ES2202301T3

ES2202301T3 - Procedimiento para la sintesis de adn tallo-bucle monocatenario.

Info

Publication number: ES2202301T3
Application number: ES92402366T
Authority: ES
Inventors: Atsushi Ohshima; Sumiko Inouye; Masayori Inouye
Original assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2012-08-28
Also published as: EP0530112A3; EP0530112A2; CA2073630C; JPH05308972A; JP3580561B2; JP2004261191A; JP4041098B2; EP0530112B1; CA2073630A1; DE69233106T2; DE69233106D1; US5643762A; EP1251169A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DEL ADN RECOMBINANTE. MAS PARTICULARMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE SINTESIS DE UN NUEVO Y UTIL ADN DE CADENA SIMPLE QUE TIENE UNA CONFIGURACION DE HELICE (ADNSS-SL). LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE SINTESIS IN VITRO E IN VIVO. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE AL VEHICULO DE DUPLICACION QUE PRODUCE ESTOS ADNSS-SL. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE A ESTAS NUEVAS ESTRUCTURAS Y DESCRIBE USOS DE ESTAS ESTRUCTURAS. SE DESCRIBE UN METODO PARA AMPLIFICAR ADNSS-SL CON O SIN GENES QUE CODIFICAN UNA PROTEINA OBJETO.

Description

Procedimiento para la síntesis de ADN tallo-bucle monocatenario.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo del ADN recombinante. Más concretamente, la invención se refiere a un procedimiento de síntesis de ADN monocatenario nuevo y útil que tiene una configuración tallo-bucle (ADNtb-mc). La invención se refiere a un procedimiento de síntesis in vivo e in vitro. Además, la invención se refiere al vehículo de replicación que se usa para producir estos ADNtb-mc. Se describe un procedimiento para amplificar ADNtb-mc con o sin genes codificadores de una proteína diana.

Antecedentes

Se sabe que la duplicación de una parte del genoma tiene lugar a través de un ARN intermedio que se transcribe de forma inversa mediante una transcriptasa inversa para generar un ADN complementario (ADNc). Para una revisión, véase Weiner y col., Ann. Rev. Biochem., 55, 631 (1986). Se considera que el consecuente flujo inverso de información genética ha representado un papel primordial en la diversificación evolutiva de los genomas eucariotas. Un mecanismo similar puede haber sido perfectamente el responsable de la evolución genómica en los procariotas, a la luz del reciente descubrimiento de transcriptasas bacterianas. Véase Inouye e Inouye, TIBS, 16, 18 (1991a) e Inouye e Inouye, Ann. Rev. Microbiol., 45, 163 (1991b). Se cree que la duplicación génica a través de la síntesis de ADNc por una transcriptasa inversa ha representado un papel importante en la diversificación de genomas durante la evolución.

La invención surgió en conexión con una investigación básica referida a la evolución del genoma. Se demostró la síntesis de un singular ADNtb-mc durante la replicación de ADN plasmídico. Se puede especular que la producción de ADNtb pueda ser ampliamente prevalente durante la replicación de ADN cromosómico tanto en procariotas como en eucariotas. Los elementos genéticos cromosómicos seguidos por estructuras RI pueden ser siempre objeto de duplicación en ADNtb a una frecuencia que depende de la estabilidad de la estructura RI y de la cualidad de la polimerasa(s).

Se ha demostrado que existen muchas estructuras RI (aproximadamente 1.000 copias en E. coli), conocidas como "REPs" para secuencias palíndromo extragénicas repetitivas o "PUs" para unidades palíndromo (Higgins y col., Nature, 298, 760 (1982), Gilson y col., EMBO. J., 3, 1417 (1984) y Gilson y col., Nucl. Acids Res., 19, 1375 (1991)). Estas estructuras están asociadas con componentes celulares específicos incluida la ADN polimerasa I, y pueden estar jugando un papel significativo en la organización cromosómica (Gilson y col., Nucl. Acids Res., 18, 3941 (1990) y Gilson y col., EMBO. J., 3, 1417 (1984)). Debería destacarse que aproximadamente el 6% del genoma humano está ocupado con elementos denominados Alu, cuyos productos transcripcionales se ha demostrado que contienen estructuras secundarias notables (Simmett y col, J. Biol. Chem., 266, 8675 (1991)).

Puesto que la síntesis de ADNtb no requiere RNA intermedio ni actividad transcriptasa inversa, en contraste con la síntesis de ADNc, el ADNtb puede producirse con más frecuencia que el ADNc. Por tanto, los ADNtb pueden haber representado un papel importante, similar al del ADNc, en la evolución genómica de procariotas y eucariotas, mediante la duplicación de elementos génicos que a continuación se dispersaron o reorganizaron dentro del genoma.

Resumen de la invención

Se ha hecho un hallazgo fundamental en relación con la presente invención. Se ha encontrado que porciones del genoma pueden ser duplicadas directamente a partir del genoma. Se ha encontrado que esta duplicación génica no requiere ni un ARN intermedio ni transcriptasa inversa, y ocurre durante la replicación del ADN.

Descrito brevemente, la invención proporciona un procedimiento para sintetizar una molécula de ADN monocatenario (ADNmc) original y útil. El procedimiento implica el uso de un ADN con repetición invertida (RI) y los componentes necesarios para iniciar y sintetizar una estructura monocatenaria. La invención también proporciona un sistema a partir del cual sintetizar tal ADNmc y con los componentes necesarios, incluyendo un ADN con repetición invertida. La invención además proporciona vehículos de replicación competentes que incluyen todos los elementos necesarios para sintetizar las novedosas moléculas de ADNmc. La estructura obtenida por el procedimiento de la invención tiene un tallo constituido por ADN bicatenario de bases complementarias; el tallo acaba en uno de sus extremos mediante dos regiones terminales, un extremo 3' y 5' respectivamente, y en el otro extremo mediante el ADNmc formando un bucle.

La invención considera el llevar a cabo el procedimiento y los sistemas in vitro.

Se describen varios usos de las moléculas, incluyendo un procedimiento para proporcionar mutaciones al azar en genes, con el propósito de generar proteínas con propiedades biológicas originales y mejoradas. Otro uso interesante que se considera es el integrar las moléculas de ADNmc de la invención dentro de ADN para generar ADN tricatenario con mayor estabilidad. Otro uso es la aplicación de la reacción en la polimerasa (RCP) empleando un único cebador.

La invención y sus diversas formas de realización se describen con mayor detalle en lo sucesivo.

Mediante el procedimiento de la invención se produce una molécula de ADNmc cuya estructura comprende una porción que constituye un tallo de ADN bicatenario de bases complementarias emparejadas dentro del ADNmc, dicho tallo forma en uno de su extremo, los extremos 3' y 5' de la molécula de ADNmc y, en el otro extremo, un bucle que está constituido por una hebra sencilla de bases no emparejadas que se une a las dos hebras sencillas del tallo. En una forma de realización específica, la región terminal 3' de una hebra es más larga que la de la otra hebra. El ADNtb puede incluir segmentos de ADN capaces de codificar una proteína, más concretamente cualquier gen/es. El gen estará localizado entre el bucle y la región terminal. El gen puede ser portador de una mutación/es.

En las figuras 5A y 5B se ilustra un mecanismo propuesto para la síntesis de los ADNtb. Se cree que la síntesis implica, resumidamente, el siguiente proceso: el ADN se inicia en el origen de replicación (OR); entonces, la replicación de la primera hebra (o "la" o "una" hebra) continúa, usando una de la hebras del ADN bicatenario como molde (por el mismo mecanismo que la replicación de ADN cromosómico (véase Tornizawa y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1865 (1977)), continuando a través de la estructura RI y dando lugar a la replicación de todo el genoma plasmídico, cuando se emplea un plásmido. Sin embargo (tal y como se describe con mayor detalle en lo sucesivo), una parte de la primera hebra forma una estructura en bucle a medida que se interrumpe o finaliza la síntesis de la primera hebra dentro del IR (Fig. 5, de la etapa 2 a 3). El bucle forma una corta región de doble hebra que actúa como cebador para continuar la síntesis de ADN. La elongación de la cadena de ADN se reanuda a p del extremo 3' recién formado, formando ahora la segunda hebra (o "la otra" hebra) usando la primera hebra naciente como molde. En lo sucesivo se describe un proceso de síntesis alternativo (o concomitante) al ya propuesto. De este modo, la dirección de síntesis del ADN se invierte mediante un cambio de molde para duplicar el fragmento de ADN (Fig. 5, de la etapa 1 a 4). La molécula de ADNtb recién sintetizada se disocia por sí misma de las hebras del molde progenitor, y éste sufre otro ciclo de replicación para formar otro ADNtb. El ADN en tallo-bucle, si es necesario, es aislado y purificado.

En otra forma de realización del procedimiento de la invención se proporciona un vehículo de ADN autorreplicante, por ejemplo un plásmido en el que se ha insertado un fragmento de ADN que contiene una estructura con repetición invertida (RI), el fragmento de ADN que servirá como molde para la síntesis de ADNmc y un cebador apropiado, por ejemplo un origen de replicación (OR) tal como el origen de replicación de E. coli (ColE1). La RI se coloca corriente abajo del OR. El vehículo autorreplicante se replica en un hospedador apropiado, por ejemplo una E. coli. El hospedador contendrá, al menos, una ADN polimerasa para sintetizar el ADNmc a partir del molde. En esta forma de realización específica, se supone que hay dos polimerasas, una primera ADN polimerasa contribuyendo a la elongación de una porción del ADNmc desde el OR hasta la RI, la primera hebra, y una segunda polimerasa que sintetiza el resto o segunda hebra de la hebra de ADNmc. A medida que finaliza la síntesis de la primera hebra, las bases complementarias se emparejan para formar un bucle monocatenario no emparejado. La síntesis de la segunda hebra tiene lugar a continuación. Se sintetiza una nueva estructura de ADN que está constituida por un tallo de ADN bicatenario y una estructura monocatenaria en forma de bucle en el extremo opuesto. El término "tallo-bucle" o "ADNtb" ha sido acuñado para esta nueva estructura de ADN.

Otra forma de realización específica proporciona un vehículo replicante en el que se ha detectado un promotor, en concreto el promotor-operador lac. No obstante, se produjo un ADNtb apoyando el modelo de síntesis propuesto, como se describe con más detalle a continuación.

El plásmido se puede construir para contener cualquier secuencia de ADN seleccionada, capaz de codificar un a proteína, entre el sitio cebador y la RI, y de esta manera el ADNtb sintetizado contendrá la secuencia de ADN o una mutación de la misma.

El ADNtb producido por el procedimiento de la invención no requiere un vehículo autorreplicante para ser sintetizado, pero puede ser sintetizado en un sistema in vitro apropiado constituido por un segmento de ADN cualquiera, lineal o no, que contenga cualquier RI y los elementos necesarios para sintetizar el ADNmc. Tal sistema se describe en lo sucesivo.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 (A) ilustra un plásmido de la invención, pUCK106.

Fig. 1 (B) (Sec. ID Nº:1) muestra la secuencia de ADN de 215pb insertada en al sitio Xbal de pUCK19.

Fig. 2 muestra una tinción con bromuro de etidio de un gel de poliacrilamida de la producción de un ADNtb procedente de pUCK106, y sus características.

Fig. 3 muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la formación de un dímero del ADNtb procedente de pUCK106.

Fig. 4 ilustra la determinación de la secuencia de ADN del ADNtb procedente de pUCK106.

(A) muestra un gel de poliacrilamida seco de la determinación de la secuencia de ADN de la región terminal 5' del ADNtb.

\newpage

(B) muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la secuenciación del extremo 5' de la región en bucle del ADNtb.

(C) muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la secuenciación del extremo 3' de la región en bucle del ADNtb.

(D) muestra una autorradiografía de un gel de poliacrilamida seco de la secuencia de ADN de la región terminal 3' del ADNtb.

(E) muestra la estructura del ADNtb procedente de pUCK106.

Fig. 5 ilustra dos modelos posibles de la síntesis de ADNtb.

Fig. 6 la línea 1 muestra el producto de la digestión de pBR322 con HaeIII como marcador de tamaños. La línea 2 muestra el ADNtb procedente de la preparación a partir de pUC7.

Fig. 7 muestra el gen para la \beta-galactosidasa en un vector transformado.

Depósito de material genético

Se ha depositado el plásmido pUCK106 con la Colección Americana de Cultivos Patrón (ATCC) bajo el número de adquisición 68679.

Se ha depositado el plásmido pUCK106\Deltalac^{PO} con la ATCC bajo el número de adquisición 68680.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no pretenden, de ninguna manera, limitar la invención. En estos ejemplos todos los porcentajes son en peso, si se trata de sólidos, y en volumen, si se trata de líquidos y todas las temperaturas están en grados Celsius, a menos que se indique otra cosa.

Por comodidad y claridad, los ejemplos se refieren a las figuras y además proporcionan una descripción detallada de las mismas.

Ejemplo 1

Fig. 1A ilustra pUCK106 (mapa circular), un plásmido específico hecho como se muestra más abajo. La barra blanca en el mapa circular representa el gen de resistencia a la canamicina (desde Tn 5). La barra blanca recta mostrada en el ángulo superior derecho, representa un fragmento de ADN de 215pb insertado en el sitio de Xbal, que contiene secuencias con repeticiones invertidas (RI) de 35pb. Las flechas negras muestran la estructura con RI. El punto negro es el origen de replicación (Ori). La flecha blanca más larga indica la dirección de replicación del ADN a partir del OR. La flecha blanca más corta muestra la posición del promotor-operador lac (lac^{PO}).

Fig. 1B muestra la secuencia de ADN de 215pb insertada en el sitio Xbal de pUCK19. Este plásmido será denominado en lo sucesivo pUCK106. Las flechas blancas indican las secuencias RI. El sitio HindIII (AAGCTT) muestra el centro de la RI.

Las posiciones de emparejamientos incorrectos en la RI están indicadas por dos interrupciones de las flechas, con las bases incorrectamente emparejadas, C y T, colocadas en dichas interrupciones.

El fragmento de ADN descrito más arriba (que contiene la RI) tiene la siguiente secuencia (SEC. ID Nº: 1):

1

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la producción de un ADNtb a partir de pUCK106 y sus características.

(A) Se transformó E. Coli CL83 con pUCK19, pUCK106 y con pUCK106\Deltalac^{PO}, y se preparó una fracción de ADN plasmídico. Se aplicó una muestra de ADN (después del tratamiento con ribonucleasa A) a un gel de poliacrilamida al 5% para electroforesis. El gel se tiñó con bromuro de etidio. La línea 1 muestra el producto de la digestión de pBR322 con HaeIII como marcador de tamaños; la línea 2, la preparación de ADN a partir de células que contienen pUCK19; la línea 3, pUCK 106; la línea 4, pUCK106\Deltalac^{PO}.

pUCK19 es una variante canamicina de pUC19.

(B) Se purificó el ADNtb procedente de pUCK106 mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida seguida por una digestión con varios enzimas de restricción. Los productos de la digestión se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (5%) y se tiñó el gel con bromuro de etidio. En referencia a la Fig. 2, la línea 1, el producto de la digestión de pBR322 con HaeIII como marcador de tamaños; la línea 2, el ADNtb sin digerir; la línea 3, el ADNtb digerido con Xbal; la línea 4, con HindIII; y la línea 5, con PvuII.

(C) Desnaturalización con calor del ADNtb procedente de pUCK106. El ADNtb purificado (como se describe más arriba) se solubilizó en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM. La solución de ADNtb se incubó durante 3 minutos en un baño de agua hirviendo y se enfrió rápidamente en un baño de hielo. Las muestras se analizaron como se describe en A. En referencia a la Fig. 2, la línea 1, el producto de la digestión de pBR322 con HaeIII como marcador de tamaños; la línea 2, el ADNtb sin tratamiento con calor; la línea 3, el ADNtb desnaturalizado con calor y después enfriado rápidamente.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la formación del dímero del ADNtb procedente de pUCK106.

(A) El ADNtb purificado procedente de pUCK106, como se describe en la Fig. 2, se solubilizó en Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM y MgCl_{2} 10 mM. La solución de ADNtb se incubó durante 3 minutos en un baño de agua hirviendo y después se enfrió progresivamente. El ADNtb renaturalizado se digirió con Xbal y los extremos 5' de los fragmentos de ADN así generados se marcaron con ATP [\gamma^{32}P] y la polinucleótido quinasa T4. Estos productos se aplicaron a un gel de poliacrilamida al 5%. Después de la electroforesis, el gel se dejó secar y se le sometió a una autorradiografía.

En referencia a la Fig. 3, la línea 1, el producto de la digestión de pBR322 con HaeIII como marcador de tamaños; la línea 2, el producto de la digestión del ADN \lambda con EcoRI y HindIII como marcador de tamaños; la línea 3, el ADNtb procedente de pUCK106 sin tratamiento; la línea 4, el producto de la digestión del ADNtb sin tratar con Xbal; la línea 5, el ADNtb después de la desnaturalización con calor seguida por enfriamiento progresivo; y la línea 6, el producto de la digestión del ADNtb procedente de la línea 5 con Xbal. Las bandas están señaladas, en el margen derecho de la figura, de la "a" a la "e".

(B) Caracterización del fragmento "d" en la Fig. 3A. Fragmento "d" purificado procedente del gel; la línea 3, el producto de la digestión del fragmento "d" purificado con HindIII; y la línea 4, el fragmento "d" tras ser desnaturalizado con calor y enfriado rápidamente, como se describe con respecto a la Fig. 2.

(C) Representación esquemática de las bandas de la "a" a la "e" que se muestran en A y B. X y H representan los sitios Xbal y HindIII respectivamente. Hay otros dos sitios HindIII en el fragmento "a" muy próximos a los sitios Xbal (dentro del fragmento "c"). Estos sitios HindIII no se muestran.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la determinación de la secuencia del ADNtb procedente de pUCK106.

(A) Determinación de la secuencia de ADN de la región terminal 5' del ADNtb. Se usaron 0,2 \mug del ADNtb aislado y purificado para la secuenciación por el procedimiento de terminación de cadena de Sanger. Se utilizó como cebador el cebador "a" (^{5'}GGTTATCCACAGAATCAG^{3'}) (SEC ID No:2), que corresponde a la secuencia de 96pb corriente abajo desde el origen (véase Fig. 4B).

(B) Secuenciación del extremo 5' de la región en bucle del ADNtb. Se digirieron 0,5 \mug del ADNtb con SacII y los extremos 5' de los fragmentos de ADN así generados se marcaron con ATP [\gamma^{32}P] y la polinucleótido quinasa T4. Se aisló y secuenció, mediante el procedimiento de Maxam-Gilbert, el fragmento de ADN que migró a, aproximadamente, 40pb.

(C) Secuenciación del extremo 3' de la región en bucle del ADNtb. Se marcaron con didesoxiATP [\gamma^{32}P], usando una desoxinucleotidil transferasa terminal, los extremos 3' del producto de la digestión de ADNtb con SacII. Se aisló y secuenció, mediante el procedimiento de Maxam-Gilbert, el fragmento de ADN que contenía la región en bucle.

(D) Secuencia de ADN de la región terminal 3' del ADNtb. Se digirió el ADNtb con AflIII (véase Fig. 4E). Se marcaron los extremos 5' con ATP [\gamma^{32}P] y la polinucleótido quinasa T4. Se separaron los productos marcados mediante un gel secuenciador. Se aisló y secuenció, mediante el procedimiento de Maxam-Gilbert, el ADN monocatenario que migró a 76pb. En referencia a la Fig. 4D, los números representan los números de residuo desde el origen de pUCK19.

(E) Estructura del ADNtb procedente de pUCK106. El ADNtb consiste en un ADN monocatenario de 1137 a 1139 bases. El extremo 5' del ADNtb parece ser heterogéneo, algunos comienzan desde +1, mientras que otros lo hacen desde -1, +2 y +3. La posición +1 corresponde al origen de replicación de ADN ColE1. Por lo tanto, varios ADNtb tienen hebras terminales 5' de diferente longitud. En el extremo 3', una secuencia de 16 bases se extiende más allá de la posición +1 del extremo 5'. Se considera que el bucle está formado con la secuencia de 4 bases (AGCT) que corresponde con la secuencia situada en el centro de la estructura RI, donde se localizará un sitio HindIII (AAGCTT). Entre los sitios SacII y PstI, se muestra el par de bases que corresponde al emparejamiento incorrecto en la estructura RI en pUCK106, que se convirtió de C.T (en pUCK106) a CG (en el ADNtb). Se muestra con una flecha la posición del cebador "a" que se usó para la secuenciación de ADN en la Fig. 4A.

La separación y purificación de los ADNtb se realiza de acuerdo con técnicas estándar tales como los procedimientos descritos en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook y col., 2ª Ed. (Secciones 1.121-1.40) ("Sambrook").

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra dos modelos posibles de la síntesis de ADNtb. En la parte superior se muestra el ADN bicatenario, en torno al origen de replicación del ADN ColE1. El círculo sombreado representa el complejo de replicación del ADN que inicia la replicación a partir del origen. Las flechas blancas sobre la hebra de ADN, indican la posición de la estructura con repetición invertida (RI) de 35pb (véase Fig. 1B) en la secuencia de ADN. El par de bases con emparejamiento incorrecto (C.T) en la estructura IR se indica también dentro de las flechas.

En la etapa 1, la horquilla de replicación del ADN avanza desde el origen (posición +1) hasta la posición indicada por el círculo sombreado. Se muestra la hebra de ADN recién sintetizada extendiéndose desde el origen (un círculo negro) hasta la horquilla de replicación. El complejo de replicación del ADN llega hasta inmediatamente antes del residuo T incorrectamente emparejado en la estructura RI, que se muestra con una flecha negra. En la etapa 2, el extremo 3' de la hebra naciente se despega del complejo de replicación del ADN y la estructura RI forma una estructura secundaria. En la etapa 3, se reinicia la síntesis de ADN desde el extremo 3' de la estructura en tallo-bucle usando como molde, bien la hebra naciente (modelo A), bien la hebra progenitora superior (modelo B). En la etapa 4, la síntesis de ADN continúa más allá del origen por 16 bases.

En el modelo A, el cebador ARN, que permanece unido al extremo 5' del ADN, puede usarse como cebador ARN. Posteriormente, el ARN se puede eliminar dando lugar a la formación del ADNtb. En el modelo B, la síntesis de ADN termina en el sitio terH por un mecanismo similar, que se reconoce por la terminación de la síntesis de la segunda hebra de ADN.

Cabe la posibilidad de que ambos modelos, A y B, puedan explicar la síntesis, y que la síntesis pueda avanzar por ambas rutas simultáneamente, al menos durante una parte del tiempo. Por lo tanto, la segunda hebra usará un molde apropiado, diferente de la hebra que sirvió de molde para la primera hebra.

Ejemplo 6 Construcción de pUCK106\Deltalac^{PO}

Cuando el fragmento de 199pb PvuII-HincII, que contiene el promotor-operador lac, se suprimió de pUCK106 (véase la Fig. 1A), el pUCK106\Deltalac^{PO} resultante produjo un nuevo ADNtb que migró más rápido que el ADNtb procedente de pUCK106, como muestra la posición (b) en la línea 4, Fig. 2A. El tamaño de este nuevo ADNtb fue de 360pb de longitud, que es más corto que el ADNtb de pUCK106 por una longitud casi idéntica al tamaño de la deleción en pUCK106\Deltalac^{PO}.

En la Fig. 2A, la línea 3 muestra el ADNtb procedente de la preparación de ADN de células que contienen pUCK106\Deltalac^{PO}.

Este experimento apoya el modelo de síntesis de ADNtb propuesto más arriba, y también indica que el promotor-operador lac no es imprescindible para la síntesis de ADNnb. Este concepto fue además respaldado por el hecho de que la producción de ADNtb a partir de pUCK106 no se vio afectada por la adición de Isopropil-\beta-D-Tiogalactopiranósido como inductor de lac. Sin embargo, hasta el momento se desconoce el motivo de la disminución de la síntesis de ADNtb a partir de pUCK106\Deltalac^{PO}.

Ejemplo 7

La síntesis de ADNtb no dependió de la secuencia primaria de la estructura RI usada por pUCK106. Interesantemente, el vector pUC7, que contiene una estructura RI en el sitio "poliligador" (segmento artificial con sitios de corte únicos para varias enzimas de restricción), también es capaz por sí mismo de producir un ADNtb que corresponde al fragmento de ADN desde el origen hasta el centro del sitio "poliligador".

El ADNtb aislado y purificado, producido a partir de pUC7, tenía 252pb de longitud. Se preparó y trató una fracción de plásmido como se indica en el Ejemplo 2, y después se aplicó (y tiñó) a un gel de poliacrilamida para electroforesis.

En la Fig. 6, la línea 1 muestra el producto de la digestión de pBR322 con HaeIII como marcador de tamaños. La línea 2 muestra el ADNtb procedente de la preparación a partir de pUC7.

El ADNtb de pUC7 se amplificó por RCP (que se describe con más detalle en lo sucesivo).

Ejemplo 8 Confirmación de la estructura del ADNtb

La estructura del ADNtb y el mecanismo que se describe más arriba (ilustrado en la Fig. 5) fueron confirmados como se indica a continuación.

Se proporcionó intencionadamente un par de bases con emparejamiento incorrecto, CT en lugar de CG, al fragmento de ADN que se construyó artificialmente. Véase Fig. 1B en las discontinuidades de la RI. El emparejamiento incorrecto se ha reparado después de la síntesis del ADNtb (con la segunda hebra tendida sobre la primera hebra). Fig 4E, ahora aparece CG. Si la estructura no fuera un estructura tendida, la polimerasa hubiera leído correctamente a través de RI, hubiera leído T e insertado una A; la nueva hebra todavía contendría el emparejamiento incorrecto. Para reemplazar la T emparejada incorrectamente, la porción RI tiene que tenderse necesariamente sobre la primera hebra, permitiendo así a la polimerasa, usar la primera hebra sintetizada como molde para sintetizar la segunda hebra, y a medida que sintetiza ésta, insertar la base complementaria G en lugar de la T emparejada incorrectamente. Esto establece inequívocamente el mecanismo de síntesis y la estructura del ADNtb de la invención.

Descripción detallada de varias formas de realización de la invención

Los inventores han hecho el descubrimiento fundamental de que parte del genoma se duplica directamente a partir del genoma. El mecanismo descubierto no requiere ni ARN intermedio ni transcriptasa inversa (TI) como es bien sabido (véase Weiner y col., Ann. Rev. Biochem., 55, 631 (1986); Kornberg, en DNA Replication (W. H. Freeman y Compañía, San Francisco, CA, 1980), pág. 101-166). Se han descubierto estructuras de ADN útiles denominadas ADN en tallo-bucle (ADNtb).

A modo de introducción, la invención proporciona varias formas de realización. Una de las formas de realización es un procedimiento (o proceso) para sintetizar una molécula (o estructura) de ADNmc útil y novedosa. Un aspecto de esta forma de realización es un sistema in vitro usado para la síntesis de dicha molécula que incluye un fragmento de ADN que contiene un sitio cebador apropiado, una repetición invertida (RI) y otros componentes necesarios para la síntesis de ADNtb.

El sistema para sintetizar tales moléculas usa un vehículo autorreplicante competente y otros componentes del sistema. Ventajosamente, el vehículo autorreplicante contiene, una repetición invertida, un ADN que sirve como molde para la replicación de la primera hebra de ADNtb, un sitio cebador apropiado para que el molde inicie la síntesis de ADN en la orientación opuesta y cuando sea necesario, la segunda hebra del ADN progenitor y otros componentes descritos más adelante.

La invención proporciona un procedimiento para sintetizar una molécula de ADN monocatenario (ADNmc) novedoso. La molécula comprende una estructura en tallo-bucle (ADNtb) cuyo tallo está constituido por ADN bicatenario de bases complementarias emparejadas dentro del ADNmc. Dicho tallo forma en un extremo las regiones terminales 5' y 3' de la molécula de ADNmc y en el otro extremo, un bucle monocatenario de ADN que une los extremos opuestos del ADN bicatenario. El procedimiento se lleva a cabo en un sistema que contiene los componentes convencionales para la síntesis de ADN y los siguientes componentes:

(a) un molde de ADN que contiene un sitio cebador apropiado y una repetición invertida (RI) corriente abajo de dicho sitio cebador,

(b) un cebador para el molde que permita iniciar la polimerización del ADN, y

(c) una ADN polimerasa para replicar el ADNtb a partir del molde.

El procedimiento comprende las siguientes etapas:

(1) unir el cebador al molde de ADN para permitir que comience la polimerización de ADN,

\newpage

(2) sintetizar el ADNmc desde el cebador usando una de las dos hebras de ADN bicatenario como molde, y de ese modo formar una hebra, continuar la síntesis de ADN de la hebra dentro de la secuencia RI y permitir que cese la síntesis dentro de la secuencia RI,

(3) permitir que dentro de la hebra recién sintetizada, las bases complementarias se emparejen en la secuencia RI para formar un bucle de una región no bicatenaria en un extremo, y una región bicatenaria, actuando la región bicatenaria como sitio cebador para continuar la síntesis de ADN,

(4) reanudar la síntesis de ADN usando como molde la hebra recién sintetizada y/o la otra hebra de ADN,

(5) formar el ADNtb, y

(6) separar y aislar el ADNtb.

El procedimiento se lleva a cabo en un sistema que contiene todos los componentes convencionales necesarios para la síntesis de ADN. Estos componentes pueden estar presentes intrínsecamente, como cuando el procedimiento se lleva a cabo in vivo; normalmente, se introducirán en el sistema cuando el procedimiento se lleva a cabo in vitro.

El procedimiento requiere la presencia de un ADN que tiene un sitio cebador apropiado y una repetición invertida corriente abajo del sitio cebador. El ADN sirve como molde para dirigir la replicación del ADN. El cebador puede ser cualquier oligonucleótido (tanto cuando ocurre naturalmente, como cuando se produce sintéticamente) que sea capaz de actuar para iniciar la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácidos nucleicos. El procedimiento de iniciación de las hebras de ADN es, por supuesto, bien conocido (véase Watson, Molecular Biology of the Gene, 3ª Ed., W. A. Benjamin, Inc.; DNA Synthesis: Present and Future, Molineux y Kohlyama, Eds.,(1977) V Parte, "G4 and ST-1 DNA Synthesis In Vitro" por Wickner; VII Parte, "DNA Synthesis in Permeable Cell Systems from Saccharomyces cerevisiae" por Oertel y Goulian). Diferentes polimerasas pueden contribuir a la síntesis de la segunda hebra, a diferencia de aquellas que contribuyen a la síntesis de la primera hebra. El cebador puede ser un cebador ADN o un cebador ARN. La síntesis se induce en presencia de nucleótidos y un agente de polimerización, tal como la ADN polimerasa a la temperatura y pH adecuados.

El procedimiento de la invención usa un agente para la polimerización tal como un enzima, que cataliza la síntesis de la hebra a lo largo del molde. Los enzimas apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, cualquier ADN polimerasa como la ADN polimerasa I o III de E. Coli, el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. Coli, la ADN polimerasa T4, la ADN polimerasa T7, la transcriptasa inversa (TI), polimerasas virales, incluidas las enzimas resistentes al calor. Es apropiada cualquier polimerasa que reconozca su sitio de iniciación para la replicación del ADN. Generalmente, cuando el proceso tiene lugar in vivo, los elementos genéticos estarán presentes, si no es así o si se realiza in vitro, serán añadidos al sistema.

Cualquier polimerasa que reconozca su sitio de iniciación puede causar o contribuir a la polimerización. Aunque los autores no desean ceñirse a ninguna teoría en particular por el momento, no debe excluirse que la polimerasa que contribuyó a la síntesis de ADN de la primera hebra también contribuya a sintetizar la otra o la segunda hebra de ADN. Por lo tanto, el procedimiento proporciona la continuidad en la síntesis de la segunda hebra hasta que termina en el extremo 3', más allá del extremo 5' de la primera hebra formada. De esta manera se forma el tallo bicatenario del ADNtb.

Existe información disponible sobre las ADN polimerasas. Por ejemplo, véase Kornberg, en DNA Replication (W. H. Freeman y Compañía, San Francisco, CA, 1980), pág. 101-166, Capítulo 4, DNA Polymerase I of E. coli, Capítulo 5, Other Procaryotic Polymerases, Capítulo 6, Eucaryotic DNA Polymerases y Capítulo 7.

Pueden considerarse otras polimerasas, tales como aquellas que son útiles para la síntesis de la segunda hebra en el ADNc.

En un ejemplo específico que se describe más arriba, se postula que son dos las polimerasas: ADN polimerasa III y polimerasa I.

Cuando se quiera replicar una secuencia de ácidos nucleicos deseada o diana, que es capaz de codificar una proteína, por ejemplo, un gen como parte del ADNtb sintetizado, la secuencia se colocará corriente arriba de la RI. Por ejemplo, cuando la replicación tiene lugar en un vehículo de replicación como es un vector, por ejemplo, pUCK106, que tiene un origen de replicación (OR), la secuencia de ácidos nucleicos diana se colocará entre la RI y el OR.

El procedimiento de la invención usa un fragmento de ADN bicatenario que tiene, como se ha descrito, un sitio cebador y también una repetición invertida (RI), es decir, dos copias de una secuencia idéntica presente en orientación inversa. La RI puede estar presente como una secuencia o "palíndromo".

Como se describirá en lo sucesivo, se preferirá ciertos enzimas frente a otros, tal como la TI cuando se desea favorecer la introducción de puntos de mutación al azar en una secuencia de ácidos nucleicos.

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La síntesis de la primera hebra avanza a modo de contagio a lo largo del molde de ADNbc atravesando la RI, lo que da lugar a la replicación de todo el genoma del plásmido. A una cierta frecuencia, la síntesis de la hebra de ADN se detiene dentro de la IR, formando una región corta de secuencia complementaria a sí misma, forma un bucle y la secuencia se hibrida consigo misma en la RI. Esta región bicatenaria dentro de la hebra recién sintetizada es reconocida como el sitio cebador por la segunda o la otra hebra. La síntesis de la segunda hebra comienza usando como molde la primera hebra formada y/o la otra hebra progenitora del ADN. Por tanto, se cree que tiene lugar una cambio de molde.

A medida que la polimerasa va incorporando nucleótidos para sintetizar la segunda hebra, se forma el tallo por el emparejamiento de las bases complementarias, lo que da lugar a su estructura bicatenaria con complementariedad interna.

La síntesis de la segunda hebra avanza a todo lo largo, pasando el primer nucleótido de la primera hebra sintetizada a través del cebador RNA de esta primera hebra, que finalmente se degrada, de este modo proporciona un extremo 3' saliente. En un ejemplo concreto, se cree que la síntesis de ADN termina en el sitio terH por un mecanismo similar al descrito en Dasgupta y col., Cell, 51, 1113 (1987).

Mediante manipulación adecuada de la longitud del extremo 3' saliente se puede controlar, por ejemplo, el alargamiento, moviendo el sitio terH corriente abajo del sitio cebador.

Además, en lugar de un tallo con un extremo 3' saliente, se considera factible bloquear la síntesis de la segunda hebra antes del final de la primera hebra colocando un sitio de terminación apropiado, por ejemplo, terH corriente arriba del sitio cebador. De esa manera, se contempla que cualquier hebra pueda ser más larga mediante una longitud predeterminada con respecto a la otra.

A medida que cesa la síntesis de la segunda hebra, el molde y el ADNtb formado se separan.

El procedimiento de la invención se puede repetir en ciclos tan a menudo como se desee. Si alguno de los componentes necesarios comienza a agotarse, se van reponiendo a medida que vaya siendo necesario.

Cuando el procedimiento de la invención tiene lugar in vivo, se proporciona un vehículo de replicación competente apropiado que contiene el fragmento de ADN molde necesario, que tiene un sitio cebador y una RI corriente abajo del sitio cebador. El fragmento de ADN que contiene la RI se insertará normalmente dentro de un sitio de restricción único en una secuencia "poliligador". Se ha usado un plásmido en el cual el "poliligador" tiene una RI (y sitios de restricción simétricos). Cuando no esté presente de forma inherente, se proporcionará un cebador a la secuencia de ADN; la polimerasa puede ser autóctona del vehículo o no. El vehículo contendrá todos los demás elementos necesarios para la replicación y la formación de los ADNtb.

A partir de lo dicho anteriormente se entenderá que cualquier vector autorreplicante que contiene un fragmento de ADN que sirva como molde, una secuencia RI, los elementos necesarios para iniciar y continuar la replicación de la hebra que formará el ADNtb, es adecuado para sintetizar de los ADNtb.

El procedimiento de la invención proporciona los ADNtb-mc. Estas estructuras ya se han descrito hasta este punto. En lo sucesivo se proporciona una descripción adicional.

La estructura que se ha denominado "tallo-bucle" o "ADNtb" es monocatenaria. En la Fig. 4E y Fig. 6 se muestra una ilustración de un ADNtb (procedente de pUCK106 y pUC7, respectivamente).

Los ADNtb típicos contienen un tallo bicatenario de bases complementarias emparejadas, y un tallo de una sola hebra conectando las dos hebras del tallo. El hecho de que el bucle sea monocatenario es otra característica interesante de los ADNtb de la invención. Los ADNtb pueden incluir un bucle de una secuencia muy corta de nucleótidos u otras considerablemente más largas. Los ADNtb pueden contener una secuencia de nucleótidos de una longitud que justo permita formar el bucle y el emparejamiento de bases para formar una doble hebra corta. El tamaño mínimo debería permitir el emparejamiento de suficientes bases para proporcionar un sitio cebador para iniciar la síntesis de la segunda hebra. El tamaño mínimo del bucle puede estar limitado por la tensión en las bases que impediría su emparejamiento en una estructura estable. El tamaño máximo está influenciado por el uso propuesto para los ADNtb. El bucle ilustrado en la Fig. 4B está constituido por cuatro bases; se pueden concebir bucles de 10, 20 o más bases. El hecho de que el bucle sea monocatenario es una característica que puede resultar bastante útil en las aplicaciones propuestas para los ADNtb.

Otra estructura interesante pensada para los ADNtb son los ADNtb dobles. En esta estructura, los extremos libres de las hebras simples de dos ADNtb se unen. Se espera que la estructura sea extremadamente estable. Es probable que sometidos a condiciones que normalmente desnaturalizan los ADN, estos ADNmc se tiendan hacia su estructura original. La unión de las hebras se llevará a cabo por procedimientos convencionales con ADN y/o ARN ligasas. Tales estructuras pueden contener genes seleccionados para codificar proteínas y, por lo tanto, proporcionan nuevas posibilidades prácticas interesantes.

Se cree que la estabilidad, que es una propiedad importante de los ADNtb, tiende a aumentar con colas dobles más largas; por tanto, tales estructuras se favorecen cuando ésta es una propiedad a enfatizar. Debería destacarse que todos las ADNtb generados a partir de un único vehículo de replicación no son, necesariamente, de tamaño idéntico. En el ejemplo mostrado más arriba, ADNtb procedentes de pUCK106, el extremo5' de la primera hebra parece ser heterogéneo, algunas hebras comienzan desde la posición +1 (que corresponde con el origen de replicación ColE1)(véase Tornizawa y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1865 (1977)), mientras otras hebras comienzan desde -1, +2 y +3.

Puede destacarse que la presencia de uno o más emparejamientos incorrectos en el fragmento de ADN más allá de las RI no afecta de manera adversa la síntesis ni la estructura de los ADNtb. Esto se ilustra con el emparejamiento incorrecto T por G, en este caso 25 nucleótidos después del centro del palíndromo (véase Fig. 1B). Este emparejamiento incorrecto se reparó en la síntesis de los ADNtb.

Aquí se proponen varias aplicaciones para los ADNtb producidos por el procedimiento de la invención que se benefician del saliente de ADNmc de un extremo de la cola sobre el otro. Por lo tanto se apreciará que ésta es una característica importante de las nuevas estructuras de la invención.

La síntesis de los ADNtb en el plásmido ilustrado describe el mejor modo de la invención. Sin embargo, cualquier vector que contenga secuencias RI y otros componentes descritos aquí, es apropiado para la síntesis de ADNtb.

La RI es un estructura que ocurre frecuentemente en procariotas y eucariotas. Cualquiera de tales RI se puede usar en la invención. Las secuencias RI también se pueden preparar sintéticamente. Un ejemplo es la RI sintetizada que se muestra en la Fig. 1B.

Las secuencias de RI o secuencias palíndromo se han obtenido a partir de E. Coli (Gilson y col., Nucl. Acids Res., 18, 3941 (1990); Gilson y col., Nucl. Acids Res., 19, 1375 (1991) informaron sobre las secuencias palíndromo de E. Coli y Salmonella entérica (una secuencia palíndromo de 40 nucleótidos de longitud). Chalker y col. Gene, 71, (1):201-5 (1988) informaron sobre la propagación de un palíndromo de 571pb en E. Coli; Lewis y col., J. Mol. Biol. (England), 215, (1):73-84 (1990) informaron de la existencia de repeticiones invertidas en el Bacilo subtilis (una repetición de 26 pares de bases), y Saurin, Comput. Appl. Biosci., 3, (2):121-7 (1987) trata el uso de un nuevo programa de ordenador para buscar sistemáticamente estructuras palíndromo repetitivas en E. Coli. Las siguientes patentes de Estados Unidos describen secuencias palíndromo: 4.975.376; 4.863.858; 4.840.901; 4.746.609; 4.719.179; 4.693.980 y 4.693.979.

Se han definido palíndromos para incluir secuencias repetitivas invertidas en las cuales casi la misma (no necesariamente la misma) secuencia se extiende en dirección opuesta. Aunque algunas son cortas (3-10 bases en una dirección), otras son mucho más largas, comprendiendo cientos de pares de bases (véase Watson, Molecular Biology of the Gene, 3ª Ed., pág. 224-225).

El tamaño de la RI en el fragmento de ADN puede variar considerablemente. Sin intención de limitarse, se pueden considerar ADNtb con repeticiones invertidas de 10 a 30 o nucleótidos más largos. Se ha informado de la existencia de repeticiones invertidas que contienen más de 300pb (véase Current Protocols, Sección 1.4.10).

Los ADNtb pueden ser el producto de la síntesis de hospedadores procariotas o eucariotas (por ejemplo, células bacterianas, de mamíferos y levaduras).

Ejemplos de vectores apropiados, tal como son un plásmido y una célula hospedadora transformada, son bien conocidos para alguien experto en la materia. Entre los hospedadores apropiados para plásmidos que contengan los componentes necesarios, están procariotas y eucariotas. Loa procariotas incluyen microorganismos tales como aquellos del género Eschrichia, en particular E. coli; del género Bacillus, en particular B. Subtilis.

Los plásmidos capaces de transformar E. Coli incluyen, por ejemplo, los plásmidos del tipo pUC y ColE1 (véase Patente de Estados Unidos nº 4.910.141). Los plásmidos capaces de transformar E. Coli incluyen, por ejemplo, plásmidos del tipo ColE1 en general. Otros plásmidos apropiados para transformar E. Coli incluyen: pSC101,pSF2124, pMB8, pMB9, pACYC184, pACYC177,pCK1, R6K, pBR312, pBR313, pML2, pML21, ColE1AP, RSF1010, pVH51 y VH153.

Los plásmidos capaces de transformar B. Subtilis.

incluyen: pC194, pC221, pC223, pUB112, pT127, pE194, pUB110, pSA0501, pSA2100, pTP4, pTP5 y sus derivados. Los plásmidos capaces de transformar ambos, B. Subtilis y E. Coli, se describen en J. Bacteriol., 145, 422-428 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1433-1436(1978) y en Principles of Gene Manipulation 2ª Ed., Carr y col. Eds., University of Ca. Press, Berkeley, 1981, pág. 48.

Los plásmidos capaces de transformar S. cerevisiae (pMP78, YEp13, pBTl1, pLC544, YEp2, YRp17, pRB8 (Ylp30), pBTI7, pBTI9, pBTI10, pAC1, pSLeI, pJDB219, pDB248 y YRp7) son de especial interés por llevar a cabo la síntesis de ADNtb en eucariotas. También son a tener en cuenta YIp5, pUC-URA3, pUC-LEU2 y pUC-HIS3. Véase la página 285 y páginas 373-378 en Methods in Enzymology, Vol. 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology" editada por Guthrie y Fink (1991), Academic Press, Inc. Otras levaduras vectores se describen en las páginas 100-104 de Experimental Manipulation of Gene Expression, editado por Masayori Inouye, Academic Press, Inc. (1983).

Además, son de particular interés unos vectores sutiles que se pueden usar para transformar E. Coli así como levaduras como S. Cerevisiae. Tales vectores incluyen los siguientes: pKB42 y pYC1. Otros ejemplos se citan en la sección "Cosmid Vectors for Low and Higher Eucaryotes" en A Practical Guide to Molecular Cloning, 2ª Edición por Bernard Perbal (1988), Wiley e hijos. Otros vectores apropiadas se describen en el Vol. 2, Secciones 13.4.1., 13.4.2. (1989), Current Protocols. Otros vehículos apropiados incluyen vectores multicopia tan populares como Yep24 (Botstein y col., Gene, 8, 17 (1979)) y pJDB207 (Beggs, Genetic Engineering (Ed. Williamson), Vol. 2, pág. 175, Academic Press (1982)). Otros que pueden seleccionarse incluyen plásmidos de la las clases YIp, como YEp51 y YEp52.

pSVL y pSKV-10 son ejemplos de vectores eucariotas disponibles comercialmente para llevar a cabo la presente invención en, por ejemplo, COS, CHO y células HeLa. Otros ejemplos se citan en A Practical Guide to Molecular Cloning.

El cultivo y fermentación de los hospedadores transformados se lleva a cabo por procedimientos estándar y convencionales conocidos en el área. Véase por ejemplo, Methods in Enzymology, Vol. 185, Gene Expression Technology (Goeddel, editor) 1990 (en particular, Growth of Cell Lines); para levaduras, véase Methods in Enzymology, Vol. 194, "Guide to Yeast Genetics & Molecular Biology"; las condiciones de crecimiento para E. coli se describen en Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, páginas 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3, 1.1.4 y 1.3.1. y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición en la página 1.21 y la purificación de ADN plasmídico se describe en la página 1.23, las condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento de células de mamífero se describen en Current Protocols, Vol. 1 y 2 en las páginas 9.0.4- 9.0.6., 9.1.1., 9.1.3., 9.2.5., 9.4.3., 11.5.2., 11.6.2. y 11.7.3.

En resumen, cuando los componentes necesarios para la iniciación y la síntesis de la primera hebra sencilla se suministran en un vector replicante, es decir, un fragmento de ADN molde con un sitio cebador y una RI (y la polimerasa(s)), se espera que se forme un ADNtb.

Cuando la síntesis de los ADNtb producidos por el procedimiento de la invención se realiza in vitro, la síntesis tendrá lugar en un medio que incluya componentes convencionales para la síntesis de hebras de nucleótidos usando el fragmento de ADN como molde. Generalmente, la síntesis tendrá lugar en una solución acuosa tamponada, preferiblemente a un pH de 7-9. Preferiblemente, un exceso molar de los nucleótidos sobre la hebra de ADN molde. Los desoxirribonucleótidos trifosfato, dATP, dCTP, dGTP y dTTP, son también un componente de la mezcla de síntesis. A estos componentes se les denomina "componentes convencionales", para el propósito de la invención aquí descrita.

La síntesis de oligonucleótidos se puede llevar a cabo por diversos procedimientos incluyendo aquellos revelados en la Patente de Estados Unidos nº 4.415.734 y en Matteuci y col. J. Am. Chem. Soc., 103 (11):3185-3191 (1981), Adams y col. J. Am. Chem. Soc., 105 (3):661-663 (1983), y Bemcage y col., Tetrahedron Letters, 22 (20):1859-1867 (1981).

Los procedimientos de la presente invención hacen uso de técnicas o ingeniería genética y clonación molecular. Técnicas generales de ingeniería genética y clonación molecular se incluyen en Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Laboratorio "Cold Spring Harbor", 1990, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2ª Ed., Bernard Perbal (1988), Methods in Enzymology, Volumen 68, Recombinant DNA (Wu, editor), Academic Press, N.Y., 1979, Methods in Enzymology, Vol. 185, Gene Expression Technology (Goeddel, editor) 1990, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 2 y 3.

Los ADNtb producidos por el procedimiento de la invención tienen varias aplicaciones interesantes. El procedimiento de la invención se puede usar para provocar mutaciones al azar en genes seleccionados. Tal sistema se ilustra en al Fig. 7, que muestra el gen para la \beta-galactosidasa en un vector transformado.

El procedimiento comprende: sintetizar un ADNtb que contiene un gen de interés localizado en el tallo; aislar el ADNtb; cortar el gen del ADNtb,; clonarlo en un vehículo replicante apropiado; y expresar la proteína codificada por el gen. Las proteínas se pueden analizar para la actividad deseada. Se pueden aplicar las colonias una prueba de detección sistemática, mediante procedimientos estándar, para identificar aquellas con los genes mutados.

Un ejemplo para generar e identificar mutaciones tiene lugar como sigue. Dentro de pUCK109 (véase Ejemplo 1), que contiene el gen lacZ, hay ligado un fragmento de ADN de 215pb que contiene la RI de 35pb (descrito en el Ejemplo 1) entre el fragmento de ADN y el OR (como muestra el Ejemplo 1): etapa 1. El plásmido es transformado en E. coli CL83 que se cultiva bajo condiciones estándar. Durante el crecimiento celular, se produce ADNtb en el que se incorporan mutaciones. A partir de entonces, el gen lacZ se aísla e inserta dentro de pUCK19 (sin el fragmento IR); Etapa 2. Se digiere pUCK19 con Kas I y EcoRI; Etapa 3. el gen lacZ mutado resultante se liga entonces dentro de PUC 19, que contiene el gen lacZ y el gen de resistencia a la ampicilina, y que se ha digerido previamente con Kas I y EcoRI; etapa 4. Finalmente, el gen lacZ aislado es transformado en E. coli CL83.

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La frecuencia de mutación se puntúa con el conocido análisis in vivo que usa \beta-gal, un substrato sin color, que es hidrolizado para dar una producto azul oscuro. Cuando las colonias no tienen color, esto indica que no se ha producido \beta-galactosidasa.

Se pueden usar para la prueba de detección sistemática otros genes de la familia del gen lac, por ejemplo, lacY o lacA, u otros genes apropiados. El gen que codifica la proteína (o polipéptido) de interés también puede usarse para determinar la frecuencia de mutaciones y para la selección del gen apropiado que codifica la proteína derivada (o polipéptido).

Este procedimiento de detección sistemática permite la selección de otras polimerasas que introducen o aumentan con mayor probabilidad la tasa de mutación en el gen diana. Así, un gen seleccionado, tal como el gen lacZ, se puede usar como el gen de detección sistemática. La transcriptasa inversa, conocida por tener una menor fidelidad de replicación, parece ser una enzima de elección para este propósito, introduciendo mutaciones en el gen diana que codifica una proteína deseada.

Entonces, la proteína(s) diana deseada se expresa mediante un hospedador transformado seleccionado que porta el gen mutado y que se seleccionó por sus propiedades biológicas deseadas.

Se cree que la frecuencia de mutación puede modificarse mediante la selección de enzimas apropiados que se sabe que tienen una menor fidelidad de replicación. De este modo, cuando se amplifican fragmentos de ADN diana o genes, el sistema depende del grado de fidelidad o infidelidad de la replicación, que es, la frecuencia de error producida por las ADN polimerasas al replicar el fragmento de ADN o gen insertado. Así, por cada error de replicación, se introducen mutaciones al azar en los genes. Cuanto mayor sea el grado de infidelidad de la ADN polimerasa, mayor será el número de mutaciones, y viceversa.

En la forma de realización de la invención ilustrada más arriba, en la que se cree que PoIII y PoI fueron activos, se espera que el primero tenga menos fidelidad, puesto que se sabe que PoI tiene una función autocorrectora. De este modo, la fidelidad en la replicación se puede regular mediante la selección apropiada de ADN polimerasas. Generalmente, se cree que las mutaciones al azar son introducidas con mayor probabilidad por la polimerasa que sintetiza la segunda hebra. La TI sería un candidato interesante.

Los genes que portan la mutación(es) deseada son útiles en el entrecruzamiento cromosómico. Por este procedimiento se puede hacer que los genes de interés, o los ADNtb portadores del gen mutado de interés, integren o intercambien información genética de una molécula similar a otra. El gen mutado coloca dentro del genoma una secuencia que es similar a la secuencia del vector y el gen homólogo es replicado por el gen mutado.

De esta manera se pueden generar nuevas cepas de microorganismos (u hospedadores) que contienen el gen mutado y que expresarán una proteína deseada. Los ADNtb portadores de genes mutados se pueden producir in vivo o in vitro.

La reacción en cadena de la polimerasa (RCP) es un procedimiento rápido para la replicación enzimática in vitro de un segmento específico de ADN. El procedimiento de RCP estándar requiere un segmento de ADN bicatenario para ser amplificado, y siempre, dos oligonucleótidos monocatenarios cebadores flanqueando el segmento, una ADN polimerasa, desoxiribonucleótidos trifosfato apropiados, un tampón y sales (véase Current Protocols, Sección 15).

El ADNtb-mc producido por el procedimiento de la invención se puede amplificar con un único cebador. Esta característica simplifica considerablemente la amplificación, ayuda a superar el problema de que un cebador encuentre su sitio de unión adecuado, hace el proceso más económico y ayuda a superar problemas asociados con el procedimiento de RCP tradicional.

La amplificación del ADNtb comprende la desnaturalización del ADNtb para formar un ADN monocatenario (desde el extremo 3' al 5'). La reacción sigue la secuencia normal: iniciación desde el extremo 3', reacción de la polimerasa, desnaturalización e hibridación. Se llevan a cabo 25 ciclos, lo que da lugar a una amplificación del ADNtb de un millón de veces. El ADNtb puede portar un gen para codificar una proteína diana.

Una revisión reciente en Science, 252, 1643-1650 (21 Junio, 1991) titulado "Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction" por Erlich y col, trata los problemas asociados con cebadores y las mejoras que se han ido proponiendo para el procedimiento de la RCP.

Por consiguiente, un procedimiento para la amplificación de las estructuras ADNtb-mc de la invención mediante un procedimiento que usa un cebador, es de gran interés. El ADNtb podría contener un gen de interés, tal como un gen mutado que tenga propiedades biológicas mejoradas.

La producción in vivo de los ADNtb de la invención se puede manipular de tal manera que proporcione una secuencia deseada. Los ADNtb así producidos pueden usarse, por lo tanto, como ADN antisentido.

Una utilidad fascinante que se ha considerado, es la papel que pueden jugar los ADNtb de la invención en la formación de hélices triples de ADN, o ADN tricatenario, y las nuevas estructuras ADNtb tricatenarias resultantes. Una revisión reciente Science, 252, 1374-1375 (27 Junio, 1991), "Triplex DNA Finally Comes of Age", destaca la oportunidad de la presente invención. El ADN tricatenario se puede formar por la unión de una tercera hebra a sitios de reconocimiento específicos en el ADN cromosómico. Se habla de hebras sintéticas de tamaños que contengan, preferiblemente, el complemento de bases total (tal como 11-15 y mayor). Los ADNtb producidos por el procedimiento del la invención, con extremos 3'(o 5') largos (y el bucle de bases no bicatenario), podrían ser candidatos excelentes. El ADN tricatenario resultante se espera que tenga una mayor estabilidad y utilidad. En la revisión se proponen nuevas terapias basadas en la formación de la triple hélice, incluso en la terapia del SIDA y la inhibición selectiva de genes y otras.

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Patente de Estados Unidos nº 4.415.734

Matteuci y col. J. Am. Chem. Soc., 103 (11):3185-3191 (1981)

Adams y col. J. Am. Chem. Soc., 105 (3):661-663 (1983)

Bemcage y col., Tetrahedron Letters, 22 (20):1859-1867 (1981).

Methods in Enzymology, Volumen 68, Recombinant DNA (Wu, R., editor), Academic Press, N.Y., 1979

Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1, 2 y 3

Current Protocols, Sección 15

Science, 252, 1643-1650 (21 Junio, 1991) titulado Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction por Erlich y col.

Science, 252, 1374-1375 (27 Junio, 1991), "Triplex DNA Finally Comes of Age".

INFORMACIÓN GENERAL

: SOLICITANTE: Universidad de Medicina y Odontología de Nueva jersey

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: TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento para la síntesis de ADN tallo-bucle monocatenarios, sus productos y usos

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: NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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: DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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: DESTINATARIO: Cabinet Beau de Lomenie

: CALLE: 55, Rue d'Amsterdam

: CIUDAD: París

: PAÍS: Francia

: CP: 75008

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: FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR

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: TIPO DE MEDIO: disquete

: ORDENADOR: Ordenador personal (PC) compatible con IBM

: SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

: PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin Release #1.0, Versión #1.25

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: DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR

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: NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/753.111

: FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de agosto de 1991

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: INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/ABOGADO

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: NOMBRE: Gillard, Marie-Luise

: REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: MLG.MHC/J16983-3

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: INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

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: TELÉFONO: 42 80 64 68

: TELEFAX: 48 74 37 60

: TELEX: 650476F

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INFORMACIÓN SOBRE LA SEC. ID Nº1:

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: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: Longitud: 215 pares de bases

: Tipo: ácido nucleico

: Tipo de hebra: doble

: Topología: desconocida

: TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

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: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº:1:

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2

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INFORMACIÓN SOBRE LA SEC. ID Nº2:

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: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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: Longitud: 18 pares de bases

: Tipo: ácido nucleico

: Tipo de hebra: sencilla

: Topología: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

: HIPOTÉTICA: No

: ANTI-SENTIDO: No

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: FUENTE PRINCIPAL:

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: CLON: cebador

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DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID Nº:2:

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3

Claims

1. Un procedimiento in vitro para sintetizar un ADN tallo-bucle (ADNtb), que comprende una hebra sencilla de ADN que tiene regiones terminales 5' y 3' y una repetición invertida que se pliega en una estructura que tiene un tallo bicatenario, formado por el emparejamiento de los miembros de la repetición invertida unidos en un extremo por un bucle monocatenario que tiene pares de bases no emparejadas y que tiene en el otro extremo las regiones terminales 5' y 3' del ADN monocatenario, tal procedimiento comprende estas etapas:

(a) proporcionar los componentes necesarios de la síntesis ADN polimerasa:

un ADN bicatenario, cuya hebra es un molde de ADN que contiene un sitio cebador y una repetición invertida corriente abajo de dicho sitio cebador,

un cebador para el molde que inicie la polimerización de ADN, y

una ADN polimerasa para replicar el ADNtb a partir del molde;

(b) unir el cebador al molde para iniciar la polimerización del ADN; y

(c) sintetizar el ADNtb comenzando desde el cebador; formar un ADN monocatenario usando una de las hebras dobles del molde de ADN como hebra progenitora; continuar la síntesis de ADN dentro de la secuencia con repetición invertida para formar una primera hebra; formar entonces una secuencia que sea complementaria a y se empareje consigo misma, formando por tanto otro sitio cebador, continuar la síntesis de ADN usando como un molde la hebra recién formada, o la otra hebra progenitora del ADN bicatenario, o ambas, para formar una segunda hebra, formando de esta manera el ADNtb monocatenario que comprende un tallo del ADNtb monocatenario de cadena doble de bases complementarias emparejadas, que comprende dicha primera hebra y dicha segunda hebra unidas en un extremo por un bucle de ADN monocatenario sin cadena doble y que tiene en el otro extremo las regiones terminales sencillas 5' y 3' del ADNtb y que aísla al ADNtb.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la síntesis de cualquiera de las dos hebras de ADN que forman el tallo del ADNtb se realiza continuando la síntesis hasta que una de las dos hebras es más larga que la otra.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la síntesis de ADN de la segunda hebra de ADN que forma el tallo del ADNtb, se detiene antes de que la segunda hebra sea más larga que la primera hebra.

4. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 3 en el que se proporcionan dos ADN polimerasas diferentes, una que sintetiza la primera hebra y otra que sintetiza la segunda hebra.

5. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el molde para la síntesis de la segunda hebra es la primera hebra sintetizada.

6. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el molde para la síntesis de la segunda hebra es la hebra del ADN bicatenario que no fue el molde para la síntesis de la primera hebra.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la síntesis se lleva a cabo en una célula procariota o eucariota que tiene un vector autorreplicante que comprende un ADN bicatenario, cuya hebra es un molde de ADN que contiene un sitio cebador y una repetición invertida corriente abajo de dicho sitio cebador.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que el vector es un plásmido.

9. El procedimiento de la reivindicación 8 en el que el plásmido es un plásmido Escherichia coli.

10. El procedimiento de la reivindicación 9 en el que el plásmido es pUCK106.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 en el que el plásmido comprende pUCK106 y un gen insertado para codificar una proteína cuyo gen se coloca entre el sitio cebador, que es un origen de replicación, y la repetición invertida.

12. El procedimiento de la reivindicación 11 en el que el gen es un gen lacZ.

13. El procedimiento de la reivindicación 8 en el que el plásmido tiene un sitio cebador para ADN polimerasa situado corriente arriba de la repetición invertida.

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14. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que se produce una familia de ADNtb aislados en la que los extremos 5' respectivos varían de tamaño.