JP4041098B2

JP4041098B2 - 一重鎖ステムループｄｎａの合成法

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Publication number: JP4041098B2
Application number: JP2004183298A
Authority: JP
Inventors: 淳大島; すみ子井上; 正順井上
Original assignee: ユニバーシティー・オブ・メディシン・アンド・デンティストリー・オブ・ニュージャージー
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 2004-06-22
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2023-01-30
Also published as: CA2073630C; EP0530112B1; JPH05308972A; US5643762A; DE69233106D1; EP1251169A1; EP0530112A2; JP2004261191A; ES2202301T3; CA2073630A1; JP3580561B2; EP0530112A3; DE69233106T2

Description

本発明は組換え体ＤＮＡの分野に関する。さらに詳しくは、本発明はステム−ループ配列（ｓｓ−ｓｌＤＮＡ）を有する新規で有用な一重鎖ＤＮＡの合成方法に関する。本発明はインビトロ及びインビボ合成方法に関する。さらに本発明はこれらのｓｓ−ｓｌＤＮＡを製造する複製ビークル（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅ）に関する。さらに、本発明はこれらの新規な構造物に関し、これらの新規な構造物の使用を開示する。さらに、標的蛋白質をコードする遺伝子を用いた、または用いないｓｓ−ｓｌＤＮＡ増幅方法をも開示する。

逆転写酵素によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写されるＲＮＡ中間体を介して、ゲノムの一部の重複が生ずることが判明している。この点については、ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）等のアン．レブ．バイオケム．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）５５，６３１（１９８６）を参照されたい。結果として遺伝情報が逆流することは真核ゲノムの進化の多様化に重要な役割を果すと考えられる。細菌由来の逆転写酵素が最近発見されたことを考慮すると、同様な機構が原核生物におけるゲノム進化の原因であるとみなされるのも非常にもっともなことだと思われる。この点についてはイノウエ（Ｉｎｏｕｅ）等のＴＩＢＳ、１６、１８（１９９１ａ）とイノウエ等による、アン．レブ．マイクロバイオル．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｉ）４５、１６３（１９９１ｂ）を参照されたい。逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成の結果生ずる遺伝子重複は進化中のゲノムの多様化に重要な役割を果していると考えられる。

本発明はゲノム進化に関連する基礎研究に伴って生じたものである。プラスミドＤＮＡの複製に特有のｓｓ−ｓｌＤＮＡの合成が実証された。ｓｌＤＮＡの形成は原核ならびに真核生物の染色体ＤＮＡ複製時に広く行われる。ＩＲ構造を伴う染色体遺伝子要素は、ＩＲ構造の安定性とポリメラーゼの性質によっては常にｓｌＤＮＡへと複製しやすいと考えられる。

反復遺伝子外パリンドローム塩基配列に対してはＲＥＰとして知られ、パリンドローム単位に対してはＰＵとして知られる多くの逆方向反復（ＩＲ）構造が存在する（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）中には約１０００コピー）ことが判明している〔ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）等のネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９８、７６０（１９８２）、ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）等、ＥＭＢＯ．Ｊ．３，１４１７（１９８４）及びギルソン等、ヌクル．アシドス．レス．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．）１９，１３７５（１９９１）〕。これらの構造はＤＮＡポリメラーゼＩを含む特定の細胞成分と会合して、染色体組織に重要な役割を果すと考えられる〔ギルソン等、ヌクル．アシドス．レス．１８、３９４１（１９９０）とギルソン等、ＥＭＢＯ．Ｊ．３、１４１７（１９８４）参照〕。ヒトゲノムの約６％がＡｌｕと呼ばれる要素によって占められ、Ａｌｕの転写生成物は実質的な第二構造を含むことが判明している〔シメット（Ｓｉｍｍｅｔｔ）等のジェイ．バイオル．ケム．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．）２６６、８６７５（１９９１）参照〕。

ｓｌＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成とは対照的にＲＮＡ中間体も逆転写酵素活性も必要としないので、ｓｌＤＮＡはｃＤＮＡよりも頻繁に形成される。従って、ｓｌＤＮＡはゲノム内に分散または再配置された遺伝子要素を重複させることによって、原核生物を真核生物の両方のゲノム進化においてｃＤＮＡと同様な、重要な役割を果すと考えられる。

本発明によって、基本的な発見がなされた。ゲノムの一部はゲノムから直接複製されることが判明した。判明したこの遺伝子重複はＲＮＡ中間体も逆転写酵素も必要とせず、ＤＮＡ複製中に生ずる。

簡単に説明すると、本発明は新規で有用な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の合成方法（又はプロセス）を提供する。この方法は一重鎖構造の合成を開始するために、ＤＮＡ逆方向反復（ＩＲ）と必要な成分との使用を含む。本発明はまた、ＤＮＡ逆方向反復を含む必要な成分からのこのようなｓｓＤＮＡの合成系をも提供する。本発明はさらに、新規なｓｓＤＮＡ分子の合成のための必要な成分の全てを含む適切な複製ビークルを提供する。本発明はまた特有の構造を形成する新規で有用なｓｓＤＮＡ分子をも提供する。この構造は相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなるステムを含み、ステムはその端部の一つにおいて２個の末端、それぞれ３′と５′末端を有し、他方の端部ではループ形成ｓｓＤＮＡを有する。

本発明はインビトロまたはインビボでの方法及び系の実施を含む。

本発明はまた改良された又は新規な生物学的性質を有する蛋白質を形成する目的で遺伝子にランダムな突然変異を起こさせる方法を含めて、新しい分子の種々な使用を開示する。他の重要な考えられる使用法は、本発明ｓｓＤＮＡ分子をＤＮＡに加えて、安定性の高い三重鎖ＤＮＡを形成することである。他の使用法は単一プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用である。

本発明とその幾つかの実施態様を下記でさらに詳述する。
本発明の方法によるとｓｓＤＮＡ内のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡのステム部分を含む構造を有するｓｓＤＮＡ分子が製造される。このステムはその端部の一つにおいてｓｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端部において２本のステム一重鎖を結合する非アニール塩基の一重鎖からなるループを形成する。特定の実施態様では、３′末端を端部に有する鎖は他方の鎖よりも長い。ｓｌＤＮＡは蛋白質をコードしうるＤＮＡセグメント、特に遺伝子を含みうる。遺伝子はループと末端との間に配置される。遺伝子は突然変異を有する遺伝子でありうる。

ｓｌＤＮＡ合成に対して仮定される機構を図６のＡと図６のＢに示す。この合成は概略的に下記の過程を含むと考えられる：ＤＮＡの合成は複製開始部位にて始まり、第１鎖（または“特定”もしくは“不特定”鎖）の複製は２本鎖ＤＮＡの鎖の一方を鋳型として進行する（染色体ＤＮＡの複製と同じ機構によって）〔トミザワ（Ｔｏｍｉｚａｗａ）等、プロク．ナトル．アカド．サイ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７４、１８６５（１９７７）参照〕、そしてプラスミドを用いる場合には、ＩＲ構造を通しての進行は全プラスミドの複製を生ずる。しかし、以下で詳述するように、第１鎖合成が中断するかまたはＩＲ内で終了した場合に、第１鎖の一部はループ構造を形成する（図６、工程２〜３）。このループは連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能する短い二重鎖部分を形成する。ＤＮＡ鎖伸長は新たに形成された３′端部から再開し、テンプレートとして発生期の第１鎖を用いて第２鎖（または“他方の”鎖）を形成する。代替えの（または同時発生の）考えられる合成過程は以下で説明する。このようにして、テンプレート切換えによってＤＮＡ合成方向は逆になり、ＤＮＡフラグメントを二重にする（図６、工程１〜４）。新しく合成されたｓｌＤＮＡ分子は親テンプレート鎖から解離され、親テンプレート鎖は他の複製ラウンドを受けて他のｓｌＤＮＡを形成する。ｓｌＤＮＡを必要に応じて単離して精製する。

本発明の他の実施態様では、ＤＮＡ自己複製ビークル（ｓｅｌｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅ）、例えば逆方向反復（ＩＲ）構造を含むＤＮＡフラグメントを挿入されたプラスミドを提供する。このＤＮＡフラグメントはｓｓＤＮＡ合成のテンプレートとして、及び適当なプライミング部位、例えば大腸菌におけるＣｏｌＥ１の複製始点として働く。ＩＲはＯＲの下流に存在する。自己複製ビークルは適当なホスト（例えば大腸菌）中で複製される。ホストは少なくとも１種のポリメラーゼを含んでテンプレートからｓｓＤＮＡを合成する。この特定の実施態様では、２種のポリメラーゼ、ＯＲからＩＲまでのｓｓＤＮＡ部分、第１鎖の伸長に寄与する第１ＤＮＡポリメラーゼと、ｓｓＤＮＡ鎖の残部もしくは第２鎖を合成する第２ＤＮＡポリメラーゼが存在すると推定される。第１鎖の合成が終了すると、相補的塩基がアニールされて一重鎖非アニールループを形成する。その後に第２鎖の合成が行われる。二重鎖ＤＮＡステムと反対端部の一重鎖ループ構造とからなる、新しいＤＮＡ構造が合成される。この新しいＤＮＡ構造に対して“ステム−ループ”または“ｓｌＤＮＡ”なる名称が設けられている。

他の特定の実施態様はプロモーター、特にｌａｃプロモーター−オペレーターが欠如した複製ビークルを提供する。それでもなお、以下で詳述するように、提案した合成モデルを支持して、ｓｌＤＮＡが製造された。

プライミング部位とＩＲとの間の蛋白質をコードしうる特定のＤＮＡ配列を含むようにプラスミドを構成することができ、合成されたｓｌＤＮＡはＤＮＡ塩基配列またはその突然変異を含むと考えられる。

本発明のｓｌＤＮＡは自己複製ビークルによって合成される必要はなく、ＩＲと、ｓｓＤＮＡ合成に必要な要素とを含む、線状もしくは非線状のＤＮＡセグメントから構成される適当なインビトロ系で合成されることができる。このような系を以下で説明する。

図１は本発明のプラスミド、ｐＵＣＫ１０６の説明図である。
図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａＩ部位に挿入された２１５−ｂｐのＤＮＡ塩基配列を示す。
図３はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成とその特徴とを説明するポリアクリルアミドゲルの臭化エチジウム染色を示す。
図４はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマー形成を説明するポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。
図５はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ塩基配列決定を説明する図である。
（Ａ）はｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
（Ｂ）はｓｌＤＮＡのループ部分の５′端部塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
（Ｃ）はｓｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
（Ｄ）はｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩基配列の乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
（Ｅ）はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの構造を説明する。
図６はｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデルを説明する図である。
図７のレーン１と３はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅＩＩＩ消化体（ｄｉｇｅｓｔ）を示し、レーン２はｐＵＣ７からのｓｌＤＮＡを示す。
図８はｓｌＤＮＡを利用して、特定の遺伝子にランダムミューテーションを導入する具体例を示す。

プラスミドｐＵＣＫ１０６はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受け入れ番号Ｎｏ．６８６７９として寄託されている。
プラスミドｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯはＡＴＣＣによって受け入れ番号Ｎｏ．６８６８０として寄託されている。

実施例
下記実施例は説明のためのものであり、本発明の如何なる限定をも意図しないものである。これらの実施例では、全ての％は固体では重量％であり、液体では容量％であり、全ての温度は、他の注釈しないかぎり、摂氏度によるものである。
便利さと簡潔さのために、実施例は図面に関連し、図面の詳細な説明を提供する。

実施例１
図１はｐＵＣＫ１０６（円形マップ）、以下に示すように製造した特定のプラスミドを説明する。円形マップ中の白抜きバー（ｏｐｅｎｂａｒ）はカナマイシン耐性遺伝子（Ｔｎ５）からを表す。上部右側に示す直線白抜きバーはＸｂａＩ部位に挿入した２１５−ｂｐＤＮＡフラグメントを表し、これは３５−ｂｐ逆方向反復（ＩＲ）塩基配列を示す。中実矢印（ｓｏｌｉｄｏｒｒｏｗ）はＩＲ構造を示す。中実円設定は複製の始点（Ｏｒｉ）である。長い白抜き矢印ＯＲからのＤＮＡ複製の方向を示す。小さい白抜き矢印はｌａｃプロモーター−オペレーター（ｌａｃＰＯ）の位置を示す。
図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａＩ部位に挿入された、配列表の配列番号１及び配列番号２でそれぞれ表されるＤＮＡより構成される２１５−ｂｐＤＮＡフラグメントの塩基配列を示す。このプラスミドはここではｐＵＣＫ１０６と名づける。白抜き矢印はＩＲ塩基配列を示す。ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）部位はＩＲの中心を示す。
ＩＲ中の不適正位置はスペース内に挿入された不適正塩基ＣとＴを含む矢印内の２個の白抜きスペースによって示す。
上記ＤＮＡフラグメント（ＩＲを含む）は図２に示された配列を有する。

実施例２
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成とその特徴とを説明する。
（Ａ）大腸菌ＣＬ８３をｐＵＣＫ１９、ｐＵＣＫ１０６のいずれかとｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ^ＰＯとによって形質転換し、プラスミドＤＮＡ画分を形成した。ＤＮＡ標本（リボヌクレアーゼＡ処理後）を電気泳動のために５％アクリルアミドゲルに塗布した。ゲルを臭化エチジウムによって染色した。レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅＩＩＩ消化体を示す。レーン２はｐＵＣＫ１９を収容する細胞からのＤＮＡ標本；レーン３はｐＵＣＫ１０６；レーン４はｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ^ＰＯを示す。ｐＵＣＫ１９はｐＵＣ１９のカナマイシン変異体である。
（Ｂ）ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡをポリアクルアミドゲル電気泳動によって精製し、次に種々の制限酵素消化を行った。消化体をポリアクリルアミド（５％）ゲル電気泳動によって分析し、ゲルを臭化エチジウムによって染色した。図３においてレーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅＩＩＩ消化体；レーン２は消化されないｓｌＤＮＡ；レーン３はＸｂａＩによって消化されたｓｌＤＮＡ；レーン４はＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたｓｌＤＮＡ；レーン５はＰｖａＩＩによって消化されたｓｌＤＮＡを示す。
（Ｃ）ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの熱変性。精製ｓｌＤＮＡ（上記のような）を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭＥＤＴＡ中に溶解した。このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で３分間インキュベートし、氷浴中で急冷した。サンプルをＡに述べたように分析した。図３においてレーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅＩＩＩ消化体；レーン２は熱処理なしのｓｌＤＮＡ；レーン３は熱変性後に急冷したｓｌＤＮＡを示す。

実施例３
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマー形成を説明する。
（Ａ）図３について述べたようなｐＵＣＫ１０６からの精製ｓｌＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ及び１０ｍＭＭｇＣｌ_２中に溶解した。このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で３分間インキュベートしてから、徐々に冷却する。再結合（ｒｅｎａｔｕｒｅｄ）ＤＮＡをＸｂａＩによって消化させ、このようにして生じたＤＮＡフラグメントをそれらの末端において〔ｒ−^３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。これらの生成物を５％ポリアクリルアミドゲルに塗布した。電気泳動後に、ゲルを乾燥させ、このゲルにオートラジオグラフィーを実施した。
図４において、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅＩＩＩ消化体；レーン２はサイズマーカーとしてのλＤＮＡのＥｃｏＲＩとＨｉｎｃｌＩＩＩ消化体；レーン３は処理なしのｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ；レーン４は非処理ｓｌＤＮＡのＸｂａＩ消化体；レーン５は熱変性後に徐冷したｓｌＤＮＡ；レーン６はレーン５からのｓｌＤＮＡのＸｂａＩ消化体を示す。帯を右手側において“ａ”から“ｅ”までマークを付した。
（Ｂ）図４のＡ中のフラグメント“ｄ”の特性化。フラグメント“ｄ”はゲルから精製した。レーン３は精製フラグメント“ｄ”のＨｉｎｄＩＩＩ消化体；レーン４では精製フラグメント“ｄ”は図３に関して述べたように熱変性し、急冷した。
（Ｃ）ＡとＢに示した“ａ”〜“ｂ”帯の概略図。ＸとＨはそれぞれＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩを示す。ＸｂａＩ部位に非常に近接したバンド“ａ”中に２個の他のＨｉｎｄＩＩＩ部位があり、これはバンド“ｃ”中にある。これらのＨｉｎｄＩＩＩ部位は図示せず。

実施例４
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのＤＮＡ塩基配列の決定を説明する。
（Ａ）ｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩基配列の決定。単離、精製したｓｌＤＮＡ０．２μｇを鎖停止方法（ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）による塩基配列決定に用いた。始点（図５のＢ参照）から下流の配列９６−ｂｐに相当する配列表の配列番号３で表されるプライマー“ａ”（５′ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧ３′）をプライマーとして用いた。
（Ｂ）ｓｌＤＮＡのループ部分の５′端部塩基配列の決定。ｓｌＤＮＡ０．５μｇをＳａｃＩＩによって消化させ、このようにして生じたＤＮＡフラグメントを５′端部において〔ｒ−３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。約４０−ｂｐ移動したＤＮＡフラグメントを単離し、マキサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法によって塩基配列を決定した。
（Ｃ）ｓｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基配列の決定。ＳａｃＩＩ消化体ｓｌＤＮＡを末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を用いて３′端部において〔ｒ−^３２Ｐ〕ジデオキシＡＴＰによって標識した。ループ部分を含むＤＮＡフラグメントを単離し、マキサム−ギルバート法によって塩基配列を決定した。
（Ｄ）ｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩基配列。ｓｌＤＮＡをＡｆｌＩＩＩによって消化させた（図５のＥ参照）、５′端部を〔ｒ−^３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。標識生成物を塩基配列決定用ゲルによって分離した。７６塩基移動した一重鎖ＤＮＡを単離し、マキサム−ギルバート法によって塩基配列決定した。図５のＤを参照すると、数字はｐＵＣＫ１９の始点からの残基数を表す。
（Ｅ）ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの構造。このｓｌＤＮＡは１１３７〜１１３９塩基の一重鎖ＤＮＡからなる。ｓｌＤＮＡの５′端部は不均一であるように見える；一部は＋１から開始し、他の部分は−１，＋２，＋３から開始する。＋１位置はＣｏｌＥｌＤＮＡ複製の始点に相当する。従って、種々のｓｌＤＮＡは異なる長さの５′末端鎖を有する。３′端部では１６塩基の配列が５′末端の＋１位置を越えて伸長する。このループはＨｉｎｄＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴ）が配置されるように設定されたＩＲ構造の中心の配列に相当する４塩基配列（ＡＧＣＴ）によって形成されると考えられる。ｐＵＣＫ１０６中のＩＲ構造中の不適正に相当する塩基対はＣ・Ｔ（ｐＵＣＫ１０６）からＣ・Ｇ（ｓｌＤＮＡ中）に変えられ、ＳａｃＩＩ部位とＰｓｔＩ部位との間に示される。図５のＡのＤＮＡ塩基配列決定に用いられるプライマー“ａ”の位置は矢印によって示す。
ｓｌＤＮＡの分離と精製は、モレキュラークローニング；アラボラトリーマニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、第２版（セクション１．１２１〜１．４０）（“サムブルック”）に述べられている方法に従って標準方法によって実施した。

実施例５
この実施例は二つの可能なｓｌＤＮＡ合成方法を説明する（図６参照）。ＣｏｌＥｌＤＮＡ複製の始点を中心とする二重鎖ＤＮＡを上部に示す。斜線入り円は始点からＤＮＡ複製を開始するＤＮＡ複製複合体を表す。ＤＮＡ鎖上の白抜き矢印はＤＮＡ塩基配列中の３５−ｂｐ逆方向反復（ＩＲ）構造（図２参照）の位置を示す。ＩＲ構造中の不適正塩基対（Ｃ・Ｔ）も矢印中に示す。
工程１において、ＤＮＡ複製フォークは始点（＋１位置）から斜線入り円によって示される位置にまで進行する。新たに合成された第１鎖が始点（中実円）から複製フォークまで伸長するのが示される。ＤＮＡ複製複合体は中実矢印によって示されるＩＲ構造中の不適正Ｔ残基の直前に達する。工程２では、この新たに合成された第１鎖の３′末端がＤＮＡ複製複合体から剥離して、２次構造がＩＲ構造によって形成される。工程３では、ＤＮＡ合成がこの新たに合成された第１鎖（モデルＡ）または上部の親鎖（モデルＢ）をテンプレートとして用いてステム−ループ構造の３′末端から再開する。工程４では、ＤＮＡ合成が始点を越えて１６塩基だけ進行する。
モデルＡでは、ＤＮＡの５′末端に結合して残留するプライマーＲＮＡがテンプレートＲＮＡとして用いられる。続いて、ＲＮＡが除去されて、ｓｌＤＮＡが形成される。モデルＢでは、ＤＮＡ合成が第２鎖ＤＮＡ合成の停止のために知られた機構と同様な機構によってｔｅｒＨ部位において停止する。
モデルＡとＢが合成を説明することができ、合成が両ルートによって、少なくとも一部の時間では、同時に進行しうることが考えられる。従って、第１鎖のテンプレートであった鎖以外の第２鎖に対しては適当なテンプレートが用いられる。

実施例６
ｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ^ＰＯの構成
ｌａｃプロモーター−オペレーターを含む１９９−ｂｐＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメントがｐＵＣＫ１０６（図１参照）から欠失すると、結果として生ずるｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ^ＰＯは図３のＡ、レーン４の位置（ｂ）に示すような、ｐＵＣＫ１０６からｓｌＤＮＡよりも迅速に移動する新しいｓｌＤＮＡを形成した。この新しいｓｌＤＮＡのサイズは３６０−ｂｐ長さであり、ｐＵＣＫ１０６ｓｌＤＮＡよりも、ｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ^ＰＯ中の欠失サイズに殆ど等しい長さだけ短い。
図３のＡでは、レーン３はｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ^ＰＯを収容する細胞からのＤＮＡ形成のｓｌＤＮＡを示す。
この実験は上記で提案したｓｌＤＮＡ合成モデルを支持し、ｌａｃプロモーター−オペレーターがｓｌＤＮＡ合成にとって本質的でないことをも実証する。この解釈はｌａｃ誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加がｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成に影響しないという事実によってさらに支持された。しかし、ｐＵＣＫ１０６Δｌａｃ^ＰＯからのｓｌＤＮＡ合成減少の理由は現在まだ不明である。

実施例７
ｓｌＤＮＡの合成はｐＵＣＫ１０６に用いられるＩＲ構造の一次塩基配列に依存しなかった。興味あることには、ポリリンカー部位にＩＲ構造を有するｐＵＣ７ベクター自体も、始点からポリリンカー中心までのＤＮＡフラグメントに対応するｓｌＤＮＡを形成することができる。
プラスミド画分を実施例２と同様に形成し、処理し、電気泳動のためにアクリルアミドゲルに塗布し染色した。
図７では、レーン１と３はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅＩＩＩ消化体を示す。レーン２はｐＣＵ７から形成されたｓｌＤＮＡを示す。

実施例８
ｓｌＤＮＡ構造の確認
上記ｓｌＤＮＡ構造と機構（図６に説明）は次のように確認した：
合成によって構築したＤＮＡフラグメントに不適正塩基ＣＴをＣＧの代りに故意に加えた。図２のＩＲの開放スペースを参照のこと。ｓｌＤＮＡ合成（第１鎖上にスナップ−バックした第２鎖を含む）後に、不適正は修正された。なぜなら図５のＥでは、ＣＧが出現している。もし構造がスナップ−バック構造でなかったとしたら、ポリメラーゼがＩＲ領域を正しく読み、Ｔを鋳型として読みＡが挿入されるはずである。すなわち；新しい鎖はまだ不適正を含むと思われる。不適正Ｔを置換するために、ＩＲ部分は第１鎖に必然的にスナップ−バックして、ポリメラーゼにテンプレートとして第１合成鎖を使わせて、第２鎖を合成させ、第２鎖が合成されるときに、不適正Ｔの代りに相補的Ｇを挿入させる。これは本発明のｓｌＤＮＡの合成機構と構造を決定的に確立する。

本発明の種々の実施態様の詳細な説明
本発明者は、ゲノムの一部が直接ゲノムから複製されるという基本的な発見をした。開示する機構は周知のような、ＲＮＡ中間体も逆転写酵素（ＲＴ）も必要としない。ワイナー等、アン．レブ．バイオケム．５５，６３１（１９８６）；コーンベルグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）、ＤＮＡ複製（ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）〔ダブリュ．エッチ．フリーマンアンドカンパニー（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）、カルフォルニア州サンフランシスコ、１９８０〕、１０１〜１６６頁参照。ステム−ループＤＮＡ（ｓｌＤＮＡ）と呼ばれる新しい、有用なＤＮＡ構造が発見された。

はじめに、本発明は幾つかの実施態様を提供する。一実施態様は新規で有用なｓｓＤＮＡ分子の合成方法（又はプロセス）である。他の実施態様は適当はプライミング部位と、逆方向反復（ＩＲ）と、ｓｌＤＮＡ合成の他の必要な成分とを有するＤＮＡフラグメントを含む、このような分子を合成するためのインビボ及びインビトロ系である。
このような分子を合成するためのインビボ系はコンピテント自己複製ビークルと系の他の成分とを用いる。この実施態様の他の面は逆方向反復、ｓｌＤＮＡの第１鎖の複製のためのテンプレートとして役立つＤＮＡ、逆配向のＤＮＡ合成をテンプレートに開始させるための適当なプライミング部位、及び必要な場合の親ＤＮＡの第２鎖と以下で述べる他の成分を含む自己複製ビークルである。

もう一つの実施態様は新規なｓｓ−ｓｌＤＮＡ分子である。
本発明は新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の合成方法を提供する。この分子は、ステムがｓｓＤＮＡ中のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなり、一端においてｓｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端において二重鎖ＤＮＡの反対端部を結合するＤＮＡの一重鎖ループを形成するステム−ループ構造（ｓｌＤＮＡ）を含む。この方法はＤＮＡ合成の通常の成分と下記成分：
（ａ）適当なプライミング部位と、前記プライミング部位の下流の逆方向反復（ＩＲ）とを含むテンプレートＤＮＡ；
（ｂ）テンプレートにＤＮＡ重合を開始させるためのプライマー；及び
（ｃ）テンプレートからｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼ
を含む系において実施される。

この方法は次の工程：
（１）ＤＮＡ重合を開始させるためのＤＮＡテンプレートのプライミング工程；
（２）テンプレートとしてＤＮＡの二重鎖の一つを用いてプライマーからｓｓＤＮＡを合成し、一つの鎖を形成し、ＩＲ塩基配列に入るまで鎖のＤＮＡ合成を続け、ＩＲ塩基配列内で合成を停止させる工程；
（３）新しく合成された鎖内のＩＲ塩基配列における相補的塩基がその端において非重複部分を重複部分とからなるループを形作するために、アニールし、重複部分を連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能させる工程；
（４）テンプレートとしてＤＮＡの新たに合成された鎖及び／又は他の鎖を用いてＤＮＡ合成を再開する工程；
（５）ｓｌＤＮＡを形成する工程；及び
（６）必要に応じてｓｌＤＮＡを分離し、単離する工程
を含む。

この方法はＤＮＡ合成のために必要な通常の成分の全てを含む系で実施される。これらの成分はインビボでこの方法が実施されるときに本質的に存在し；この方法をインビトロで実施するときに通常、系に導入される。

この方法は、適当なプライミング部分と、このプライミング部位から下流の逆方向反復とを有するＤＮＡの存在を必要とする。ＤＮＡはＤＮＡ複製を導くためのテンプレートとして機能する。プライマーは、ＤＮＡ鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成を開始させるように作用しうるオリゴヌクレオチド（天然に生成又は合成的の製造）でありうる。ＤＮＡ複製の開始方法は当然周知である。ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、遺伝子の分子生物学（ＭｏｌｅｗｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ）、第３版、ダブリュ．エイ．ベンジャミン社（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ．Ｉｎｃ．）；ＤＮＡ合成：現在と今後（ＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＰｒｅｓｅｎｔａｎｄＦｕｔｕｒｅ）、モリノイクス（Ｍｏｌｉｎｅｕｘ）とコイヤマ（Ｋｏｈｉｙａｍａ）編集、（１９７７）第Ｖ部、“インビトロにおけるＧ４とＳＴ−１ＤＮＡ合成（Ｇ４とＳＴ−１ＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＶｉｔｒｏ）”ワーカー著；第ＶＩＩ部、“サッカロマイセスセレヴィジェからの透過性細胞系におけるＤＮＡ合成（ＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＰｅｒｍｅａｂｌｅＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓｆｒｏｍＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）オエルテル（Ｏｅｒｔｅｌ）とゴーリアン（Ｇｏｕｌｉａｎ）著を参照のこと。第１鎖の合成に寄与するポリメラーゼに対して、第２鎖の合成には異なるポリメラーゼが寄与する。プライマーはＤＮＡ又はＲＮＡプライマーのいずれでも良い。合成はヌクレオチドと、例えばＤＮＡポリメラーゼのような重合剤との存在下、適当な温度及びｐＨにおいて誘導される。

本発明の方法は、テンプレートに沿った鎖の合成を触媒する酵素のような重合剤を用いる。このための適当な酵素には、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩもしくはＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）；ウイルスポリメラーゼがあり、熱安定性酵素をも含まれる。そのＤＮＡ複製開始部位を認識するポリメラーゼが適当である。一般に、このプロセスをインビボで実施する場合に、これらの遺伝要素が存在すると考えられ；インビボで実施しない場合又はインビトロで実施する場合には、これらを系に加えることになる。

開始部位を認識するポリメラーゼは重合を惹起させる又は重合に寄与する。発明者はこの場合に特定の理論にしばられるのを望むわけではないが、第１ＤＮＡ鎖の合成に寄与するポリメラーゼが他方のすなわち第２ＤＮＡ鎖の合成にも寄与することを除外することはできない。従って、この方法は第２鎖が第１合成鎖の５′末端を越えて３′末端において停止するまで、第２鎖の合成を続けることを含む。このように、ｓｌＤＮＡの重複ステムが形成される。

ＤＮＡポリメラーゼについての情報は入手可能である。例えば、コーンベルグによるＤＮＡ複製（ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ダブリュ．エッチ．フリーマンアンドカンパニー、カルフォルニア州、サンフランシスコ）、１０１〜１６０頁、第４章、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩｏｆＥ．Ｃｏｌｉ）、第５章、他の原核生物ポリメラーゼ（ＯｔｈｅｒＰｒｏｃａｒｙｏｔｉｃＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）、第６章、真核生物ＤＮＡポリメラーゼ（ＥｕｃａｒｙｏｔｉｃＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）及び第７章を参照のこと。
ｃＤＮＡ中の第２鎖合成に有用であるポリメラーゼのような、他のポリメラーゼも考えられる。

上記の特定の説明では、ポリメラーゼが２種類：ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩとポリメラーゼＩであることが考えられる。
もし蛋白質をコードしうる好ましいもしくは標的となる核酸塩基配列を例えば合成されたｓｌＤＮＡ部分遺伝子として複製することが望ましい場合にはこの塩基配列をＩＲの上流に配置する。例えば、複製始点（ＯＲ）を有する、例えばｐＵＣＫ１０６等のベクターのような、複製ビークル中で複製が行われる場合には、標的核酸配列はＩＲとＯＲとの間に位置する。

本発明の方法は、上述したように、プライミング部位と逆方向反復（ＩＲ）すなわち逆配向で存在する二つの同じ塩基配列を含む二重鎖ＤＮＡフラグメントを用いる。ＩＲは塩基配列又は“パリンドローム”として存在しうる。

後に述べるように、核酸配列へのランダム点突然変異の導入を容易にすることが好ましい場合には、例えばＲＴのような、ある特定の酵素が特に好ましい。

第１鎖の合成がｄｓＤＮＡテンプレートに沿って接触しながら、ＩＲを通って進行して、全プラスミドゲノムの複製を生ずる。一定の周期で、ＤＮＡ鎖の合成はＩＲ内で停止して、それ自体に相補的である塩基配列の短い部分を形成し、ループを形成し、ＩＲ塩基配列においてそれ自体にアニールする。新たに合成された鎖内のこの二重鎖部分は第２鎖又は他のＤＮＡ鎖のプライミング部位として認識される。第２鎖の合成はＤＮＡの最初に形成された鎖及び／又は他の親鎖をテンプレートとして用いて出発する。従って、テンプレート切換えが生ずると考えられる。

ヌクレオチドを含むポリメラーゼによって第２鎖が合成されるので、アニールされた相補的塩基からステムが形成され、内部相補性を有する二重構造が生ずる。

第２鎖の合成は第１合成鎖の第１ヌクレオチドをはるかに過ぎて、この第１鎖のＲＮＡプライマーを通って進行する、第１鎖は結局は減成して、３′−オーバーハングを形成する。一つの特定の説明では、ＤＮＡ合成はダスグプタ（Ｄａｓｇｕｐｔａ）等、セル（Ｃｅｌｌ）５１、１１１３（１９８７）に述べられている方法と同様な方法によってｔｅｒＨ部位において停止すると考えられる。

適当な処置によって、３′末端オーバーハングの長さは、例えば延ばすように、ｔｅｒＨ部位をプライミング位置から下流へ動かすことによって制御することができる。

さらに、３′末端オーバーハングを有するステムの代りに、適当な停止部位、例えばｔｅｒＨをプライミング部位の上流に配置することによって、第１鎖の端部の前で第２鎖の合成をブロックすることが可能であると考えられる。従って、いずれかの鎖が他方に比べてかなりの長さで長くなると考えられる。

第２鎖合成が停止したときに、テンプレートと形成されたｓｌＤＮＡが分離する。

本発明の方法は望ましい頻度のサイクルでくり返すことができる。必要な成分のいずれかが欠乏すると、必要に応じて補充することができる。

この方法をインビボで実施する場合には、プライミング部位とこのプライミング部位の下流のＩＲとを含む、適当なコンピテント複製ビークルが形成される。ＩＲを有するＤＮＡフラグメントは通常、ポリリンカー塩基配列中に特有の制限部位に挿入される。ポリリンカーがＩＲ（及び対称的制限部位）を有するプラスミドが用いられている。本質的に存在しない場合には、ＤＮＡフラグメントにＤＮＡ塩基配列へのプライマーが供給される；ポリメラーゼはビークルに固有であっても固有でなくても良い。ビークルは複製とｓｌＤＮＡ形成とに必要な、他の全ての成分を含む。

上述したことから、テンプレートとして役立つＤＮＡフラグメント、ＩＲ塩基配列、ｓｌＤＮＡを形成する鎖の複製をプライムし、続けるために必要な要素を含む自己複製ビークルがｓｌＤＮＡの合成に適することが理解されるであろう。

本発明の他の主要な実施態様は新しいｓｌＤＮＡを形成する。これらの構造はすでに上述した、以下では補足の説明を述べる。
“ステム−ループ”又は“ｓｌＤＮＡ”と名づけられた新しい構造は一重鎖である。ｓｌＤＮＡの説明は図５のＥ（ｐＵＣＫ１０６から）と図７（ｐＵＣ７から）に示す。

典型的なｓｌＤＮＡはアニールされた相補的塩基の重複二重鎖ステムと、ステムの２鎖を結合する一重鎖ヌクレオチドのループとを含む。ループの一重鎖性は本発明のｓｌＤＮＡのもう一つの興味ある特徴である。ｓｌＤＮＡはヌクレオチドの非常に短い配列またはかなり長い配列のループを含むことができる。ｓｌＤＮＡはループを形成するために充分な長さのヌクレオチド配列と短い重複二重鎖を形成する塩基対合を含むことができる。最小サイズは第２鎖の合成開始のためのプライミング部位を形成するために充分な塩基対合を与えるものであるべきである。ループの最小サイズは安定構造になるための塩基対合を阻止する塩基上の歪み（ｓｔｒａｉｎ）によって限定される。最大サイズはｓｌＤＮＡに予定された用途によって影響される。図５のＢに図示したループは４塩基からなるが；１０塩基、２０塩基又はそれ以上の塩基のループも考えられる。ｓｌＤＮＡループの一重鎖性はｓｌＤＮＡに提案される用途に非常に有用である特徴である。

ｓｌＤＮＡに考えられる他の興味ある構造は二重体ｓｌＤＮＡである。この構造では、二つのｓｌＤＮＡの一重鎖の自由端部が結合する。この構造は非常に安定であると期待される。通常ＤＮＡを変性させるような条件に暴露されると、これらのｓｓＤＮＡはそれらのオリジナル構造に“スナップ−バック”しがちである。鎖の結合はＤＮＡ及び／又はＲＮＡリガースによる通常の方法によって実施される。このような構造は蛋白質をコードするための特定の遺伝子をも有し、それによって興味ある新しい実用的可能性を提供する。

ｓｌＤＮＡの重要な性質である安定性は重複端部（ｔａｉｌ）が長くなると共に増加する傾向があると考えられる；従って、このような構造はこのことが強調されるべき特性である場合に好ましい。同一の複製ビークルから形成されるｓｌＤＮＡの全てが必ずしも同じサイズでないことに注目すべきである。上記説明では、ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡにおいて、第１鎖の５′末端は不均一であるように思われ、一部の鎖は＋１位置（ＣｏｌＥｌ複製の始点に相当）から出発するが〔トミザワ等、プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ、７４、１８８５（１９７７）を参照のこと〕、他の鎖は−１，＋２，＋３から出発する。従って、ＤＮＡは類似したｓｌＤＮＡの類と見なすことができる。

ＤＮＡフラグメント内にＩＲを越えて一つ以上の不適正が存在することがｓｌＤＮＡの合成にも構造にも不利な影響を与えないことが認められる。このことはこの場合にパリンドロームの中心から２５ヌクレオチド離れたＧに対する不適正Ｔによって説明される（図２参照）。この不適正はｓｌＤＮＡの合成において修復された。
端部の１末端の他方の末端をこえたｓｓＤＮＡオーバーハングを利用した、本発明のｓｌＤＮＡの幾つかの用途が提案される。それ故、このことが本発明の新しい構造の重要な特徴であることは理解されよう。

図示したプラスミド内のｓｌＤＮＡの合成は本発明の最も良い形式（ｍｏｄｅ）を説明する。
しかし、ＩＲとここに述べる他の成分とを含むベクターはｓｌＤＮＡの合成に適切である。
ＩＲは原核生物と真核生物にしばしば出現する構造である。このようなＩＲは本発明に使用可能である。ＩＲ塩基配列は合成的に製造することもできる。１例は図２に示す合成ＩＲである。

ＩＲの塩基配列又はパリンドローム塩基配列は大腸菌から得られている〔ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）等、ヌクル．アシドス．レス．１８、３９４１（１９９０）〕；ギルソン等のヌクル．アシドス．レス．１９、１３７５（１９９１）は大腸菌とサルモネラエンテリチカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｃａ）からのパリンドローム塩基配列を報告している（パリンドローム単位配列４０ヌクレオチド長さ）。チャルカー（Ｃｈａｌｈｅｒ）等のジーン（Ｇｅｎｅ）７１、（１）：２０１−５（１９８８）は大腸菌における５７１−ｂｐパリンドロームの増殖を報告している；逆方向反復はルイス（Ｌｅｗｉｓ）等、ジェイ．モル．バイオル．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）（イングランド）２１５、（１）：７３〜８４（１９９０）によって枯草菌（Ｂａｃｉｅｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）において報告されている（２６−塩基対反復）、サウリン（Ｓａｕｒｉｎ）のコンプト．アプル．バイオサイ．（Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．）３、（２）：１２１−７（１９８７）は大腸菌における反復パリンドローム構造を系統的に研究するための新しいコンピュータープログラムの使用を考察している。下記米国特許はポリドンローム塩基配列を開示する：第４９７５３７６号；第４８６３８５８号；第４８４０９０１号；第４７４６６０９号；第４７１９１７９号；第４６９３９８０号及び第４６９３９７９号。

パリンドロームは殆ど同じ（必ずしも同一ではない）塩基配列が逆方向にランする逆方向反復を含むと定義されている。一部は短いが（一方向に３〜１０塩基）、他の配列は数百の塩基対を含めて、非常に長い。ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、遺伝子の分子生物学（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＧｅｎｅ）第３版、２２４〜２２５頁。
ＤＮＡフラグメント中のＩＲはサイズがかなり変化しうる。限定するわけではなく、１０から３０以上のヌクレオチドの逆方向反復を含むｓｌＤＮＡが考えられる。逆方向反復は３００を越えるｂｐを含むと報告されている。カレントプロトコール（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ）、セクション１．４．１０．

ｓｌＤＮＡは原核生物又は真核生物のホスト表現（例えば細菌、酵母及び哺乳動物細胞）の合成生成物である。

プラスミドのような適当なベクターの例とこれによって形質転換されるホスト細胞は、当業者に周知である。必要な成分を有するプラスミドの適当なホストには、原核生物と真核生物とが存在する。原核生物は、例えばエシエリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、特に大腸菌；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属；特に枯草菌のような微細物を含む。

大腸菌を形質転換することのできるプラスミドは、例えばｐＵＣ型とＣｏｌＥｌ型プラスミドがある。米国特許第４９１０１４１号参照。大腸菌を形質転換することができるプラスミドは例えば、一般にＣｏｌＥｌ型プラスミドを含む。大腸菌の形質転換に適当な、他のプラスミドを下記に挙げる：ｐＳＣ１０１、ｐＳＦ２１２４、ｐＭＢ８、ｐＭＢ９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＣＫ１、Ｒ６Ｋ、ｐＢＲ３１２、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２、ｐＭＬ２１、ＣｏｌＥｌＡＰ、ＲＳＦ１０１０、ｐＶＨ５１、ｐＶＨ１５３。

枯草菌を形質転換することのできるプラスミドを下記に挙げる：ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２２３、ｐＵＢ１１２、ｐＴ１２７、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＳＡ０５０１、ｐＳＡ２１００、ｐＴＰ４、ｐＴＰ５及びこれらの誘導体。

枯草菌と大腸菌の両方を形質転換することのできるプラスミドは、ジェイ．バクテリオル．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１４５、４２２〜４２８（１９８２）；プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ、７５、１４３３〜１４３６（１９７８）及び遺伝子操作の原理（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＧｅｎｅＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）第２版、カル（Ｃａｒｒ）等編集、カリフォルニア大学出版局（バークレイ）、１９８１、４８頁に述べられている。

真核生物においてｓｌＤＮＡ合成を実施するために特に重要であるのは、エス．セレヴィジェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換することのできるプラスミド：ｐＭＰ７８、ＹＥｐ１３、ｐＢＴＩ１、ｐＬＣ５４４、ＹＥｐ２、ＹＲｐ１７、ｐＲＢ８（ＹＩｐ３０）、ｐＢＴ１７、ｐＢＴ１９、ｐＢＴ１１０、ｐＡＣ１、ｐＳＬｅ１、ｐＪＤＢ２１９、ｐＤＢ２４８及びＹＲｐ７である。ＹＩｐ５、ｐＵＣ−ＵＲＡ３、ｐＵＣ−ＬＵＥ２及びｐＵＣ−ＨＩＳ３も考えられる。酵素学における方法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１９４巻、２８５、３７３〜３７８頁「酵母遺伝学と分子生物学のガイド（ＧｕｉｄｅｔｏＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」、グスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ）とフィンク（Ｆｅｎｋ）編集（１９９１）、アカデミックプレス社（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．Ｉｎｃ）を参照のこと。他の酵母ベクターは遺伝子表現の実験操作（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）イノウエマサノリ（ＭａｓｓａｙｏｒｉＩｎｏｕｙｅ）編集、アカデミックプレス社（１９８３）、１００〜１０４頁に述べられている。

さらに、大腸菌ならびに例えばエス．セレヴィジェのような酵母の形質転換に用いることができるシャトルベクターが特に重要である。このようなベクターはｐｋｂ４２とｐＹＣ１を含む。他の例は分子クローニングの実用ガイド（ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）ベルナードペルバル（ＢｅｒｎａｒｄＰｅｒｂａｌ）による第２版（ウイリーアンドサンズ）中の“下等及び高等真核生物のコスミドベクター（ＣｏｓｍｉｄＶｅｃｔｏｒｆｏｒＬｏｗａｎｄＨｉｇｈｅｒＥｕｃａｒｙｏｔｅｓ）”に関するセクションに挙げられている。他の適当なベクターはカレントプロトコール、２巻、セクション１３．４．１、１３．４．２（１９８９）に述べられる。他の適当なビークルはＹＥｐ２４〔ボトシュタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）等、ジーン、８、１７（１８７９）〕とｐＪＤＢ２０７〔ベッグ（Ｂｅｇｇｓ）、ゲネチックエンジニヤリング（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（ウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）編集）２巻、１７５頁、アカデミックプレス（１９８２）のような、一般のマルチコピーベクターを含む。選択可能な、他のベクターは、ＹＥｐ５１とＹＥｐ５２のようなＹＩｐクラスのプラスミドを含む。

本発明の実施するための商業的に入手可能な真核ベクターの例は、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞におけるｐＳＶＬとｐＫＳＶ−１０である。他の例は分子クローニング実用ガイドに挙げられている。

形質転換ホストの培養と発酵は技術上公知の標準的な一般方法によって実施される。例えば、メソッズインエンザイモロジー、１８５巻、遺伝子表現テクノロジー〔編集者ゴッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）〕１９９０（特に細胞ラインの増殖）を参照、酵母に関しては、メソッズインエンザイモロジー、１９４巻、酵母遺伝学と分子生物学のガイドを参照；大腸菌の増殖条件は、カレントプロトコールインモレキュラーバイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、１巻、１．１．１、１．１．２、１．１．３、１．１．４、１．３．１頁及びモレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル（ＭｏｌｏｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）第２版、１．２１頁に述べられており、プラスミドＤＮＡの精製は１．２３頁に述べられており、哺乳動物細胞に適した培養増殖条件がカレントプロトコール、１巻と２巻、９．０．４〜９．０．６、９．１．１、９．１．２、９．１．３、９．２．５、９．４．３、１１．５．２、１１．６．２及び１１．７．３頁に述べられている。

要約すると、一重第１鎖の複製開始と合成のために必要な成分、すなわち開始部位を含むＤＮＡテンプレートフラグメントとＩＲ（及びポリメラーゼ）を複製ビークル中に供給すると、ｓｌＤＮＡが形成されると期待される。
本発明のｓｌＤＮＡの合成をインビトロで実施する場合に、合成はテンプレートとしてＤＮＡフラグメントを用いるヌクレオチド鎖の合成のための通常の成分を含む培質中で実施する。一般に、合成は好ましくはｐＨ７〜９の緩衝化水溶液中で行われる。ＤＮＡテンプレート鎖上にモル過剰量のオリゴヌクレオチドが存在することが好ましい、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰも合成混合物の成分である。溶液を加熱し、次に冷却する。次にポリメラーゼを加えると、合成が進行する。これらの成分はここに述べる本発明のための「通常成分」と呼ばれる。

オリゴヌクレオチド合成は、米国特許第４４１５７３４号と、マットイシ（Ｍａｔｔｅｕｃｉ）等ジェイ．アム．ケム．ソク．１０３（１１）：３１８５〜３１９１頁（１９８１）；アダムス（Ａｄａｍｓ）等、ジェイ．アム．ケム．ソク．１０５（３）：６６１〜６６３頁（１９８３）；及びベムケージ（Ｂｅｍｃａｇｅ）等、テトラヘドロンレタース（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ）２２（２０）：１８５９〜１８６７（１９８１）に述べられている。

本発明の方法は遺伝子工学の技術と分子クローニングを利用する。遺伝子工学の一般的技術と分子クローニングは下記文献に含まれる：サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、モノキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９９０、分子クローニング便覧、第２版、バーナード、ペルバル（１９８８）；メソッズインエンザイモロジー、６８巻、組換えＲＮＡ〔ウー（Ｗｕ）編集者〕、アカデミックプレス、Ｎ．Ｙ．、１９７９；メソッズインエンザイモロジー、１８５巻、遺伝子表現テクノロジー〔ゴエデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）編集者〕１９９０、カレントプロトコールスインモレキュラーバイオロジー、１，２及び３巻。

本発明のｓｌＤＮＡは幾つかの重要な用途を有する。本発明の方法は特定の遺伝子にライダム突然変異を導入するために利用することができる。このような系は形質転換ベクター中のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を示す図７に説明される。

この方法は、ステム中の配置された重要な遺伝子を含むｓｌＤＮＡの合成、ｓｌＤＮＡの単離、ｓｌＤＮＡから遺伝子の切断、適当な複製ビークルへのそれのクローニング及びその遺伝子によってコードされる蛋白質の表現を含む。蛋白質は目的の活性に関して試験することができる。標準方法によって、コロニーを検査して、突然変異遺伝子を有するコロニーを確認することができる。

突然変異の発生と確認の説明は次のように進める。ｌａｃＺ遺伝子を収容するｐＵＣＫ１９（実施例１参照）中に、ＤＮＡフラグメントとＯＲ（実施例１に示す）との間に３５ｂｐＩＲ（実施例に説明）を含む前出の配列表の配列番号１及び２で構成され、図２で示す２１５ｂｐＤＮＡフラグメントを結合させる。このプラスミドを標準条件下で増殖するコンピテント大腸菌ＣＬ８３に形質転換させる。その後、ｓｌＤＮＡを単離し、ｌａｃＺ遺伝子を切断して、ｐＵＣ１９中（ＩＲ含有フラグメントをもっていない）に挿入する。次いでこのプラスミドを大腸菌ＣＬ８３に形質転換させる。突然変異の頻度をβ−ｇａｌ、無色基質を用いて公知のインビボ試験によって評価する。前記無色基質は加水分解されると暗青色生成物を生ずる。コロニーが無色である場合には、このことがβ−ガラクトシダーゼが製造されないことを示唆する。

ｌａｃ遺伝子類の他の遺伝子、例えばｌａｃＹもしくはｌａｃＡ又は他の適当な遺伝子をこのスクリーニング試験に用いることができる。重要な蛋白質（又はポリペプチド）をコードする遺伝子も、突然変異の頻度決定と、誘導蛋白質（又はポリペプチド）をコードする適当な遺伝子の選択とに用いることができる。

スクリーニング方法は標的遺伝子に突然変異を導入し、突然変異率を増加させやすい、ポリメラーゼの選択を可能にする。従って、例えばｌａｃＺ遺伝子のような適当な遺伝子をスクリーニング遺伝子として用いることができる。複製確実度（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）の低いことが知られる逆転写酵素は目的蛋白質をコードする標的遺伝子に突然変異を導入するために選択すべき酵素であるように思われる。

好ましい標的蛋白質は、好ましい生物学的性質のために選択された、突然変異遺伝子を有する、特定のコンピテント形質転換ホストによって表現される。

突然変異の頻度は、複製における確実度の低いことが知られる適当な酵素を選択することによって影響されやすいと考えられる。従って、標的ＤＮＡフラグメント又は遺伝子を増幅する場合に、系は複製確実度又は不確実度すなわち挿入ＤＮＡフラグメント又は遺伝子の複製におけるＤＮＡポリメラーゼによってなされるエラー（ｅｒｒｏｒ）頻度に依存する。このようにして、各複製エラーに対して、ランダム突然変異が遺伝子に導入される。ＤＮＡポリメラーゼの不確実度が高ければ高いほど、突然変異遺伝子類は大きくなる（この逆もいえる）。

ＰｏｌＩＩＩとＰｏｌＩとが有効であると考えられる本発明の上記実施態様の一つでは、ＰｏｌＩが自己修正機能を有することが知られているので、ＰｏｌＩＩが低い確実性を有すると考えられる。このようにして、系の複製確実度はＤＮＡポリメラーゼの適当な選択によって調節することができる。一般に、ランダム突然変異は第２鎖を合成するポリメラーゼによって導入されやすいと考えられる。興味ある候補ポリメラーゼはＲＴである。

好ましい突然変異を有する遺伝子は染色体交差（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）に有用である。この方法によって、重要な遺伝子又は突然変異遺伝子を有するｓｌＤＮＡを用いて、同種の一つの分子からもう一つの分子への遺伝情報を融和させ、交換することができる。突然変異遺伝子はゲノム内にペクター塩基配列に類似した塩基配列を配置し、相同な遺伝子が突然変異遺伝子によって複製される。

このようにして、突然変異遺伝子を含み、好ましい蛋白質を表現する微生物の新しい系統が発生することができる。突然変異遺伝子を有するｓｌＤＮＡはインビトロ又はインビボで製造することができる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡの特定セグメントをインビトロ酵素増幅するための迅速手段である。標準ＰＣＲ方法は増幅すべき二重鎖ＤＮＡセグメント、セグメントと側面を接する常に二つの一重鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、適当なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、バッファー及び塩を必要とする。カレントプロトコールセクション１５参照のこと。

本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡは単一プライマーによって増幅することができる。この特徴は増幅をかなり簡単化し、プライマーがその適当な複製開始部位を見出す問題の解決を助け、これをさらに経済的にし、従来のＰＣＲ方法に付随する問題の解決を助ける。

ｓｌＤＮＡの増幅はｓｌＤＮＡを変性して、一重鎖ＤＮＡ（３′から５′末端まで）を形成することを含む。この反応は通常の順序：３′末端からのプライミング、ポリメラーゼ反応、変性とアニーリングに従って行われる。これが２５サイクル実施されると、ｓｌＤＮＡの１００万倍増幅が生ずる。ｓｌＤＮＡは標的蛋白質をコードする遺伝子を有することができる。

エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）等による“ポリメラーゼ連鎖反応における最近の進歩（ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）”なるタイトルのサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５２、１６４３〜１６５０（１９９１年６月２１日）内の最近の報告はプライマーに関連する問題と、ＰＣＲ方法に提案されている改良とを考察している。

従って、本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡ構造を１プライマーを用いる方法によって増幅する方法は非常に重要である。ｓｌＤＮＡは例えば改良された生物学的特性を有する突然変異遺伝子のような、重要な遺伝子を有することができる。

本発明のｓｌＤＮＡのインビボ製造は目的の塩基配列を形成するように操作されることができる。このようにして製造されたｓｌＤＮＡを次に、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）ＤＮＡとして用いることができる。

現在考えられている魅力的な用途は、本発明のｓｌＤＮＡが三重鎖らせんＤＮＡ、すなわち三重鎖ＤＮＡを形成し、結果としての新しい三重鎖ｓｌＤＮＡの形成に果たす役割である。サイエンス、２５２、１３７４〜１３７５（１９９１年６月２７日）における最近の報告、“三重鎖ＤＮＡがついに完成（ＴｒｉｐｌｅｘＤＮＡＦｉｎａｌｌｙＣｏｍｅｓｏｆＡｇｅ）”は本発明の適時性を強調している。三重鎖ＤＮＡは第３鎖を染色体ＤＮＡ上の特定認識部位に結合させることによって製造することができる。好ましくは塩基の完全量（ｆｕｌｌｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（例えば１１〜１５以上）を含むサイズの合成鎖を検討している。長い３′（又は５′）末端（及び非重複塩基のループ）を有する本発明のｓｌＤＮＡは良好な候補であるように思われる。結果として生ずる三重鎖ＤＮＡは大きな安定性と有用性とを有するように思われる。ＡＩＤＳ療法、選択的遺伝子阻害等を含めた三重鎖らせん形成に基づく新しい療法がこの報告に提案されている。

本発明が技術と科学に有意な貢献をすることは認められるであろう。

図１は本発明のプラスミド、ｐＵＣＫ１０６の説明図である。図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａ１Ｉ部位に挿入された２１５−ｂｐのＤＮＡ塩基配列を示す。図３はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成とその特徴とを説明するポリアクリルアミドゲルの臭化エチジウム染色を示す。図４はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマー形成を説明するポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。図５はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ塩基配列決定を説明する図である。図６はｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデルを説明する図である。図７のレーン１と３はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅＩＩＩ消化体（ｄｉｇｅｓｔ）を示し、レーン２はｐＵＣ７からのｓｌＤＮＡを示す。図８はｓｌＤＮＡを利用して、特定の遺伝子にランダムミューテーションを導入する具体例を示す図である。

配列番号１及び２は２１５ｂｐＤＮＡフラグメントの配列である。
配列番号３はプライマーの配列である。

Claims

ステムが一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなり、一端においてｓｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端において二重鎖ＤＮＡの反対端部を結合するＤＮＡの一重鎖ループを形成するステム−ループ構造（ｓｌＤＮＡ）を含むｓｓＤＮＡ分子の合成方法であって、前記方法が下記成分：
（ａ）適当なプライミング部位と前記プライミング部位の下流の逆方向反復（ＩＲ）とを含むテンプレートＤＮＡ；
（ｂ）テンプレートにＤＮＡ重合を開始させるプライマー；及び
（ｃ）テンプレートからのｓｌＤＮＡを複製するためのＤＮＡポリメラーゼ
を含む系において行われる場合であって、次の工程：
（１）ＤＮＡ重合を開始させるためのテンプレートのプライミング工程；
（２）プライマーからテンプレートを用いてＩＲ塩基配列までｓｓＤＮＡを合成する工程；および
（３）新たに合成されたｓｓＤＮＡ鎖内のＩＲ塩基配列における相補的塩基がループを形成してそれ自体にアニールし、形成された二重鎖部分を連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能させる工程
を含むｓｓＤＮＡ分子の合成方法。