CN110747191B

CN110747191B - 多肽、嵌合聚合酶及其应用

Info

Publication number: CN110747191B
Application number: CN201910989110.8A
Authority: CN
Inventors: 高亚平; 田晖; 何筠; 伊戈尔·伊万诺夫
Original assignee: Anxuyuan Biotechnology Shenzhen Co ltd; Shenzhen Research Institute Tsinghua University
Current assignee: Anxuyuan Biotechnology Shenzhen Co ltd; Shenzhen Research Institute Tsinghua University
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN110747191A

Abstract

本发明公开了一种多肽、嵌合聚合酶及其应用。该多肽具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。该嵌合聚合酶包括：噬菌体DNA聚合酶；上述多肽；连接噬菌体DNA聚合酶和上述多肽的连接肽。野生型的DNA聚合酶对高浓度盐的耐受性较差，在高氯化钠或氯化钾环境中，其活性急剧降低，无法得到预期的延生产物，而本发明所提供的多肽可以有效提高DNA聚合酶的耐盐性，在通过连接肽将其连接到DNA聚合酶上形成嵌合DNA聚合酶后，聚合酶的耐盐性有了很大的提升，可以适用于较高盐浓度下的扩增。

Description

多肽、嵌合聚合酶及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种多肽、嵌合聚合酶及其应用。

背景技术

目前，在医学、生物学、农学以及相关的一些领域，核酸扩增正成为一种普遍的检验中间手段。而在核酸扩增的诸多方法中，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是用于体外DNA扩增的最常用方法。在PCR过程中，通常利用寡核苷酸引物、DNA聚合酶以及特定的模板链等通过退火延伸来生成DNA双链产物，并借由提高和降低反应混合物的温度(即，热循环)使得DNA双链产物的两条链重新分开，充当下一轮退火和延伸的模板并不断重复从而实现扩增。

在过去的十几年间，已经开发出了不依赖于热循环的其它核酸扩增方法。这些方法因其循环过程无需依赖运行温度的变化而被称为是“等温扩增”。等温扩增作为PCR的有益补充，主要应用在微量的全基因组扩增和检测等方面。大多数的等温扩增过程中需要用到具有较强的链置换活性的DNA聚合酶，这些酶可以在复制的时候置换下游的DNA链从而不需要模板变性。Phi29 DNA聚合酶是等温扩增过程中的一种常用聚合酶，该聚合酶主要从枯草芽孢杆菌噬菌体Phi29中分离得到，具有良好的链置换能力和持续合成能力，目前已成为等温扩增的首选DNA聚合酶。但也应该看到，野生型Phi29 DNA聚合酶的两个缺陷：(1)耐盐性较差，在高氯化钠或氯化钾环境中，其活性急剧降低，难于适应在高盐体系中的应用；(2)底物DNA结合能力较差，需要提高反应体系中的酶量，来提高扩增产物。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够提高DNA聚合酶耐盐性的多肽、包含该多肽的嵌合聚合酶以及该嵌合聚合酶的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种多肽，该多肽具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

本发明实施例的有益效果是：

该多肽可以有效提高DNA聚合酶的耐盐性，在通过连接肽将其连接到DNA聚合酶上形成嵌合DNA聚合酶后，聚合酶的耐盐性有了很大的提升，可以适用于较高盐浓度下的扩增。

本发明的第二方面，提供一种嵌合聚合酶，包括：噬菌体DNA聚合酶；上述多肽；连接噬菌体DNA聚合酶和上述多肽的连接肽。其中，上述多肽为超嗜热甲烷菌(Methanopyruskandleri)拓扑异构酶V羧基端的E-L HhH模序，E-L HhH模序具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

该嵌合聚合酶相比于现有的野生型的DNA聚合酶而言，耐盐性能有了很大的提升，可以适用于较高盐浓度下的扩增。

根据本发明的一些实施例，噬菌体DNA聚合酶为Phi29 DNA聚合酶。

根据本发明的一些实施例，Phi29 DNA聚合酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

根据本发明的一些实施例，噬菌体DNA聚合酶通过羧基端与所述连接肽相连。

根据本发明的一些实施例，连接肽是至少2个氨基酸长的氨基酸序列，其使得嵌合聚合酶能够保持其两端功能性氨基酸序列的结构和功能。具体的连接肽序列的选择可以采用常用的柔性连接肽、刚性连接肽；或结合生物信息学技术，根据同源建模的方法计算机辅助相应的遗传算法设计相应的连接肽。

根据本发明的一些实施例，连接肽具有如SEQ ID No.5或SEQ ID No.9所示的氨基酸序列或具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供编码上述嵌合聚合酶的核苷酸序列。根据本发明的实施例，该核苷酸序列可以是如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供一种重组载体，该重组载体包括上述的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，该重组载体可以是在质粒载体的多克隆位点插入上述核苷酸序列得到的重组质粒。

根据本发明的实施例，质粒载体可以是诸如pET28a等本领域所知的质粒载体。

根据本发明的实施例，重组载体可以是在诸如pET28a等质粒载体的Eco RⅠ和NotⅠ酶切识别位点插入上述核苷酸序列得到的重组质粒。

本发明的第五方面，提供一种重组细胞，该重组细胞包括上述的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，该重组细胞可以是将上述重组载体导入大肠杆菌得到的重组细胞。

根据本发明的实施例，该重组细胞可以是将上述重组载体导入大肠杆菌DH5α得到的重组细胞。

本发明的第六方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述的嵌合聚合酶。

根据本发明的实施例，该试剂盒可以是DNA扩增试剂盒或测序试剂盒。

根据本发明的实施例，该试剂盒包括上述的嵌合聚合酶、缓冲液、核苷三磷酸、引物。

本发明的第七方面，提供一种对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，包括将模板DNA与混合物接触的步骤，混合物包括缓冲液、引物、核苷三磷酸和上述任一种嵌合聚合酶。

根据本发明的实施例，提供一种滚环扩增的方法，包括将模板DNA与上述嵌合聚合酶、缓冲液、引物、核苷三磷酸混合，在特定温度条件下作用一定时长。

根据本发明的实施例，提供一种滚环扩增的方法，包括将模板DNA与上述嵌合聚合酶、缓冲液、引物、核苷三磷酸混合，在20-30℃的温度条件下反应30min-3h。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的突变型Phi29-el嵌合聚合酶的构建策略图。

图2是野生型Phi29和TopV-el基因的质粒模板的PCR产物和回收产物结果，其中A是PCR结果，B是回收产物结果，A和B中marker右侧分别代表Phi29的质粒模板的条带和TopV-el的质粒模板的条带。

图3是野生型Phi29和TopV-el基因的质粒模板的酶切产物和酶切回收产物的结果。其中，A表示酶切产物的电泳结果，泳道2和泳道3为Phi29片段、泳道4和泳道5为TopV-el片段；B表示酶切回收产物的电泳结果，泳道2为Phi29片段、泳道3为TopV-el片段。

图4是野生型Phi29 DNA聚合酶和突变型Phi29-el嵌合聚合酶的12％SdS-PAGE电泳结果，A表示野生型Phi29 DNA聚合酶的电泳结果，B表示突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳结果。

图5是野生型Phi29 DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶的扩增能力检测结果。A是野生型Phi29 DNA聚合酶的电泳检测结果，B是突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳检测结果，A和B中的泳道2、泳道3、泳道4、泳道5分别代表酶和模板的浓度比例为20、10、5和2.5倍的情况。

图6是野生型Phi29 DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶的耐盐性能力检测结果，其中，A为野生型Phi29 DNA聚合酶的电泳结果，B为突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳结果，A和B中的泳道3-5分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的NaCl，泳道6-8分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的KCl；C和D分别表示A和B中的野生型Phi29 DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶在NaCl和KCl的不同浓度条件下的相对产物量。

图7是本发明的一个对比例的嵌合聚合酶的耐盐性能力检测结果，其中，A为电泳结果，泳道3-5分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的NaCl，泳道6-8分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的KCl；B为不同盐种类和不同盐浓度条件下的相对产物量。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

1.实验步骤

嵌合聚合酶的构建策略如图1所示，图1是本发明的一个实施例的突变型Phi29-el嵌合聚合酶的构建策略图。

1.1质粒模板扩增

选取野生型Phi29 DNA聚合酶基因和TopV-el基因的质粒模板，添加限制性内切酶酶切位点的引物。准备PCR反应体系，如表1：

表1.质粒PCR反应体系

PCR扩增的条件为95℃变性30s，循环周期为95℃，30s，54℃，30s，72℃，2min，30个循环。PCR结束后，用NEB Monarch^TM PCR&DNA Cleanup Kit回收PCR。其中，DNA marker为全式金公司生产1kb plus DNA ladder(BM211-02)。Phi29片段扩增模板为质粒pGEX-6P-1-Phi29，来自于深圳清华大学研究院分子诊断及测序研发中心。TopV-el片段扩增模板为质粒pGEX-6P-1-TopVel，由上海捷瑞公司合成。ExpTaq DNA聚合酶购自湖南艾瑞克公司。

1.2质粒模板酶切

酶切Phi29片段和TopV-el片段。准备酶切反应体系，如表2：

表2.酶切反应体系

酶切反应条件为：37℃，16h。酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带选取凝胶DNA回收试剂盒(天根，货号DP204-02)回收。Kas I购自NEB(R0544S)。

1.3融合基因扩增

连接Phi29片段和TopV-el片段。准备连接反应体系，如表3：

表3.Phi29-EL连接反应体系

连接反应条件为：16℃，30min。

选取连接产物(即Phi29和TopV-el的融合基因片段，Phi29-EL)扩增。准备PCR反应体系，如表4：

表4.Phi29-EL融合基因片段PCR反应体系

PCR扩增的条件为95℃变性30s，循环周期为95℃，30s，55℃，30s，72℃，3min，30个循环。PCR结束后，用NEB Monarch^TM PCR&DNA Cleanup Kit(T1030)回收PCR产物。

1.4重组质粒构建

选取EcoR I和Not I对1.3中的PCR回收产物和pET28a载体进行双酶切，准备酶切反应体系，如表5：

表5.酶切反应体系

酶切反应条件为：37℃，16h。酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带选取凝胶DNA回收试剂盒回收。EcoR I(R3101)和Not I(R3189)购自NEB。

连接Phi29-EL片段和pET28a片段。准备连接反应体系，如表6：

表6.Phi29-EL与pET28a连接反应体系

连接反应条件为：16℃，30min。

取连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆。选用

PlasmidDNA Purification Kit(质粒提取试剂盒)提取质粒，进行测序，获得序列正确的突变型Phi29 DNA聚合酶质粒pET28a-Phi29el。

1.5蛋白表达纯化

取质粒pGEX6P-1-Phi29和pET28a-Phi29el，转化大肠杆菌表达菌株Rosette(Transgene),表达野生型Phi29 DNA聚合酶和Phi29-EL DNA嵌合聚合酶。蛋白诱导表达选择Overnight Express Autoinduction system(Millipore)。诱导条件为30℃，16h。

蛋白纯化步骤包括：

①收集菌体，超声破碎细胞。功率50-100W，超声5-15s，间隔10-30s。共持续20-40min。

②离心去除细胞碎片，取上清。分别采用采用Glutathione Sepharose 4B和NiSepharose亲和层析柱纯化步骤裂解粗产物。

③用12％SdS-PAGE检测蛋白纯度和浓度。

2.实验结果

2.1质粒模板扩增

图2是野生型Phi29和TopV-el基因的质粒模板的PCR产物和回收产物结果，其中A是PCR结果，B是回收产物结果，A和B中marker右侧分别代表Phi29的质粒模板的条带和TopV-el的质粒模板的条带。从图中可以看出，该次PCR已扩增出目的条带。

2.2质粒模板酶切

图3是野生型Phi29和TopV-el基因的质粒模板的酶切产物和酶切回收产物的结果。其中，A表示酶切产物的电泳结果，泳道2和泳道3为Phi29片段、泳道4和泳道5为TopV-el片段；B表示酶切回收产物的电泳结果，泳道2为Phi29片段、泳道3为TopV-el片段。A中泳道2和泳道3、B中泳道2表示的Phi29片段约为1.7kb；A中泳道4和泳道5、B中泳道3表示的TopV-el片段约为1.4kb。

2.3蛋白质检测

图4是野生型Phi29 DNA聚合酶和突变型Phi29-el嵌合聚合酶的12％SdS-PAGE电泳结果，A表示野生型Phi29 DNA聚合酶的电泳结果，B表示突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳结果。其中，A中泳道1和泳道2为野生型Phi29 DNA聚合酶，分子量为67.0kD；B中泳道1、泳道2和泳道3为BSA，泳道4和泳道5为突变型Phi29-el嵌合聚合酶，分子量为116.6kD。

上述结果表明，突变型Phi29-el嵌合聚合酶构建成功。

本实施例中，野生型Phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

野生型Phi29 DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

TopoV-EL(超嗜热甲烷菌(Methanopyrus kandleri)拓扑异构酶V羧基端的E-LHhH模序)的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

TopoV-EL(超嗜热甲烷菌(Methanopyrus kandleri)拓扑异构酶V羧基端的E-LHhH模序)的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5(GTGSGA)所示；

连接肽的核苷酸序列如SEQ ID No.6(GGTACCGGCTCTGGCGCC)所示；

突变型Phi29-el嵌合聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；

突变型Phi29-el嵌合聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

实施例2

扩增能力检测

将单链M13mp18(7249bp)和引物(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)退火生成模板引物复合物，以相同浓度的野生型Phi29 DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶催化延伸反应。调整酶和模板的浓度比例为20、10、5和2.5倍。

其中，引物退火反应体系包括：10pM单链M13mp18和100pM引物，1×退火缓冲液。10×退火缓冲液包括：100mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM EDTA、1M NaCl。退火反应条件为：95℃，5min；25℃，3h。

延伸反应体系包括10nM M13mp18、不同浓度的野生型Phi29 DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶、反应缓冲液(50mM的Tris-HCl、10mM的MgCl₂、10mM的(NH₄)₂SO₄、4mM的DTT及200μM的dNTPs，25℃时pH为7.5)。反应条件是30℃，30min。0.5M EDTA终止反应后，采用碱性琼脂糖凝胶电泳检测延伸产物。电泳条件为100V/3h，电泳结束后采用SYBR Gold染料染色。10×碱性琼脂糖电泳缓冲液包括：500mmol/L NaOH、10mmol/L EDTA)。6×碱性凝胶载样缓冲液(Leagene,NA0067)。

图5是野生型Phi29 DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶的扩增能力检测结果。A是野生型Phi29 DNA聚合酶的电泳检测结果，B是突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳检测结果，A和B中的泳道2、泳道3、泳道4、泳道5分别代表酶和模板的浓度比例为20、10、5和2.5倍的情况。从图5中可以看出，野生型Phi29 DNA聚合酶和突变型Phi29 DNA聚合酶均具有滚环复制能力，能够催化生成大于50kb的单链DNA。而在相同的酶浓度条件下，突变型Phi29-el嵌合聚合酶能够更多的反应产物；而且，突变型Phi29-el嵌合聚合酶在低模板浓度的扩增能力显著高于野生型Phi29 DNA聚合酶。

实施例3

耐盐性检测

采用与实施例2类似的滚环复制实验，同样以单链M13作为模板，反应体系的区别仅在于在延伸反应体系中分别添加100mM、200mM和300mM的NaCl以及100mM、200mM和300mM的KCl。结果如图6所示。图6是野生型Phi29 DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶的耐盐性能力检测结果，其中，A为野生型Phi29 DNA聚合酶的电泳结果，B为突变型Phi29-el嵌合聚合酶的电泳结果，A和B中的泳道3-5分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的NaCl，泳道6-8分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的KCl；C和D分别表示A和B中的野生型Phi29 DNA聚合酶及突变型Phi29-el嵌合聚合酶在NaCl和KCl的不同浓度条件下的相对产物量。从图中可以看出，A中泳道3-8未发现有明显的延伸产物的条带，而B中泳道3、泳道4、泳道6-8则可以看到有较为明显的延伸产物的条带；比较C和D，在不同的高盐浓度条件下，突变型Phi29-el嵌合聚合酶扩增产物量均明显高于野生型Phi29 DNA聚合酶。该结果表明，野生型的Phi29 DNA聚合酶对高浓度盐的耐受性较差，在高氯化钠或氯化钾环境中，其活性急剧降低，无法得到预期的延生产物，而突变型Phi29-el嵌合聚合酶的耐盐性则得到了显著的提高，能够分别耐受200mM的NaCl和300mM的KCl，在上述高盐体系中可以正常使用。

实施例4

不同模序的比较

对比例1

一种嵌合聚合酶，采用实施例1中的方法将野生型Phi29 DNA聚合酶与超嗜热甲烷菌(Methanopyrus kandleri)拓扑异构酶V羧基端的H模序通过氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的连接肽连接。

将对比例1中的嵌合聚合酶采用实施例3中提供的方法测试其耐盐性结果如图7所示。图7是本发明的一个对比例的嵌合聚合酶的耐盐性能力检测结果，其中，A为电泳结果，泳道3-5分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的NaCl，泳道6-8分别为体系中添加了100mM、200mM和300mM的KCl；B为不同盐种类和不同盐浓度条件下的相对产物量。从图7中可以看到，泳道3-8未发现有明显的延伸产物的条带，该嵌合聚合酶在高盐浓度条件下扩增产物的量下降异常明显，结合图6进行比较可以发现，其在100mM、200mM和300mM的NaCl或KCl溶液中扩增产物的相对量已经接近于野生型的Phi29 DNA聚合酶的水平，与突变型Phi29-el嵌合聚合酶的扩增水平相差较大。

实施例5

一种嵌合聚合酶Phi29-el，与实施了1的区别在于，所述采用的连接肽不同，本实施例中所采用的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.9(AYVDGA)所示。采用实施例1中的方法构建嵌合聚合酶Phi29-el，连接Phi29片段和TopV-el片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对阳性克隆中提取得到质粒进行测序，获得序列正确的突变型Phi29 DNA聚合酶质粒pET28a-Phi29el。转化大肠杆菌表达菌株Rosette(Transgene)表达Phi29-el DNA嵌合聚合酶。提纯后采用实施例3中的方法对野生型Phi29 DNA聚合酶和突变型Phi29-el DNA嵌合聚合酶的耐盐性检测，结果表明，野生型的Phi29 DNA聚合酶对高浓度盐的耐受性较差，在高氯化钠或氯化钾环境中，其活性急剧降低，无法得到预期的延生产物，而突变型Phi29-el嵌合聚合酶的耐盐性则得到了显著的提高，在高盐体系中仍然可以正常使用。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳清华大学研究院

安序源生物科技（深圳）有限公司

<120> 多肽、嵌合聚合酶及其应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 575

<212> PRT

<213> 噬菌体Phi29

<400> 1

Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr

1 5 10 15

Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile

20 25 30

Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met

35 40 45

Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys

50 55 60

Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys

65 70 75 80

Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg

85 90 95

Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys

100 105 110

Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe

115 120 125

Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly

130 135 140

Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro

145 150 155 160

Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala

165 170 175

Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser

180 185 190

Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys

195 200 205

Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr

210 215 220

Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys

225 230 235 240

Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala

245 250 255

Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu

260 265 270

Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile

275 280 285

Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile

290 295 300

Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly

305 310 315 320

Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met

325 330 335

Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys

340 345 350

Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr

355 360 365

Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu

370 375 380

Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr

385 390 395 400

Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu

405 410 415

Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe

420 425 430

Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys

435 440 445

Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly

450 455 460

Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu

465 470 475 480

Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg

485 490 495

Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys

500 505 510

Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val

515 520 525

Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu

530 535 540

Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln

545 550 555 560

Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys

565 570 575

<210> 2

<211> 1728

<212> DNA

<213> 噬菌体Phi29

<400> 2

atgaaacaca tgccgagaaa gatgtatagt tgtgactttg agacaactac taaagtggaa 60

gactgtaggg tatgggcgta tggttatatg aatatagaag atcacagtga gtacaaaata 120

ggtaatagcc tggatgagtt tatggcgtgg gtgttgaagg tacaagctga tctatatttc 180

cataacctca aatttgacgg agcttttatc attaactggt tggaacgtaa tggttttaag 240

tggtcggctg acggattgcc aaacacatat aatacgatca tatctcgcat gggacaatgg 300

tacatgattg atatatgttt aggctacaaa gggaaacgta agatacatac agtgatatat 360

gacagcttaa agaaactacc gtttcctgtt aagaagatag ctaaagactt taaactaact 420

gttcttaaag gtgatattga ttaccacaaa gaaagaccag tcggctataa gataacaccc 480

gaagaatacg cctatattaa aaacgatatt cagattattg cggaagctct gttaattcag 540

tttaagcaag gtttagaccg gatgacagca ggcagtgaca gtctaaaagg tttcaaggat 600

attataacca ctaagaaatt caaaaaggtg tttcctacat tgagtcttgg actcgataag 660

gaagtgagat acgcctatag aggtggtttt acatggttaa atgataggtt caaagaaaaa 720

gaaatcggag aaggcatggt cttcgatgtt aatagtctat atcctgcaca gatgtatagc 780

cgtctccttc catatggtga acctatagta ttcgagggta aatacgtttg ggacgaagat 840

tacccactac acatacagca tatcagatgt gagttcgaat tgaaagaggg ctatataccc 900

actatacaga taaaaagaag taggttttat aaaggtaatg agtacctaaa aagtagcggc 960

ggggagatag ccgacctctg gttgtcaaat gtagacctag aattaatgaa agaacactac 1020

gatttatata acgttgaata tatcagcggc ttaaaattta aagcaactac aggtttgttt 1080

aaagatttta tagataaatg gacgtacatc aagacgacat cagaaggagc gatcaagcaa 1140

ctagcaaaac tgatgttaaa cagtctatac ggtaaattcg ctagtaaccc tgatgttaca 1200

gggaaagtcc cttatttaaa agagaatggg gcgctaggtt tcagacttgg agaagaggaa 1260

acaaaagacc ctgtttatac acctatgggc gttttcatca ctgcatgggc tagatacacg 1320

acaattacag cggcacaggc ttgttatgat cggataatat actgtgatac tgacagcata 1380

catttaacgg gtacagagat acctgatgta ataaaagata tagttgaccc taagaaattg 1440

ggatactggg cacatgaaag tacattcaaa agagctaaat atctgagaca gaagacctat 1500

atacaagaca tctatatgaa agaagtagat ggtaagttag tagaaggtag tccagatgat 1560

tacactgata taaaatttag tgttaaatgt gcgggaatga ctgacaagat taagaaagag 1620

gttacgtttg agaatttcaa agtcggattc agtcggaaaa tgaagcctaa gcctgtgcaa 1680

gtgccgggcg gggtggttct ggttgatgac acattcacaa tcaaataa 1728

<210> 3

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Leu Lys Thr Leu Glu Ser Ile Val Gly Asp Leu Glu Lys Ala Asp Glu

1 5 10 15

Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Ala Ser Ala Val Arg Arg Leu Pro Val

20 25 30

Glu Glu Leu Arg Glu Leu Gly Phe Ser Asp Asp Glu Ile Ala Glu Ile

35 40 45

Lys Gly Ile Pro Lys Lys Leu Arg Glu Ala Phe Asp Leu Glu Thr Ala

50 55 60

Ala Glu Leu Tyr Glu Arg Tyr Gly Ser Leu Lys Glu Ile Gly Arg Arg

65 70 75 80

Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Leu Glu Leu Gly Ala Thr Pro Lys Ala Ala

85 90 95

Ala Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Leu Leu Asn Ile Glu Gly

100 105 110

Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile Leu Glu Ala Val Asp Tyr Asp

115 120 125

Leu Glu Arg Leu Ala Ser Leu Asn Pro Glu Glu Leu Ala Glu Lys Val

130 135 140

Glu Gly Leu Gly Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val Val Tyr Ala Ala Arg

145 150 155 160

Glu Arg Val Glu Ser Arg Arg Lys Ser Gly Arg Gln Glu Arg Ser Glu

165 170 175

Glu Glu Trp Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Val Gly Glu Gly Arg Ala

180 185 190

Arg Arg Leu Ile Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Gly Glu Val Gly Lys Leu

195 200 205

Val Glu Asn Ala Glu Val Ser Lys Leu Leu Glu Val Pro Gly Ile Gly

210 215 220

Asp Glu Ala Val Ala Arg Leu Val Pro Gly Tyr Lys Thr Leu Arg Asp

225 230 235 240

Ala Gly Leu Thr Pro Ala Glu Ala Glu Arg Val Leu Lys Arg Tyr Gly

245 250 255

Ser Val Ser Lys Val Gln Glu Gly Ala Thr Pro Asp Glu Leu Arg Glu

260 265 270

Leu Gly Leu Gly Asp Ala Lys Ile Ala Arg Ile Leu Gly Leu Arg Ser

275 280 285

Leu Val Asn Lys Arg Leu Asp Val Asp Thr Ala Tyr Glu Leu Lys Arg

290 295 300

Arg Tyr Gly Ser Val Ser Ala Val Arg Lys Ala Pro Val Lys Glu Leu

305 310 315 320

Arg Glu Leu Gly Leu Ser Asp Arg Lys Ile Ala Arg Ile Lys Gly Ile

325 330 335

Pro Glu Thr Met Leu Gln Val Arg Gly Met Ser Val Glu Lys Ala Glu

340 345 350

Arg Leu Leu Glu Arg Phe Asp Thr Trp Thr Lys Val Lys Glu Ala Pro

355 360 365

Val Ser Glu Leu Val Arg Val Pro Gly Val Gly Leu Ser Leu Val Lys

370 375 380

Glu Ile Lys Ala Gln Val Asp Pro Ala Trp Lys Ala Leu Leu Asp Val

385 390 395 400

Lys Gly Val Ser Pro Glu Leu Ala Asp Arg Leu Val Glu Glu Leu Gly

405 410 415

Ser Pro Tyr Arg Val Leu Thr Ala Lys Lys Ser Asp Leu Met Arg Val

420 425 430

Glu Arg Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile Arg Ala Ala Gly

435 440 445

<210> 4

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgaagaccc tggagagcat agtaggggat ctggagaagg ccgacgagct gaagcggaag 60

tacggatccg cgtccgcggt tcgacgtctg cccgtagagg agctacgcga actcgggttc 120

tccgacgatg agatcgccga gatcaagggg atacctaaga agctccggga ggccttcgac 180

cttgagaccg ccgcggaact ctacgagcgg tacggttcgc tgaaagagat cggtcgccga 240

ctctcttacg acgatctact cgagctcggt gcgactccga aggccgcggc cgagatcaag 300

gggccggagt tcaagttcct cctgaacatc gaaggggtcg gaccgaaact cgctgagcgg 360

atactcgagg ccgtggatta tgacctcgag cgactggctt ccctgaatcc cgaggaactt 420

gcggagaagg tggaaggact gggcgaagag ctcgcggagc gcgtcgtgta cgctgctagg 480

gagcgcgtag aaagtcgcag gaagtccggc cgccaggagc ggtcggagga agaatggaag 540

gagtggctcg agcgtaaggt cggcgagggg agggctcgcc ggttgattga gtatttcggc 600

tccgcgggtg aagtaggaaa gctggtcgag aacgccgagg tgtcgaagct actggaggtc 660

ccgggtatag gcgacgaggc cgtcgctagg ctcgtaccgg gctacaagac cctacgagac 720

gccggtctca cgccggccga agcggagcgc gtgctgaaac ggtacggctc ggtctccaaa 780

gtgcaggaag gagccactcc ggacgagtta cgcgagctcg gcctcggcga cgccaagatc 840

gcgaggatcc tgggcctgcg cagcctggtg aacaagaggc tggacgtgga caccgcgtac 900

gagctcaagc gtagatacgg ttccgtctcc gccgtccgga aggccccggt gaaagaactg 960

cgcgagctcg gcctctccga tcggaagatc gcacgtatca agggcatccc ggagacgatg 1020

cttcaggtcc gagggatgag cgtggagaaa gcggagcggc tgctggagcg tttcgatacc 1080

tggaccaagg tgaaggaagc tcccgtctcg gagctggtga gagtcccggg tgtcggattg 1140

agtttggtga aggagatcaa ggctcaggtg gatccggcct ggaaggcact tctggatgtc 1200

aaaggggtca gtccggagct ggccgaccgg ctcgtcgagg agctcggcag cccgtatcgg 1260

gtgctgacgg ccaagaaatc cgacctgatg agagtcgaga gagtcggacc gaagctcgcc 1320

gagcgaatcc gggccgcggg c 1341

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Thr Gly Ser Gly Ala

1 5

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtaccggct ctggcgcc 18

<210> 7

<211> 1028

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr

1 5 10 15

Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile

20 25 30

Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met

35 40 45

Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys

50 55 60

Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys

65 70 75 80

Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg

85 90 95

Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys

100 105 110

Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe

115 120 125

Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly

130 135 140

Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro

145 150 155 160

Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala

165 170 175

Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser

180 185 190

Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys

195 200 205

Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr

210 215 220

Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys

225 230 235 240

Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala

245 250 255

Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu

260 265 270

Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile

275 280 285

Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile

290 295 300

Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly

305 310 315 320

Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met

325 330 335

Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys

340 345 350

Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr

355 360 365

Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu

370 375 380

Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr

385 390 395 400

Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu

405 410 415

Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe

420 425 430

Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys

435 440 445

Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly

450 455 460

Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu

465 470 475 480

Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg

485 490 495

Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys

500 505 510

Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val

515 520 525

Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu

530 535 540

Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln

545 550 555 560

Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Gly

565 570 575

Thr Gly Ser Gly Ala Leu Lys Thr Leu Glu Ser Ile Val Gly Asp Leu

580 585 590

Glu Lys Ala Asp Glu Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Ala Ser Ala Val

595 600 605

Arg Arg Leu Pro Val Glu Glu Leu Arg Glu Leu Gly Phe Ser Asp Asp

610 615 620

Glu Ile Ala Glu Ile Lys Gly Ile Pro Lys Lys Leu Arg Glu Ala Phe

625 630 635 640

Asp Leu Glu Thr Ala Ala Glu Leu Tyr Glu Arg Tyr Gly Ser Leu Lys

645 650 655

Glu Ile Gly Arg Arg Leu Ser Tyr Asp Asp Leu Leu Glu Leu Gly Ala

660 665 670

Thr Pro Lys Ala Ala Ala Glu Ile Lys Gly Pro Glu Phe Lys Phe Leu

675 680 685

Leu Asn Ile Glu Gly Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg Ile Leu Glu

690 695 700

Ala Val Asp Tyr Asp Leu Glu Arg Leu Ala Ser Leu Asn Pro Glu Glu

705 710 715 720

Leu Ala Glu Lys Val Glu Gly Leu Gly Glu Glu Leu Ala Glu Arg Val

725 730 735

Val Tyr Ala Ala Arg Glu Arg Val Glu Ser Arg Arg Lys Ser Gly Arg

740 745 750

Gln Glu Arg Ser Glu Glu Glu Trp Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Val

755 760 765

Gly Glu Gly Arg Ala Arg Arg Leu Ile Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Gly

770 775 780

Glu Val Gly Lys Leu Val Glu Asn Ala Glu Val Ser Lys Leu Leu Glu

785 790 795 800

Val Pro Gly Ile Gly Asp Glu Ala Val Ala Arg Leu Val Pro Gly Tyr

805 810 815

Lys Thr Leu Arg Asp Ala Gly Leu Thr Pro Ala Glu Ala Glu Arg Val

820 825 830

Leu Lys Arg Tyr Gly Ser Val Ser Lys Val Gln Glu Gly Ala Thr Pro

835 840 845

Asp Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Gly Asp Ala Lys Ile Ala Arg Ile

850 855 860

Leu Gly Leu Arg Ser Leu Val Asn Lys Arg Leu Asp Val Asp Thr Ala

865 870 875 880

Tyr Glu Leu Lys Arg Arg Tyr Gly Ser Val Ser Ala Val Arg Lys Ala

885 890 895

Pro Val Lys Glu Leu Arg Glu Leu Gly Leu Ser Asp Arg Lys Ile Ala

900 905 910

Arg Ile Lys Gly Ile Pro Glu Thr Met Leu Gln Val Arg Gly Met Ser

915 920 925

Val Glu Lys Ala Glu Arg Leu Leu Glu Arg Phe Asp Thr Trp Thr Lys

930 935 940

Val Lys Glu Ala Pro Val Ser Glu Leu Val Arg Val Pro Gly Val Gly

945 950 955 960

Leu Ser Leu Val Lys Glu Ile Lys Ala Gln Val Asp Pro Ala Trp Lys

965 970 975

Ala Leu Leu Asp Val Lys Gly Val Ser Pro Glu Leu Ala Asp Arg Leu

980 985 990

Val Glu Glu Leu Gly Ser Pro Tyr Arg Val Leu Thr Ala Lys Lys Ser

995 1000 1005

Asp Leu Met Arg Val Glu Arg Val Gly Pro Lys Leu Ala Glu Arg

1010 1015 1020

Ile Arg Ala Ala Gly

1025

<210> 8

<211> 3087

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaaacaca tgccgagaaa gatgtatagt tgtgactttg agacaactac taaagtggaa 60

gactgtaggg tatgggcgta tggttatatg aatatagaag atcacagtga gtacaaaata 120

ggtaatagcc tggatgagtt tatggcgtgg gtgttgaagg tacaagctga tctatatttc 180

cataacctca aatttgacgg agcttttatc attaactggt tggaacgtaa tggttttaag 240

tggtcggctg acggattgcc aaacacatat aatacgatca tatctcgcat gggacaatgg 300

tacatgattg atatatgttt aggctacaaa gggaaacgta agatacatac agtgatatat 360

gacagcttaa agaaactacc gtttcctgtt aagaagatag ctaaagactt taaactaact 420

gttcttaaag gtgatattga ttaccacaaa gaaagaccag tcggctataa gataacaccc 480

gaagaatacg cctatattaa aaacgatatt cagattattg cggaagctct gttaattcag 540

tttaagcaag gtttagaccg gatgacagca ggcagtgaca gtctaaaagg tttcaaggat 600

attataacca ctaagaaatt caaaaaggtg tttcctacat tgagtcttgg actcgataag 660

gaagtgagat acgcctatag aggtggtttt acatggttaa atgataggtt caaagaaaaa 720

gaaatcggag aaggcatggt cttcgatgtt aatagtctat atcctgcaca gatgtatagc 780

cgtctccttc catatggtga acctatagta ttcgagggta aatacgtttg ggacgaagat 840

tacccactac acatacagca tatcagatgt gagttcgaat tgaaagaggg ctatataccc 900

actatacaga taaaaagaag taggttttat aaaggtaatg agtacctaaa aagtagcggc 960

ggggagatag ccgacctctg gttgtcaaat gtagacctag aattaatgaa agaacactac 1020

gatttatata acgttgaata tatcagcggc ttaaaattta aagcaactac aggtttgttt 1080

aaagatttta tagataaatg gacgtacatc aagacgacat cagaaggagc gatcaagcaa 1140

ctagcaaaac tgatgttaaa cagtctatac ggtaaattcg ctagtaaccc tgatgttaca 1200

gggaaagtcc cttatttaaa agagaatggg gcgctaggtt tcagacttgg agaagaggaa 1260

acaaaagacc ctgtttatac acctatgggc gttttcatca ctgcatgggc tagatacacg 1320

acaattacag cggcacaggc ttgttatgat cggataatat actgtgatac tgacagcata 1380

catttaacgg gtacagagat acctgatgta ataaaagata tagttgaccc taagaaattg 1440

ggatactggg cacatgaaag tacattcaaa agagctaaat atctgagaca gaagacctat 1500

atacaagaca tctatatgaa agaagtagat ggtaagttag tagaaggtag tccagatgat 1560

tacactgata taaaatttag tgttaaatgt gcgggaatga ctgacaagat taagaaagag 1620

gttacgtttg agaatttcaa agtcggattc agtcggaaaa tgaagcctaa gcctgtgcaa 1680

gtgccgggcg gggtggttct ggttgatgac acattcacaa tcaaaggtac cggctctggc 1740

gccctgaaga ccctggagag catagtaggg gatctggaga aggccgacga gctgaagcgg 1800

aagtacggat ccgcgtccgc ggttcgacgt ctgcccgtag aggagctacg cgaactcggg 1860

ttctccgacg atgagatcgc cgagatcaag gggataccta agaagctccg ggaggccttc 1920

gaccttgaga ccgccgcgga actctacgag cggtacggtt cgctgaaaga gatcggtcgc 1980

cgactctctt acgacgatct actcgagctc ggtgcgactc cgaaggccgc ggccgagatc 2040

aaggggccgg agttcaagtt cctcctgaac atcgaagggg tcggaccgaa actcgctgag 2100

cggatactcg aggccgtgga ttatgacctc gagcgactgg cttccctgaa tcccgaggaa 2160

cttgcggaga aggtggaagg actgggcgaa gagctcgcgg agcgcgtcgt gtacgctgct 2220

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atcgcgagga tcctgggcct gcgcagcctg gtgaacaaga ggctggacgt ggacaccgcg 2640

tacgagctca agcgtagata cggttccgtc tccgccgtcc ggaaggcccc ggtgaaagaa 2700

ctgcgcgagc tcggcctctc cgatcggaag atcgcacgta tcaagggcat cccggagacg 2760

atgcttcagg tccgagggat gagcgtggag aaagcggagc ggctgctgga gcgtttcgat 2820

acctggacca aggtgaagga agctcccgtc tcggagctgg tgagagtccc gggtgtcgga 2880

ttgagtttgg tgaaggagat caaggctcag gtggatccgg cctggaaggc acttctggat 2940

gtcaaagggg tcagtccgga gctggccgac cggctcgtcg aggagctcgg cagcccgtat 3000

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gccgagcgaa tccgggccgc gggctaa 3087

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Tyr Val Asp Gly Ala

1 5

Claims

1.一种嵌合聚合酶，其特征在于，包括：

噬菌体DNA聚合酶，所述噬菌体DNA聚合酶为Phi29 DNA聚合酶，所述Phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

连接肽，连接所述噬菌体DNA聚合酶和所述多肽；

其中，所述多肽通过所述连接肽连接于所述噬菌体DNA聚合酶的羧基端。

2.根据权利要求1所述的嵌合聚合酶，其特征在于，所述连接肽具有如SEQ ID No.5或SEQ ID No.9所示的氨基酸序列。

3.核酸分子，编码权利要求1至2任一项所述的嵌合聚合酶。

4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求3所述的核酸分子。

5.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求3所述的核酸分子。

6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至2任一项所述的嵌合聚合酶。

7.一种对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，其特征在于，包括将所述模板DNA与混合物接触的步骤，所述混合物包括缓冲液、引物、核苷三磷酸和DNA聚合酶，所述DNA聚合酶为权利要求1至2任一项所述的嵌合聚合酶。