JPH0343085A

JPH0343085A - 核酸配列を増幅し検出するための組成物及び方法

Info

Publication number: JPH0343085A
Application number: JP1299472A
Authority: JP
Inventors: Zvi G Loewy; ズビ　ジー．ローウィー; Howard J Baum; ハワード　ジェー．バーン
Original assignee: Lifecodes Corp
Current assignee: Lifecodes Corp
Priority date: 1988-11-18
Filing date: 1989-11-17
Publication date: 1991-02-25
Also published as: EP0369775A2; EP0369775A3; AU4470789A; IL92089A0; CA2001110A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は核酸配列を増幅し検出る、ための紹成物及び方
法に間る、。

〔従来の技術と発明が解決しようとる、課題〕多くの応
用にとって、興味ある核酸配列を増幅る、ことは望まし
いものである。第一の例は診断の分野である。！！ｉ染
剤に特異的な核酸配列を増幅る、ことは、より大きな検
出感度をもたらすであろう、事実、増幅法自体が検出手
段としての役目を果たしつる。第二の例は、核酸構造及
びＩＲ能の研究のために多量の核酸配列が必要とされる
場合である。その他多くの例が文献中に見出される。

新しい配列又は既存配列からの核酸合成について、幾つ
かの方法が文献中に記述されている。これらの方法は、
完全に特定化された配列の所定核酸を多量に生産できる
。しかし、関心事の核酸配列（本明口書で１関心事の核
＃配列Ｊとは、求めようとしている配列のもの）は実証
その他によって完全に特定されいない場合は、これらの
方法は関心事でない（本明細書で１関心事でない核酸配
列」とは、求めようとしているものでない配列のもの）
他の核酸配列の中で、関心事の核酸配列を選択的に増幅
る、ことを可能とる、ものでない。

新しい核酸を合成る、一つの既知方法は、ヌクレオシド
誘導体からの核酸の有機合成によるものである。この合
成は、ｒｆＩ液中又は固体支持体上で行なうことができ
る。有機合成の一つのタイプはホスホトリエステル法で
ある。この方法の説明については、ナラング（Ｎａｒａ
ｎｓ）ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

６８巻９０頁（１９７９年）及び合衆国特許第４，３５
６，２７０号を参照されたい、有機合成の第二のタイプ
はホスホジエステル法である。この方法の説明について
は、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ａ＋ｏ１．６８巻１０９頁（１９７９年）を参照された
い、ホスホトリエステル及びホスホジエステル法の両方
とも、オリゴヌクレオチド類をつくるのに使用でき、次
にこれらを一緒にる、と、かなりの大きさの遺伝子が形
成される。しかし、これらの方法は、労力と時間がかか
り、高価な設備と試薬を必要とし、また全体的に効率が
低い、このため、これらの方法は任意所望の多量の核酸
を合成る、には実際的でない。

また、関心事の少量の既存核酸から多量に核酸をつくる
方法も存在している。これらの方法は、絹換え核酸技術
を用いるものである。このため、第二の方法は関心事の
核酸を適当なりローニングベクターへ挿入して実砲され
る。関心事の核酸を含有る、絽換え型は、次に適当なホ
ストに導入される。関心事の核酸のコピーが鞘換え型の
７１製及びｌ又は転写を経てホスト内につくられる。こ
れらの方法の説明については、例えばマニアティス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クローニング：実験マニュア
ルＣコールドスプリングハーバ−研究所、３９０−４０
１頁（１９８２年）］、合衆国特許第４，４１６，９８
８号及び第４゜４０３．０３６号を参照されたい。この
方法の欠点は、クローニングの前又は後に関心事の核酸
を関心事でない核酸から分離せねばならないことである
。

核酸合成の第三の方法、すなわち有機合成とクローニン
グの練合わせは、合衆国特許第４．２９３．１＋５２号
に記述されている。この方法では、適当なオリボヌクレ
オチドを有機的に合成し、続いてベクターに挿入る、。

初期の挿入で形成される組換え型を、次の挿入に先立っ
て増幅る、。

核酸配列をつくる第四の方法は、転写に基づいている。

核酸が適当なプロモータ配列から下流に適当に位置る、
ならば、核酸配列の複数コピーが転写によって得られる
。例として、メルトン（Ｎｅｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　Ｉ：２巻４０３５頁（１９８
４年）を参竪のこと。もっと最近では、ミリガン（Ｍ　
ｉ　Ｉ　１ｉ３ａｎ　）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　　１５巻８７８３頁（１９８７年）が、
大部分−末鎖である鋳型からの転写を教示している。こ
こでも、先行技術の方法は完全に特定化された核酸配列
の増幅された生産を教示しているが、関心事でない他の
核酸配列の中での、関心事の核酸配列の選択的合成を教
示していない。更に、ミリガンらは延長された長さのＲ
ＮＡの合成を教示していない。

核酸合成の第五の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｂ）としても知られており、核酸配列の繰り返し的、酵
素的な、プライム化された合成に基づいている（合衆国
特許第４．６８３．＋９５号を参照）。

関心事の核酸配列をプライマーで二量体（三本鎖部分を
形成る、ように両者が結合したもの）化る、が、このプ
ライマーは関心事の核酸に刻る、相補体の一端である。

第一のプライマーを伸長した生成物は酵素合成によって
つくられる０次に第一のプライマーの伸長生成物は、プ
ライマーを伸長る、合成の次ラウンド用の新鋳型として
利用できる。実際、関心事の核酸配７＋１の一端である
第ニプライマーは新しい鋳型に二量体化され、関心事の
核酸配列のコピーである第二伸長生成物の合成を準備る
、０反応条件が、プライマー、基質及び酵素を制限しな
いものであれば、関心事の核酸配列及びその相補体の量
はプライマー伸長合成サイクルの数の指数関数として成
長る、であろう。

ＰＣＲは関心事の核酸配列又はその相補体に関連しない
核酸配列の合成を必要としない。更に、関心事の核酸配
列を完全に特定化る、必要がない。

その両端を特定化すればよい。例えば、遺伝子の５”及
び３′末端が知られていて、内部配列が知られていない
場合にこの方法を応用できる。全ゲノムＤＮＡから出発
る、だけで、多量の遺伝子がこの方法でつくられる。し
かし、ＰＣＲ法にも重大な欠点がある。理由は不明であ
るが、プライマーより内部の配列が長さ１キロベースを
越えると、ＰＣＲは能率的に働かなくなる。最後に、こ
の方法は関心事のｐｉ酸配列の相補体の増幅された合成
を必然的にもたらし、従って一方向の増幅、すなわち遺
伝子の一本鎖のみの増幅を許容しない。

〔課題を解決る、手段〕

本発明は核酸配夕１１を増幅及び／又は検出る、ための
紹成物及び方法に間る、。特定的には、本発明は、特定
の核酸配列から、初めに存在る、量に比べて多量に配列
コピーをつくるための鞘成物及び方法に関る、。初期の
核酸はＲＮＡ又はＤＮＡでありうる。これは−末鎖でも
二本鎖でもよい。また、比較的純粋な種でも、核酸？Ｆ
ｉ合物の一成分でもよい。本発明の増幅法：ｉ、核酸配
り１１の増幅を達成る、ために、繰り返し反応を利用し
ている。繰り返し反応はその特定の核酸配列の存在に決
定的に依存しているため、本発明方法は特定の核酸配列
の検出手段としても役立つ。

より詳しくは、本発明は関心事の目標核酸と二量体化（
二本鎖部分を形成る、ように結合）る、ポリヌクレオチ
ドプローブに結合された“移動性プロモータ構造体°′
を提供している。関心事の目標核酸は移動性プロモータ
構造体の制御下に転写によって増幅される。関心事の目
標核酸のそれ以上の増幅、及び本方法のその他の応用は
、下に説明されている。本発明は上の従来の技術で説明
された第四及び第五の方法に幾分の類似性をもっている
。しかし、（ａ）本発明は関心事の核酸配列の完全な特
定化を必要とせず、また（ｂ）本発明は関心事でない他
の核酸配列の中で、関心事の核酸配列の選択的合成を許
容る、点で、またその池の面で、第四の方法より改良さ
れている。本発明が第五の方法より改良されいる点は、
（ａ）これが遺伝子の一方向合或を許容し、また（ｂ）
閏−心事の核酸配列の一端のみにて配列情報が特定化さ
れればよいこと、及びその他の面である。

ＰＣＲ系と比較して、本発明の核酸配列増幅用ポリメラ
ーゼｌ転写系の利点は、以下のように要約できる。

ａ）　ＰＣＲで複製できるよＯも長い目標配列が、本発
明系で転写できる。

ｂ）　ＰＣＲでは、サイクルごとに核酸配列を２倍にで
きる。ポリメラーゼ／転写では、核酸配列は１００＠増
加できる。

Ｃ）各サイクルの時間は、ＰＣＲよりもポリメラーゼ／
転写のほうが短い。

ｄ）　ＩＩ！！！安定性酵素が本発明系では不要である
。

ｅ）ポリメラーゼ／転写はＰＣＲより強化された特異性
を引きだす。

ｆ）ポリメラーゼ／転写系はＲＮＡとＤＮＡに対して作
用る、。ＰＣＲは１）ＮＡでのみ実証された（　ＲＮＡ
が追加酵素で逆転写されない限りにおいて）。

８）ポリメラーゼｌ転写は、ＤＮＡを切断る、ようなサ
イクルごとの熱変性を必要としない。

第１図は、移動性プロモータ構造体、すなわちＴｎ５　
ｎｅｏ遺伝子のアニール処理複合体の一般化された構造
及び生成法を示す。ｎｅｏ遺伝子の部分的制限地図は、
図の上部に提示されている。目標配列は遺伝子の５’ｌ
ｉ域の２７０塩基対のＢｇｌ■／Ｐｖｕｌｌ断片に相当
る、。移動性プロモータ構造体のプローブ配列に相補的
な目標領域のＤＮＡ配列が示されている。プロモータと
プローブ配列を構成る、２本の相補的オリゴヌクレオチ
ド（ＡとＢ〉は目標鋳型にアニール処理される。移動性
プロモータ構造体は目標鋳型に再結合され、続いてＲＮ
Ａポリメラーゼによって転写される。上部のオリゴヌク
レオチドはく−）ストランドに相当し、下部のオリゴヌ
クレオチドは〈＋）プロモータストランドに相当る、。

第２図は、再結合済みアニール処理複合体の形成を例証
している。再結合済み複合体はポリアクリルアミドゲル
分析によって検出される。

第３図は、Ｔ３移動性プロモータ構造体であるＴｎ５　
ｎｅｏ遺伝子のアニール処理複合体からの転写生成物の
１！ス泳動分析を示す。

第４ＥＦＩは、ａ）“クローン化″Ｔ３ポリメラーゼ単
位の構造体；及びｂ）Ｔ３移動性プロモータ構造体の転
写複合体を例示している。

第６図は、プライマー岬長合成と比べた時の、移動性プ
ロモータ構造体で得られる増幅程度を例証している。

第６図は、全ヒトゲノムＵ軸Ａの背景におけるＴ３移動
性プロモータ構速球の特異性を例示している。

第７図は、鋳型（目標配列〉が、ａ）野性型Ｈａｅ１１
１−Ｈｉｎｆｌβグロブリン断片；及びｂ）野性型Ｈａ
ｅｌｌｌ−Ｑｄｅｌρグロブリン断片である場合の、再
結合済みアニール処理複合体を例示している。

第８図は、ＲＮＡ鋳型から得られる転写生成物のｔ気泳
動分析を示す。

第９図は、移動性プロモータ構造体に指示された転写と
、プライマー伸長合成による逆転写との複数交互サイク
ルの一般図を例示しており、これによって関心事のポリ
ヌクレオチドが合成のサイクル数に対して指数関数的に
増幅できる。実線は関心事の目標配タリに相当る、。オ
リゴヌクレオチドＡとＢからなる移動性プロモータ構造
体は、アニール処理されて、目標配列に再結合される（
段階１）、適当なＲＮＡポリメラーゼによる転写は、複
数の転写体を生ずる（波線、段Ｆ１２）、転写体をコピ
ーる、ために、プライマー〈オリゴヌクレオチドＣ〉を
転写体の３′末端にアニール処理しく段階３）、デオキ
シヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼの添加によって延
長される。オリゴヌクレオチドＡ′とＢを含めてなる第
二の移動性プロモータ構造体をアニール処理し、プライ
マー伸長部に再結合る、（段階４）。この梓動性プロモ
ータ構造体は架橋配列を欠いている。この方法のＴｉ数
サイクルは、補間の目標配列の指数関数的増幅をもたら
す、この方式は、架橋配り１１が効率的転写に必要でな
い場合の状況にも適用できる。この場合、オリゴヌクレ
オチドＡ’は反復法を通じてオリゴヌクレオチドへの代
わりとなる。

第１０図は、移動性プロモータ構造体に指示された複数
ラウンドの転写の全体案を例示したものである。実線は
関心事の目標配列に相当る、。オリゴスクレオチドＡと
Ｂからなる移動性プロモー夕構造体は、アニール処理さ
れて目標配列に再結合されろく段階１）。適当なＲＮＡ
ポリメラーゼによる転写は複数の転写体く波線、段階２
）をもたらす。転写体はアニール処理されて、オリゴヌ
クレオチドＡとＣからなる第二の移動性プロモータ構造
体へ再結合される（段階３）。ＲＮＡ鋳型の転写は相補
的な転写体の合成を生じる（段階４）。

これらの転写体はアニール処理されて、オリゴヌクレオ
チｌ”　ＤとＢを含めてなる第三の移動性プロモータに
再結合される（段ＰＪ　５　）。この移動性プロモータ
構造体は架橋配列を欠いている。このＲＮＡ鋳型の転写
は、段階４のＲＮＡに相補的な転写体の合成をもたらす
。これらの転写体は、続いてアニール処理されて、オリ
ゴヌクレオチドＤとＣを含めてなる第四の移動性プロモ
ータ構造体に再結合され、この構造体も架橋配列を欠い
ている（段階６）。この方法を反復る、と、期間目標配
列の指数関数的増幅をもたらす。この方式も、架橋配列
が効率的転写に必要でない場合の状況に適用可能である
。この場合、オリゴヌクレオチドＤは反復性を通してオ
リゴヌクレオチＦ’　Ａの代わりとなる。

以下は、本開示に使用されている神々の用語とその意図
された意味である。

［ブロモ−タコ転写開始に必須のもので、転写開始を制御る、二本鎖ポ
リヌクレオチド配列。プロモータは非対称的に働く。二
本鎖ポリヌクレオチド配列を考えてみよう。

５’−ｔ、、、Ｂｘ、、ＹＺｃ、、、、、Ｄ−３’３’
−ａ、、、、ｂｘ、、ｙｚｃ、、、、、ｄ−５’ここで
”Ａ”塩基はワトソン：クリック体系に従って”ａ”と
対合し、１８”は”ｂ”と対合る、。また、５’−Ｘ、
、ＹＺ−３’ ３’−ｘ、、ｙｚ−５’ はプロモータである。

プロモータは非対称的に働くため、ＲＮＡポリメラーゼ
は５“から３′への方向に一本鎖のみを転写る、。

本出願の目的にとって、以下の取決めが採用される。

（１）プロモータは包括的に次のように示される。

５’−Ｘ、、ＹＺ−３’ ３’−ｘ、、ｙｚ−５’ （２）転写の方向はＸから２へ向かい、２がらＸへでは
ない。

（３）ストランド（叉は配クリ）　５’−Ａ、、ＢＸ、
、ＹＺＣ，、、Ｄ−３’はプラスストランド（又は配列
）である。

（４）ストランド（叉は配列）３’−ａ、、、ｂｘ、、
ｙｚｃ、、、ｄ−５はマイナスストランド（又は配列）
である。

（５）配列５°−Ｘ、、ＹＺ−３’は°”プラスプロモ
ータ師配列である。

（６）配列３’−ｘ、、ｙｚ−５’は°゛マイナスフロ
モータ″配列ある。

転写体の第一ヌクレオチド（すなわち５゛−末端ヌクレ
オチド）はプロモータから下流の（すなわちプロモータ
の３゛測て）アラスストランド上の第一ヌクレオチドに
相当る、。

［プローブ配列コこれと、実質的に相補的なポリヌクレオチドとの間で形
成されろ二重体が、転写を許容る、条件下に安定である
ような長さ及び組成のポリヌクレオチド、本出願では、
プローブは、包括的に５’−Ｄ、。

、、ＥＦ−３’又は３’−ｆｅ、、、ｄ−５’で示され
る。ポリヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチドの
範囲と重複る、範囲内にありうる。

［目標ポリヌクレオチド］プローブの目標ポリヌクレオチドは、プローブと実質的
に相補的なポリスクレオチドであって、この両者間に形
成される二重体が転写を許容る、条件下に安定であるよ
うなポリヌクレオチドである。本出願では、目標ポリヌ
クレオチドは包括的に３’−ｄ、、、ｅｆｐ、、、、、
ｑｒ−５’　Ｓｌ、は３’−１ｍｎｄ、、、、ｅｆｐ、
、、。

ｑｒ−５’で示される。プローブ配列とその目標ポリヌ
クレオチドが７ニール処理されて二重体を形成る、時、
プローブの目標ポリヌクレオチドの３′末端ヌクレオチ
ドが、プローブ配列の５′末端ヌクレオチドと非常に好
ましく塩基列合る、か、又は°゛謂刻合”をず６゜誤７
１合がないことが非常に好ましい。

［架橋配列コプローブ配列とプロモータとの間のオリゴ−又はポリヌ
クレオチド架橋。架橋配列の存在は必須ではないが、完
全長の転写体の合成を容易にる、。

このため、架橋配列はゼロ又はそれ以上のヌクレオチド
長でありうる。

［移動性プロモータ構造体］移動性プロモータ構造体はプロモータとプローブ配列と
を含めてなる。移動性プロモータ構造体は架橋配列も含
むこと゛がある。更に、移動性プロモータ構造体はプロ
ーブ配列の目標ポリヌクレオチドにハイブリッド形成に
よって結合できる。ハイブリッド化構造体は転写的にコ
ンピテントであり、目標ポリヌクレオチドは転写鋳型又
はその−部となる。

［＋１ヌクレオチド、＋！”ヌクレオチド］転写体の第
一ヌクレオチドは、プラスプロモータ配列の３′末端に
隣接した転写複合体のプラスストランド上のヌクレオチ
ドに相当る、。転写体の第一ヌクレオチドが対応してい
るヌクレオチドは、十ｌヌクレオチドと呼ばれるａ　＋
ｌヌクレオチドと塩基対合る、マイナスストランド上の
ヌクレオチドは、＋ｌ′ヌクレオチドと呼ばれる。

本発明の一つの態様において、５′から３゛への方向で
、（１）プラスプロモータ配列、（２）゛プラス゛架橋
配列、及び（３）プローブ配列の順序に結合された３つ
のポリヌクレオチド配列を含めてなる第一ポリヌクレオ
チド配列は、３′から５′への方向で（１）マイナスプ
ロモータ配列と（２）“マイナス゛架橋配列の１ｌｌｌ
ｉ序に結合された２つのポリヌクレオチド配列を含めて
なる第二ポリヌクレオチド配列と二量体化されるが、そ
の場合、プラスプロモータ配列はマイナスプロモータ配
列と相補的であり、また゛プラス”架橋配列は“°マイ
ナス”架橋配列と相補的であって、次の部分的に二本鎖
のポリヌクレオチド構造体が形成される。

−５’−Ｘ、、ＹＺ（＋）、Ｄ、、、、、ＥＦ−３’−
−３’−ｘｏ、ｙｚ（ｉ）ｎ　　　　　　　　　（Ａ）
ここで（１）　−は第一ポリヌクレオチド配りリの残り
の部分を表わす。

（２〉零零は第二ポリヌクレオチド配列の残りの部分を
表わす。

（３）１はヌクレオチドで、ｉは１と塩基対合る、ヌク
レオチドである。

（４）ｎは０より大きいか等しい。

（５）（１）ｎは°°プラス″架橋配列で、（ｉ）。は
（１）ｎに相補的な゛マイナス”架橋配列である。

（６）　５’−Ｘ、、ＹＺ−３’ ３’−ｘ、、ｙｚ−５’は７０モータである。

（７）　５’−Ｄ、、、、ＥＦ−３’はプローブ配列で
ある。

第一ポリヌクレオチド配列は３′末端をもち、これはプ
ローブ配列の３′末端でもある。第二ポリヌクレオチド
配列は５′末端をもち、これは、式Ａでｎ〉０の場合は
“°マイナス師架橋配列の５′末端であり、ｎ＝ｏの場
合はプロモータの５′末端である。式（Ａ）の構造体は
（１）ｎの合成を除いて転写を支持しないが、下に詳述
されているように、゛移動性プロモータ構造体１′とし
ての役目を果たし得る。

幾つかの移動性プロモータ構造体の場合、特異的な架橋
配列があることが好ましい。このため、十ｌヌクレオチ
ドはプローブ配列の５′末端から数塩基離れている。こ
の用意は転写の失敗を低下させるものと考えられ、また
プロモータが転写鋳型に結合される時に完全長さの転写
体の合成を容易にる、。

′及び°°は、ヌクレオチド以外の部分、例えばリポー
タ−分子を含めてなるものでもよい。−及び°°は、第
一及び第二ポリヌクレオチド配９１１がより大きいポリ
ヌクレオチド配クリの二部外であるように共有的に結合
できる。その場合、５′−Ｘ、、ＹＺ（＋）ｎ−３′及
び３’−ｘ、、ｙｚ（ｉ）ｎ−５’を含めてなる二量体
は、相補的配列のハイブリッド形成を許容る、条件下に
自動的に形成されよう。そうでない場合は、式（Ａ）の
構造体を形成る、ために、第一及び第二配列を該条件下
に一緒にしなければならない。

本発明のもう一つの態様では、移動性プロモータ構造体
は関心事の目標ポリヌクレオチドにアニール処１Ｆされ
て、転写的にコンピテントであるアニール処理複合（４
，を形成ずろ。ずなわち、複合体は、移動性プロモータ
構造体の制御下にｆ多動性ブロモータ構造体と両立る、
ＲＮＡポリメラーゼによって関心事の目標ポリヌクレオ
チドの転写を支持る、であろう。（ＲＮＡｌ＆ｌ’存件
のＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡアニール処理複合体を好
むと予想されることに留意されたい。ｌｃｉ］様に、Ｄ
　Ｎ　Ａ　ＩＲ存性ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡアニー
ル処理複合体を好むことが予想されよう。しかし、複合
体の化学的性質について、絶対的な要件はない。）アニール処理複合体の化学構造を、下の式（Ｂ）にボす
。

（Ｂ）へ−５’−Ｘ、、ＹＺ（１）。Ｄ、、、、ＥＦ−３’−
−３’−ｘ、、ｙｚ（ｉ）、ＰＯ，ＶＷ−３’−ｄ、、
、、ｅｆｐ、、、、、、ｑｒ−５’こコテ５’−ＷＶｄ
、　、、　、ｅｆｐ、　、　、　、　、ｑｒ−５’！、
ｔ　目標ポリヌクレオチドである。その他の記号は式（
Ａ）中のものと同し意味をもっている。（アニール処理
複合体（１３）の全長転写体は５’−（＋）、Ｉｌ、、
、、、ＥＦＰ、、、、、、ＱＲ−３’であろう。）移動性プロモータ構造体上のプローブ配列は、関心事の
目標ポリヌクレオチドと二量体を形成る、。プローブ配
列の長さと組成は、転写過程を支持る、条件下に二量体
が安定であるような長さ及び組成である。例えば、二量
体は転写反応混合物中に溶融してはならない。それ以外
では、プローブ配列と目標ポリヌクレオチドとの間のあ
る程度の誤対合は許容できる。誤対合が許容されるのは
、恐ら＜　ＲＮＡポリメラーゼが（マイナスストランド
の連続であるところの）関心事の目標ポリヌクレオチド
である鋳型ストランドを読取り、第一ヌクレオチドで始
まる転写体で、鋳型ストランドに相補的な転写体を合成
る、ためであろう、プローブ配列と目標ポリヌクレオチ
ドとの間の誤対合はこの過程を中断しないであろう。

好ましい態様においては、マイナスプロモータ配列、又
は場合によってはマイナス架橋配列、の５′末端ヌクレ
オチドは同じ二重らせん上の目標ヌクレオチドの３′末
端ヌクレオチドに隣接している。このため、好ましい態
様においては、構造体（Ｂ）は次のような形となる。

一５’−Ｘ、、ＹＺ（１）ｎＤ、、、、ＥＦ−３’零ネ
３’−Ｘ、、ｙ２（＋）ｎＰＯ，−５’　　　０１１−
３’ｄ、、、、ｅｆｐ、、、、ｑｒ−５’Ｂ′ ここて３′−ｄ、、、、ｅｆｐ、、、、ｑｒ−５’は目
標ポリヌクレオチドであり、その他の記号は式（Ａ）中
と同し意味をもっている。

好ましいＢ様において、アニール処理複合体は再結合（
リゲーション）されて、再結合清みアニール処理複合体
を形成る、。アニール処理複合体には、移動性プロモー
タ構造体の第二ポリヌクレオチド配列上゛の５′末端ヌ
クレオチドと関心事の目標ポリヌクレオチドの３′末端
ヌクレオチドとの間に切断部がある。（式（Ｒ′）を参
ｉ１；ｊ、）再結合済みアニール処理複合体では切断部
（ｎｉｃｋ）は峰田され、鋳型は＋１′ヌクレオチドか
ら移動性プロモータ間の連結部を経て目はポリヌクレオ
チドの５゛宋端まで連続的なストランドである。

再結合済１−７ニール処浬知合体と非出結合アニール処
１１１ｊ川合（４：の双方とち転（う゛を支持る、が、
全長転写体は再結合済みアニール処理複合体によつで、
はるかに効率的に合成されろ。

移動性プロモータ構造体が、関心事の目標ポリヌクレオ
チドでのアニール処理に先立って形成されなくともよい
ことに注目すべきである。即ち、移動性プロモータ構造
体の第一ポリヌクレオチド配列と第二ポリヌクレオチド
配列、及び関心事の目標ポリヌクレオチドが単一反応混
合物にされて、ここでこれらがアニール処理複合体を形
成でき。

転写的にコンピテントな各複合体から転写体の多くのコ
ピーがつくられるため、式（８）又は（Ｂ′）又は再結
合型の＜Ｂ′）を使用して、関心事の目標ボッ又クレオ
チド又はその部分を増幅できる。複合体上に架橋配列す
なわち（１）ｎがあれば、これは配列５’−Ｄ、、、Ｅ
Ｆ、、、、によって同時増幅されよう。

関心事の目標ポリヌクレオチドは、関心事でないその他
のポリヌクレオチドを含めてなる混合物中にあ０うる。

移動性アロモータ構造体は選択性を示す。プロモータ上
のプローブ配列は、プローブ配り１１と関心事の目Ｗ＜
リヌクレオチトとの相補性（場合により、全体的又は実
質的）のため、関心事の目標ポリヌクレオチドにアニー
ルる、が、関心事でないその他のポリヌクレオチドには
、相補性の欠如のためアニールしない。アニール処理条
件、転写条件、長さ及びｌ叉は矧成は、移動性プロモー
タ構造体の選択性を高めるか低めるかる、ために調整で
きる。

移動性プロモータ構造体自体は（架橋配列の合成を除い
て）転写を支持しないため、またアニール処理複合体く
ｎ動性プロモータからの転写を支持る、）は関心事の目
標ポリヌクレオチドが試験試料中に存在る、場合にのみ
形成できるため、移動性プロモータに依存る、転写過程
は試験試料中の目標ポリヌクレオチドの存在と量を検出
る、ための方法として使用できる。

好ましい態様において、試験試料は検出試験に使用され
る移動性プロモータ構造体に関連る、“内因性”プロモ
ータを含んでいない、°°内因性”プロモータは、アニ
ール処理複合体を転写る、のに用いられるＲＮＡポリメ
ラーゼが内因性プロモータを含めてなる転写単位をも転
写る、場合には、移動性プロモータ構造体に関連づけら
れる。更に、その他任意の内因性転写能力が、例えば先
行の脱タンパク化によって不能とされるであろう、この
ように、好ましい態様においては、移動性プロモータ構
造体に指示された転写があり、そのような転写のみがあ
る。このタイプの好ましい態様の一例は、移動性プロモ
ータ構造体が非常に特異的な原核プロモータであって、
試験試料が原核起源のポリヌクレオチドを含有る、場合
である。非常に特異的な原核プロモータの例は、Ｔ３、
Ｔ７及びＳｒ１からのバクテリオファージプロモータで
ある。

試験混合物が移動性プロモータ構造体に指示された転写
のみを支持る、ことは決定的ではない。

例えば、試験混合物は次に三つを支持できる。（Ｏ移動
性プロモータ構造体に指示された転写、（１０移動性ブ
ロモ一ダ構造体依存性転写に使用されるＲＮＡポリメラ
ーゼが試験混合物中にプロモータとしである内因性配列
を含有る、場合のハイブリッド転写、及び（ｉｉｉ）非
特異的に開始されるＲＮＡ合成［シャーミン（Ｓｈａｒ
ｍｅｅｎ）及びティラー（Ｔａｙｌｏｒ）、Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１５巻６７０５−６７１１頁
（１９８７年）；ジエンボーン（５Ｃ１１ｅｎｂｏｒｎ
）及びミーレンドルフ（Ｍ　ｉ　ｅ−ｒｅｎｄｏｒｆ）
、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１３巻６２２
３−６２３６頁（１９８５年〉］、この状況では、関心
事の目標ポリヌクレオチド中にコードされた情報を運搬
る、転写体は、それてもあるその他の特定化できる特性
、例えば特定的大きざから検出てきる。

発明のもう一つの態様で１．１、関心事の目標ポリヌク
レオチドの特性中にコードされた関心事の遺伝情報は、
桟動性７０モーダ構造体に指示された転写と、それに続
く転写生成物のそれ叙しの特性化によって明らかにされ
ろ。

例えば、野性９遺１云子は変異型遺伝子には欠けている
ような特定の場所に制用部位をもちうる。

る、と、野性型生物と変ｔ４型生狗のゲノムが適当な制
限酵素で消化される場合、関心事の野性型遺伝子断片は
対応る、変異型遺伝子断片とは異なる大きさをもってあ
ろう。この二生物から得られろ移動性ブロモーダ措造体
に指示された転写ちまた、大きさが異なるであろう。

もう一つの例は、野性型遺伝子と変異型遺伝子との間の
よく特性化された差が知られていないか、又は知られて
いるとしても１．差を明らかにる、ための都合のよい方
法が存在しない場合である。ここで、関心事の野性型遺
伝子と、対応る、変異型遺伝子とを、上に述べたように
、移動性プロモータ構造に指示された転写にかけろこと
ができる。

次に野性型及び変異型転写体は、任意適当な手法によっ
て配列決定され、遺伝子の配列が比較される。

多くの配列決定手法がＩＱ在利用できる。サンガー　（
Ｓａｎｇｅｒ）らの配り１１決定手法とその変法が記述
されており、分子遺伝学の技術で周知である。例として
、サンガーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４巻５４６巻真４６３頁７年〉を参
照のこと。その代わりに、移動性プロモータ構造体に指
示された転写体を直接に配列決定できる。例として、ギ
ツシュ（Ｇｉｓｈ）及びエクスティン（Ｅｃｋｓｔｅｉ
ｎ）、５ｃｉｅｎｃｅ２４０巻＋　５２０−１５２２頁
（１’１３８８年）を１　！ＩＨ６配列決定（こ関る、
これらの２文献は参照によって本出願に取り入れられて
いる。

もう一つの態様で、移動性プロモータ構造体の指示下に
つくられる転写体は、プライマー伸長合成によって逆転
写される。プライマー伸長合成はファインバーブ（Ｆｅ
ｉｎｂｅｒｉり及びフォーゲルシュタイン（Ｖｏｇｅｌ
ｓｔｅｉｎ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　１３７巻２Ｂ＋３−２６７頁（１９８４年）に記述
されている。この方法は移動性ブＯモータ依存性の合成
と組合わせると、目標ポリヌクレオチド配列に相補的な
ポリヌクレオチド配列の増幅をもたらす。必亜な場合、
転写体は絽合わせ方法の生成物として逆転写体のみを残
すように、優先的に消化できる。例えば、転写体がＲＮ
Ａで、逆転写体がＤＮＡでありうる。転写体をＲＮＡ５
ｅ　（リボヌクレアーゼ）で消１ヒできる。

発明のもう一つのＢ様では、第一の移動性プロモータ構
造体は第一目標ポリヌクレオチド配列の転写体の合成を
指示る、。転写体はプライマー伸長合成によって逆転写
される。（逆転写用のプライマーは、仔意所望の転写体
部分にハイブリッド化る、ために選択できる。〉転写体
−逆転写体二量体をその一本鎖成分に溶融る、。逆転写
体は第一目標ポリヌクレオチド配列と同じ配列をもち、
今や第二目標ポリヌクレオチド配列として利用できる。

第二目標ポリヌクレオチド配列に適しｋ（すなわち、移
動性プロモータ構造体に指示された転写を許容る、ため
に安定なハイブリッドを形成る、ようなプローブ配列を
もった）第二移動性プロモータ構造体は、第二転写体の
転写を指示る、ために提供される。この方法は反復され
る。第一、第二、第三８９０１．転写体はすべて第一目
標ポリヌクレオチドの配列を含めてなる。このため、こ
の反復法は目標ポリヌクレオチド配列の指数関数的増幅
（移動性プロモータ構造体に指示された転写のサイクル
数に対して）を許容る、。この反復法を第９図に図式的
に示す。

第一、第二、第三１．９．移動性プロモータ構造体は、
異なるものでありうるが、その必要はない。

一般には、二つの移動性プロモータ構造体で十分である
。一つの態様では、第一の移動性プロモータ構造体は架
橋配列をもたず、移動性プロモータ構造体の全系統が同
じである。

発明のもう一つのｅ様では、移動性プロモータ構造体に
指示された転写反応の転写体は、第二移動性プロモータ
構造体に指示された“第二ラウンド”の転写において、
関心事の目標ポリヌクレオチドとしての役目を果たす。

この場合も、方法は反復される。一つの反復ｌ去が第１
０１ａで図式的に例示されている。

好ましい態様では、転写の各所ラウンドの前に再結合反
応が行なわれる。というのは、再結合済みアニール処理
複合体は再結合されない複合体より効率的であるためで
ある。

もう一つの態様では、第一移動性ブロモーダ構造体は架
橋配列をもっていない。

〔実施例〕

以下は本発明実施の最善の方式を含めた手１１１０を例
示る、実施例である。これら０実施例は限定的に考えら
れてはならない。池にｌ子育がなければ、すべての百分
率は重喰で、またすべての溶媒混合物割合は容量による
。

実施例１　移動性プロモータ構造体の形成第−ＤＮＡ配
列：５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡ
ＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＡＡＣ（続　く）（続き）ＧＣ
ＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣ−３’を第二ＤＮＡ配列：３’−ＴＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＴＴ
Ｇ−５’と二量体化る、と移動性プロモータができる。

５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡ
ＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＡＡＣ（続く）３’−ＴＴＡＡ
ＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＴＴＧ−５’（続き
）ＧＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣ−３’この二量体はバクテ
リオファージＴ３のＲＮＡポリメラーゼによる転写を指
示る、のに有用である。

二本鎖配列：５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ−３’３’
−ＴＴＡＡＴＴＧにＧＡＧＴＧＡＴＴＴ−５’は天然の
Ｔ３　ＲＮＡポリメラーゼプロモータである［バス（Ｂ
ａｓｕ）ら、１９８４年１．１８Ｃ２５９巻＋９９３−
１９９８頁コ。

二量体　５’−ＧＧＧＡＡＣ−３’ ３’−ＣＣＣＴ丁Ｇ−５’ はプラス架橋配列５”−（＋ＧＧＡＡｆ、’−３’とマ
イナス架橋配列３’−ＣＣＣＴＴに−５’によって形成
される。

第−ＤＮＡ配列の３′末端上の最後の２５ヌクレτチド
からなるＤＮＡ配列、すなわち５’−ＣＴＧＣＧＣＡＡ
ＧＧＡＡＣＧＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣ−３’は、細菌ト
ランスボゾンＴｎ５のｎｅｏ遺伝子の配列に相補的な１
０一ブ配列を形成る、。

実ｍ例２　転写コンピテントなアニール処理複合体の形
成実施例１の移動性プロモータ構造体を関心事の目標ＤＮ
Ａ配列、すなわちＴｎ５のｎｅｏ遺伝子の２７０塩基配
列にアニール処理した。２７０塩基配列は、ｎｅｏ遺伝
子（ファーマシア）を含有る、プラスミドｐＺＬ２５０
（ｐＡＣ３６２）の２７０塩基対のＰｖｕ■−ｅ３＋ｎ
制限断片を溶融る、ことによって得られた［ローライ（
Ｌｏｅｗｙ）ら［１９８７年］Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１巻６２６−６３５頁］、アニ
ール処理複合体は第１図に例示的に示されている。この
複合体は転写的にコンピテントである。

実施例３　再結合済みアニール処理複合体の形成実施例
２のアニール処理複合体をＴ４　　ＤＮＡリガーゼと一
緒に３７℃で一夜培養る、と、再結合されたアニール処
理複合体が生じ、その移動性プロモータ構造体のマイナ
スストランドの５′末端ヌクレオチドと目標ｎｅｏ遺伝
子配列の３′末端ヌクレオチドとの間の切断部が＊＊＊
され、３’−５’ホスホジ工ステル結合に置き換えられ
る。移動性プロモータ構造体のマイナスストランドの５
１末端ヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
と３２ｐＡＴＰでラベルされた。第２図はアニール処理
複合体の形成を例証している。レーン１は２７０塩基の
大きさの標準に相当る、。レーン２は標識付きオリゴヌ
クレオチドのみを示し、レーンａはｎｅｏ遺伝子用２７
０塩基の目標配列に再結合された標識付きオリゴヌクレ
オチドを示す、再結合済みアニール処理複合体の形成は
、変性ゲル中での放射性ＤＮＡの電気移動度において、
低分子量に対応る、移動度から約３００塩基に対応る、
移動度への変化によって示される。

実施例４　移動性プロモータ構造体に指示された転写実施例３の再結合済みアニール処理複合体をリポヌクレ
オシド三燐酸の存在下に・Ｔ３ポリメラーゼと一緒に培
養した。生体外転写用の反応条件が、本質的に記述のと
おりに行なわれた［メルトン（ＭｅＩｔｏｎ）ら、［１
９８４年］Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　
１２巻４０３５頁コ、転写反応に続いて、ｔＲＮＡ　（
１０■ｇ／ｍ１）２μｍと４Ｍ氷酢酸９０μｍを容管に
加え、ＲＮＡを沈殿させるために、管をｌθ分間氷Ｅに
置いた。ペレットを集め、２Ｍ氷酢Ｍ　２００μｍの添
加によって第二の酢酸沈殿を行ない、続いて７０Ｘエタ
ノールで洗浄した。ペレットを体質染料（９０ｘホルム
アミド、ＩＸ　ＴＯＥ、　０．０２ｘブロモフエノール
ブルー、０．０２Ｘキシレンシアツール）中に再懸濁し
、６＝ポリアクリルアミド酎ユリアゲル上で分析した。

第３図はＴ３移動性プロモータ構造体転写反応の生成物
を例示している。レーンｌは２７０塩基の大きさの標準
を含有した。移動性プロモータ構造体に指示された転写
からの全長転写体は、レーン１中の材料とは；Ｉ同しＩ
ｉ２置に走ることが予想される。

事実、レーン２は転写反応の生成物を含有し、予想位置
に顕著なバシトを示したが、より小さい大きさの生成物
も明らかであった。レーン３と４は、電気泳動に先立っ
て、それぞれＲＮＡ５ｅ及びＤＮＡ５ｅで処理された転
写反応生成物を含有した。結果は、転写反応生成物がＲ
ＮＡであることを明らかに示し。

た、レーン６は、転写反応生成物が陰イオン交換樹脂（
クイアジエン〉に結合できることを示す。

ＲＮＡはこの樹脂に特異的に結合る、が、ＤＮＡとタン
パクはカラムから溶離される。全体的に、これらの結果
は、転写反応から得られる生成物が実際にＲＮＡである
ことを例証している。

その他のポリメラーゼ、例えばＴ７　ＲＮＡポリメラー
ゼとＳＦ３　ＲＮＡポリメラーセを上の反応に使用して
、本質的に同じ結果が得られる。

実施Ｐ１４５　　移動性ブａモータ構造体に指示された
転写複合体の効率本実施例では、移動性プロモータ構造体に指示された転
写複合体の効率を、゛°クローン化”系における同様な
複合体の効率と比較した。ｐＡＣ３８９は移動性プロモ
ータ構造体に認識される同じ配列の上流にクローン化Ｔ
３プロモータを含有る、プラスミドである。　ｐＡＣ３
８９は、ｎｅｏｌｌ伝子（第１図）（ファ−マシアから
人手できる）からの２７０塩基対のＥｃｏＲ１／Ｐｖｕ
　ＩＩ断片を単離し、この断片をＥＣ（ＩＲ＋及びＥｃ
ｏＲ■て制限されたブルースクリプトベクター（ストラ
タジーン〉へ再結合る、ことによって得られた。ｐＡＣ
３８９から生ずるＲＮＡストランドは、ｐＡＣ３６２の
移動性プロモータ構造体転写から得られろものと同しス
トランドである。ｐＡＣ３８９の関連部分を第４Ａ図に
示す。

実施例；３の再結合済みアニール処理複合体も比較のた
めに示す（４Ｂ）。転写開始位置は（−）ストランドオ
リゴヌクレオチドの上方の星印によって表わされている
。２転写゛°単位”のヌクレオチド配列は、ｐＡＣ３８
９に存在る、小さなポリリンカー配列（５７ヌクレオチ
ド長）中でのみ異なっている。

第１表は、所定量の線状１ヒｐ　Ａ　Ｃ３）！　り又は
柊動性プロモータ構造体−ｎｅｏ遺伝子複合体を転写鋳
型として使用した時の転写生成物の存在を確認している
。

この結果は転写体の出現を反映しており、２種の転写複
合体がかなりの効率をもつことを例証している。

第１表Ｔ３移動性プロモータ構造体の感度８転写単位鋳型濃度モータ構造体　＋　　　＋　　　＋ｐＡＣ３８９＋　　　　　　＋　　　　　　　＋ａ感受
性は、転写体の存在（＋）又は不在（−）を検出る、こ
とによって決定された。

実施例６　　ｎｅｏ！を転子配列の増幅本実施例では、
ｎｅｏ遺伝子目標配列の１当量を使用して、プライマー
伸長合成用の鋳型として使用されたものと同し再結合済
み転写コンピテント複合体を形成させた。鋳型コピー当
たり１コピーのプライマー伸長が部つくられる。しかし
、転写複合体中の１鋳型が多くの転写体をつくることが
できる。特異的活性の差を許容後の、放射性前駆体取り
入れの比は、移動性プロモータ構造体に指示された転写
による遺伝子増幅の尺度である。第５図は、移動性プロ
モータ構造体で得られる標準的増幅の程度を示す。２７
０塩基の大きさの標準はＭて指定される場所に示されて
いる。プライマー伸長生成物をレーンＡに、Ｔ３移動性
プロモータ構造体転写の生成物をレージＢに示す、プラ
イマー伸長で生ずるよりも約５０（８多い生成物が、転
写反応の結果として生ずる。

実施例７　移動性プロモータ構造体の選択性移動性プロ
モータ構造体転写複合体の形のｌ　ｌａｇから５００　
ｎｇまで変化る、ｎｅｏ遺伝子配列の量を、全部ヒトの
ＤＮＡ　１μｇ、！ｌ−扉合した。ヒトゲノムＤＩＩＡ
は、本質的に記述のとおりに単離された［クンケル・エ
ル・エム（Ｋｕｎｋ６１　、　Ｌ、Ｍ、）［１９８２年
］Ｎｕｃ１．　Ａｃｄｓ　Ｒｅｓ、　１０巻１５５７−
１５７１（頁］。目標配列ＤＮＡ＃びにヒトゲノムＩＪ
ＮＡをＢｇｌｌ１）走びＰｖｕｒｌでｌ白化させた。

目標配列ＤＮＡ　（ｎｅｏ配列）、ヒトゲノムＤＮＡ及
びＴ３プロモータを含めてなる適当なオリゴヌクレオチ
ドを１００℃で１０分培養し、３７℃に徐々にアニール
処理した。切断部の１「葺成のため、この複合体をＴ４
ＤＮＡリガーゼと一緒に一夜培青したく第１図）。

これらの混合物を記述（実施例４）のとおりに転写反応
中に培養した。第６図は、百万倍過剰の非特異的背景で
転写反応を実施した時に、Ｔ３の特異的転写体が検出で
きることを示す。

実施例日　特異的ゲノム配列の存在検出式（Ａ）の移動
性プロモータ構造体を使用して（鎌形細胞遺伝子型の検
出）、（ａ）バクテリオファージＴ３プロモータ：５’−ＡＡ
ＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ−３’３’−ＴＴＡＡ
ＴＴ＋；τ；ＧＡＧＴＧＡＴＴＴ−５゜（ｂ）架橋配列
：５”−ＧＧＧＡＡ（−３’ ３’−ＣＣＣＴ丁Ｇ−５′ 及び（ｃ）プローブ配列：５　’　−ＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡ
ＧＧＧ−３’からなる移動性プロモータ構造体を、野性
型個体からのゲノム（ＩＮＡの制限消化までアニール処
理した。ゲノムＤＮＡは）ＩａｅｍとＨｉｎｆ　ｒ　、
又はＩｔ　ａ　ｅ　ｍとＤｄｅＴで消化させてあった。

プローブ配列はＨａ　ｅ　ＩＴ位置に隣接しており、こ
れは５′側の冬型性Ｄｄｅｌへ約１５０塩基の位置であ
る［ボンズ（Ｐｏｎｃｚ）ら、ＪＢＣ２５８巻１１５９
９−１１６０９頁、１９８３年］。第７図は、ＤＮＡが
それぞれＨａｅ［ｆｆ　／Ｈｉｎｆ　Ｉ及びＨａｅｌｌ
ｌ　１０ｄｅ　ｌで制限される場合の野性型個体の再結
合済みアニール処理複合体を例示している。再結合済み
複合体を変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動にか
けた。

実施例９　移動性プロモータ構造体に指示されたＲＮＡ
鋳型の転写実施例１の移動性プロモータ構造体を、Ｔｎ５のｎｅｏ
遺伝子の２７０塩基配クリに相補的なＲＮＡ配列にアニ
ール処理した。　ＲＮＡ鋳型は、バクテリオファージＳ
Ｐ６ブロモータの制御下にｎｅｏ遺伝子をコードしたプ
ラスミド（ｐＡＣ３９９）を転写る、ことによって得ら
れた。　ｐＡＣ３９９は、ｎｅｏ遺伝子をコードしたＢ
ｇ＋１１／５ａｌｌ断片を、Ｂａｎ＋旧及び５ａｌｌで
制限された一Ｐ６（プロメガから人手できる）へ挿入る
、ことによって構築された。Ｓｒ１　ＲＮＡポリメラー
ゼによるｐＡＣ３９９の転写はｍＲＮＡを生じ、続いて
これをクイアジエンカラムで単離した。Ｔ３プロモータ
を含めてなるオリゴヌクレオチドをＲＮＡにアニール処
理し、複合体をＴ４　ＲＮＡリガーゼによって室温で一
夜再結合させた。再結合済み７二一ル処理複合体をリポ
ヌクレオシド三燐酸の存在下に７３　ＲＮＡポリメラー
ゼと一緒に培養した０反応条件は既述のとおりである［
メルトンら［１９８４年］ＮｕＣ１，Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　１２巻４０３５頁］、転写生成物を実施例４に述
べたとおりに氷酢酸で沈殿させ、６ｘポリアクリルアミ
ド相ユリアゲル上で分画した。結果を第８図に示す。

レーン１は２７０塩基の大きさの標準に相当る、。

レーン２はＴ３　ＲＮＡポリメラーゼで転写されたＲＮ
Ａ１０Ｎ＾転写複合体の転写生成物に相当る、。レーン
３は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼで転写された同一転写
複合体に相当る、。レーン４は、限定的なヌクレオチド
濃度の存在下に（リボＣＴＰを添加しない）Ｔ３　ＲＮ
Ａポリメラーゼで転写された転写複合体に相当る、。レ
ーン６は、任意のポリメラーゼの不在下に転写された転
写複合体に相当る、。これらの結果は、Ｔ３　ＲＮＡポ
リメラーゼの存在下に、ＲＮＡは適当な転写鋳型として
の役目を果たすことを示唆している。

実施例１０　核酸配列の増幅／検出用キット便宜上と標
準化のため、核酸配列を増幅及びｌ又は検出る、ための
試薬をキットにまとめることができる。このようなキッ
トは包装型で以下のものをもった多容器単位を含めてな
る。

（ａ）プラスプロモータ配列、プラス架Ｍａｌｉａ列、
及び１０一プ配列を含めてなる第一のポリヌクレオチド
配列を含有る、容器であって、その場合に０〉プラスプ
ロモータ配列が５′でプラス架橋配列へと結合され、プ
ラス架橋配列が５１でプローブ配列へと結合されており
、（ｉｉ）プラス架橋配列がゼａ又はそれ以上のヌクレ
オチド長であり、かつ（１目）第一ポリヌクレオチド配
列の３′末端がプローブ配列の３′末端である場合の第
一ポリヌクレオチド配列を含有る、容器；（ｂ）マイナスプロモータ配列を含めてなる第二のポリ
ヌクレオチド配列を含有る、容器であって、その場合に
（ｉ）マイナスプロモータ配９１１が３′でマイナス架
橋配列へ結合され、００マイナスプロモ一タ配列がプラ
ス１０モータ配列と相補的てあり、（ｉｉ０マイナス架
架橋列がプラス架橋配列と相補的であり、かつ（ｉｖ）
第二ポリヌクレオチド配列の５′末端がマイナス架橋配
列の５′末端である場合の第二ポリヌクレオチド配列を
含有る、容器；及び（Ｃ）プローブ配列のハイブリッドを検出る、手段を含
有る、容器。

上のキット成分は、実験室用の！ｌｆｆ１に容易に適合
できる。

また、当業者に自明のように、本発明方法は連続型で所
望の核酸配列を提供る、ために自動化できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、移動性プロモータ構造体、すなわちＴｎ５　
ｎｅｏ遺伝子のアニール処理複合体の一般化された構造
及び生成法を示す略図である。第２図は、再結合済み７二一ル処理ｍ合体の形成を例証
しているポリアクリルアミドゲル分析の写真である。第３図は、Ｔ３移動性プロモータ構造体であるＴｎ５　
ｎｅｏ遺伝子のアニール処理複合体からの転写生成物の
電気泳動分析を示す写真である。第４図は、ａ）°゛クローン化Ｔ３ボリメラーセ単イ０
の構造体；及びｂ）Ｔ３ｆＧ動性アロモータ構造体の転
写複合体を例示している略図である。第５図は、プライマー伸長合成と比べた時の、移動性プ
ロモータ構造体で得られる増幅丘度を例証している分析
結果を示す写真である。第６図は、全ヒトゲノムＤＮＡの背景におけるＴ３移動
性プロモータ構造体の特異性を例示している分析結果の
写真である。第７図は、鋳型（目標配列〉が、ａ）野性型１１ａｅ■
−旧ｎｆｌβグロブリン断片；及びｂ）野性型Ｈａｅｍ
−Ｄｄｅ　Ｉβグロブリン断片である場合の、再結合済
みアニール処理複合体を例示している分析写真である。第８図は、ＲＮＡ鋳型から得られろ転写生成物の電気泳
動分析を示す写真である。第９図は、移動性プロモータ構造体に指示された転写と
、プライマー伸長合成による逆転写との複数交互サイク
ルの略■である。第１０図は、移動性プロモータ構造体に指示された複数
ラウンドの転写の全体案を例示した略図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、（ａ）プラスプロモータ配列、プラス架橋配列、及
びプローブ配列を含めてなる第一のポリヌクレオチド配
列であって、（ｉ）プラスプロモータ配列がプラス架橋
配列へ５’で結合され、プラス架橋配列がプローブ配列
へ５’で結合されており、（ｉｉ）プラス架橋配列がゼ
ロ又はそれ以上のヌクレオチド長であり、かつ（ｉｉｉ
）第一ポリヌクレオチド配列の３’末端がプローブ配列
の３’末端である場合の第一ポリヌクレオチド配列；及
び（ｂ）マイナスプロモータ配列を含めてなる第二のポリ
ヌクレオチド配列であって、（ｉ）マイナスプロモータ
配列がマイナス架橋配列へ３’で結合され、（ｉｉ）マ
イナスプロモータ配列がプラスプロモータ配列と相補的
であり、（ｉｉｉ）マイナス架橋配列がプラス架橋配列
と相補的であり、かつ（ｉｖ）第二ポリヌクレオチド配
列の５’末端がマイナス架橋配列の５’末端である場合
の第二ポリヌクレオチド配列；を含めてなる移動性プロモータ構造体。２、プラス架橋配列が少なくとも１ヌクレオチド長であ
る、特許請求の範囲第１項の移動性プロモータ。３、プラス架橋配列が少なくとも６ヌクレオチド長であ
る、特許請求の範囲第１項の移動性プロモータ。４、特許請求の範囲第１項の移動性プロモータ構造体と
関心事の目標ポリヌクレオチドとを含めてなるアニール
処理複合体であって、（ｉ）関心事の目標ポリヌクレオ
チドと、移動性プロモータ構造体のプローブ配列とが、
転写を許容する条件下に安定なハイブリッドを形成し、
かつ（ｉｉ）関心事の目標ポリヌクレオチドの３’末端
部分が一本鎖である場合のアニール処理複合体。５、プローブ配列が、関心事の目標ポリヌクレオチド上
の一つのヌクレオチドと誤対合ないし不対合になってい
る少なくとも一つのヌクレオチドを含有する、特許請求
の範囲第４項のアニール処理複合体。６、移動性プロモータ構造体の第二ポリヌクレオチド配
列の５’末端と、関心事の目標ポリヌクレオチドの３’
末端との間の切断部が、共有的に結合される、特許請求
の範囲第４又は５項のアニール処理複合体。７、移動性プロモータ構造体の第二ポリヌクレオチド配
列の５’末端と、関心事の目標ポリヌクレオチドの３’
末端との間の切断部が、酵素的再結合によって共有的に
結合される、特許請求の範囲第４又は５項のアニール処
理複合体。８、特許請求の範囲１項のアニール処理複合体と、アニ
ール処理複合体中に存在する任意のポリヌクレオチドと
ハイブリッドを形成できない関心事でない少なくとも一
つのヌクレオチドとを含めてなる組成物であって、ハイ
ブリッドが転写を許容する条件下に安定であるような組
成物。９、更に、ポリヌクレオチドリガーゼを含めてなる、特
許請求の範囲第８項の組成物。１０、（ａ）（１）プラスプロモータ配列、プラス架橋
配列及びプローブ配列を含めてなる第一のポリヌクレオ
チド配列と、（２）マイナスプロモータ配列、及びマイ
ナス架橋配列を含めてなる第二のポリヌクレオチド配列
を含めてなる移動性プロモータ構造体を、これらがアニ
ール処理複合体を形成するようにハイブリッド化条件下
に関心事の目標ポリヌクレオチドと一緒に培養し、その
場合に（Ａ）（ｉ）プラスプロモータ配列はプラス架橋配列に
５’で結合され、プラス架橋配列がプローブ配列に５’
で結合され、（ｉｉ）プラス架橋配列がゼロ又はそれ以上のヌクレオ
チド長であり、（ｉｉｉ）第一ポリヌクレオチド配列の３’末端がプロ
ーブ配列の３’末端であり、（Ｂ）（ｉ）マイナスプロモータ配列がマイナス架橋配
列に３’で結合され、（ｉｉ）マイナスプロモータ配列がプラスプロモータ配
列と相補的であり、（ｉｉｉ）マイナス架橋配列がプラス架橋配列と相補的
であり、（ｉｖ）第二ポリヌクレオチド配列の５’末端がマイナ
ス架橋配列の５’末端であり、（Ｃ）関心事の目標ポリヌクレオチドと移動性プロモー
タのプローブ配列が、転写を許容する条件下に安定なハ
イブリッドを形成でき、かつ（ｂ）アニール処理複合体の移動性プロモータの指示下
に、転写を許容する条件下にアニール処理複合体を培養
し、それによって関心事の目標ポリヌクレオチドの相補体、
又は該相補体の二次配列を含めてなるポリヌクレオチド
配列が増幅される場合の、ポリヌクレオチド増幅法。１１、関心事の目標ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレ
オチドが、プローブ配列の５’末端ヌクレオチドと塩基
対合又は誤対合している、特許請求の範囲第１０項によ
る方法。１２、更に、段階（ａ）の後であるが段階（ｂ）に先立
って、第二ポリヌクレオチド配列の５’末端とアニール
処理複合体上の関心事の目標ポリヌクレオチドの３’末
端との間に位置する切断部を修復することを含めてなる
、特許請求の範囲第１０又は１１項の方法。１３、目標
ポリヌクレオチドが核酸又は核酸混合物中に含まれる、
特許請求の範囲１０又は１１項の方法。１４、核酸又は核酸混合物が二本鎖であり、段階（ａ）
の前又は間に変性によって二本鎖が分離される、特許請
求の範囲第１３項の方法。１５、関心事の目標ポリヌクレオチドがＲＮＡ又はＤＮ
Ａである、特許請求の範囲第１０又は１１項の方法。１６、第一及び第二ポリヌクレオチド配列がＲＮＡ又は
ＤＮＡである、特許請求の範囲第１０又は１１項の方法
。１７、転写を許容する条件の一つがＲＮＡポリメラーゼ
の存在である、特許請求の範囲第１０又は１１項の方法
。１８、ＲＮＡポリメラーゼがＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６ＲＮＡポリメラー
ゼからなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１７項の
方法。１９、（ａ）（１）プラスプロモータ配列、プラス架橋
配列及びプローブ配列を含めてなる第一のポリヌクレオ
チド配列と、（２）マイナスプロモータ配列、及びマイ
ナス架橋配列を含めてなる第二のポリヌクレオチド配列
を含めてなる移動性プロモータ構造体を、これらがアニ
ール処理複合体を形成するようにハイブリッド化条件下
に関心事の目標ポリヌクレオチドと一緒に培養し、その
場合に（Ａ）（ｉ）プラスプロモータ配列はプラス架橋配列に
５’で結合され、プラス架橋配列がプローブ配列に５’
で結合され、（ｉｉ）プラス架橋配列がゼロ又はそれ以上のヌクレオ
チド長であり、（ｉｉｉ）第一ポリヌクレオチド配列の３’末端がプロ
ーブ配列の３’末端であり、（Ｂ）（ｉ）マイナスプロモータ配列がマイナス架橋配
列に３’で結合され、（ｉｉ）マイナスプロモータ配列がプラスプロモータ配
列と相補的であり、（ｉｉｉ）マイナス架橋配列がプラス架橋配列と相補的
であり、（ｉｖ）第二ポリヌクレオチド配列の５’末端がマイナ
ス架橋配列の５’末端であり、（Ｃ）関心事の目標ポリヌクレオチドと移動性プロモー
タのプローブ配列が、転写を許容する条件下に安定なハ
イブリッドを形成でき、その場合に関心事の目標ポリヌクレオチドの３’末端ヌ
クレオチドがプローブ配列の５’末端ヌクレオチドと塩
基対合又は誤対合し、（ｂ）第二ポリヌクレオチド配列の５’末端とアニール
化複合体上の関心事の目標ポリヌクレオチドの３’末端
との間に位置する切断部を修復し、（ｃ）アニール処理複合体の移動性プロモータの指示下
に、転写を許容する条件下にアニール化複合体を培養し
、（ｄ）段階（ｃ）の転写生成物を配列決定し、それによ
って関心事の目標ポリヌクレオチドが特性化される場合
の、ポリヌクレオチド配列の特性化法。２０、段階（ｂ）が省略される、特許請求の範囲第１９
項による方法。２１、関心事の目標ポリヌクレオチドがＲＮＡ又はＤＮ
Ａである、特許請求の範囲第１９又は２０項の方法。２２、関心事の目標ポリヌクレオチドが核酸又は核酸混
合物中に含まれる、特許請求の範囲第１９又は２０項の
方法。２３、（ａ）（１）プラスプロモータ配列、プラス架橋
配列及びプローブ配列を含めてなる第一のポリヌクレオ
チド配列と、（２）マイナスプロモータ配列、及びマイナス架橋配列
を含めてなる第二のポリヌクレオチド配列を含めてなる
移動性プロモータ構造体を、これらがアニール処理複合
体を形成するようにハイブリッド化条件下に関心事の目
標ポリヌクレオチドと一緒に培養し、その場合に（Ａ）（ｉ）プラスプロモータ配列は５’でプラス架橋
配列に結合され、プラス架橋配列が５’でプローブ配列
に結合され、（ｉｉ）プラス架橋配列がゼロ又はそれ以上のヌクレオ
チド長であり、（ｉｉｉ）第一ポリヌクレオチド配列の３’末端がプロ
ーブ配列の３’末端であり、（Ｂ）（ｉ）マイナスプロモータ配列が３’でマイナス
架橋配列に結合され、（ｉｉ）マイナスプロモータ配列がプラスプロモータ配
列と相補的であり、（ｉｉｉ）マイナス架橋配列がプラス架橋配列と相補的
であり、（ｉｖ）第二ポリヌクレオチド配列の５’末端がマイナ
ス架橋配列の５’末端であり、（ｂ）アニール処理複合体の移動性プロモータの指示下
に、転写を許容する条件下にアニール化複合体を培養し
、（ｃ）特徴的な大きさをもった転写生成物の在不在を検
出し、それによってプローブ配列と実質的に相補的な特異的ポ
リヌクレオチド配列が検出される場合の、特異的ポリヌ
クレオチド配列の検出法。２４、段階（ａ）の後で、ポリヌクレオチドのデュプレ
ックス領域中に存在する切断部が再結合される、特許請
求の範囲第２３項による方法。２５、（ａ）（１）プラスプロモータ配列、プラス架橋
配列及びプローブ配列を含めてなる第一のポリヌクレオ
チド配列と、（２）マイナスプロモータ配列、及びマイナス架橋配列
を含めてなる第二のポリヌクレオチド配列を含めてなる
移動性プロモータ構造体を、これらがアニール処理複合
体を形成するようにハイブリッド化条件下に関心事の目
標ポリヌクレオチドと一緒に培養し、その場合に（Ａ）（ｉ）プラスプロモータ配列はプラス架橋配列に
５’で結合され、プラス架橋配列がプローブ配列に５’
で結合され、（ｉｉ）プラス架橋配列がゼロ又はそれ以上のヌクレオ
チド長であり、（ｉｉｉ）第一ポリヌクレオチド配列の３’末端がプロ
ーブ配列の３’末端であり、（Ｂ）（ｉ）マイナスプロモータ配列がマイナス架橋配
列に３’で結合され、（ｉｉ）マイナスプロモータ配列がプラスプロモータ配
列と相補的であり、（ｉｉｉ）マイナス架橋配列がプラス架橋配列と相補的
であり、（ｉｖ）第二ポリヌクレオチド配列の５’末端がマイナ
ス架橋配列の５’末端であり、（Ｃ）関心事の目標ポリヌクレオチドと移動性プロモー
タのプローブ配列が、転写を許容する条件下に安定なハ
イブリッドを形成でき、その場合に関心事の目標ポリヌ
クレオチドの３’末端ヌクレオチドがプローブ配列の５
’末端ヌクレオチドと塩基対合又は誤対合し、（ｂ）ポリヌクレオチドのデュプレックス領域中に存在
する切断部をリガーゼによって再結合させ、（ｃ）アニール処理複合体の移動性プロモータの指示下
に、転写を許容する条件下にアニール化され再結合され
た複合物を培養し、かつ（ｄ）特徴的な大きさをもった転写生成物の在不在を検
出し、それによって、プローブ配列と実質的に相補的な特異的
ポリヌクレオチド配列が検出される場合の、特異的ポリ
ヌクレオチド配列の検出法。２６、段階（ｂ）が省略される、特許請求の範囲第２５
項による方法。２７、特異的ポリヌクレオチド配列がＲＮＡ又はＤＮＡ
である、特許請求の範囲第２３、２４又は２５項の方法
。２８、特異的ポリヌクレオチド配列が核酸又は核酸混合
物中に含まれる、特許請求の範囲第２３、２４又は２５
項の方法。２９、核酸又は核酸混合物が二本鎖であり、二本鎖が段
階（ａ）の前又は間に変性によって分離される、特許請
求の範囲第２８項の方法。３０、（ａ）（１）ｎ番目のプラスプロモータ配列とｎ
番目のプラス架橋配列を含めてなるｎ番目のプラス鎖、
及び（２）ｎ番目のマイナスプロモータ配列とｎ番目の
マイナス架橋配列とを含めてなるｎ番目のマイナス鎖、
の二つを含めてなるｎ番目の移動性プロモータ構造体を
、これらがアニール処理複合体を形成するようにハイブ
リッド化条件下に、ｎ番目の目標ポリヌクレオチドと一
緒に培養し、その場合に（Ａ）（ｉ）ｎ番目のプラスプロモータ配列は５’でｎ
番目のプラス架橋配列に結合され、ｎ番目のプラス架橋配列が５’でｎ番目のプローブ配列
に結合され、（ｉｉ）ｎ番目のプラス架橋配列がゼロ又はそれ以上の
ヌクレオチド長であり、（ｉｉｉ）ｎ番目のプラスポリヌクレオチド配列の３’
末端がｎ番目のプローブ配列の３’末端であり、（Ｂ）（ｉ）ｎ番目のマイナスプロモータ配列が３’で
ｎ番目のマイナス架橋配列に結合され、（ｉｉ）ｎ番目のマイナスプロモータ配列がｎ番目のプ
ラスプロモータ配列と相補的であり、（ｉｉｉ）ｎ番目のマイナス架橋配列がｎ番目のプラス
架橋配列と相補的であり、（ｉｖ）ｎ番目のマイナス鎖の５’末端がｎ番目のマイ
ナス架橋配列の５’末端であり、（Ｃ）（ｉ）ｎ番目の目標ポリヌクレオチドとｎ番目の
移動性プロモータのｎ番目のプローブ配列が、転写を許
容する条件下に安定なハイブリッドを形成でき、その場
合にｎ番目の目標ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオ
チドがｎ番目のプローブ配列の５’末端ヌクレオチドと
塩基対合又は誤対合し、（ｉｉ）第一サイクル中の目標ポリヌクレオチドが特異
的ポリヌクレオチドであり、（ｉｉｉ）第一以外の任意のサイクル中の目標ヌクレオ
チドが、前のサイクルの移動性プロモータ構造体に指示
された転写体であり、（ｂ）ｎ番目のマイナス鎖の５’末端とアニール処理複
合体上のｎ番目の目標ポリヌクレオチドの３末端との間
に位置する切断部を修復し、（ｃ）ｎ番目の移動性プロモータの指示下に、転写を許
容する条件下にアニール処理複合体を培養し、それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
増幅される場合の、移動性プロモータ構造体に指示され
た、少なくとも２サイクルの転写を行なうことを含めて
なる、ポリヌクレオチド配列の増幅法。３１、段階（ｂ）が省略される、特許請求の範囲第３０
項による方法。３２、（ａ）特許請求の範囲第３０項による移動性プロ
モータ構造体で指示される、少なくとも２サイクルの転
写を行ない；かつ（ｂ）最後の転写サイクルの転写生成物を配列決定し、それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
特性化されることを含めてなる、ポリヌクレオチド配列
の特性化法。３３、（ａ）特許請求の範囲第３１項による移動性プロ
モータ構造体で指示される、少なくとも２サイクルの転
写を行ない；かつ（ｂ）最後の転写サイクルの転写生成物を配列決定し、それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
特性化されることを含めてなる、ポリヌクレオチド配列
の特性化法。３４、（ａ）特許請求の範囲第３０項による移動性プロ
モータ構造体で指示される、少なくとも２サイクルの転
写を行ない；かつ（ｂ）最後の転写サイクルの転写生成物の大きさを標準
的遺伝情報と関連づけ；それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
特性化されることを含めてなる、ポリヌクレオチド配列
の特性化法。３５、（ａ）特許請求の範囲第３１項による移動性プロ
モータ構造体で指示される、少なくとも２サイクルの転
写を行ない；かつ（ｂ）最後の転写サイクルの転写生成物の大きさを標準
的遺伝情報と関連づけ；それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
特性化されることを含めてなる、ポリヌクレオチド配列
の特性化法。３６、すべてのプラスプロモータ配列が同一である、特
許請求の範囲第３０項の方法。３７、すべてのプラスプロモータ配列が同一である、特
許請求の範囲第３１項の方法。３８、移動性プロモータ構造体に指示された、少なくと
も２サイクルの転写を行なうことを含めてなる、特異的
ポリヌクレオチド配列の検出法であつて、その場合にｎ
が整数であり、ｎ番目のサイクルが、（ａ）（１）ｎ番目のプラスプロモータ配列とｎ番目の
プラス架橋配列を含めてなるｎ番目のプラス鎖、及び（
２）ｎ番目のマイナスプロモータ配列とｎ番目のマイナ
ス架橋配列とを含めてなるｎ番目のマイナス鎖、の二つ
を含めてなるｎ番目の移動性プロモータ構造体を、これ
らがアニール処理複合体を形成するようにハイブリッド
化条件下に、ｎ番目の目標ポリヌクレオチドと一緒に培
養し、その場合に（Ａ）（ｉ）ｎ番目のプラスプロモータ配列は５’でｎ
番目のプラス架橋配列に結合され、ｎ番目のプラス架橋配列が５’でｎ番目のプローブ配列
に結合され、（ｉｉ）ｎ番目のプラス架橋配列がゼロ又はそれ以上の
ヌクレオチド長であり、（ｉｉｉ）ｎ番目のプラスポリヌクレオチド配列の３’
末端がｎ番目のプローブ配列の３’末端であり、（Ｂ）（ｉ）ｎ番目のマイナスプロモータ配列が３’で
ｎ番目のマイナス架橋配列に結合され、（ｉｉ）ｎ番目のマイナスプロモータ配列がｎ番目のプ
ラスプロモータ配列と相補的であり、（ｉｉｉ）ｎ番目のマイナス架橋配列がｎ番目のプラス
架橋配列と相補的であり、（ｉｖ）ｎ番目のマイナス鎖の５’末端がｎ番目のマイ
ナス架橋配列の５’末端であり、（Ｃ）ｎ番目の移動性
プロモータのｎ番目のプローブ配列が、転写を許容する
条件下に、ｎ番目の目標ポリヌクレオチドと安定なハイ
ブリッドを形成でき、その場合に（ｉ）第一サイクル中の目標ポリヌクレオチドが特異的
ポリヌクレオチドであり、（ｉｉｉ）第一以外の任意のサイクル中の目標ヌクレオ
チドが、前のサイクルの移動性プロモータ構造体に指示された転写体であり、（ｉｉｉ）ｎ番目の目標ポリヌクレオチドの３’末端ヌ
クレオチドがｎ番目のプローブ配列の５’末端ヌクレオ
チドと塩基対合又は誤対合し、（ｂ）ｎ番目のマイナス鎖の５’末端とアニール化複合
体上のｎ番目の目標ポリヌクレオチドの３’末端との間
に位置する切断部を修復し、（ｃ）ｎ番目の移動性プロモータの指示下に、転写を許
容する条件下にアニール処理複合体を培養し、それによつて移動性プロモータに指示された転写体の存
在が、特異的ポリヌクレオチドの存在を示す場合の、特
異的ポリヌクレオチド配列の検出法。３９、段階（ｈ）が省略される、特許請求の範囲第３８
項による方法。４０、特異的ポリヌクレオチドが生物学的試料中に含有
される、特許請求の範囲第３８項の方法。４１、特異的ポリヌクレオチドが生物学的試料中に含有
される、特許請求の範囲第３９項の方法。４２、全てのプラスプロモータ配列が同じである、特許
請求の範囲第３８ないし４１項の任意の一つのものの方
法。４３、特異的ポリヌクレオチドがＲＮＡないしＤＮＡで
ある、特許請求の範囲第３０ないし４１項の任意の一つ
のものの方法。４４、特異的ポリヌクレオチドが核酸又は核酸混合物中
に含有される、特許請求の範囲第３０ないし４１項の任
意の一つのものの方法。４５、核酸又は核酸混合物が二本鎖であり、二本鎖が段
階（ａ）の前又は間に変性によって分離される、特許請
求の範囲第３０ないし４１項の任意の一つのものの方法
。４６、移動性プロモータ構造体に指示された転写と、プ
ライマー伸長合成による逆転写との交互サイクルの実施
を含めてなるポリヌクレオチド配列の増幅法であって、
その場合にｎがゼロより大きいか又は等しい整数で、（
２ｎ＋１）サイクルが、（ａ）（１）（２ｎ＋１）番目
のプラスプロモータ配列、（２ｎ＋１）番目のプラス架
橋配列、及び（２ｎ＋１）プローブ配列を含めてなる（
２ｎ＋１）番目のプラス鎖、及び（２）（２ｎ＋１）番
目のマイナスプロモータ配列と（２ｎ＋１）番目のマイ
ナス架橋配列とを含めてなる（２ｎ＋１）番目のマイナ
ス鎖とを、これらがアニール化複合体を形成するように
ハイブリッド化条件下に、（２ｎ＋１）番目の目標ポリ
ヌクレオチドと一緒に培養し、その場合に（Ａ）（ｉ）（２ｎ＋１）番目のプラスプロモータ配列
は５’で（２ｎ＋１）番目のプラス架橋配列に結合され
、（２ｎ＋１）番目のプラス架橋配列が５’で（２ｎ＋
１）番目のプローブ配列に結合され、（ｉｉ）（２ｎ＋１）番目のプラス架橋配列がゼロ又は
それ以上のヌクレオチド長であり、（ｉｉｉ）（２ｎ＋１）番目のプラスポリヌクレオチド
配列の３’末端が（２ｎ＋１）番目のプローブ配列の３
’末端であり、（Ｂ）（ｉ）（２ｎ＋１）番目のマイナスプロモータ配
列が３’で（２ｎ＋１）番目のマイナス架橋配列に結合
され、（ｉｉ）（２ｎ＋１）番目のマイナスプロモータ配列が
（２ｎ＋１）番目のプラスプロモータ配列と相補的であ
り、（ｉｉｉ）（２ｎ＋１）番目のマイナス架橋配列が（２
ｎ＋１）番目のプラス架橋配列と相補的であり、（ｉｖ）（２ｎ＋１）番目のマイナス鎖の５’末端が（
２ｎ＋１）番目のマイナス架橋配列の５’末端であり、（Ｃ）（ｉ）（２ｎ＋１）番目の目標ポリヌクレオチド
と（２ｎ＋１）番目の移動性プロモータの（２ｎ＋１）
番目のプローブ配列が、転写を許容する条件下に安定なハイブリッドを形成でき、その場合に（２ｎ＋１）番目の目標ポリヌクレオチドの
３’末端ヌクレオチドが（２ｎ＋１）番目のプローブ配
列の５’末端ヌクレオチドと塩基対合又は誤対合し、（ｉｉ）第一サイクル中の目標ポリヌクレオチドが特異
的ポリヌクレオチドであり、（ｉｉｉ）第一以外の任意のサイクル中の目標ヌクレオ
チドが、前のサイクルの移動性プロモータ構造体に指示された転写体であり、（ｂ）（２ｎ＋１）番目のマイナス鎖の５’末端とアニ
ール化複合体上の（２ｎ＋１）番目の目標ポリヌクレオ
チドの３’末端との間に位置する切断部を修復し、（ｃ）（２ｎ＋１）番目の移動性プロモータの指示下に
、転写を許容する条件下にアニール処理複合体を培養す
るという段階を含めてなり；また、ｎが１より大きいか又は等しい整数であって、２
ｎ番目のサイクルが、（ｄ）前の（２ｎ−１）番目のサイクルの移動性プロモ
ータに指示された転写体とハイブリッドを形成できるプ
ライマーをアニール処理し、その場合にハイブリッドが
プライマー伸長合成による逆転写を許容するような条件
下に安定であり；（ｅ）プライマー伸長合成によるによる（２ｎ−１）番
目のサイクルの転写体の逆転写を形成するという段階を
含めてなり；それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
増幅される場合の、ポリヌクレオチド配列の増幅法。４７、段階（ｂ）が省略される、特許請求の範囲第４６
項による方法。４８、（ａ）移動性プロモータ構造体に指示された転写
と特許請求の範囲第４６項による逆転写との交互サイク
ルを実行し；かつ（ｂ）最後の転写サイクルの転写生成物を配列決定し、それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
特性化されることを含めてなる、ポリヌクレオチド配列
の特性化法。４９、（ａ）移動性プロモータ構造体に指示された転写
と特許請求の範囲第４７項による逆転写との交互サイク
ルを実行し；かつ（ｂ）最後の転写サイクルの転写生成物を配列決定し、それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
特性化されることを含めてなる、ポリヌクレオチド配列
の特性化法。５０、（ａ）移動性プロモータ構造体に指示された転写
と特許請求の範囲第４６項による逆転写との交互サイク
ルを実行し；かつ（ｂ）最後の転写サイクルの転写生成物の大きさを標準
的遺伝情報と関連づけ；それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
特性化されることを含めてなる、ポリヌクレオチド配列
の特性化法。５１、（ａ）移動性プロモータ構造体に指示された転写
と特許請求の範囲第４７項による逆転写との交互サイク
ルを実行し；かつ（ｂ）最後の転写サイクルの転写生成物の大きさを標準
的遺伝情報と関連づけ；それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体が
特性化されることを含めてなる、ポリヌクレオチド配列
の特性化法。５２、すべてのプラスプロモータ配列が同じである、特
許請求の範囲第４６項の方法。５３、すべてのプラスプロモータ配列が同じである、特
許請求の範囲第４７項の方法。５４、移動性プロモータ構造体に指示された転写と逆転
写との交互サイクルの実施を含めてなる特異的ポリヌク
レオチド配列の検出法であつて、その場合にｎがゼロ又
は正の整数で、（２ｎ＋１）番目のサイクルが、（ａ）（１）（２ｎ＋１）番目のプラスプロモータ配列
、（２ｎ＋１）番目のプラス架橋配列、及び（２ｎ＋１
）番目のプローブ配列を含めてなる（２ｎ＋１）番目の
プラス鎖、及び（２）（２ｎ＋１）番目のマイナスプロ
モータ配列と（２ｎ＋１）番目のマイナス架橋配列とを
含めてなる（２ｎ＋１）番目のマイナス鎖とを、これら
がアニール処理複合体を形成するようにハイブリッド化
条件下に、（２ｎ＋１）番目の目標ポリヌクレオチドと
一緒に培養し、その場合に（Ａ）（ｉ）（２ｎ＋１）番目のプラスプロモータ配列
は５’で（２ｎ＋１）番目のプラス架橋配列に結合され
、（２ｎ＋１）番目のプラス架橋配列が５’で（２ｎ＋
１）番目のプローブ配列に結合され、（ｉｉ）（２ｎ＋１）番目のプラス架橋配列がゼロ又は
それ以上のヌクレオチド長であり、（ｉｉｉ）（２ｎ＋１）番目のプラスポリヌクレオチド
配列の３’末端が（２ｎ＋１）番目のプローブ配列の３
’末端であり、（Ｂ）（ｉ）（２ｎ＋１）番目のマイナスプロモータ配
列が３’で（２ｎ＋１）番目のマイナス架橋配列に結合
され、（ｉｉ）（２ｎ＋１）番目のマイナスプロモータ配列が
（２ｎ＋１）番目のプラスプロモータ配列と相補的であ
り、（ｉｉｉ）（２ｎ＋１）番目のマイナス架橋配列が（２
ｎ＋１）番目のプラス架橋配列と相補的であり、（ｉｖ）（２ｎ＋１）番目のマイナス鎖の５’末端が（
２ｎ＋１）番目のマイナス架橋配列の５’末端であり、（Ｃ）（２ｎ＋１）番目の移動性プロモータの（２ｎ＋
１）番目のプローブ配列が、転写を許容する条件下に、（２ｎ＋１）番目の目標ポリヌクレオチドと
安定なハイブリッドを形成でき、その場合に（ｉ）第一サイクル中の目標ポリヌクレオチドが特異的
ポリヌクレオチドであり、（ｉｉ）第一以外の任意のサイクル中の目標ヌクレオチ
ドが、先行する第二サイクルの逆転写体であり、（ｉｉｉ）（２ｎ＋１）番目の目標ポリヌクレオチドの
３’末端ヌクレオチドが（２ｎ＋１）番目のプローブ配
列の５’末端ヌクレオチドと塩基対合又は誤対合し、（ｂ）（２ｎ＋１）番目のマイナス鎖の５’末端とアニ
ール化複合体上の（２ｎ＋１）番目の目標ポリヌクレオ
チドの３’末端との間に位置する切断部を修復し、（ｃ）（２ｎ＋１）番目の移動性プロモータの指示下に
、転写を許容する条件下にアニール処理複合体を培養す
るという段階を含めてなり；また、ｎが１より大きいか又は等しい整数であって、２
ｎ番目のサイクルが、（ｄ）前の（２ｎ−１）番目のサイクルの移動性プロモ
ータに指示された転写体とハイブリッドを形成できるプ
ライマーをアニール処理し、その場合にハイブリッドが
プライマー伸長合成による逆転写を許容するような条件
下に安定であり；（ｅ）プライマー伸長合成によるによる（２ｎ−１）番
目のサイクルの転写体の逆転写体を形成するという段階
を含めてなり；それによって特異的ポリヌクレオチド又はその相補体の
存在が特異的ポリヌクレオチドの存在を示す場合の、特
異的ポリヌクレオチド配列の検出法。５５、段階（ｂ）が省略される、特許請求の範囲第５４
項による方法。５６、移動性プロモータ構造体に指示される少なくとも
２サイクルの転写がある、特許請求の範囲第４６ないし
５５項の任意の一つのものの方法。５７、すべてのプラスプロモータ配列が同じである、特
許請求の範囲第５６項の方法。５８、特異的ポリヌクレオチドがＲＮＡ又はＤＮＡであ
る、特許請求の範囲第４６又は５５項の任意の一つのも
のの方法。５９、特異的ポリヌクレオチドが核酸又は核酸混合物中
に含有される、特許請求の範囲第４６又は５５項の任意
の一つのものの方法。６０、核酸又は核酸混合物が二本鎖であり、二本鎖が段
階（ａ）の前又は間に変性によって分離される、特許請
求の範囲第４６又は５５項の任意の一つのものの方法。６１、プライマー伸長合成で形成される逆転写体が、移
動性プロモータ構造体に指示される転写サイクルの段階
（ａ）の前又は間に、変性によってその鋳型から分離さ
れる、特許請求の範囲第４６又は５５項の任意の一つの
ものの方法。６２、（ａ）プラスプロモータ配列、プラス架橋配列、
及びプローブ配列を含めてなる第一のポリヌクレオチド
配列であって、（ｉ）プラスプロモータ配列が５’でプ
ラス架橋配列へと結合され、プラス架橋配列が５’でプ
ローブ配列へと結合されており、（ｉｉ）プラス架橋配
列がゼロ又はそれ以上のヌクレオチド長であり、かつ（
ｉｉｉ）第一ポリヌクレオチド配列の３’末端がプロー
ブ配列の３’末端である場合の第一ポリヌクレオチド配
列；及び（ｂ）マイナスプロモータ配列を含めてなる第二のポリ
ヌクレオチド配列であって、（ｉ）マイナスプロモータ
配列が３’でマイナス架橋配列へ結合され、（ｉｉ）マ
イナスプロモータ配列がプラスプロモータ配列と相補的
であり、（ｉｉｉ）マイナス架橋配列がプラス架橋配列
と相補的であり、かつ（ｉｖ）第二ポリヌクレオチド配
列の５’末端がマイナス架橋配列の５’末端である場合
の第二ポリヌクレオチド配列；を含めてなる、核酸配列を増幅、特性化、又は検出する
ためのキット。６３、第一ポリヌクレオチド配列がＲＮＡ又はＤＮＡで
ある、特許請求の範囲第６２項によるキット。６４、第二ポリヌクレオチド配列がＲＮＡ又はＤＮＡで
ある、特許請求の範囲第６２項によるキット。６５、ＲＮＡポリメラーゼを含有する、特許請求の範囲
第６２項によるキット。６６、逆転写に適したプライマーを含有する、特許請求
の範囲第６２項によるキット。６７、逆転写に適したポリメラーゼを含有する、特許請
求の範囲第６２項によるキット。６８、転写の複数ラウ
ンドに適したポリヌクレオチド配列を含有する、特許請
求の範囲第６２項によるキット。６９、ポリヌクレオチド配列がＲＮＡ又はＤＮＡである
、特許請求の範囲第６８項によるキット７０、検出用試薬を包含する、特許請求の範囲第６２項
によるキット。７１、（１）ＲＮＡ配列を移動性プロモータ構造体でア
ニール処理し；（２）生ずる複合体を再結合させ；かつ
（３）該再結合済みアニール処理複合体をリポヌクレオ
シド三燐酸の存在下にＲＮＡポリメラーゼと一緒に培養
することを含めてなる、ＲＮＡ鋳型の転写法。７２、該移動性プロモータ構造体が以下のもの、すなわ
ち５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡ
ＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＡＡＣＧＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧ
Ｃ−３’ ３’−ＴＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＴＴ
Ｇ−５’である、特許請求の範囲第７１項による方法。７３、該ＲＮＡ配列がＴｎ５のｎｅｏ遺伝子の２７０塩
基配列と相補的である、特許請求の範囲第７１項による
方法。７４、該再結合が酵素的に行なわれる、特許請求の範囲
第７１項による方法。７５、Ｔ４ＲＮＡリガーゼが再結合に使用される、特許
請求の範囲第７４項による方法。７６、段階（３）の該
ＲＮＡポリメラーゼがＴ３ＲＮＡポリメラーゼである、
特許請求の範囲第７１項による方法。