JPH05308972A - 一重鎖ステムループｄｎａの合成法、その生成物および使用 - Google Patents

一重鎖ステムループｄｎａの合成法、その生成物および使用

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JPH05308972A
JPH05308972A JP4250604A JP25060492A JPH05308972A JP H05308972 A JPH05308972 A JP H05308972A JP 4250604 A JP4250604 A JP 4250604A JP 25060492 A JP25060492 A JP 25060492A JP H05308972 A JPH05308972 A JP H05308972A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】ステム−ループ配列（ｓｓ−ｓｌＤＮＡ）を有
する一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の合成方法を提供す
る。 【構成】組換えＤＮＡの分野に属し、インビトロ及びイ
ンビボでの合成が可能である。この方法は一重鎖構造の
合成を開始するためにＤＮＡ逆方向反復（ＩＲ）と必要
な成分との使用を含み、ＩＲを含む必要な成分からのｓ
ｓＤＮＡの合成系より成る。さらにｓｓＤＮＡ分子の合
成のための必要成分の全てを含む複製ビークルより成
る。ｓｓＤＮＡ分子の構造は相補的塩基の二重鎖ＤＮＡ
から成るステムを含み、ステムはその端部の一つにおい
て２個の末端、それぞれ３′と５′末端を有し、他方の
端部ではループ形成ｓｓＤＮＡを有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換え体ＤＮＡの分野に
関する。さらに詳しくは、本発明はステム−ループ配列
（ｓｓ−ｓｌＤＮＡ）を有する新規で有用な一重鎖ＤＮ
Ａの合成方法に関する。本発明はインビトロ及びインビ
ボ合成方法に関する。さらに本発明はこれらのｓｓ−ｓ
ｌＤＮＡを製造する複製ビークル（replicating vehicl
e)に関する。さらに、本発明はこれらの新規な構造物に
関し、これらの新規な構造物の使用を開示する。さら
に、標的蛋白質をコードする遺伝子を用いた、または用
いないｓｓ−ｓｌＤＮＡ増幅方法をも開示する。
【０００２】
【従来の技術】逆転写酵素によって相補的ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）へと逆転写されるＲＮＡ中間体を介して、ゲノム
の一部の重複が生ずることが判明している。この点につ
いては、ワイナー（Weiner) 等のアン．レブ．バイオケ
ム．（Ann. Rev. Biochem.) ５５，６３１（１９８６）
を参照されたい。結果として遺伝情報が逆流することは
真核ゲノムの進化の多様化に重要な役割を果すと考えら
れる。細菌由来の逆転写酵素が最近発見されたことを考
慮すると、同様な機構が原核生物におけるゲノム進化の
原因であるとみなされるのも非常にもっともなことだと
思われる。この点についてはイノウエ（Inoue)等のＴＩ
ＢＳ、１６、１８（１９９１ａ）とイノウエ等による、
アン．レブ．マイクロバイオル．（Ann. Rev. Microbio
li) ４５、１６３（１９９１ｂ）を参照されたい。逆転
写酵素によるｃＤＮＡ合成の結果生ずる遺伝子重複は進
化中のゲノムの多様化に重要な役割を果していると考え
られる。
【０００３】本発明はゲノム進化に関連する基礎研究に
伴って生じたものである。プラスミドＤＮＡの複製に特
有のｓｓ−ｓｌＤＮＡの合成が実証された。ｓｌＤＮＡ
の形成は原核ならびに真核生物の染色体ＤＮＡ複製時に
広く行われる。ＩＲ構造を伴う染色体遺伝子要素は、Ｉ
Ｒ構造の安定性とポリメラーゼの性質によっては常にｓ
ｌＤＮＡへと複製しやすいと考えられる。
【０００４】反復遺伝子外パリンドローム塩基配列に対
してはＲＥＰとして知られ、パリンドローム単位に対し
てはＰＵとして知られる多くの逆方向反復（ＩＲ）構造
が存在する（大腸菌（E. coli.) 中には約１０００コピ
ー）ことが判明している〔ヒギンス（Higgins)等のネイ
チャー（Nature) ２９８、７６０（１９８２）、ギルソ
ン(Gilson)等、ＥＭＢＯ．Ｊ．３，１４１７（１９８
４）及びギルソン等、ヌクル．アシドス．レス．（Nuc
l. Acids. Res. ）１９、１３７５（１９９１）〕。こ
れらの構造はＤＮＡポリメラーゼＩを含む特定の細胞成
分と会合して、染色体組織に重要な役割を果すと考えら
れる〔ギルソン等、ヌクル．アシドス．レス．１８、３
９４１（１９９０）とギルソン等、ＥＭＢＯ．Ｊ．３
、１４１７（１９８４）参照〕。ヒトゲノムの約６％
がＡｌｕと呼ばれる要素によって占められ、Ａｌｕの転
写生成物は実質的な第二構造を含むことが判明している
〔シメット（Simmett)等のジェイ．バイオル．ケム．
（J. Biol. chem.) ２６６、８６７５（１９９１）参
照〕。
【０００５】ｓｌＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成とは対照的
にＲＮＡ中間体も逆転写酵素活性も必要としないので、
ｓｌＤＮＡはｃＤＮＡよりも頻繁に形成される。従っ
て、ｓｌＤＮＡはゲノム内に分散または再配置された遺
伝子要素を重複させることによって、原核生物を真核生
物の両方のゲノム進化においてｃＤＮＡと同様な、重要
な役割を果すと考えられる。
【０００６】
【本発明の概要】本発明によって、基本的な発見がなさ
れた。ゲノムの一部はゲノムから直接複製されることが
判明した。判明したこの遺伝子重複はＲＮＡ中間体も逆
転写酵素も必要とせず、ＤＮＡ複製中に生ずる。
【０００７】簡単に説明すると、本発明は新規で有用な
一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の合成方法（又はプロ
セス）を提供する。この方法は一重鎖構造の合成を開始
するために、ＤＮＡ逆方向反復（ＩＲ）と必要な成分と
の使用を含む。本発明はまた、ＤＮＡ逆方向反復を含む
必要な成分からのこのようなｓｓＤＮＡの合成系をも提
供する。本発明はさらに、新規なｓｓＤＮＡ分子の合成
のための必要な成分の全てを含む適切な複製ビークルを
提供する。本発明はまた特有の構造を形成する新規で有
用なｓｓＤＮＡ分子をも提供する。この構造は相補的塩
基の二重鎖ＤＮＡからなるステムを含み、ステムはその
端部の一つにおいて２個の末端、それぞれ３′と５′末
端を有し、他方の端部ではループ形成ｓｓＤＮＡを有す
る。
【０００８】本発明はインビトロまたはインビボでの方
法及び系の実施を含む。
【０００９】本発明はまた改良された又は新規な生物学
的性質を有する蛋白質を形成する目的で遺伝子にランダ
ムな突然変異を起こさせる方法を含めて、新しい分子の
種々な使用を開示する。他の重要な考えられる使用法
は、本発明ｓｓＤＮＡ分子をＤＮＡに加えて、安定性の
高い三重鎖ＤＮＡを形成することである。他の使用法は
単一プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）の適用である。
【００１０】本発明とその幾つかの実施態様を下記でさ
らに詳述する。本発明の方法によるとｓｓＤＮＡ内のア
ニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡのステム部分を
含む構造を有するｓｓＤＮＡ分子が製造される。このス
テムはその端部の一つにおいてｓｓＤＮＡ分子の５′と
３′末端を形成し、他端部において２本のステム一重鎖
を結合する非アニール塩基の一重鎖からなるループを形
成する。特定の実施態様では、３′末端を端部に有する
鎖は他方の鎖よりも長い。ｓｌＤＮＡは蛋白質をコード
しうるＤＮＡセグメント、特に遺伝子を含みうる。遺伝
子はループと末端との間に配置される。遺伝子は突然変
異を有する遺伝子でありうる。
【００１１】ｓｌＤＮＡ合成に対して仮定される機構を
図６のＡと図６のＢに示す。この合成は概略的に下記の
過程を含むと考えられる：ＤＮＡの合成は複製開始部位
にて始まり、第１鎖（または“特定”もしくは“不特
定”鎖）の複製は２本鎖ＤＮＡの鎖の一方を鋳型として
進行する（染色体ＤＮＡの複製と同じ機構によって）
〔トミザワ（Tomizawa) 等、プロク．ナトル．アカド．
サイ．（Proc. Natl. Acad. Sci.）ＵＳＡ、７４、１８
６５（１９７７）参照〕、そしてプラスミドを用いる場
合には、ＩＲ構造を通しての進行は全プラスミドの複製
を生ずる。しかし、以下で詳述するように、第１鎖合成
が中断するまたはＩＲ内で終了した場合に、第１鎖の一
部はループ構造を形成する（図６、工程２〜３）。この
ループは連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能
する短い二重鎖部分を形成する。ＤＮＡ鎖伸長は新たに
形成された３′端部から再開し、テンプレートとして発
生期の第１鎖を用いて第２鎖（または“他方の”鎖）を
形成する。代替えの（または同時発生の）考えられる合
成過程は以下で説明する。このようにして、テンプレー
ト切換えによってＤＮＡ合成方向は逆になり、ＤＮＡフ
ラグメントを二重にする（図６、工程１〜４）。新しく
合成されたｓｌＤＮＡ分子は親テンプレート鎖から解離
され、親テンプレート鎖は他の複製ラウンドを受けて他
のｓｌＤＮＡを形成する。ｓｌＤＮＡを必要に応じて単
離して精製する。
【００１２】本発明の他の実施態様では、ＤＮＡ自己複
製ビークル（self replicating vehicle) 、例えば逆方
向反復（ＩＲ）構造を含むＤＮＡフラグメントを挿入さ
れたプラスミドを提供する。このＤＮＡフラグメントは
ｓｓＤＮＡ合成のテンプレートとして、及び適当なプラ
イミング部位、例えば大腸菌におけるＣｏｌＥ１の複製
始点として働く。ＩＲはＯＲの下流に存在する。自己複
製ビークルは適当なホスト（例えば大腸菌）中で複製さ
れる。ホストは少なくとも１種のポリメラーゼを含んで
テンプレートからｓｓＤＮＡを合成する。この特定の実
施態様では、２種のポリメラーゼ、ＯＲからＩＲまでの
ｓｓＤＮＡ部分、第１鎖の伸長に寄与する第１ＤＮＡポ
リメラーゼと、ｓｓＤＮＡ鎖の残部もしくは第２鎖を合
成する第２ＤＮＡポリメラーゼが存在すると推定され
る。第１鎖の合成が終了すると、相補的塩基がアニール
されて一重鎖非アニールループを形成する。その後に第
２鎖の合成が行われる。二重鎖ＤＮＡステムと反対端部
の一重鎖ループ構造とからなる、新しいＤＮＡ構造が合
成される。この新しいＤＮＡ構造に対して“ステム−ル
ープ”または“ｓｌＤＮＡ”なる名称が設けられてい
る。
【００１３】他の特定の実施態様はプロモーター、特に
ｌａｃプロモーター−オペレーターが欠如した複製ビー
クルを提供する。それでもなお、以下で詳述するよう
に、提案した合成モデルを支持して、ｓｌＤＮＡが製造
された。
【００１４】プライミング部位とＩＲとの間の蛋白質を
コードしうる特定のＤＮＡ配列を含むようにプラスミド
を構成することができ、合成されたｓｌＤＮＡはＤＮＡ
塩基配列またはその突然変異を含むと考えられる。
【００１５】本発明のｓｌＤＮＡは自己複製ビークルに
よって合成される必要はなく、ＩＲと、ｓｓＤＮＡ合成
に必要な要素とを含む、線状もしくは非線状のＤＮＡセ
グメントから構成される適当なインビトロ系で合成され
ることができる。このような系を以下で説明する。
【００１６】図１は本発明のプラスミド、ｐＵＣＫ１０
６の説明図。図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａI 部位に挿入
された２１５−ｂｐのＤＮＡ塩基配列を示す。図３はｐ
ＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成とその特徴とを説
明するポリアクリルアミドゲルの臭化エチジウム染色を
示す。図４はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマ
ー形成を説明するポリアクリルアミドゲルのオートラジ
オグラフを示す。図５はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮ
Ａ塩基配列決定を説明する図である。(A) はｓｌＤＮＡ
の５′端部のＤＮＡ塩基配列決定を説明する乾燥ポリア
クリルアミドゲルのオートラジオグラフである。(B) は
ｓｌＤＮＡのループ部分の５′端部塩基配列決定を説明
する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ
である。(C) はｓｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基
配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオー
トラジオグラフである。(D) はｓｌＤＮＡの３′端部の
ＤＮＡ塩基配列の乾燥ポリアクリルアミドゲルのオート
ラジオグラフである。(E) はｐＵＣＫ１０６からのｓｌ
ＤＮＡの構造を説明する。図６はｓｌＤＮＡ合成の二つ
の可能なモデルを説明する図である。図７のレーン１と
３はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII
消火体(digest)を示し、レーン２はｐＵ７Ｃからのｓｌ
ＤＮＡを示す。図８はｓｌＤＮＡを利用して、特定の遺
伝子にランダムミューテーションを導入する具体例を示
す。
【００１７】プラスミドｐＵＣＫ１０６はアメリカンタ
イプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受け入れ番
号Ｎｏ．６８６７９として寄託されている。プラスミド
ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃPOはＡＴＣＣによって受け入れ
番号Ｎｏ．６８６８０として寄託されている。
【００１８】
【実施例】下記実施例は説明のためのものであり、本発
明の如何なる限定をも意図しないものである。これらの
実施例では、全ての％は固体では重量％であり、液体で
は容量％であり、全ての温度は、他の注釈しないかぎ
り、摂氏度によるものである。便利さと簡潔さのため
に、実施例は図面に関連し、図面の詳細な説明を提供す
る。
【００１９】実施例 １ 図１はｐＵＣＫ１０６（円形マップ）、以下に示すよう
に製造した特定のプラスミドを説明する。円形マップ中
の白抜きバー（open bar) はカナマイシン耐性遺伝子
（Ｔｎ５）からを表す。上部右側に示す直線白抜きバー
はＸｂａI 部位に挿入した２１５−ｂｐＤＮＡフラグメ
ントを表し、これは３５−ｂｐ逆方向反復（ＩＲ）塩基
配列を示す。中実矢印（solid orrow)はＩＲ構造を示
す。中実円設定は複製の始点（Ori)である。長い白抜き
矢印ＯＲからのＤＮＡ複製の方向を示す。小さい白抜き
矢印はｌａｃプロモーター−オペレーター（ｌａｃPO）
の位置を示す。図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａI 部位に挿
入された、配列表の配列番号１及び配列番号２でそれぞ
れ表されるＤＮＡより構成される２１５−ｂｐＤＮＡフ
ラグメントの塩基配列を示す。このプラスミドはここで
はｐＵＣＫ１０６と名づける。白抜き矢印はＩＲ塩基配
列を示す。ＨｉｎｄIII （ＡＡＧＣＴＴ）部位はＩＲの
中心を示す。ＩＲ中の不適正位置はスペース内に挿入さ
れた不適正塩基ＣとＴを含む矢印内の２個の白抜きスペ
ースによって示す。上記ＤＮＡフラグメント（ＩＲを含
む）は図２に示された配列を有する。
【００２０】実施例 ２ この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成と
その特徴とを説明する。 (A) 大腸菌ＣＬ８３をｐＵＣＫ１９、ｐＵＣＫ１０６
のいずれかとｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃPOとによって形質
転換し、プラスミドＤＮＡ画分を形成した。ＤＮＡ標本
（リボヌクレアーゼＡ処理後）を電気泳動のために５％
アクリルアミドゲルに塗布した。ゲルを臭化エチジウム
によって染色した。レーン１はサイズマーカーとしての
ｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体を示す。レーン２はｐ
ＵＣＫ１９を収容する細胞からのＤＮＡ標本；レーン３
はｐＵＣＫ１０６；レーン４はｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ
POを示す。ｐＵＣＫ１９はｐＵＣ１９のカナマイシン変
異体である。 (B) ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡをポリアクルア
ミドゲル電気泳動によって精製し、次に種々の制限酵素
消化を行った。消化体をポリアクリルアミド（５％）ゲ
ル電気泳動によって分析し、ゲルを臭化エチジウムによ
って染色した。図３においてレーン１はサイズマーカー
としてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン２は
消化されないｓｌＤＮＡ；レーン３はＸｂａI によって
消化されたｓｌＤＮＡ；レーン４はＨｉｎｄIII によっ
て消化されたｓｌＤＮＡ；レーン５はＰｖａIIによって
消化されたｓｌＤＮＡを示す。 (C) ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの熱変性。精製
ｓｌＤＮＡ（上記のような）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。
このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で３分間インキュベ
ートし、氷浴中で急冷した。サンプルをＡに述べたよう
に分析した。図３においてレーン１はサイズマーカーと
してのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン２は熱
処理なしのｓｌＤＮＡ；レーン３は熱変性後に急冷した
ｓｌＤＮＡを示す。
【００２１】実施例 ３ この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマ
ー形成を説明する。 (A) 図３について述べたようなｐＵＣＫ１０６からの
精製ｓｌＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、１５０ｍＭ ＭａＣｌ及び１０ｍＭＭｇＣｌ
2 中に溶解した。このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で
３分間インキュベートしてから、徐々に冷却する。再結
合（renatured)ＤＮＡをＸｂａI によって消化させ、こ
のようにして生じたＤＮＡフラグメントをそれらの末端
において〔ｒ−32Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによって標識した。これらの生成物を５％ポリア
クリルアミドゲルに塗布した。電気泳動後に、ゲルを乾
燥させ、このゲルにオートラジオグラフィーを実施し
た。図４において、レーン１はサイズマーカーとしての
ｐＢＲ３２２のＨａｅIII消化体；レーン２はサイズマ
ーカーとしてのλＤＮＡのＥｃｏＲＩとＨｉｎｃｌIII
消火体；レーン３は処理なしのｐＵＣＫ１０６からのｓ
ｌＤＮＡ；レーン４は非処理ｓｌＤＮＡのＸｂａI 消化
体；レーン５は熱変性後に徐冷したｓｌＤＮＡ；レーン
６はレーン５からのｓｌＤＮＡのＸｂａI 消化体を示
す。帯を右手側において“ａ”から“ｅ”までマークを
付した。 (B) 図４のＡ中のフラグメント“ｄ”の特性化。フラ
グメント“ｄ”はゲルから精製した。レーン３は精製フ
ラグメント“ｄ”のＨｉｎｄIII 消化体；レーン４では
精製フラグメント“ｄ”は図３に関して述べたように熱
変性し、急冷した。 (C) ＡとＢに示した“ａ”〜“ｂ”帯の概略図。Ｘと
ＨはそれぞれＸｂａIとＨｉｎｄIII を示す。ＸｂａI
部位に非常に近接したバンド“ａ”中に２個の他のＨｉ
ｎｄIII 部位があり、これはバンド“ｃ”中にある。こ
れらのＨｉｎｄIII 部位は図示せず。
【００２２】実施例 ４ この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのＤＮＡ
塩基配列の決定を説明する。 (A) ｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩基配列の決定。
単離、精製したｓｌＤＮＡ０．２μｇを鎖停止方法（ch
ain termination method) による塩基配列決定に用い
た。始点（図５のＢ参照）から下流の配列９６−ｂｐに
相当する配列表の配列番号３で表されるプライマー
“ａ”（5 ′ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧ
3 ′）をプライマーとして用いた。 (B) ｓｌＤＮＡのループ部分の５′端部塩基配列の決
定。ｓｌＤＮＡ０．５μｇをＳａｃIIによって消化さ
せ、このようにして生じたＤＮＡフラグメントを５′端
部において〔ｒ−32Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼによって標識した。約４０−ｂｐ移動したＤＮ
Ａフラグメントを単離し、マキサム−ギルバート（Maxa
m - Gilbert)法によって塩基配列を決定した。 (C) ｓｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基配列の決
定。ＳａｃII消化体ｓｌＤＮＡを末端デオキシヌクレオ
チジル転移酵素を用いて３′端部において〔ｒ−32Ｐ〕
ジデオキシＡＴＰによって標識した。ループ部分を含む
ＤＮＡフラグメントを単離し、マキサム−ギルバート法
によって塩基配列を決定した。 (D) ｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩基配列。ｓｌＤ
ＮＡをＡｆｌIII によって消化させた（図５のＥ参
照）、５′端部を〔ｒ−32Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによって標識した。標識生成物を塩基配
列決定用ゲルによって分離した。７６塩基移動した一重
鎖ＤＮＡを単離し、マキサム−ギルバート法によって塩
基配列決定した。図５のＤを参照すると、数字はｐＵＣ
Ｋ１９の始点からの残基数を表す。 (E) ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの構造。このｓ
ｌＤＮＡは１１３７〜１１３９塩基の一重鎖ＤＮＡから
なる。ｓｌＤＮＡの５′端部は不均一であるように見え
る；一部は＋１から開始し、他の部分は−１，＋２，＋
３から開始する。＋１位置はＣｏｌＥｌ ＤＮＡ複製の
始点に相当する。従って、種々のｓｌＤＮＡは異なる長
さの５′末端鎖を有する。３′端部では１６塩基の配列
が５′末端の＋１位置を越えて伸長する。このループは
ＨｉｎｄIII 部位（ＡＡＧＣＴＴ）が配置されるように
設定されたＩＲ構造の中心の配列に相当する４塩基配列
（ＡＧＣＴ）によって形成されると考えられる。ｐＵＣ
Ｋ１０６中のＩＲ構造中の不適正に相当する塩基対はＣ
・Ｔ（ｐＵＣＫ１０６）からＣ・Ｇ（ｓｌＤＮＡ中）に
変えられ、ＳａｃII部位とＰｓｔI 部位との間に示され
る。図５のＡのＤＮＡ塩基配列決定に用いられるプライ
マー“ａ”の位置は矢印によって示す。ｓｌＤＮＡの分
離と精製は、モレキュラー クローニング；ア ラボラ
トリーマニュアル（Molecular Cloning ；A laboratory
Manual)、サムブルック（Sambrook) 等、第２版（セク
ション１．１２１〜１．４０）（“サムブルック”）に
述べられている方法に従って標準方法によって実施し
た。
【００２３】実施例 ５ この実施例は二つの可能なｓｌＤＮＡ合成方法を説明す
る（図６参照）。ＣｏｌＥｌ ＤＮＡ複製の始点を中心
とする二重鎖ＤＮＡを上部に示す。斜線入り円は始点か
らＤＮＡ複製を開始するＤＮＡ複製複合体を表す。ＤＮ
Ａ鎖上の白抜き矢印はＤＮＡ塩基配列中の３５−ｂｐ逆
方向反復（ＩＲ）構造（図２参照）の位置を示す。ＩＲ
構造中の不適正塩基対（Ｃ・Ｔ）も矢印中に示す。工程
１において、ＤＮＡ複製フォークは始点（＋１位置）か
ら斜線入り円によって示される位置にまで進行する。新
たに合成された第１鎖が始点（中実円）から複製フォー
クまで伸長するのが示される。ＤＮＡ複製複合体は中実
矢印によって示されるＩＲ構造中の不適正Ｔ残基の直前
に達する。工程２では、この新たに合成された第１鎖の
３′末端がＤＮＡ複製複合体から剥離して、２次構造が
ＩＲ構造によって形成される。工程３では、ＤＮＡ合成
がこの新たに合成された第１鎖（モデルＡ）または上部
の親鎖（モデルＢ）をテンプレートとして用いてステム
−ループ構造の３′末端から再開する。工程４では、Ｄ
ＮＡ合成が始点を越えて１６塩基だけ進行する。モデル
Ａでは、ＤＮＡの５′末端に結合して残留するプライマ
ーＲＮＡがテンプレートＲＮＡとして用いられる。続い
て、ＲＮＡが除去されて、ｓｌＤＮＡが形成される。モ
デルＢでは、ＤＮＡ合成が第２鎖ＤＮＡ合成の停止のた
めに知られた機構と同様な機構によってｔｅｒＨ部位に
おいて停止する。モデルＡとＢが合成を説明することが
でき、合成が両ルートによって、少なくとも一部の時間
では、同時に進行しうることが考えられる。従って、第
１鎖のテンプレートであった鎖以外の第２鎖に対しては
適当なテンプレートが用いられる。
【００２４】実施例 ６ ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃPOの構成 ｌａｃプロモーター−オペレーターを含む１９９−ｂｐ
ＰｖｕII−ＨｉｎｃIIフラグメントがｐＵＣＫ１０６
（図１参照）から欠失すると、結果として生ずるｐＵＣ
Ｋ１０６ΔｌａｃPOは図３のＡ、レーン４の位置（ｂ）
に示すような、ｐＵＣＫ１０６からｓｌＤＮＡよりも迅
速に移動する新しいｓｌＤＮＡを形成した。この新しい
ｓｌＤＮＡのサイズは３６０−ｂｐ長さであり、ｐＵＣ
Ｋ１０６ｓｌＤＮＡよりも、ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃPO
中の欠失サイズに殆ど等しい長さだけ短い。図３のＡで
は、レーン３はｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃPOを収容する細
胞からのＤＮＡ形成のｓｌＤＮＡを示す。この実験は上
記で提案したｓｌＤＮＡ合成モデルを支持し、ｌａｃプ
ロモーター−オペレーターがｓｌＤＮＡ合成にとって本
質的でないことをも実証する。この解釈はｌａｃ誘導物
質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ドの添加がｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成に影
響しないという事実によってさらに支持された。しか
し、ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃPOからのｓｌＤＮＡ合成減
少の理由は現在まだ不明である。
【００２５】実施例 ７ ｓｌＤＮＡの合成はｐＵＣＫ１０６に用いられるＩＲ構
造の一次塩基配列に依存しなかった。興味あることに
は、ポリリンカー部位にＩＲ構造を有するｐＵＣ７バク
ター自体も、始点からポリリンカー中心までのＤＮＡフ
ラグメントに対応するｓｌＤＮＡを形成することができ
る。ｐＵＣ７から形成された単離精製されたｓｌＤＮＡ
は２５２ｂｐ長さであった。プラスミド画分を実施例２
と同様に形成し、処理し、電気泳動のためにアクリルア
ミドゲルに塗布し染色した。図７では、レーン１と３は
サイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII消化
体を示す。レーン２はｐＣＵ７から形成されたｓｌＤＮ
Ａを示す。ｓｌＵＣ７のｓｌＤＮＡはＰＣＲ（以下で詳
述する）によって増幅した、レーン４（矢印）はｓｌＤ
ＮＡを示す。
【００２６】実施例 ８ ｓｌＤＮＡ構造の確認 上記ｓｌＤＮＡ構造と機構（図６に説明）は次のように
確認した：合成によって構築したＤＮＡフラグメントに
不適正塩基ＣＴをＣＧの代りに故意に加えた。図２のＩ
Ｒの開放スペースを参照のこと。ｓｌＤＮＡ合成（第１
鎖上にスナップ−バックした第２鎖を含む）後に、不適
正は修正された。なぜなら図５のＥでは、ＣＧが出現し
ている。もし構造がスナップ−バック構造でなかったと
したら、ポリメラーゼがＩＲ領域を正しく読み、Ｔを鋳
型として読みＡが挿入されるはずである。すなわち；新
しい鎖はまだ不適正を含むと思われる。不適正Ｔを置換
するために、ＩＲ部分は第１鎖に必然的にスナップ−バ
ックして、ポリメラーゼにテンプレートとして第１合成
鎖を使わせて、第２鎖を合成させ、第２鎖が合成される
ときに、不適正Ｔの代りに相補的Ｇを挿入させる。これ
は本発明のｓｌＤＮＡの合成機構と構造を決定的に確立
する。
【００２７】本発明の種々の実施態様の詳細な説明 本発明者は、ゲノムの一部が直接ゲノムから複製される
という基本的な発見をした。開示する機構は周知のよう
な、ＲＮＡ中間体も逆転写酵素（ＲＴ）も必要としな
い。ワイナー等、アン．レブ．バイオケム．５５，６３
１（１９８６）；コーンベルグ（Kornberg) 、ＤＮＡ複
製（ＤＮＡ Replication)〔ダブリュ．エッチ．フリー
マン アンド カンパニー（W. H. Freeman and Compan
y)、カルフォルニア州サンフランシスコ、１９８０〕、
１０１〜１６６頁参照。ステム−ループＤＮＡ（ｓｌＤ
ＮＡ）と呼ばれる新しい、有用なＤＮＡ構造が発見され
た。
【００２８】はじめに、本発明は幾つかの実施態様を提
供する。一実施態様は新規で有用なｓｓＤＮＡ分子の合
成方法（又はプロセス）である。他の実施態様は適当は
プライミング部位と、逆方向反復（ＩＲ）と、ｓｌＤＮ
Ａ合成の他の必要な成分とを有するＤＮＡフラグメント
を含む、このような分子を合成するためのインビボ及び
インビトロ系である。このような分子を合成するための
インビボ系はコンピテント自己複製ビークルと系の他の
成分とを用いる。この実施態様の他の面は逆方向反復、
ｓｌＤＮＡの第１鎖の複製のためのテンプレートとして
役立つＤＮＡ、逆配向のＤＮＡ合成をテンプレートに開
始させるための適当なプライミング部位、及び必要な場
合の親ＤＮＡの第２鎖と以下で述べる他の成分を含む自
己複製ビークルである。
【００２９】もう一つの実施態様は新規なｓｓ−ｓｌＤ
ＮＡ分子である。本発明は新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤ
ＮＡ）分子の合成方法を提供する。この分子は、ステム
がｓｓＤＮＡ中のアニールされた相補的塩基の二重鎖Ｄ
ＮＡからなり、一端においてｓｓＤＮＡ分子の５′と
３′末端を形成し、他端において二重鎖ＤＮＡの反対端
部を結合するＤＮＡの一重鎖ループを形成するステム−
ループ構造（ｓｌＤＮＡ）を含む。この方法はＤＮＡ合
成の通常の成分と下記成分： (a) 適当なプライミング部位と、前記プライミング部
位の下流の逆方向反復（ＩＲ）とを含むテンプレートＤ
ＮＡ； (b) テンプレートにＤＮＡ重合を開始させるためのプ
ライマー；及び (c) テンプレートからｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡポ
リメラーゼを含む系において実施される。
【００３０】この方法は次の工程： (1) ＤＮＡ重合を開始させるためのＤＮＡテンプレー
トのプライミング工程； (2) テンプレートとしてＤＮＡの二重鎖の一つを用い
てプライマーからｓｓＤＮＡを合成し、一つの鎖を形成
し、ＩＲ塩基配列に入るまで鎖のＤＮＡ合成を続け、Ｉ
Ｒ塩基配列内で合成を停止させる工程； (3) 新しく合成された鎖内のＩＲ塩基配列における相
補的塩基がその端において非重複部分を重複部分とから
なるループを形作するために、アニールし、重複部分を
連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能させる工
程； (4) テンプレートとしてＤＮＡの新たに合成された鎖
及び／又は他の鎖を用いてＤＮＡ合成を再開する工程； (5) ｓｌＤＮＡを形成する工程；及び (6) 必要に応じてｓｌＤＮＡを分離し、単離する工程
を含む。
【００３１】この方法はＤＮＡ合成のために必要な通常
の成分の全てを含む系で実施される。これらの成分はイ
ンビボでこの方法が実施されるときに本質的に存在し；
この方法をインビトロで実施するときに通常、系に導入
される。
【００３２】この方法は、適当なプライミング部分と、
このプライミング部位から下流の逆方向反復とを有する
ＤＮＡの存在を必要とする。ＤＮＡはＤＮＡ複製を導く
ためのテンプレートとして機能する。プライマーは、Ｄ
ＮＡ鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合
成を開始させるように作用しうるオリゴヌクレオチド
（天然に生成又は合成的の製造）でありうる。ＤＮＡ複
製の開始方法は当然周知である。ワトソン(Watson)、遺
伝子の分子生物学(Molewlar Biology of the Gene)、第
３版、ダブリュ．エイ．ベンジャミン社(W. A. Benjami
n. Inc.)；ＤＮＡ合成：現在と今後（ＤＮＡ Synthesi
s ： Present and Future)、モリノイクス（Molineux)
とコイヤマ（Kohiyama) 編集、（１９７７）第V 部、
“インビトロにおけるＧ４とＳＴ−１ＤＮＡ合成（Ｇ４
とＳＴ−１ＤＮＡ Synthesis in Vitro) ”ワーカー
著；第VII 部、“サッカロマイセスセレヴィジェからの
透過性細胞系におけるＤＮＡ合成（ＤＮＡ Synthesis
in Permeable Cell Systems fromSaccharomyces cerevi
siae)オエルテル(Oertel)とゴーリアン(Goulian) 著を
参照のこと。第１鎖の合成に寄与するポリメラーゼに対
して、第２鎖の合成には異なるポリメラーゼが寄与す
る。プライマーはＤＮＡ又はＲＮＡプライマーのいずれ
でも良い。合成はヌクレオチドと、例えばＤＮＡポリメ
ラーゼのような重合剤との存在下、適当な温度及びｐＨ
において誘導される。
【００３３】本発明の方法は、テンプレートに沿った鎖
の合成を触媒する酵素のような重合剤を用いる。このた
めの適当な酵素には、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
I もしくはIII 、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼI のクレノ
フ(Klenow)フラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）；ウイルス
ポリメラーゼがあり、熱安定性酵素をも含まれる。その
ＤＮＡ複製開始部位を認識するポリメラーゼが適当であ
る。一般に、このプロセスをインビボで実施する場合
に、これらの遺伝要素が存在すると考えられ；インビボ
で実施しない場合又はインビトロで実施する場合には、
これらを系に加えることになる。
【００３４】開始部位を認識するポリメラーゼは重合を
惹起させる又は重合に寄与する。発明者はこの場合に特
定の理論にしばられるのを望むわけではないが、第１Ｄ
ＮＡ鎖の合成に寄与するポリメラーゼが他方のすなわち
第２ＤＮＡ鎖の合成にも寄与することを除外することは
できない。従って、この方法は第２鎖が第１合成鎖の
５′末端を越えて３′末端において停止するまで、第２
鎖の合成を続けることを含む。このように、ｓｌＤＮＡ
の重複ステムが形成される。
【００３５】ＤＮＡポリメラーゼについての情報は入手
可能である。例えば、コーンベルグによりるＤＮＡ複製
（ＤＮＡ Replication)（ダブリュ．エッチ．フリーマ
ンアンド カンパニー、カルフォルニア州、サンフラン
シスコ）、１０１〜１６０頁、第４章、大腸菌のＤＮＡ
ポリメラーゼI （ＤＮＡ Polymerase I of E. Coli)、
第５章、他の原核生物ポリメラーゼ（Other Procaryoti
c Polymerases)、第６章、真核生物ＤＮＡポリメラーゼ
（Eucaryotic ＤＮＡ Polymerases)及び第７章を参照
のこと。ｃＤＮＡ中の第２鎖合成に有用であるポリメラ
ーゼのような、他のポリメラーゼも考えられる。
【００３６】上記の特定の説明では、ポリメラーゼが２
種類：ＤＮＡポリメラーゼIII とポリメラーゼI である
ことが考えれる。もし蛋白質をコードしうる好ましいも
しくは標的となる核酸塩基配列を例えば合成されたｓｌ
ＤＮＡ部分遺伝子として複製することが望ましい場合に
はこの塩基配列をＩＲの上流に配置する。例えば、複製
始点（ＯＲ）を有する、例えばｐＵＣＫ１０６等のベク
ターのような、複製ビークル中で複製が行われる場合に
は、標的核酸配列はＩＲとＯＲとの間に位置する。
【００３７】本発明の方法は、上述したように、プライ
ミング部位と逆方向反復（ＩＲ）すなわち逆配向で存在
する二つの同じ塩基配列を含む二重鎖ＤＮＡフラグメン
トを用いる。ＩＲは塩基配列又は“パリンドローム”と
して存在しうる。
【００３８】後に述べるように、核酸配列へのランダム
点突然変異の導入を容易にすることが好ましい場合に
は、例えばＲＴのような、ある特定の酵素が特に好まし
い。
【００３９】第１鎖の合成がｄｓＤＮＡテンプレートに
沿って接触しながら、ＩＲを通って進行して、全プラス
ミドゲノムの複製を生ずる。一定の周期で、ＤＮＡ鎖の
合成はＩＲ内で停止して、それ自体に相補的である塩基
配列の短い部分を形成し、ループを形成し、ＩＲ塩基配
列においてそれ自体にアニールする。新たに合成された
鎖内のこの二重鎖部分は第２鎖又は他のＤＮＡ鎖のプラ
イミング部位として認識される。第２鎖の合成はＤＮＡ
の最初に形成された鎖及び／又は他の親鎖をテンプレー
トとして用いて出発する。従って、テンプレート切換え
が生ずると考えらる。
【００４０】ヌクレオチドを含むポリメラーゼによって
第２鎖が合成されるので、アニールされた相補的塩基か
らステムが形成され、内部相補性を有する二重構造が生
ずる。
【００４１】第２鎖の合成は第１合成鎖の第１ヌクレオ
チドをはるかに過ぎて、この第１鎖のＲＮＡプライマー
を通って進行する、第１鎖は結局は減成して、３′−オ
ーバーハングを形成する。一つの特定の説明では、ＤＮ
Ａ合成はダスグプタ(Dasgupta)等、セル(Cell)５１、１
１１３（１９８７）に述べられている方法と同様な方法
によってｔｅｒＨ部位において停止すると考えられる。
【００４２】適当な処置によって、３′末端オーバーハ
ングの長さは、例えば延ばすように、ｔｅｒＨ部位をプ
ライミング位置から下流へ動かすことによって制御する
ことができる。
【００４３】さらに、３′末端オーバーハングを有する
ステムの代りに、適当な停止部位、例えばｔｅｒＨをプ
ライミング部位の上流に配置することによって、第１鎖
の端部の前で第２鎖の合成をブロックすることが可能で
あると考えられる。従って、いずれかの鎖が他方に比べ
てかなりの長さで長くなると考えられる。
【００４４】第２鎖合成が停止したときに、テンプレー
トと形成されたｓｌＤＮＡが分離する。
【００４５】本発明の方法は望ましい頻度のサイクルで
くり返すことができる。必要な成分のいずれかが欠乏す
ると、必要に応じて補充することができる。
【００４６】この方法をインビボで実施する場合には、
プライミング部位とこのプライミング部位の下流のＩＲ
とを含む、適当なコンピテント複製ビークルが形成され
る。ＩＲを有するＤＮＡフラグメントは通常、ポリリン
カー塩基配列中に特有の制限部位に挿入される。ポリリ
ンカーがＩＲ（及び対称的制限部位）を有するプラスミ
ドが用いられている。本質的に存在しない場合には、Ｄ
ＮＡフラグメントにＤＮＡ塩基配列へのプライマーが供
給される；ポリメラーゼはビークルに固有であっても固
有でなくても良い。ビークルは複製とｓｌＤＮＡ形成と
に必要な、他の全ての成分を含む。
【００４７】上述したことから、テンプレートとして役
立つＤＮＡフラグメント、ＩＲ塩基配列、ｓｌＤＮＡを
形成する鎖の複製をプライムし、続けるために必要な要
素を含む自己複製ビークルがｓｌＤＮＡの合成に適する
ことが理解されるであろう。
【００４８】本発明の他の主要な実施態様は新しいｓｌ
ＤＮＡを形成する。これらの構造はすでに上述した、以
下では補足の説明を述べる。“ステム−ループ”又は
“ｓｌＤＮＡ”と名づけられた新しい構造は一重鎖であ
る。ｓｌＤＮＡの説明は図５のＥ（ｐＵＣＫ１０６か
ら）と図７（ｐＵＣ７から）に示す。
【００４９】典型的なｓｌＤＮＡはアニールされた相補
的塩基の重複二重鎖ステムと、ステムの２鎖を結合する
一重鎖ヌクレオチドのループとを含む。ループの一重鎖
性は本発明のｓｌＤＮＡのもう一つの興味ある特徴であ
る。ｓｌＤＮＡはヌクレオチドの非常に短い配列または
かなり長い配列のループを含むことができる。ｓｌＤＮ
Ａはループを形成するために充分な長さのヌクレオチド
配列と短い重複二重鎖を形成する塩基対合を含むことが
できる。最小サイズは第２鎖の合成開始のためのプライ
ミング部位を形成するために充分な塩基対合を与えるも
のであるべきである。ループの最小サイズは安定構造に
なるための塩基対合を阻止する塩基上の歪み(strain)に
よって限定される。最大サイズはｓｌＤＮＡに予定され
た用途によって影響される。図５のＢに図示したループ
は４塩基からなるが；１０塩基、２０塩基又はそれ以上
の塩基のループも考えられる。ｓｌＤＮＡループの一重
鎖性はｓｌＤＮＡに提案される用途に非常に有用である
特徴である。
【００５０】ｓｌＤＮＡに考えられる他の興味ある構造
は二重体ｓｌＤＮＡである。この構造では、二つのｓｌ
ＤＮＡの一重鎖の自由端部が結合する。この構造は非常
に安定であると期待される。通常ＤＮＡを変性させるよ
うな条件に暴露されると、これらのｓｓＤＮＡはそれら
のオリジナル構造に“スナップ−バック”しがちであ
る。鎖の結合はＤＮＡ及び／又はＲＮＡリガースによる
通常の方法によって実施される。このような構造は蛋白
質をコードするための特定の遺伝子をも有し、それによ
って興味ある新しい実用的可能性を提供する。
【００５１】ｓｌＤＮＡの重要な性質である安定性は重
複端部（tail) が長くなると共に増加する傾向があると
考えられる；従って、このような構造はこのことが強調
されるべき特性である場合に好ましい。同一の複製ビー
クルから形成されるｓｌＤＮＡの全てが必ずしも同じサ
イズでないことに注目すべきである。上記説明では、ｐ
ＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡにおいて、第１鎖の５′
末端は不均一であるように思われ、一部の鎖は＋１位置
（ＣｏｌＥｌ複製の始点に相当）から出発するが〔トミ
ザワ等、プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ、７
４、１８８５（１９７７）を参照のこと〕、他の鎖は−
１，＋２，＋３から出発する。従って、ＤＮＡは類似し
たｓｌＤＮＡの類と見なすことができる。
【００５２】ＤＮＡフラグメント内にＩＲを越えて一つ
以上の不適正が存在することがｓｌＤＮＡの合成にも構
造にも不利な影響を与えないことが認められる。このこ
とはこの場合にパリンドロームの中心から２５ヌクレオ
チド離れたＧに対する不適正Ｔによって説明される（図
２参照）。この不適正はｓｌＤＮＡの合成において修復
された。端部の１末端の他方の末端をこえたｓｓＤＮＡ
オーバーハングを利用した、本発明のｓｌＤＮＡの幾つ
かの用途が提案される。それ故、このことが本発明の新
しい構造の重要な特徴であることは理解されよう。
【００５３】図示したプラスミド内のｓｌＤＮＡの合成
は本発明の最も良い形式(mode)を説明する。しかし、Ｉ
Ｒとここに述べる他の成分とを含むベクターはｓｌＤＮ
Ａの合成に適切である。ＩＲは原核生物と真核生物にし
ばしば出現する構造である。このようなＩＲは本発明に
使用可能である。ＩＲ塩基配列は合成的に製造すること
もできる。１例は図２に示す合成ＩＲである。
【００５４】ＩＲの塩基配列又はパリンドローム塩基配
列は大腸菌から得られている〔ギルソン(Gilson)等、ヌ
クル．アシドス．レス．１８、３９４１（１９９
０）〕；ギルソン等のヌクル．アシドス．レス．１９、
１３７５（１９９１）は大腸菌とサルモネラエンテリチ
カ(Salmonella enteritica) からのパリンドローム塩基
配列を報告している（パリンドローム単位配列４０ヌク
レオチド長さ）。チャルカー(Chalher) 等のジーン(Gen
e)７１、（１）：２０１−５（１９８８）は大腸菌にお
ける５７１−ｂｐパリンドロームの増殖を報告してい
る；逆方向反復はルイス(Lewis) 等、ジェイ．モル．バ
イオル．(J. Mol. Biol)（イングランド）２１５、
（１）：７３〜８４（１９９０）によって枯草菌(Bacie
lus subtilis) において報告されている（２６−塩基対
反復）、サウリン(Saurin)のコンプト．アプル．バイオ
サイ．(Compt. Appl. Biosci.)３、（２）：１２１−７
（１９８７）は大腸菌における反復パリンドローム構造
を系統的に研究するための新しいコンピュータープログ
ラムの使用を考察している。下記米国特許はポリドンロ
ーム塩基配列を開示する：第４９７５３７６号；第４８
６３８５８号；第４８４０９０１号；第４７４６６０９
号；第４７１９１７９号；第４６９３９８０号及び第４
６９３９７９号。
【００５５】パリンドロームは殆ど同じ（必ずしも同一
ではない）塩基配列が逆方向にランする逆方向反復を含
むと定義されている。一部は短いが（一方向に３〜１０
塩基）、他の配列は数百の塩基対を含めて、非常に長
い。ワトソン(Watson)、遺伝子の分子生物学(Molecular
Biology of Gene) 第３版、２２４〜２２５頁。ＤＮＡ
フラグメント中のＩＲはサイズがかなり変化しうる。限
定するわけではなく、１０から３０以上のヌクレオチド
の逆方向反復を含むｓｌＤＮＡが考えらる。逆方向反復
は３００を越えるｂｐを含むと報告されている。カレン
ト プロトコール(Current Protocols) 、セクション
１．４．１０．
【００５６】ｓｌＤＮＡは原核生物又は真核生物のホス
ト表現（例えば細菌、酵母及び哺乳動物細胞）の合成生
成物である。
【００５７】プラスミドのような適当なベクターの例と
これによって形質転換されるホスト細胞は、当業者に周
知である。必要な成分を有するプラスミドの適当なホス
トには、原核生物と真核生物とが存在する。原核生物
は、例えばエシエリキア(Escherichia) 属、特に大腸
菌；バチルス(Bacillus)属；特に枯草菌のような微細物
を含む。
【００５８】大腸菌を形質転換することのできるプラス
ミドは、例えばｐＵＣ型とＣｏｌＥｌ型プラスミドがあ
る。米国特許第４９１０１４１号参照。大腸菌を形質転
換することができるプラスミドは例えば、一般にＣｏｌ
Ｅｌ型プラスミドを含む。大腸菌の形質転換に適当な、
他のプラスミドを下記に挙げる：ｐＳＣ１０１、ｐＳＦ
２１２４、ｐＭＢ８、ｐＭＢ９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐ
ＡＣＹＣ１７７、ｐＣＫ１、Ｒ６Ｋ、ｐＢＲ３１２、ｐ
ＢＲ３１３、ｐＭＬ２、ｐＭＬ２１、ＣｏｌＥｌＡＰ、
ＲＳＦ１０１０、ｐＶＨ５１、ｐＶＨ１５３。
【００５９】枯草菌を形質転換することのできるプラス
ミドを下記に挙げる：ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２
２３、ｐＵＢ１１２、ｐＴ１２７、ｐＥ１９４、ｐＵＢ
１１０、ｐＳＡ０５０１、ｐＳＡ２１００、ｐＴＰ４、
ｐＴＰ５及びこれらの誘導体。
【００６０】枯草菌と大腸菌の両方を形質転換すること
のできるプラスミドは、ジェイ．バクテリオル．(J. Ba
cteriol.) １４５、４２２〜４２８（１９８２）；プロ
ク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ、７５、１４３３〜
１４３６（１９７８）及び遺伝子操作の原理(Principle
s of Gene Manipulation) 第２版、カル(Carr)等編集、
カリフォルニア大学出版局（バークレイ）、１９８１、
４８頁に述べられている。
【００６１】真核生物においてｓｌＤＮＡ合成を実施す
るために特に重要であるのは、エス．セレヴィジェ(S.
cerevisiae) を形質転換することのできるプラスミド：
ｐＭＰ７８、ＹＥｐ１３、ｐＢＴＩ１、ｐＬＣ５４４、
ＹＥｐ２、ＹＲｐ１７、ｐＲＢ８（ＹＩｐ３０）、ｐＢ
Ｔ１７、ｐＢＴ１９、ｐＢＴ１１０、ｐＡＣ１、ｐＳＬ
ｅ１、ｐＪＤＢ２１９、ｐＤＢ２４８及びＹＲｐ７であ
る。ＹＩｐ５、ｐＵＣ−ＵＲＡ３、ｐＵＣ−ＬＵＥ２及
びｐＵＣ−ＨＩＳ３も考えられる。酵素学における方法
（Methods in Enzymology)１９４巻、２８５、３７３〜
３７８頁「酵母遺伝学と分子生物学のガイド(Guide to
Yeast Genetics and Molecular Biology) 」、グスリー
(Guthrie) とフィンク(Fenk)編集（１９９１）、アカデ
ミックプレス社（Academic Press. Inc)を参照のこと。
他の酵母ベクターは遺伝子表現の実験操作(Experimenta
l Manipulation of Gene Expression)イノウエ マサノ
リ(Massayori Inouye)編集、アカデミック プレス社
（１９８３）、１００〜１０４頁に述べられている。
【００６２】さらに、大腸菌ならびに例えばエス．セレ
ヴィジェのような酵母の形質転換に用いることができる
シャトルベクターが特に重要である。このようなベクタ
ーはｐｋｂ４２とｐＹＣ１を含む。他の例は分子クロー
ニングの実用ガイド(A Practical Guide to Molecular
Cloning)ベルナード ペルバル(Bernard Perbal)による
第２版（ウイリーアンドサンズ）中の“下等及び高等真
核生物のコスミドベクター(Cosmid Vector for Low and
Higher Eucaryotes) ”に関するセクションに挙げられ
ている。他の適当なベクターはカレント プロトコー
ル、２巻、セクション１３．４．１、１３．４．２（１
９８９）に述べられる。他の適当なビークルはＹＥｐ２
４〔ボトシュタイン(Botstein ）等、ジーン、８、１７
（１８７９）〕とｐＪＤＢ２０７〔ベッグ(Beggs) 、ゲ
ネチック エンジニヤリング(Genetic Engineering)
（ウィリアムソン(Williamson)編集）２巻、１７５頁、
アカデミック プレス（１９８２）のような、一般のマ
ルチコピーベクターを含む。選択可能な、他のベクター
は、ＹＥｐ５１とＹＥｐ５２のようなＹＩｐクラスのプ
ラスミドを含む。
【００６３】本発明の実施するための商業的に入手可能
な真核ベクターの例は、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅ
Ｌａ細胞におけるｐＳＶＬとｐＫＳＶ−１０である。他
の例は分子クローニング実用ガイドに挙げられている。
【００６４】形質転換ホストの培養と発酵は技術上公知
の標準的な一般方法によって実施される。例えば、メソ
ッズ イン エンザイモロジー、１８５巻、遺伝子表現
テクノロジー〔編集者ゴッデル(Goeddel) 〕１９９０
（特に細胞ラインの増殖）を参照、酵母に関しては、メ
ソッズ イン エンザイモロジー、１９４巻、酵母遺伝
学と分子生物学のガイドを参照；大腸菌の増殖条件は、
カレント プロトコールイン モレキュラー バイオロ
ジー(Current Protocols in Molecular Biology)、１
巻、１．１．１、１．１．２、１．１．３、１．１．
４、１．３．１頁及びモレキュラー クローニング：ア
ラボラトリー マニュアル(Moloecular Cloning ：A
Laboratory Manual)第２版、１．２１頁に述べられてお
り、プラスミドＤＮＡの精製は１．２３頁に述べられて
おり、哺乳動物細胞に適した培養増殖条件がカレント
プロトコール、１巻と２巻、９．０．４〜９．０．６、
９．１．１、９．１．２、９．１．３、９．２．５、
９．４．３、１１．５．２、１１．６．２及び１１．
７．３頁に述べられている。
【００６５】要約すると、一重第１鎖の複製開始と合成
のために必要な成分、すなわち開始部位を含むＤＮＡテ
ンプレートフラグメントとＩＲ（及びポリメラーゼ）を
複製ビークル中に供給すると、ｓｌＤＮＡが形成される
と期待される。本発明のｓｌＤＮＡの合成をインビトロ
で実施する場合に、合成はテンプレートとしてＤＮＡフ
ラグメントを用いるヌクレオチド鎖の合成のための通常
の成分を含む培質中で実施する。一般に、合成は好まし
くはｐＨ７〜９の緩衝化水溶液中で行われる。ＤＮＡテ
ンプレート鎖上にモル過剰量のオリゴヌクレオチドが存
在することが好ましい、デオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰも合成混
合物の成分である。溶液を加熱し、次に冷却する。次に
ポリメラーゼを加えると、合成が進行する。これらの成
分はここに述べる本発明のための「通常成分」と呼ばれ
る。
【００６６】オリゴヌクレオチド合成は、米国特許第４
４１５７３４号と、マットイシ(Matteuci)等ジェイ．ア
ム．ケム．ソク．１０３（１１）：３１８５〜３１９１
頁（１９８１）；アダムス(Adams) 等、ジェイ．アム．
ケム．ソク．１０５（３）：６６１〜６６３頁（１９８
３）；及びベムケージ(Bemcage) 等、テトラヘドロンレ
タース(Tetrahedron Letters) ２２（２０）：１８５９
〜１８６７（１９８１）に述べられている。
【００６７】本発明の方法は遺伝子工学の技術と分子ク
ローニングを利用する。遺伝子工学の一般的技術と分子
クローニングは下記文献に含まれる：サムブロック(Sam
brook)等、モノキュラー クローニング：ア ラボラト
リー マニュアル、第２版、コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laborator
y) 、１９９０、分子クローニング便覧、第２版、バー
ナード、ペルバル（１９８８）；メソッズ イン エン
ザイモロジー、６８巻、組換えＲＮＡ〔ウー（Wu）編集
者〕、アカデミック プレス、Ｎ．Ｙ．、１９７９；メ
ソッズ イン エンザイモロジー、１８５巻、遺伝子表
現テクノロジー〔ゴエデル(Goeddel) 編集者〕１９９
０、カレント プロトコールス イン モレキュラー
バイオロジー、１，２及び３巻。
【００６８】本発明のｓｌＤＮＡは幾つかの重要な用途
を有する。本発明の方法は特定の遺伝子にライダム突然
変異を導入するために利用することができる。このよう
な系は形質転換ベクター中のβーガラクトシダーゼの遺
伝子を示す図７に説明される。
【００６９】この方法は、ステム中の配置された重要な
遺伝子を含むｓｌＤＮＡの合成、ｓｌＤＮＡの単離、ｓ
ｌＤＮＡから遺伝子の切断、適当な複製ビークルへのそ
れのクローニング及びその遺伝子によってコードされる
蛋白質の表現を含む。蛋白質は目的の活性に関して試験
することができる。標準方法によって、コロニーを検査
して、突然変異遺伝子を有するコロニーを確認すること
ができる。
【００７０】突然変異の発生と確認の説明は次のように
進める。ｌａｃＺ遺伝子を収容するｐＵＣＫ１９（実施
例１参照）中に、ＤＮＡフラグメントとＯＲ（実施例１
に示す）との間に３５ｂｐＩＲ（実施例に説明）を含む
前出の配列表の配列番号１及び２で構成され、図２で示
す２１５ｂｐＤＮＡフラグメントを結合させる。このプ
ラスミドを標準条件下で増殖するコンピテント大腸菌Ｃ
Ｌ８３に形質転換させる。その後、ｓｌＤＮＡを単離
し、ｌａｃＺ遺伝子を切断して、ｐＵＣ１９中（ＩＲ含
有フラグメントをもっていない）に挿入する。次いでこ
のプラスミドを大腸菌ＣＬ８３に形質転換させる。突然
変異の頻度をβ−ｇａｌ、無色基質を用いて公知のイン
ビボ試験によって評価する、前記無色基質は加水分解さ
れると暗青色生成物を生ずる。コロニーが無色である場
合には、このことがβ−ガラクトシダーゼが製造されな
いことを示唆する。
【００７１】ｌａｃ遺伝子類の他の遺伝子、例えばｌａ
ｃＹもしくはｌａｃＡ又は他の適当な遺伝子をこのスク
リーニング試験に用いることができる。重要な蛋白質
（又はポリペプチド）をコードする遺伝子も、突然変異
の頻度決定と、誘導蛋白質（又はポリペプチド）をコー
ドする適当な遺伝子の選択とに用いることができる。
【００７２】スクリーニング方法は標的遺伝子に突然変
異を導入し、突然変異率を増加させやすい、ポリメラー
ゼの選択を可能にする。従って、例えばｌａｃＺ遺伝子
のような適当な遺伝子をスクリーニング遺伝子として用
いることができる。複製確実度（replication fidelit
y）の低いことが知られる逆転写酵素は目的蛋白質をコ
ードする標的遺伝子に突然変異を導入するために選択す
べき酵素であるように思われる。
【００７３】好ましい標的蛋白質は、好ましい生物学的
性質のために選択された、突然変異遺伝子を有する、特
定のコンピテント形質転換ホストによって表現される。
【００７４】突然変異の頻度は、複製における確実度の
低いことが知られる適当な酵素を選択することによって
影響されやすいと考えられる。従って、標的ＤＮＡフラ
グメント又は遺伝子を増幅する場合に、系は複製確実度
又は不確実度すなわち挿入ＤＮＡフラグメント又は遺伝
子の複製におけるＤＮＡポリメラーゼによってなされる
エラー（error ）頻度に依存する。このようにして、各
複製エラーに対して、ランダム突然変異が遺伝子に導入
される。ＤＮＡポリメラーゼの不確実度が高ければ高い
ほど、突然変異遺伝子類は大きくなる（この逆もいえ
る）。
【００７５】ＰｏｌIII とＰｏｌI とが有効であると考
えられる本発明の上記実施態様の一つでは、ＰｏｌI が
自己修正機能を有することが知られているので、Ｐｏｌ
IIが低い確実性を有すると考えられる。このようにし
て、系の複製確実度はＤＮＡポリメラーゼの適当な選択
によって調節することができる。一般に、ランダム突然
変異は第２鎖を合成するポリメラーゼによって導入され
やすいと考えられる。興味ある候補ポリメラーゼはＲＴ
である。
【００７６】好ましい突然変異を有する遺伝子は染色体
交差（chromosomal crossover)に有用である。この方法
によって、重要な遺伝子又は突然変異遺伝子を有するｓ
ｌＤＮＡを用いて、同種の一つの分子からもう一つの分
子への遺伝情報を融和させ、交換することができる。突
然変異遺伝子はゲノム内にペクター塩基配列に類似した
塩基配列を配置し、相同な遺伝子が突然変異遺伝子によ
って複製される。
【００７７】このようにして、突然変異遺伝子を含み、
好ましい蛋白質を表現する微生物の新しい系統が発生す
ることができる。突然変異遺伝子を有するｓｌＤＮＡは
インビトロ又はインビボで製造することができる。
【００７８】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡ
の特定セグメントをインビトロ酵素増幅するための迅速
手段である。標準ＰＣＲ方法は増幅すべき二重鎖ＤＮＡ
セグメント、セグメントと側面を接する常に二つの一重
鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラー
ゼ、適当なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）、バッファー及び塩を必要とする。カレント プロ
トコール セクション１５参照のこと。
【００７９】本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡは単一プライマ
ーによって増幅することができる。この特徴は増幅をか
なり簡単化し、プライマーがその適当な複製開始部位を
見出す問題の解決を助け、これをさらに経済的にし、従
来のＰＣＲ方法に付随する問題の解決を助ける。
【００８０】ｓｌＤＮＡの増幅はｓｌＤＮＡを変性し
て、一重鎖ＤＮＡ（３′から５′末端まで）を形成する
ことを含む。この反応は通常の順序：３′末端からのプ
ライミング、ポリメラーゼ反応、変性とアニーリングに
従って行われる。これが２５サイクル実施されると、ｓ
ｌＤＮＡの１００万倍増幅が生ずる。ｓｌＤＮＡは標的
蛋白質をコードする遺伝子を有することができる。
【００８１】エルリッヒ（Erlich）等による“ポリメラ
ーゼ連鎖反応における最近の進歩（Recent Advances in
Polymerase Chain Reaction）”なるタイトルのサイエ
ンス（Science ）２５２、１６４３〜１６５０（１９９
１年６月２１日）内の最近の報告はプライマーに関連す
る問題と、ＰＣＲ方法に提案されている改良とを考察し
ている。
【００８２】従って、本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡ構造を
１プライマーを用いる方法によって増幅する方法は非常
に重要である。ｓｌＤＮＡは例えば改良された生物学的
特性を有する突然変異遺伝子のような、重要な遺伝子を
有することができる。
【００８３】本発明のｓｌＤＮＡのインビボ製造は目的
の塩基配列を形成するように操作されることができる。
このようにして製造されたｓｌＤＮＡを次に、アンチセ
ンス（antisense ）ＤＮＡとして用いることができる。
【００８４】現在考えられている魅力的な用途は、本発
明のｓｌＤＮＡが三重鎖らせんＤＮＡ、すなわち三重鎖
ＤＮＡを形成し、結果としての新しい三重鎖ｓｌＤＮＡ
の形成に果たす役割である。サイエンス、２５２、１３
７４〜１３７５（１９９１年６月２７日）における最近
の報告、“三重鎖ＤＮＡがついに完成（Triplex ＤＮＡ
Finally Comes of Age ）”は本発明の適時性を強調し
ている。三重鎖ＤＮＡは第３鎖を染色体ＤＮＡ上の特定
認識部位に結合させることによって製造することができ
る。好ましくは塩基の完全量（full complement ）（例
えば１１〜１５以上）を含むサイズの合成鎖を検討して
いる。長い３′（又は５′）末端（及び非重複塩基のル
ープ）を有する本発明のｓｌＤＮＡは良好な候補である
ように思われる。結果として生ずる三重鎖ＤＮＡは大き
な安定性と有用性とを有するように思われる。ＡＩＤＳ
療法、選択的遺伝子阻害等を含めた三重鎖らせん形成に
基づく新しい療法がこの報告に提案されている。
【００８５】本発明が技術と科学に有意な貢献をするこ
とは認められるであろう。
【００８６】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２１５ 配列の型：核酸 配列： CTAGAGATAT GTTCATAAAC ACGCATGTAG GCAGATAGAT CTTTGGTTGT GAATCGCAAC 60 CAGTGGCCTT ATGGCAGGAG CCGCGGATCA CCTACCATCC CTAATGACCT GCAGGCATGC 120 AAGCTTGCAT GCCTGCAGGT CATTAGGTAC GGCAGGTGTG CTCGAGGCGA AGGAGTGCCT 180 GCATGCGTTT CTCCTTGGCT TTTTTCCTCT GGGAT 215 配列番号：２ 配列の長さ：２１５ 配列の型：核酸 配列： CTAGATCCCA GAGGAAAAAA GCCAAGGAGA AACGCATGCA GGCACTCCTT CGCCTCGAGC 60 ACACCTGCCG TACCTAATGA CCTGCAGGCA TGCAAGCTTG CATGCCTGCA GGTCATTAGG 120 GATGGTAGGT GATCCGCGGC TCCTGCCATA AGGCCACTGG TTGCGATTCA CAACCAAAGA 180 TCTATCTGCC TACATGCGTG TTTATGAACA TATCT 215 配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 配列： GGTTATCCAC AGAATCAG 18
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のプラスミド、ｐＵＣＫ１０６の
説明図。
【図２】図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａ1I部位に挿入され
た２１５−ｂｐのＤＮＡ塩基配列を示す図。
【図３】図３はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成
とその特徴とを説明するポリアクリルアミドゲルの臭化
エチジウム染色を示す。
【図４】図４はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイ
マー形成を説明するポリアクリルアミドゲルのオートラ
ジオグラフを示す。
【図５】図５はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ塩基配
列決定を説明する図である。
【図６】図６はｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデルを
説明する図である。
【図７】図７のレーン１と３はサイズマーカーとしての
ｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体（digest）を示し、レ
ーン２はｐＵＣ７からのｓｌＤＮＡを示す。
【図８】図８はｓｌＤＮＡを利用して、特定の遺伝子に
ランダムミューテーションを導入する具体例を示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 (72)発明者 井上 すみ子 アメリカ合衆国ニュージャージー州08807、 ブリッジウォーター、リンベイル レーン ３ (72)発明者 井上 正順 アメリカ合衆国ニュージャージー州08807、 ブリッジウォーター、リンベイル レーン ３

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＤＮＡポリメラーゼ合成に必要な成分を
    含み、下記成分： (a) 適当なプライミング部位と前記プライミング部位
    の下流の逆方向反復（ＩＲ）とを含むテンプレートＤＮ
    Ａ； (b) テンプレートにＤＮＡ重合を開始させるプライマ
    ー；及び (c) テンプレートからのｓｌＤＮＡを複製するための
    ＤＮＡポリメラーゼを含む系において形成される、ステ
    ムがｓｓＤＮＡ中のアニールされた相補的塩基の二重鎖
    ＤＮＡからなり、一端においてｓｓＤＮＡ分子の５′と
    ３′末端を形成し、他端において二重鎖ＤＮＡの反対端
    部を結合するＤＮＡの一重鎖ループを形成するステム−
    ループ構造（ｓｌＤＮＡ）を含む、新規な一重鎖ＤＮＡ
    （ｓｓＤＮＡ）分子を合成する方法であって、次の工
    程： (1) ＤＮＡ重合を開始させるためのテンプレートのプ
    ライミング工程； (2) プライマーからテンプレートとしてＤＮＡ二重鎖
    の一つを用いてｓｓＤＮＡを合成し、ＤＮＡ合成をＩＲ
    塩基配列に入るまで続け、ＩＲ塩基配列内で合成を停止
    させる工程； (3) 新たに合成された鎖内のＩＲ塩基配列の相補的塩
    基に非重複部分と重複部分とからなるループ形成をルー
    プのネックにおいてアニールさせ、重複部分を連続ＤＮ
    Ａ合成のプライミング部位として機能させる工程； (4) テンプレートとしてＤＮＡの新たに合成された鎖
    及び／又は他の鎖を用いてＤＮＡ合成を再開する工程； (5) ｓｌＤＮＡを形成する工程；及び (6) 必要に応じてｓｌＤＮＡを分離する工程ををむ方
    法。
  2. 【請求項２】 ループ形成後の第２鎖が第１鎖に比べて
    長くなるまでＤＮＡ合成を続けさせる請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 ループ形成後に第２鎖が第１鎖に比べて
    長くなる前に第２鎖合成を停止させる請求項１記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 系が第１鎖合成ポリメラーゼと第２鎖合
    成ポリメラーゼの２種ポリメラーゼを含む請求項１記載
    の方法。
  5. 【請求項５】 第２鎖合成のテンプレートが第１合成鎖
    である請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 第２鎖合成のテンプレートがオリジナル
    のテンプレートＤＮＡの他方の鎖である請求項１記載の
    方法。
  7. 【請求項７】 合成を自己複製ＤＮＡビークル中で実施
    する請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 自己複製ビークルがプラスミドである請
    求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 プラスミドが大腸菌プラスミドである請
    求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 プラスミドがｐＵＣＫ１０６である請
    求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 プラスミドが複製始点と逆方向反復と
    の間に配置された蛋白質をコードする遺伝子を含む請求
    項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である請求項
    １１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 プラスミドが逆方向反復の上流に配置
    された第１ポリメラーゼの複製始点を有する請求項１２
    記載の方法。
  14. 【請求項１４】 各５′末端のサイズが異なるｓｌＤＮ
    Ａ類が製造される請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 インビトロで実施される請求項１記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 第１鎖合成ポリメラーゼと第２鎖合成
    ポリメラーゼの２種ポリメラーゼを含む請求項１５記載
    の方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１記載の方法によって得られる
    ｓｌＤＮＡ。
  18. 【請求項１８】 請求項１０記載の方法によって得られ
    るｓｌＤＮＡ。
  19. 【請求項１９】 ステムがｓｓＤＮＡ中のアニールされ
    た相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなり、一端においてｓ
    ｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端において
    二重鎖ＤＮＡの反対端部を結合するＤＮＡの一重鎖ルー
    プを形成するステム−ループ構造（ｓｌＤＮＡ）を含
    む、新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子を合成する
    ための系であって、 ＤＮＡポリメラーゼ合成の必要な成分をも含み、下記成
    分： (a) 適当なプライミング部位と前記プライミング部位
    の下流の逆方向反復（ＩＲ）とを含むテンプレートＤＮ
    Ａフラグメント； (b) テンプレートにＤＮＡ重合を開始させるプライマ
    ー；及び (c) テンプレートから及び／又はＤＮＡフラグメント
    の第２鎖からｓｌＤＮＡを複製するためのＤＮＡポリメ
    ラーゼを含む系。
  20. 【請求項２０】 ｓｓＤＮＡの第１鎖合成ポリメラーゼ
    と第２鎖合成ポリメラーゼの２種ポリメラーゼを含む請
    求項１９記載の系。
  21. 【請求項２１】 自己複製可能なＤＮＡビークルをも含
    むインビボ系である請求項２０記載の系。
  22. 【請求項２２】 自己複製ＤＮＡビークルがプラスミド
    である請求項２１記載の系。
  23. 【請求項２３】 プラスミドが大腸菌プラスミドである
    請求項２２記載の系。
  24. 【請求項２４】 プラスミドがｐＵＣＫ１０６である請
    求項２３記載の系。
  25. 【請求項２５】 プラスミドが複製始点と逆方向反復と
    の間に配置された蛋白質をコードしうるＤＮＡ塩基配列
    をも含む請求項２４記載の系。
  26. 【請求項２６】 ＤＮＡ塩基配列が遺伝子である請求項
    ２５記載の系。
  27. 【請求項２７】 遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である請求項
    ２６記載の系。
  28. 【請求項２８】 ステムがｓｓＤＮＡ中のアニールされ
    た相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなり、一端においてｓ
    ｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端において
    二重鎖ＤＮＡの反対端部を結合するＤＮＡの一重鎖ルー
    プを形成するステム−ループ構造（ｓｌＤＮＡ）を含
    む、単離精製された、新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮ
    Ａ）分子。
  29. 【請求項２９】 ステムの３′末端又は５′末端の一方
    が他方に比べて長い請求項２８記載の新規な一重鎖ＤＮ
    Ａ（ｓｓＤＮＡ）。
  30. 【請求項３０】 ３′末端が２末端の長い方である請求
    項２９記載の新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）。
  31. 【請求項３１】 各５′末端一重塩基配列のサイズが異
    なる請求項２８記載のｓｌＤＮＡ類。
  32. 【請求項３２】 ３５ｂｐ逆方向反復塩基配列を含むテ
    ンプレートＤＮＡから合成された請求項２８記載のｓｌ
    ＤＮＡ。
  33. 【請求項３３】 一重鎖ループが４塩基を含む請求項２
    ８記載のｓｌＤＮＡ。
  34. 【請求項３４】 ループとステム末端との間に配置され
    た、蛋白質をコードしうるＤＮＡ塩基配列を含む請求項
    ２８記載の新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）。
  35. 【請求項３５】 ＤＮＡ塩基配列が遺伝子である請求項
    ３４記載の新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）。
  36. 【請求項３６】 遺伝子がβ−ガラクトシダーゼをコー
    ドする遺伝子である請求項３５記載の新規な一重鎖ＤＮ
    Ａ（ｓｓＤＮＡ）。
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