进行PCR扩增，使用的DNA模板为人的基因组DNA，使用的RNA模板为人的基因组DNA的转录RNA，扩增产物大小分别为424bp、932bp，在不同模板序列浓度下进行多组平行实验，其中，

扩增产物为424bp体系的DNA引物序列：

S-F：CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGCA（SEQ ID NO：3）；

S-R：ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTA（SEQ ID NO：4）；

扩增产物为932bp体系的RNA引物序列：

M-F：GGGGGUCUAAGAGCUUGUAAACUG（SEQ ID NO：5）；

M-R：UUGUGCCUCUGUAAGCAUGUAGCU（SEQ ID NO：6）；

PCR反应体系为：

30cycles*(61℃，60s)；61℃，5min。

DNA模板和RNA模板恒温扩增的结果图如图2所示。结果表明：

（1）使用dr DNA聚合酶能成功扩增出DNA片段，说明dr DNA聚合酶具有DNA延伸活性；

（2）使用dr DNA聚合酶能成功扩增出RNA片段，说明dr DNA聚合酶具有RNA延伸活性；

（3）使用dr DNA聚合酶对DNA片段或RNA片段进行扩增，能在61℃的恒温条件下完成；

（4）使用dr DNA聚合酶对DNA片段或RNA片段进行恒温扩增时，在20-30min内即可完成全片段扩增；

（5）本申请公开的dr DNA聚合酶对低浓度的DNA片段或RNA片段仍然具有高扩增活性。

四、咽拭子样本耐受性能检测

通过以下步骤对dr DNA聚合酶在咽拭子样本中耐受性能进行检测：

S1、将dr DNA聚合酶制成COVID-19实时荧光扩增检测试剂盒；

S2、使用COVID-19实时荧光扩增检测试剂盒在61℃下对咽拭子样本进行恒温扩增检测。

其中，咽拭子样本为浙大儿院的临床样本，COVID-19实时荧光扩增检测试剂盒直接对采集的新鲜临床样本直接进行检测。

咽拭子样本扩增结果数据图如图3所示，目标基因由FAM通道、ROX通道显示。结果表明，dr DNA聚合酶能直接对新鲜临床样本的COVID-19进行检测并成功扩增出目标基因。

五、粪便样本耐受性能检测

通过以下步骤对dr DNA聚合酶在粪便样本中耐受性能进行检测：

S1、将dr DNA聚合酶制成COVID-19实时荧光扩增检测试剂盒；

S2、使用COVID-19实时荧光扩增检测试剂盒在61℃下对粪便样本进行恒温扩增检测。

其中，粪便样本为浙大儿院的临床样本，COVID-19实时荧光扩增检测试剂盒直接对采集的新鲜临床样本直接进行检测。

粪便样本扩增结果数据图如图4和图5所示，目标基因1由FAM通道显示，目标基因2由ROX通道显示。结果表明，当粪便样本被稀释10倍后，COVID-19实时荧光扩增检测试剂盒对样本进行直接扩增检测，目标基因2在第41个循环后就出现了ROX信号；当粪便样本被稀释1000万倍后，目标基因1和目标基因2仍分别出现了FAM信号和ROX信号，说明本申请公开的dr DNA聚合酶对粪便样本的耐受性高、扩增效率快、且灵敏度高。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

本申请包含已以ASCII格式的电子版提交的序列表并且其全部内容通过引用并入本申请。2020年11月28日创建的所述ASCII副本的文件名为NSequence-2020112354，文件大小9.77KB字节。

SEQ ID NO：1：

Val Arg Ile Asn Leu Thr Tyr Tyr Gly Val Leu Leu Ser Ala Gly Cys

1 5 10 15

Leu Ala Lys Leu Arg His Gly Gln Gly Arg Ser Pro Thr Arg Leu Ala

20 25 30

Ser Pro Gly Ile Gly Ser Ile Thr Val Gln Ser Ala Val Tyr Asp Pro

35 40 45

Glu Ala Trp Leu Leu Glu Ser Ser Gly Leu Leu Pro Ala Lys Cys Pro

50 55 60

Val Ser Ala Glu Trp Ile Gln Val Gln Lys Arg Thr Thr Cys Trp Gly

65 70 75 80

Asn Ile His Pro Lys Asp Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Arg

85 90 95

Trp Thr Gly Trp Tyr Gln Met Val Val Asp Lys Phe Ile Gly Leu Ser

100 105 110

Cys Ser Gln Gly Thr Cys Tyr Tyr Lys Asn Cys Thr Gly Val Ser Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Leu Asn Thr Asn Ser Gly Val His Glu Asn Pro Lys Gln

130 135 140

Gly Val Ser His Asp Leu Gly Arg Arg Thr Thr Ser Leu Ser Glu Thr

145 150 155 160

Leu Thr Glu Gly Leu Gln Thr Glu Ala Gly His Arg Ile Ser Ala Leu

165 170 175

Lys Gly Val Pro Arg Ile His Arg Gly Arg Asp Arg Arg Arg Gly Ala

180 185 190

Ala Val Gly Met Leu Phe Leu Ser Phe Pro Asn Leu Ser Asp Glu Leu

195 200 205

Ser Glu Lys Ile Ser Arg Leu Ser Asn Val Arg Pro Arg Arg Asn Ala

210 215 220

Pro Glu Cys Tyr Asp Phe Ser Gly Arg Glu Val Pro Cys Trp Gly Ile

225 230 235 240

Thr Ile Thr Thr Val Ser Pro Thr Val Pro Glu Arg Lys Ser Asp Glu

245 250 255

Ala Arg Arg Thr Thr Leu Pro Tyr Lys Cys Ala Val Pro Gln Arg Leu

260 265 270

Ile Leu Pro Glu Ala Arg Ser Gly Leu Arg Gln Ala Ala Leu Val Thr

275 280 285

Pro Gly Arg Thr Cys Lys Thr Pro Ile Phe Arg Phe Pro Arg Tyr Gln

290 295 300

Lys Gly Asn Gly Thr Gly Pro Tyr Ser Trp Val Ser Thr Val Tyr Cys

305 310 315 320

Thr Tyr Asn Leu Arg Ala Glu Ile Gly Ala Ala Gly Gln Pro Val Leu

325 330 335

Leu Gly Ser Val Ser Lys Arg Thr Ala Ile Arg Tyr Ile Trp Gly Arg

340 345 350

Tyr Leu Arg Gln Pro Phe Gly Pro Cys Trp Phe Val Phe Asp Ala Thr

355 360 365

Pro Ala Thr Gly Lys Pro Tyr Pro Lys Pro Ser Gly Ser Val Pro Val

370 375 380

Val His Val Trp Val Arg Pro Val Leu Leu Asp Gly Gly Arg Gly Asp

385 390 395 400

Pro Asn Asp Ser Leu Arg Lys Arg His Ile Ser Cys Ala Asp His Pro

405 410 415

Ser Thr Lys Lys Tyr Phe Arg Leu Arg Gly Gly Ser Ile Ser Arg Ser

420 425 430

Pro Gly Leu Tyr Trp Ile Arg Leu Leu Leu Arg Thr Val Arg Gln Pro

435 440 445

Asp Gln Ser Leu Ser Glu His Tyr Leu Gly Leu Gly His Thr Leu Ala

450 455 460

Asp Leu Asp Val Val Thr Glu Asn Asn Thr Thr Thr Ile Met Leu Pro

465 470 475 480

Arg Thr Leu Leu Gly Asp Lys Glu Leu Ala Leu Cys Asn Ile Leu Val

485 490 495

Asp Leu Cys Ser Arg Ala Leu Ile Arg Gln Phe Ala Asp Ser Leu Arg

500 505 510

Cys Lys Lys Pro Thr Leu Ser Thr Ser Ser Thr Phe Lys Gly Ala Asp

515 520 525

Cys Ala Gly Leu Tyr Tyr Thr Leu Ser Thr Arg His Asp Gly Arg Ala

530 535 540

Glu Gly Asp Ala Leu Ala Lys Arg Ser Leu Leu Thr Lys Ala Ala Met

545 550 555 560

Asn Ala Met His Ser Leu Pro Val Ala Val Lys Cys Gln Glu Leu His

565 570 575

Gly Arg Ala Val Asn Val Ile Ala Gly Ala Arg Ser Phe Cys Asn Ser

580 585 590

Thr Leu Val Thr Leu Thr Ser Trp Ala Ser Glu Thr Ser Gln Ser Ser

595 600 605

Glu Arg Leu Leu Asp Ala Ala Thr Leu Gly Ile Tyr Phe Ala Val Arg

610 615 620

Lys Trp Val Glu Thr Glu Leu Leu Thr Pro Pro Arg Phe Ala Glu Arg

625 630 635 640

Val Thr Ser Leu Phe Phe Arg Ser Arg Arg Arg Ala Asp Leu Thr Pro

645 650 655

Gln Pro Leu Leu Ser Arg Gln Leu Arg Phe Met Lys Asp Phe Gln Val

660 665 670

Gly Thr Ser Gly Pro Ala Lys Cys Pro Val Arg Ile Asn Leu Thr Tyr

675 680 685

Tyr Gly Val Leu Leu Ser Ala Gly Cys Leu Ala Lys Leu Arg His Gly

690 695 700

Gln Gly Arg Ser Pro Thr Arg Leu Ala Ser Pro Gly Ile Gly Ser Ile

705 710 715 720

Thr Val Gln Ser Ala Val Tyr Asp Pro Glu Ala Trp Leu Leu Glu Ser

725 730 735

Ser Gly Leu Leu

740

SEQ ID NO：2：

gtacgtatca atctgactta ttatggggtt ttattatcgg cgggatgttt agcgaagtta 60

cggcatggtc aagggcgctc acctacacga ctagcgtccc ccggtatagg ttccattact 120

gtgcaaagcg cagtatacga tcccgaagct tggttactcg agagttcggg cttattgccc 180

gcgaaatgcc cagtcagcgc agaatggata caggtccaaa aacgaacgac ctgctggggc 240

aacatccacc caaaggatgg cgctcgtaga actggtcagt acaagcgctg gacgggctgg 300

taccaaatgg tagtggacaa gtttatcgga cttagttgtt cccaaggcac gtgctactac 360

aaaaattgca ccggggtgtc gataagcaca ctgctgaaca ccaattctgg cgtgcatgaa 420

aaccccaagc aaggcgtctc acacgatcta ggccgtcgta caacatccct gagtgaaacc 480

ctgaccgagg gacttcagac ggaagcaggg catagaatat ctgcacttaa gggcgtcccc 540

cgaatacatc ggggccgcga tagaagaagg ggggctgcgg tggggatgct gttcttatct 600

tttcctaact tatctgacga gttgtctgag aaaatttctc gactatcaaa tgtgaggccg 660

cgcagaaatg ctcccgaatg ctacgatttt agcgggcgtg aagttccttg ctggggaatt 720

acgatcacta ctgtgtcgcc gacagtacca gagcgtaagt cggatgaagc ccggcgcacc 780

acactaccct ataagtgcgc tgtgccacaa cgcctgattc taccagaggc gcgttcgggt 840

ttgcgccagg ctgccctggt aacccctgga cgcacctgta aaaccccaat atttcgcttt 900

ccacggtacc agaaaggcaa tggcacaggg ccctacagct gggtatcgac tgtgtattgt 960

acttataatt tgagagcgga aattggtgcg gcaggacaac ccgtactcct tggaagcgtc 1020

tcgaaacgca ccgccattcg ttatatctgg gggagatatc taagacagcc attcggaccg 1080

tgctggttcg ttttcgacgc cacgccggcc acaggcaagc catacccaaa gccctcaggg 1140

tccgtccccg tagtacacgt atgggtccgg ccggtccttt tggatggagg gagaggggat 1200

cctaatgata gtttgcgtaa gcgacacata tcatgtgcgg atcatccatc aacgaaaaag 1260

tactttagac tgaggggtgg gtcaatttcg agatcgcctg gcttgtactg gattcgccta 1320

ttgttgcgga ctgttcggca gcctgatcag tcgctaagcg agcattacct cgggctggga 1380

catacactcg cagatctaga cgtcgtgact gagaataata caaccacaat catgttaccg 1440

cggaccctcc ttggtgataa ggagctggct ttgtgtaaca tacttgtaga cctgtgttct 1500

agggctttga ttcggcagtt tgctgactcg ctgcgttgta agaaacccac cctgtcaaca 1560

tcttccacat ttaaaggggc ggactgcgcc ggactatact acacgctcag cactcgacac 1620

gatgggcgag ccgaaggcga tgcactcgcc aagcgctctc tgctgactaa agcagctatg 1680

aatgccatgc acagcctacc tgtagcagta aagtgccaag aactccacgg acgcgctgta 1740

aacgtaatcg caggggcccg atccttttgc aattcaactc tagtaaccct cacgtcgtgg 1800

gctagcgaga ctagtcagag cagcgagcgt ttgctcgatg cagccaccct ggggatatac 1860

tttgccgtgc gtaagtgggt ggagaccgaa ctgctaacgc cccctcggtt tgcagagcgg 1920

gtcacgtcac tttttttccg gagccgcagg agagccgatc ttacgcccca gccattattg 1980

agtcgtcagc taaggttcat gaaagacttc caagtaggta caagtggacc cgcgaaatgc 2040

ccagtacgta tcaatctgac ttattatggg gttttattat cggcgggatg tttagcgaag 2100

ttacggcatg gtcaagggcg ctcacctaca cgactagcgt cccccggtat aggttccatt 2160

actgtgcaaa gcgcagtata cgatcccgaa gcttggttac tcgagagttc gggcttattg 2220

SEQ ID NO:3：

ccctgggctc tgtaaagaat agca 24

SEQ ID NO:4：

atcagagctt aaactgggaa gcta 24

SEQ ID NO:5：

gggggucuaa gagcuuguaa acug 24

SEQ ID NO:6：

uugugccucu guaagcaugu agcu 24

序列表

<110> 南京普济生物有限公司

<120> 一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶及其应用方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 740

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Arg Ile Asn Leu Thr Tyr Tyr Gly Val Leu Leu Ser Ala Gly Cys

1 5 10 15

Leu Ala Lys Leu Arg His Gly Gln Gly Arg Ser Pro Thr Arg Leu Ala

20 25 30

Ser Pro Gly Ile Gly Ser Ile Thr Val Gln Ser Ala Val Tyr Asp Pro

35 40 45

Glu Ala Trp Leu Leu Glu Ser Ser Gly Leu Leu Pro Ala Lys Cys Pro

50 55 60

Val Ser Ala Glu Trp Ile Gln Val Gln Lys Arg Thr Thr Cys Trp Gly

65 70 75 80

Asn Ile His Pro Lys Asp Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Arg

85 90 95

Trp Thr Gly Trp Tyr Gln Met Val Val Asp Lys Phe Ile Gly Leu Ser

100 105 110

Cys Ser Gln Gly Thr Cys Tyr Tyr Lys Asn Cys Thr Gly Val Ser Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Leu Asn Thr Asn Ser Gly Val His Glu Asn Pro Lys Gln

130 135 140

Gly Val Ser His Asp Leu Gly Arg Arg Thr Thr Ser Leu Ser Glu Thr

145 150 155 160

Leu Thr Glu Gly Leu Gln Thr Glu Ala Gly His Arg Ile Ser Ala Leu

165 170 175

Lys Gly Val Pro Arg Ile His Arg Gly Arg Asp Arg Arg Arg Gly Ala

180 185 190

Ala Val Gly Met Leu Phe Leu Ser Phe Pro Asn Leu Ser Asp Glu Leu

195 200 205

Ser Glu Lys Ile Ser Arg Leu Ser Asn Val Arg Pro Arg Arg Asn Ala

210 215 220

Pro Glu Cys Tyr Asp Phe Ser Gly Arg Glu Val Pro Cys Trp Gly Ile

225 230 235 240

Thr Ile Thr Thr Val Ser Pro Thr Val Pro Glu Arg Lys Ser Asp Glu

245 250 255

Ala Arg Arg Thr Thr Leu Pro Tyr Lys Cys Ala Val Pro Gln Arg Leu

260 265 270

Ile Leu Pro Glu Ala Arg Ser Gly Leu Arg Gln Ala Ala Leu Val Thr

275 280 285

Pro Gly Arg Thr Cys Lys Thr Pro Ile Phe Arg Phe Pro Arg Tyr Gln

290 295 300

Lys Gly Asn Gly Thr Gly Pro Tyr Ser Trp Val Ser Thr Val Tyr Cys

305 310 315 320

Thr Tyr Asn Leu Arg Ala Glu Ile Gly Ala Ala Gly Gln Pro Val Leu

325 330 335

Leu Gly Ser Val Ser Lys Arg Thr Ala Ile Arg Tyr Ile Trp Gly Arg

340 345 350

Tyr Leu Arg Gln Pro Phe Gly Pro Cys Trp Phe Val Phe Asp Ala Thr

355 360 365

Pro Ala Thr Gly Lys Pro Tyr Pro Lys Pro Ser Gly Ser Val Pro Val

370 375 380

Val His Val Trp Val Arg Pro Val Leu Leu Asp Gly Gly Arg Gly Asp

385 390 395 400

Pro Asn Asp Ser Leu Arg Lys Arg His Ile Ser Cys Ala Asp His Pro

405 410 415

Ser Thr Lys Lys Tyr Phe Arg Leu Arg Gly Gly Ser Ile Ser Arg Ser

420 425 430

Pro Gly Leu Tyr Trp Ile Arg Leu Leu Leu Arg Thr Val Arg Gln Pro

435 440 445

Asp Gln Ser Leu Ser Glu His Tyr Leu Gly Leu Gly His Thr Leu Ala

450 455 460

Asp Leu Asp Val Val Thr Glu Asn Asn Thr Thr Thr Ile Met Leu Pro

465 470 475 480

Arg Thr Leu Leu Gly Asp Lys Glu Leu Ala Leu Cys Asn Ile Leu Val

485 490 495

Asp Leu Cys Ser Arg Ala Leu Ile Arg Gln Phe Ala Asp Ser Leu Arg

500 505 510

Cys Lys Lys Pro Thr Leu Ser Thr Ser Ser Thr Phe Lys Gly Ala Asp

515 520 525

Cys Ala Gly Leu Tyr Tyr Thr Leu Ser Thr Arg His Asp Gly Arg Ala

530 535 540

Glu Gly Asp Ala Leu Ala Lys Arg Ser Leu Leu Thr Lys Ala Ala Met

545 550 555 560

Asn Ala Met His Ser Leu Pro Val Ala Val Lys Cys Gln Glu Leu His

565 570 575

Gly Arg Ala Val Asn Val Ile Ala Gly Ala Arg Ser Phe Cys Asn Ser

580 585 590

Thr Leu Val Thr Leu Thr Ser Trp Ala Ser Glu Thr Ser Gln Ser Ser

595 600 605

Glu Arg Leu Leu Asp Ala Ala Thr Leu Gly Ile Tyr Phe Ala Val Arg

610 615 620

Lys Trp Val Glu Thr Glu Leu Leu Thr Pro Pro Arg Phe Ala Glu Arg

625 630 635 640

Val Thr Ser Leu Phe Phe Arg Ser Arg Arg Arg Ala Asp Leu Thr Pro

645 650 655

Gln Pro Leu Leu Ser Arg Gln Leu Arg Phe Met Lys Asp Phe Gln Val

660 665 670

Gly Thr Ser Gly Pro Ala Lys Cys Pro Val Arg Ile Asn Leu Thr Tyr

675 680 685

Tyr Gly Val Leu Leu Ser Ala Gly Cys Leu Ala Lys Leu Arg His Gly

690 695 700

Gln Gly Arg Ser Pro Thr Arg Leu Ala Ser Pro Gly Ile Gly Ser Ile

705 710 715 720

Thr Val Gln Ser Ala Val Tyr Asp Pro Glu Ala Trp Leu Leu Glu Ser

725 730 735

Ser Gly Leu Leu

740

<210> 2

<211> 2220

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtacgtatca atctgactta ttatggggtt ttattatcgg cgggatgttt agcgaagtta 60

cggcatggtc aagggcgctc acctacacga ctagcgtccc ccggtatagg ttccattact 120

gtgcaaagcg cagtatacga tcccgaagct tggttactcg agagttcggg cttattgccc 180

gcgaaatgcc cagtcagcgc agaatggata caggtccaaa aacgaacgac ctgctggggc 240

aacatccacc caaaggatgg cgctcgtaga actggtcagt acaagcgctg gacgggctgg 300

taccaaatgg tagtggacaa gtttatcgga cttagttgtt cccaaggcac gtgctactac 360

aaaaattgca ccggggtgtc gataagcaca ctgctgaaca ccaattctgg cgtgcatgaa 420

aaccccaagc aaggcgtctc acacgatcta ggccgtcgta caacatccct gagtgaaacc 480

ctgaccgagg gacttcagac ggaagcaggg catagaatat ctgcacttaa gggcgtcccc 540

cgaatacatc ggggccgcga tagaagaagg ggggctgcgg tggggatgct gttcttatct 600

tttcctaact tatctgacga gttgtctgag aaaatttctc gactatcaaa tgtgaggccg 660

cgcagaaatg ctcccgaatg ctacgatttt agcgggcgtg aagttccttg ctggggaatt 720

acgatcacta ctgtgtcgcc gacagtacca gagcgtaagt cggatgaagc ccggcgcacc 780

acactaccct ataagtgcgc tgtgccacaa cgcctgattc taccagaggc gcgttcgggt 840

ttgcgccagg ctgccctggt aacccctgga cgcacctgta aaaccccaat atttcgcttt 900

ccacggtacc agaaaggcaa tggcacaggg ccctacagct gggtatcgac tgtgtattgt 960

acttataatt tgagagcgga aattggtgcg gcaggacaac ccgtactcct tggaagcgtc 1020

tcgaaacgca ccgccattcg ttatatctgg gggagatatc taagacagcc attcggaccg 1080

tgctggttcg ttttcgacgc cacgccggcc acaggcaagc catacccaaa gccctcaggg 1140

tccgtccccg tagtacacgt atgggtccgg ccggtccttt tggatggagg gagaggggat 1200

cctaatgata gtttgcgtaa gcgacacata tcatgtgcgg atcatccatc aacgaaaaag 1260

tactttagac tgaggggtgg gtcaatttcg agatcgcctg gcttgtactg gattcgccta 1320

ttgttgcgga ctgttcggca gcctgatcag tcgctaagcg agcattacct cgggctggga 1380

catacactcg cagatctaga cgtcgtgact gagaataata caaccacaat catgttaccg 1440

cggaccctcc ttggtgataa ggagctggct ttgtgtaaca tacttgtaga cctgtgttct 1500

agggctttga ttcggcagtt tgctgactcg ctgcgttgta agaaacccac cctgtcaaca 1560

tcttccacat ttaaaggggc ggactgcgcc ggactatact acacgctcag cactcgacac 1620

gatgggcgag ccgaaggcga tgcactcgcc aagcgctctc tgctgactaa agcagctatg 1680

aatgccatgc acagcctacc tgtagcagta aagtgccaag aactccacgg acgcgctgta 1740

aacgtaatcg caggggcccg atccttttgc aattcaactc tagtaaccct cacgtcgtgg 1800

gctagcgaga ctagtcagag cagcgagcgt ttgctcgatg cagccaccct ggggatatac 1860

tttgccgtgc gtaagtgggt ggagaccgaa ctgctaacgc cccctcggtt tgcagagcgg 1920

gtcacgtcac tttttttccg gagccgcagg agagccgatc ttacgcccca gccattattg 1980

agtcgtcagc taaggttcat gaaagacttc caagtaggta caagtggacc cgcgaaatgc 2040

ccagtacgta tcaatctgac ttattatggg gttttattat cggcgggatg tttagcgaag 2100

ttacggcatg gtcaagggcg ctcacctaca cgactagcgt cccccggtat aggttccatt 2160

actgtgcaaa gcgcagtata cgatcccgaa gcttggttac tcgagagttc gggcttattg 2220

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctgggctc tgtaaagaat agca 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcagagctt aaactgggaa gcta 24

<210> 5

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggggucuaa gagcuuguaa acug 24

<210> 6

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uugugccucu guaagcaugu agcu 24

Claims

1.一种用于恒温直接扩增核酸的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种应用权利要求1所述DNA聚合酶的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述DNA聚合酶直接在样本中对靶核酸进行恒温扩增的方法。

3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述DNA聚合酶作为COVID-19试剂盒中使用的DNA聚合酶，对含有COVID-19的样本直接进行恒温扩增。

4.根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于，所述样本溶液为咽拭子样本。

5.根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于，所述样本溶液为粪便样本。