JPH07289262A - 部位特異的変異導入方法 - Google Patents
部位特異的変異導入方法Info
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- JPH07289262A JPH07289262A JP7063484A JP6348495A JPH07289262A JP H07289262 A JPH07289262 A JP H07289262A JP 7063484 A JP7063484 A JP 7063484A JP 6348495 A JP6348495 A JP 6348495A JP H07289262 A JPH07289262 A JP H07289262A
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- Japan
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- site
- dna
- vector
- stranded dna
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 操作がより簡便な部位特異的変異導入方法、
及びそれに用いるためのベクターを提供する。 【構成】 部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿
入した２本鎖ＤＮＡベクターを熱変性することにより１
本鎖ＤＮＡを形成させる工程を含む部位特異的変異導入
方法。選択プライマーを用いて１本鎖ＤＮＡから２本鎖
ＤＮＡを調製する工程を含む部位特異的変異導入方法。
前記各方法に用いるためのベクターであって、１箇所以
上のアンバーコドンを含む薬剤耐性遺伝子を有する部位
特異的変異導入用ベクター。
及びそれに用いるためのベクターを提供する。 【構成】 部位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿
入した２本鎖ＤＮＡベクターを熱変性することにより１
本鎖ＤＮＡを形成させる工程を含む部位特異的変異導入
方法。選択プライマーを用いて１本鎖ＤＮＡから２本鎖
ＤＮＡを調製する工程を含む部位特異的変異導入方法。
前記各方法に用いるためのベクターであって、１箇所以
上のアンバーコドンを含む薬剤耐性遺伝子を有する部位
特異的変異導入用ベクター。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学において使
用される部位特異的変異導入（Site-Specific Mutagene
sis)を、より一層簡素化するための方法及びそれに使用
するベクターに関する。
用される部位特異的変異導入（Site-Specific Mutagene
sis)を、より一層簡素化するための方法及びそれに使用
するベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子工学の分野においては、遺
伝子をクローニングし、発現するだけの技術では、有用
な物質を単にそのまま大量に取得するための方法として
も成功する例は少ない。部位特異的変異導入法によっ
て、最大の発現量を得るためにフレームを合わせ、また
アミノ酸配列を変えることなく開始コドン付近のＤＮＡ
配列を変える操作は、最低限必要な技術である。また、
クローニング発現させた蛋白質をより有用なものにする
ため、部位特異的変異導入法を用いて、アミノ酸を削
除、変換し、その物質の特異性を変化させ、その物質が
酵素である場合なら、最適ｐＨ、安定性、基質特異性、
Ｋｍ値等を操作する技術は必須である。更に、蛋白質工
学研究分野の手法としても、部位特異的変異導入法を用
いてＤＮＡレベルでの変異導入、削除は、研究をより迅
速、正確に行う技術として重要である。
伝子をクローニングし、発現するだけの技術では、有用
な物質を単にそのまま大量に取得するための方法として
も成功する例は少ない。部位特異的変異導入法によっ
て、最大の発現量を得るためにフレームを合わせ、また
アミノ酸配列を変えることなく開始コドン付近のＤＮＡ
配列を変える操作は、最低限必要な技術である。また、
クローニング発現させた蛋白質をより有用なものにする
ため、部位特異的変異導入法を用いて、アミノ酸を削
除、変換し、その物質の特異性を変化させ、その物質が
酵素である場合なら、最適ｐＨ、安定性、基質特異性、
Ｋｍ値等を操作する技術は必須である。更に、蛋白質工
学研究分野の手法としても、部位特異的変異導入法を用
いてＤＮＡレベルでの変異導入、削除は、研究をより迅
速、正確に行う技術として重要である。
【０００３】部位特異的変異導入の典型的な操作（ギャ
ップトデュプレックス法）は次の項目から成っている。 （１）まず、ファージ由来の１本鎖と２本鎖で存在でき
るベクターであってアンバーコドンを含むベクターに目
的の変異を導入したいＤＮＡをクローニングする。 （２）クローンの一本鎖ＤＮＡをファージ感染により調
製する。 （３）この１本鎖ＤＮＡと、外来ＤＮＡの挿入されてい
ない２本鎖ベクターを直鎖状にしたものとを、変性後ハ
イブリダイズさせて、目標ＤＮＡの部分が一本鎖でベク
ターの部分が２本鎖になっているＤＮＡ（ギャップトデ
ュプレックスＤＮＡ）を形成させる。 （４）次に導入したい変異のとおりに化学合成したオリ
ゴヌクレオチド（変異プライマー）をハイブリダイズさ
せて、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応によりギャップ
を埋め、目的の変異点以外は完全に相補的な２本鎖ＤＮ
Ａを調製する。 （５）このＤＮＡを、mutSの宿主大腸菌（ＤＮＡの修復
能力を欠損している株）にトランスフェクションし、親
ＤＮＡを持つファージクローンと変異ＤＮＡを持つファ
ージクローンを成育させる。 （６）更に、 sup°の宿主大腸菌にトランスフェクショ
ンし、目的の変異ＤＮＡを持つファージクローンを選択
する。 しかしながら、この方法はファージ感染による１本鎖Ｄ
ＮＡの調製や、外来ＤＮＡの挿入されていない２本鎖ベ
クターの調製が必要であり、操作が煩雑である。更に、
ファージベクターを使用するので、大きなＤＮＡ断片、
例えば５kb以上の長さのＤＮＡは挿入されにくく、ま
た、ファージ特有の複製過程で変異が起こりやすい欠点
が指摘されている。特開平１−２５２２９１号公報に
は、これらの課題を解決するためのベクターとして、プ
ラスミド／ファージ融合ベクターが記載されている。こ
れは、アンバーコドンを含むアンピシリン耐性遺伝子と
バクテリオファージＭ１３由来のインタージェニックリ
ージョンを含んだ約３．２kbの融合ベクターである。こ
のベクターは、比較的大きなサイズの遺伝子が挿入でき
る利点があり、更に、複製時に変異が生じる不安定性が
認められない。しかし、このベクターを用いて部位特異
的変異導入を行う場合でもやはりヘルパーファージを感
染させて１本鎖ＤＮＡを調製しなければならず、また、
外来ＤＮＡの挿入されていない直鎖状２本鎖ＤＮＡの調
製も必要であり、操作が煩雑である。更に、このベクタ
ーはアンピシリン耐性遺伝子を含むので以下のような問
題も有している。すなわち、アンピシリン耐性は該遺伝
子がコードするβ−ラクタマーゼによるアンピシリンの
不活化によってもたらされるが、この酵素は分泌性タン
パク質であるので、過剰量の菌体をプレートにまくと、
分泌されて漏れだしたβ−ラクタマーゼのためにその部
分のアンピシリンが不活化され、アンピシリン感受性の
菌も生育してしまう。したがって、１枚のプレートにま
くことができる菌体量が限られている。
ップトデュプレックス法）は次の項目から成っている。 （１）まず、ファージ由来の１本鎖と２本鎖で存在でき
るベクターであってアンバーコドンを含むベクターに目
的の変異を導入したいＤＮＡをクローニングする。 （２）クローンの一本鎖ＤＮＡをファージ感染により調
製する。 （３）この１本鎖ＤＮＡと、外来ＤＮＡの挿入されてい
ない２本鎖ベクターを直鎖状にしたものとを、変性後ハ
イブリダイズさせて、目標ＤＮＡの部分が一本鎖でベク
ターの部分が２本鎖になっているＤＮＡ（ギャップトデ
ュプレックスＤＮＡ）を形成させる。 （４）次に導入したい変異のとおりに化学合成したオリ
ゴヌクレオチド（変異プライマー）をハイブリダイズさ
せて、ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応によりギャップ
を埋め、目的の変異点以外は完全に相補的な２本鎖ＤＮ
Ａを調製する。 （５）このＤＮＡを、mutSの宿主大腸菌（ＤＮＡの修復
能力を欠損している株）にトランスフェクションし、親
ＤＮＡを持つファージクローンと変異ＤＮＡを持つファ
ージクローンを成育させる。 （６）更に、 sup°の宿主大腸菌にトランスフェクショ
ンし、目的の変異ＤＮＡを持つファージクローンを選択
する。 しかしながら、この方法はファージ感染による１本鎖Ｄ
ＮＡの調製や、外来ＤＮＡの挿入されていない２本鎖ベ
クターの調製が必要であり、操作が煩雑である。更に、
ファージベクターを使用するので、大きなＤＮＡ断片、
例えば５kb以上の長さのＤＮＡは挿入されにくく、ま
た、ファージ特有の複製過程で変異が起こりやすい欠点
が指摘されている。特開平１−２５２２９１号公報に
は、これらの課題を解決するためのベクターとして、プ
ラスミド／ファージ融合ベクターが記載されている。こ
れは、アンバーコドンを含むアンピシリン耐性遺伝子と
バクテリオファージＭ１３由来のインタージェニックリ
ージョンを含んだ約３．２kbの融合ベクターである。こ
のベクターは、比較的大きなサイズの遺伝子が挿入でき
る利点があり、更に、複製時に変異が生じる不安定性が
認められない。しかし、このベクターを用いて部位特異
的変異導入を行う場合でもやはりヘルパーファージを感
染させて１本鎖ＤＮＡを調製しなければならず、また、
外来ＤＮＡの挿入されていない直鎖状２本鎖ＤＮＡの調
製も必要であり、操作が煩雑である。更に、このベクタ
ーはアンピシリン耐性遺伝子を含むので以下のような問
題も有している。すなわち、アンピシリン耐性は該遺伝
子がコードするβ−ラクタマーゼによるアンピシリンの
不活化によってもたらされるが、この酵素は分泌性タン
パク質であるので、過剰量の菌体をプレートにまくと、
分泌されて漏れだしたβ−ラクタマーゼのためにその部
分のアンピシリンが不活化され、アンピシリン感受性の
菌も生育してしまう。したがって、１枚のプレートにま
くことができる菌体量が限られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、操作
がより簡便な部位特異的変異導入方法、及びそれに用い
るためのベクターを提供することにある。
がより簡便な部位特異的変異導入方法、及びそれに用い
るためのベクターを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は部位特異的変異導入方法に関し、部
位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した２本鎖
ＤＮＡベクターを熱変性することにより１本鎖ＤＮＡを
形成させる工程を含むことを特徴とする。本発明の第２
の発明は部位特異的変異導入に用いるためのベクターに
関し、１箇所以上のアンバーコドンを含むクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子を有す
ることを特徴とする。
発明の第１の発明は部位特異的変異導入方法に関し、部
位特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した２本鎖
ＤＮＡベクターを熱変性することにより１本鎖ＤＮＡを
形成させる工程を含むことを特徴とする。本発明の第２
の発明は部位特異的変異導入に用いるためのベクターに
関し、１箇所以上のアンバーコドンを含むクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子を有す
ることを特徴とする。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ベクターは、１箇所以上のアンバーコドンを含むクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子
を含む。クロラムフェニコール耐性は、該遺伝子がコー
ドするクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼによるクロラムフェニコールの不活化によってもたら
される。また、カナマイシン耐性は、該遺伝子がコード
するアミノグリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼ
によるカナマイシンの不活化によってもたらされる。こ
れらの酵素は菌体内酵素なので、従来のアンピシリン耐
性のような問題はなく１枚のプレートにより多くの菌体
をまくことができる。特に、カナマイシン耐性遺伝子を
もつベクターは、他の薬剤耐性遺伝子を持つベクターに
比べて各薬剤存在下で培養した菌体からのベクターの収
率が高いので、特に好ましい。本発明のベクターは、そ
の他の配列、例えば適当なクローニングサイトを含んで
いてもよい。なお、本発明のベクターは部位特異的変異
導入に好適であるが、一般的なクローニングベクターと
しても効果的な使い方がある。すなわち、一般に、ある
クローニングベクターにクローニングされているＤＮＡ
断片を別のベクターに移しかえる際には、元のベクター
由来のバックグラウンドを除くために、ＤＮＡ断片を精
製するか、別のベクターとして薬剤耐性が元のベクター
とは異なるベクターを選択して、元のベクター由来のク
ローンを除去する。しかし、本発明のベクターの適当な
クローニングサイトにＤＮＡ断片をクローニングしてお
けば、このベクターと同じ薬剤耐性（クロラムフェニコ
ール耐性又はカナマイシン耐性）をもつ他のベクターに
再クローニングする場合でも、supE宿主菌から sup°宿
主菌へと菌株を変えるだけで元のベクター由来のバック
グラウンドを容易に除去することができる。
ベクターは、１箇所以上のアンバーコドンを含むクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子
を含む。クロラムフェニコール耐性は、該遺伝子がコー
ドするクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼによるクロラムフェニコールの不活化によってもたら
される。また、カナマイシン耐性は、該遺伝子がコード
するアミノグリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼ
によるカナマイシンの不活化によってもたらされる。こ
れらの酵素は菌体内酵素なので、従来のアンピシリン耐
性のような問題はなく１枚のプレートにより多くの菌体
をまくことができる。特に、カナマイシン耐性遺伝子を
もつベクターは、他の薬剤耐性遺伝子を持つベクターに
比べて各薬剤存在下で培養した菌体からのベクターの収
率が高いので、特に好ましい。本発明のベクターは、そ
の他の配列、例えば適当なクローニングサイトを含んで
いてもよい。なお、本発明のベクターは部位特異的変異
導入に好適であるが、一般的なクローニングベクターと
しても効果的な使い方がある。すなわち、一般に、ある
クローニングベクターにクローニングされているＤＮＡ
断片を別のベクターに移しかえる際には、元のベクター
由来のバックグラウンドを除くために、ＤＮＡ断片を精
製するか、別のベクターとして薬剤耐性が元のベクター
とは異なるベクターを選択して、元のベクター由来のク
ローンを除去する。しかし、本発明のベクターの適当な
クローニングサイトにＤＮＡ断片をクローニングしてお
けば、このベクターと同じ薬剤耐性（クロラムフェニコ
ール耐性又はカナマイシン耐性）をもつ他のベクターに
再クローニングする場合でも、supE宿主菌から sup°宿
主菌へと菌株を変えるだけで元のベクター由来のバック
グラウンドを容易に除去することができる。
【０００７】本発明の方法による部位特異的変異導入
は、例えば以下の工程によって行うことができる。 （１）本発明のベクターに標的となるＤＮＡを挿入す
る。 （２）（１）で調製したＤＮＡ挿入ベクター、変異プラ
イマー、及び選択プライマーを、選択プライマーが過剰
の状態で混合して熱変性を行いこれらをハイブリダイズ
させる。 （３）ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により、変異プ
ライマーと選択プライマーとの間を埋め、目的の変異点
及び選択配列中の変異点以外は完全に相補的な二本鎖Ｄ
ＮＡを調製する。 （４）このＤＮＡで、mutSの宿主大腸菌を形質転換し、
親ＤＮＡを持つクローンと変異ＤＮＡを持つクローンを
成育させる。 （５）更に、 sup°の宿主大腸菌を形質転換し、クロラ
ムフェニコール又はカナマイシン存在下で培養を行い、
アンバー変異が復帰してクロラムフェニコール耐性又は
カナマイシン耐性を獲得した、すなわち目的の変異ＤＮ
Ａを持つクローンを選択する。
は、例えば以下の工程によって行うことができる。 （１）本発明のベクターに標的となるＤＮＡを挿入す
る。 （２）（１）で調製したＤＮＡ挿入ベクター、変異プラ
イマー、及び選択プライマーを、選択プライマーが過剰
の状態で混合して熱変性を行いこれらをハイブリダイズ
させる。 （３）ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応により、変異プ
ライマーと選択プライマーとの間を埋め、目的の変異点
及び選択配列中の変異点以外は完全に相補的な二本鎖Ｄ
ＮＡを調製する。 （４）このＤＮＡで、mutSの宿主大腸菌を形質転換し、
親ＤＮＡを持つクローンと変異ＤＮＡを持つクローンを
成育させる。 （５）更に、 sup°の宿主大腸菌を形質転換し、クロラ
ムフェニコール又はカナマイシン存在下で培養を行い、
アンバー変異が復帰してクロラムフェニコール耐性又は
カナマイシン耐性を獲得した、すなわち目的の変異ＤＮ
Ａを持つクローンを選択する。
【０００８】なお、本明細書中において、選択配列と
は、薬剤耐性遺伝子の中に１箇所以上のアンバーコドン
を含む配列をいう。また、選択プライマーとは、選択配
列に相補的な配列を有し、かつアンバー変異を復帰させ
る変異を持つプライマーをいう。
は、薬剤耐性遺伝子の中に１箇所以上のアンバーコドン
を含む配列をいう。また、選択プライマーとは、選択配
列に相補的な配列を有し、かつアンバー変異を復帰させ
る変異を持つプライマーをいう。
【０００９】本発明においては１本鎖ＤＮＡを熱変性に
よって形成させるので、従来のようなファージ感染によ
る１本鎖ＤＮＡの調製といった複雑な操作を必要としな
い。その結果、操作が簡略化され、かかる日数も１日少
なくてすむ。熱変性の結果生じた１本鎖ＤＮＡは、従来
のようにギャップトデュプレックスＤＮＡを形成させる
のに用いてもよく、前述の例のように選択プライマーと
変異プライマーをハイブリダイズさせて用いてもよい。
熱変性の方法としては、１本鎖ＤＮＡが形成される方法
であれば何でもよいが、例えば、９０〜１００℃で数分
間処理したのち、氷上で急冷すればよい。
よって形成させるので、従来のようなファージ感染によ
る１本鎖ＤＮＡの調製といった複雑な操作を必要としな
い。その結果、操作が簡略化され、かかる日数も１日少
なくてすむ。熱変性の結果生じた１本鎖ＤＮＡは、従来
のようにギャップトデュプレックスＤＮＡを形成させる
のに用いてもよく、前述の例のように選択プライマーと
変異プライマーをハイブリダイズさせて用いてもよい。
熱変性の方法としては、１本鎖ＤＮＡが形成される方法
であれば何でもよいが、例えば、９０〜１００℃で数分
間処理したのち、氷上で急冷すればよい。
【００１０】本発明は、熱変性の結果生じた１本鎖ＤＮ
Ａから選択プライマーを用いて２本鎖ＤＮＡを調製する
工程も含む。この工程は、従来のようにギャップトデュ
プレックスＤＮＡを形成させる工程を経ないので、クロ
ーンされていない直鎖状２本鎖ＤＮＡを調製する必要が
なく、選択プライマーとなるオリゴヌクレオチドを準備
するだけでよい。選択プライマーの長さは特に限定され
ないが、２０mer 程度が一般的である。選択プライマー
を選ぶ位置としては、選択配列中のアンバーコドンとの
ミスマッチが選択プライマーの配列の真ん中から５′個
になるように選ぶ方がよい。 （５）の工程においては、クロラムフェニコール又はカ
ナマイシン存在下で培養した菌体からいったんＤＮＡを
抽出して、再度 sup°の宿主大腸菌に形質転換すれば、
更に高い効率で部位特異的変異導入を行うことができ
る。
Ａから選択プライマーを用いて２本鎖ＤＮＡを調製する
工程も含む。この工程は、従来のようにギャップトデュ
プレックスＤＮＡを形成させる工程を経ないので、クロ
ーンされていない直鎖状２本鎖ＤＮＡを調製する必要が
なく、選択プライマーとなるオリゴヌクレオチドを準備
するだけでよい。選択プライマーの長さは特に限定され
ないが、２０mer 程度が一般的である。選択プライマー
を選ぶ位置としては、選択配列中のアンバーコドンとの
ミスマッチが選択プライマーの配列の真ん中から５′個
になるように選ぶ方がよい。 （５）の工程においては、クロラムフェニコール又はカ
ナマイシン存在下で培養した菌体からいったんＤＮＡを
抽出して、再度 sup°の宿主大腸菌に形質転換すれば、
更に高い効率で部位特異的変異導入を行うことができ
る。
【００１１】図１に、本発明による部位特異的変異導入
の典型的な流れを示す。図中、CmR、CmS はそれぞれク
ロラムフェニコール耐性、クロラムフェニコール感受性
を、KmR 、KmS はそれぞれカナマイシン耐性、カナマイ
シン感受性を表す。
の典型的な流れを示す。図中、CmR、CmS はそれぞれク
ロラムフェニコール耐性、クロラムフェニコール感受性
を、KmR 、KmS はそれぞれカナマイシン耐性、カナマイ
シン感受性を表す。
【００１２】
【実施例】以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１３】実施例１ 部位特異的変異導入用ベクター
の構築 （１）クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むベクター
の構築 pHSG1337〔ジーン（Gene) 、第６１巻、第６３〜７４頁
（１９８７）に記載〕のクロラムフェニコール耐性遺伝
子（cat-1)内にあるPvuII サイトを消失させ、かつその
部分にアンバー変異を２箇所導入するために、配列表の
配列番号１に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチド
プライマーを作製した。このプライマーは、本来はＣで
ある４番目と１３番目の塩基をＴに変えてあり、その結
果、グルタミンコドン（ＣＡＧ）に代わってアンバーコ
ドン（ＴＡＧ）が出現するようになっている。０．５μ
ｇのpHSG1337（約０．６pmol) と６０pmolの上記プライ
マーを４０μｌのＢＡ緩衝液（２０mM トリス−塩酸
ｐＨ ７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＮａＣ
ｌ）に溶解し、９５℃で３分間インキュベートした後氷
中で急冷した。次に、６μｌの１０×Ｔ４ＰＬ緩衝液
（１００mM トリス−塩酸 ｐＨ７．５、５mM ｄＮＴ
Ｐ、１０mM ＡＴＰ、２０mM ジチオスレイトール）、
２０単位のＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ、１５００単位
のＴ４ ＤＮＡ リガーゼを加え、蒸留水で６０μｌに
した後２５℃で２時間インキュベートした。反応液を、
エタノール沈殿したのち乾燥し５０μｌのPvuII 緩衝液
（１０mM トリス−塩酸 ｐＨ ７．５、７mM ＭｇＣ
ｌ2 、７mM ２−メルカプトエタノール、６０mM Ｎａ
Ｃｌ）に溶解して、１０単位のPvuII を加え、３７℃で
２時間反応させた。反応液１０μｌを大腸菌ＢＭＨ７１
−１８株（supE、mutS) にトランスフォームし、１５μ
ｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３mlを加
え、３７℃で一晩培養した。培養液１mlからプラスミド
をアルカリ−ＳＤＳ法で回収し、エタノール沈殿、乾燥
し、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０mM トリス−塩酸 ｐ
Ｈ ７．５、１mMＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液４μ
ｌをPvuII 緩衝液５０μｌに溶解したのち１０単位のPv
uII を加えて、３７℃で２時間反応させた。反応液１０
μｌを、大腸菌ＢＭＨ７１−１８株にトランスフォーム
し、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＳ寒
天培地に適当量プレーティングし、３７℃で一晩培養し
た。生育したコロニーを適当量個別に拾い培養し、それ
ぞれプラスミドを回収、PvuII で処理し、切断されない
プラスミドpHSG1337am2 が得られた。
の構築 （１）クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むベクター
の構築 pHSG1337〔ジーン（Gene) 、第６１巻、第６３〜７４頁
（１９８７）に記載〕のクロラムフェニコール耐性遺伝
子（cat-1)内にあるPvuII サイトを消失させ、かつその
部分にアンバー変異を２箇所導入するために、配列表の
配列番号１に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチド
プライマーを作製した。このプライマーは、本来はＣで
ある４番目と１３番目の塩基をＴに変えてあり、その結
果、グルタミンコドン（ＣＡＧ）に代わってアンバーコ
ドン（ＴＡＧ）が出現するようになっている。０．５μ
ｇのpHSG1337（約０．６pmol) と６０pmolの上記プライ
マーを４０μｌのＢＡ緩衝液（２０mM トリス−塩酸
ｐＨ ７．５、１０mM ＭｇＣｌ2 、５０mM ＮａＣ
ｌ）に溶解し、９５℃で３分間インキュベートした後氷
中で急冷した。次に、６μｌの１０×Ｔ４ＰＬ緩衝液
（１００mM トリス−塩酸 ｐＨ７．５、５mM ｄＮＴ
Ｐ、１０mM ＡＴＰ、２０mM ジチオスレイトール）、
２０単位のＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ、１５００単位
のＴ４ ＤＮＡ リガーゼを加え、蒸留水で６０μｌに
した後２５℃で２時間インキュベートした。反応液を、
エタノール沈殿したのち乾燥し５０μｌのPvuII 緩衝液
（１０mM トリス−塩酸 ｐＨ ７．５、７mM ＭｇＣ
ｌ2 、７mM ２−メルカプトエタノール、６０mM Ｎａ
Ｃｌ）に溶解して、１０単位のPvuII を加え、３７℃で
２時間反応させた。反応液１０μｌを大腸菌ＢＭＨ７１
−１８株（supE、mutS) にトランスフォームし、１５μ
ｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３mlを加
え、３７℃で一晩培養した。培養液１mlからプラスミド
をアルカリ−ＳＤＳ法で回収し、エタノール沈殿、乾燥
し、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０mM トリス−塩酸 ｐ
Ｈ ７．５、１mMＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液４μ
ｌをPvuII 緩衝液５０μｌに溶解したのち１０単位のPv
uII を加えて、３７℃で２時間反応させた。反応液１０
μｌを、大腸菌ＢＭＨ７１−１８株にトランスフォーム
し、１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＳ寒
天培地に適当量プレーティングし、３７℃で一晩培養し
た。生育したコロニーを適当量個別に拾い培養し、それ
ぞれプラスミドを回収、PvuII で処理し、切断されない
プラスミドpHSG1337am2 が得られた。
【００１４】一方、pHSG396 、pHSG397 、pHSG398 、pH
SG399 （いずれも宝酒造社製）それぞれ０．５μｇを、
AccIII、ApaLI 、NcoIで処理し、1133bp（pHSG398 及び
pHSG399 から）、1144bp（pHSG396 及びpHSG397 から）
の ApaLI−NcoIフラグメントを回収した。次に、２μｇ
のpHSG1337am2 をApaLI 、NcoIで処理し、1095bpのフラ
グメントを回収し、４等分し、上記 pHSG396〜399 由来
のフラグメントとライゲーションし、pKF396、pKF397、
pKF398、pKF399を得た。図２にこれらのプラスミドの構
築図を示す。更に図３にpKF396〜399 の構造を示す。図
中、各プライマーの小文字は変異部位を、（Δａ）はア
デニン残基欠失を、（PvuII)は２箇所のアンバーコドン
がいずれもグルタミンコドンに復帰した場合に出現する
PvuII サイトを示す。すなわち、これらのベクターは２
箇所のアンバーコドンを含むクロラムフェニコール耐性
遺伝子（cat-１am2)を持ち、lacZ′領域にマルチクロー
ニングサイトを持つためsupE宿主菌を用いればIPTGとX-
gal を含むプレートで、外来ＤＮＡの挿入の有無が容易
に判別できる。また、pUC ベクターと同じ複製開始点を
持つため、コピー数が多く、更に、これらのベクターは
サイズが小さく（２２２８bp又は２２３９bp）、大きな
サイズ（５kb以上）の遺伝子が挿入できる利点がある。
これらのベクターは、互いに異なるマルチクローニング
サイトを持つので、目的に応じて使い分けることができ
る。
SG399 （いずれも宝酒造社製）それぞれ０．５μｇを、
AccIII、ApaLI 、NcoIで処理し、1133bp（pHSG398 及び
pHSG399 から）、1144bp（pHSG396 及びpHSG397 から）
の ApaLI−NcoIフラグメントを回収した。次に、２μｇ
のpHSG1337am2 をApaLI 、NcoIで処理し、1095bpのフラ
グメントを回収し、４等分し、上記 pHSG396〜399 由来
のフラグメントとライゲーションし、pKF396、pKF397、
pKF398、pKF399を得た。図２にこれらのプラスミドの構
築図を示す。更に図３にpKF396〜399 の構造を示す。図
中、各プライマーの小文字は変異部位を、（Δａ）はア
デニン残基欠失を、（PvuII)は２箇所のアンバーコドン
がいずれもグルタミンコドンに復帰した場合に出現する
PvuII サイトを示す。すなわち、これらのベクターは２
箇所のアンバーコドンを含むクロラムフェニコール耐性
遺伝子（cat-１am2)を持ち、lacZ′領域にマルチクロー
ニングサイトを持つためsupE宿主菌を用いればIPTGとX-
gal を含むプレートで、外来ＤＮＡの挿入の有無が容易
に判別できる。また、pUC ベクターと同じ複製開始点を
持つため、コピー数が多く、更に、これらのベクターは
サイズが小さく（２２２８bp又は２２３９bp）、大きな
サイズ（５kb以上）の遺伝子が挿入できる利点がある。
これらのベクターは、互いに異なるマルチクローニング
サイトを持つので、目的に応じて使い分けることができ
る。
【００１５】（２）カナマイシン耐性遺伝子を含むベク
ターの構築 プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造社）をHindIII 、Sm
aIで部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末
端とした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行い、
カナマイシン耐性遺伝子を保持し、かつマルチクローニ
ングサイト内のHindIII −SmaI領域（３０ｂｐ）を欠失
させたプラスミドｐ１５１４を構築した。次に、配列表
の配列番号２、３、４に示す５′末端リン酸化オリゴヌ
クレオチドを作製し、実施例１−（１）と同様にしてｐ
１５１４のカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ）内にある
HindIII 、SmaI、ClaIの各サイトを消失させた。更にカ
ナマイシン耐性遺伝子にアンバー変異を２箇所導入する
ために、配列表の配列番号５に示す５′末端リン酸化オ
リゴヌクレオチドを作製し、ジーン、第１５２巻、第２
７１〜２７５頁（１９９５）に記載の方法に従いプラス
ミドＤＮＡにニックを入れ、アンバー変異が導入された
カナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ−３）をもつプラスミ
ドｐ２９９−５を構築した。次に、前出のジーンに記載
のプラスミドｐＫＦ１６ｃをAseIで処理し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼにより平滑末端とし、更にBglIで処理して
マルチクローニングサイトを含む３３８ｂｐのＤＮＡ断
片を回収した。次に、ｐ２９９−５をNspIで処理し、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、更にBglIで処理
し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１９３１ｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収し、上記ｐＫＦ１６ｃ由来の３３８ｂｐの
ＤＮＡ断片と連結してプラスミドｐ１５２９を構築し
た。次に、ｐ１５２９をDsaIで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼにより平滑末端とした後に連結反応を行い６１
ｂｐのDsaI−DsaI領域を欠失させて、プラスミドｐＫＦ
２９６を構築した。一方、前出のジーンに記載のプラス
ミドｐＫＦ１７ｃ、ｐＫＦ１８ｃ、ｐＫＦ１９ｃをNdeI
とBglIで処理し、マルチクローニングサイトを含む２２
９ｂｐ（ｐＫＦ１７ｃ）、２１７ｂｐ（ｐＫＦ１８ｃ、
ｐＫＦ１９ｃ）のＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＫＦ
２９６をNdeIとBglIで処理し、カナマイシン耐性遺伝子
を含む１９８３ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、上記２２９
ｂｐ又は２１７ｂｐのｐＫＦ１７ｃ〜ｐＫＦ１９ｃ由来
のＤＮＡ断片とライゲーションし、プラスミドｐＫＦ２
９７、ｐＫＦ２９８、ｐＫＦ２９９をそれぞれ構築し
た。図４にｐＫＦ２９６〜２９９の構築図を示す。図中
のＭＣＳはマルチクローニングサイトを表す。なお、ｐ
ＫＦ２９６〜２９９はそれぞれ実施例１−（１）のｐＫ
Ｆ３９６〜３９９と同じマルチクローニングサイトをも
っている。すなわち、これらのベクターは２箇所のアン
バーコドンを含むカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ−
３）を持ち、lacZ′領域にマルチクローニングサイトを
持つためsupE宿主菌を用いればIPTGとX-gal を含むプレ
ートで、外来ＤＮＡの挿入の有無が容易に判別できる。
また、pUC ベクターと同じ複製開始点を持つため、コピ
ー数が多く、更に、これらのベクターはサイズが小さく
（２２１６bp又は２２０４bp）、大きなサイズ（５kb以
上）の遺伝子が挿入できる利点がある。これらのベクタ
ーは、互いに異なるマルチクローニングサイトを持つの
で、目的に応じて使い分けることができる。
ターの構築 プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造社）をHindIII 、Sm
aIで部分消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末
端とした後Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結反応を行い、
カナマイシン耐性遺伝子を保持し、かつマルチクローニ
ングサイト内のHindIII −SmaI領域（３０ｂｐ）を欠失
させたプラスミドｐ１５１４を構築した。次に、配列表
の配列番号２、３、４に示す５′末端リン酸化オリゴヌ
クレオチドを作製し、実施例１−（１）と同様にしてｐ
１５１４のカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ）内にある
HindIII 、SmaI、ClaIの各サイトを消失させた。更にカ
ナマイシン耐性遺伝子にアンバー変異を２箇所導入する
ために、配列表の配列番号５に示す５′末端リン酸化オ
リゴヌクレオチドを作製し、ジーン、第１５２巻、第２
７１〜２７５頁（１９９５）に記載の方法に従いプラス
ミドＤＮＡにニックを入れ、アンバー変異が導入された
カナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ−３）をもつプラスミ
ドｐ２９９−５を構築した。次に、前出のジーンに記載
のプラスミドｐＫＦ１６ｃをAseIで処理し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼにより平滑末端とし、更にBglIで処理して
マルチクローニングサイトを含む３３８ｂｐのＤＮＡ断
片を回収した。次に、ｐ２９９−５をNspIで処理し、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、更にBglIで処理
し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１９３１ｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収し、上記ｐＫＦ１６ｃ由来の３３８ｂｐの
ＤＮＡ断片と連結してプラスミドｐ１５２９を構築し
た。次に、ｐ１５２９をDsaIで処理し、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼにより平滑末端とした後に連結反応を行い６１
ｂｐのDsaI−DsaI領域を欠失させて、プラスミドｐＫＦ
２９６を構築した。一方、前出のジーンに記載のプラス
ミドｐＫＦ１７ｃ、ｐＫＦ１８ｃ、ｐＫＦ１９ｃをNdeI
とBglIで処理し、マルチクローニングサイトを含む２２
９ｂｐ（ｐＫＦ１７ｃ）、２１７ｂｐ（ｐＫＦ１８ｃ、
ｐＫＦ１９ｃ）のＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＫＦ
２９６をNdeIとBglIで処理し、カナマイシン耐性遺伝子
を含む１９８３ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、上記２２９
ｂｐ又は２１７ｂｐのｐＫＦ１７ｃ〜ｐＫＦ１９ｃ由来
のＤＮＡ断片とライゲーションし、プラスミドｐＫＦ２
９７、ｐＫＦ２９８、ｐＫＦ２９９をそれぞれ構築し
た。図４にｐＫＦ２９６〜２９９の構築図を示す。図中
のＭＣＳはマルチクローニングサイトを表す。なお、ｐ
ＫＦ２９６〜２９９はそれぞれ実施例１−（１）のｐＫ
Ｆ３９６〜３９９と同じマルチクローニングサイトをも
っている。すなわち、これらのベクターは２箇所のアン
バーコドンを含むカナマイシン耐性遺伝子（ａｇｒ−
３）を持ち、lacZ′領域にマルチクローニングサイトを
持つためsupE宿主菌を用いればIPTGとX-gal を含むプレ
ートで、外来ＤＮＡの挿入の有無が容易に判別できる。
また、pUC ベクターと同じ複製開始点を持つため、コピ
ー数が多く、更に、これらのベクターはサイズが小さく
（２２１６bp又は２２０４bp）、大きなサイズ（５kb以
上）の遺伝子が挿入できる利点がある。これらのベクタ
ーは、互いに異なるマルチクローニングサイトを持つの
で、目的に応じて使い分けることができる。
【００１６】実施例２ 実施例１−（１）で作製したベクターpKF399のlacZ′遺
伝子のディレーションミューテーションの導入を行い、
その効率を数値化した。lacZ′遺伝子はlacZα−ペプチ
ドをコードしており、この遺伝子をlacZΔＭ１５の遺伝
子型を持つ宿主菌に導入するとβ−ガラクトシダーゼ活
性を生ずる。したがって、lacZ′遺伝子がそのままであ
ればIPTGとX-gal の存在下で生育コロニーは青くなり、
ミューテーションが入ると生育コロニーは白くなり、こ
れらの青コロニーと白コロニーの数を比較することによ
り部位特異的変異導入の効率を数値化できる。クロラム
フェニコール耐性遺伝子内のダブルアンバー変異を復帰
させる選択プライマー（CQ2)として、配列表の配列番号
６に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製し
た。すなわち、pKF399ではCQ2 の４番目と１３番目のＣ
に対応する塩基がＴであるのでストップコドンになる
（図３参照）。lacZ′遺伝子にディレーションミューテ
ーションを導入する変異プライマー（dZ) として、配列
表の配列番号７に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオ
チドを作製した。すなわち、dZは１０番目のＣと１１番
目のＴの間にあるＡを欠落するように合成した（図３参
照）。次に、下記の表１に示すサンプルを調製した。
伝子のディレーションミューテーションの導入を行い、
その効率を数値化した。lacZ′遺伝子はlacZα−ペプチ
ドをコードしており、この遺伝子をlacZΔＭ１５の遺伝
子型を持つ宿主菌に導入するとβ−ガラクトシダーゼ活
性を生ずる。したがって、lacZ′遺伝子がそのままであ
ればIPTGとX-gal の存在下で生育コロニーは青くなり、
ミューテーションが入ると生育コロニーは白くなり、こ
れらの青コロニーと白コロニーの数を比較することによ
り部位特異的変異導入の効率を数値化できる。クロラム
フェニコール耐性遺伝子内のダブルアンバー変異を復帰
させる選択プライマー（CQ2)として、配列表の配列番号
６に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチドを作製し
た。すなわち、pKF399ではCQ2 の４番目と１３番目のＣ
に対応する塩基がＴであるのでストップコドンになる
（図３参照）。lacZ′遺伝子にディレーションミューテ
ーションを導入する変異プライマー（dZ) として、配列
表の配列番号７に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオ
チドを作製した。すなわち、dZは１０番目のＣと１１番
目のＴの間にあるＡを欠落するように合成した（図３参
照）。次に、下記の表１に示すサンプルを調製した。
【００１７】
【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── ５×ＢＡ緩衝液 pKF399 CQ2 dZ サンプルNo.1 ４μｌ 25fmol 25 pmol 25pmol サンプルNo.2 ４μｌ 25fmol 2.5pmol 25pmol サンプルNo.3 ４μｌ 25fmol 250 fmol 25pmol サンプルNo.4 ４μｌ 25fmol 25 fmol 25pmol サンプルNo.5 ４μｌ 25fmol 0 25pmol ───────────────────────────────────
【００１８】それぞれ蒸留滅菌水で全量２０μｌにし
た。次に、それぞれの溶液を１００℃で３分間インキュ
ベートし、氷中にて急冷した。次に、それぞれの溶液に
７μｌの滅菌蒸留水、３μｌの１０×Ｔ４ＰＬ緩衝液、
０．５μｌのＴ４ ＤＮＡ リガーゼ（１７５単位）、
０．５μｌのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ（２単位）を
加え、２５℃で２時間インキュベートした。反応終了し
た各溶液それぞれ５μｌに大腸菌ＢＭＨ７１−１８株コ
ンピテントセル５０μｌを加え、０℃で３０分間、４２
℃で２分間、次いで０℃で２分間インキュベートした
後、ＬＳ培地１mlを加え、３７℃で１時間インキュベー
トした。更にＬＳ培地２mlと１．５mg／mlのクロラムフ
ェニコール溶液３０μｌを加え３７℃で一晩振とう培養
した。培養後、培養液１mlより煮沸法（ただしフェノー
ル処理、クロロホルム処理、及びRNase 処理は行わな
い）にて粗プラスミドＤＮＡを調製し、１００μｌの滅
菌蒸留水に溶解した。このＤＮＡ溶液５μｌを５０μｌ
の大腸菌ＴＨ３α株（supE、lacZΔＭ１５）又は大腸菌
ＯＭ２７９株（ sup°、lacZΔＭ１５）コンピテントセ
ルにトランスフォームしてＬＳ培地１ml加え、３７℃で
１時間インキュベートした。この溶液に１５μｇ／mlの
クロラムフェニコールとX-gal を含む寒天培地に適当量
プレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
それぞれのコロニー数をカウントし、部位特異的変異導
入の効率を計算した。なお、大腸菌ＴＨ３α株はsupEな
ので、アンバーコドン（ＴＡＧ）がグルタミンコドン
（ＣＡＧ）に復帰してもしなくても菌は生育する。一
方、大腸菌ＯＭ２７９株は sup°なので、アンバーコド
ンがグルタミンコドンに復帰したもののみが、生育す
る。また、lacZ′部分にディレーションが入るとコロニ
ーは白く、入らないとコロニーは青くなる。結果を以下
の表２及び表３に示す。
た。次に、それぞれの溶液を１００℃で３分間インキュ
ベートし、氷中にて急冷した。次に、それぞれの溶液に
７μｌの滅菌蒸留水、３μｌの１０×Ｔ４ＰＬ緩衝液、
０．５μｌのＴ４ ＤＮＡ リガーゼ（１７５単位）、
０．５μｌのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ（２単位）を
加え、２５℃で２時間インキュベートした。反応終了し
た各溶液それぞれ５μｌに大腸菌ＢＭＨ７１−１８株コ
ンピテントセル５０μｌを加え、０℃で３０分間、４２
℃で２分間、次いで０℃で２分間インキュベートした
後、ＬＳ培地１mlを加え、３７℃で１時間インキュベー
トした。更にＬＳ培地２mlと１．５mg／mlのクロラムフ
ェニコール溶液３０μｌを加え３７℃で一晩振とう培養
した。培養後、培養液１mlより煮沸法（ただしフェノー
ル処理、クロロホルム処理、及びRNase 処理は行わな
い）にて粗プラスミドＤＮＡを調製し、１００μｌの滅
菌蒸留水に溶解した。このＤＮＡ溶液５μｌを５０μｌ
の大腸菌ＴＨ３α株（supE、lacZΔＭ１５）又は大腸菌
ＯＭ２７９株（ sup°、lacZΔＭ１５）コンピテントセ
ルにトランスフォームしてＬＳ培地１ml加え、３７℃で
１時間インキュベートした。この溶液に１５μｇ／mlの
クロラムフェニコールとX-gal を含む寒天培地に適当量
プレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
それぞれのコロニー数をカウントし、部位特異的変異導
入の効率を計算した。なお、大腸菌ＴＨ３α株はsupEな
ので、アンバーコドン（ＴＡＧ）がグルタミンコドン
（ＣＡＧ）に復帰してもしなくても菌は生育する。一
方、大腸菌ＯＭ２７９株は sup°なので、アンバーコド
ンがグルタミンコドンに復帰したもののみが、生育す
る。また、lacZ′部分にディレーションが入るとコロニ
ーは白く、入らないとコロニーは青くなる。結果を以下
の表２及び表３に示す。
【００１９】
【表２】 表２ ＴＨ３α株の場合 ─────────────────────────────────── 青 白 合計 （白／合計）×100 サンプルNo.1 2.4×104 6.4×102 2.5×104 2.6 サンプルNo.2 6.0×104 3.2×102 6.0×104 0.5 サンプルNo.3 1.2×105 1.4×103 1.2×105 1.2 サンプルNo.4 1.9×105 2.4×103 1.9×105 1.3 サンプルNo.5 1.5×105 1.2×103 1.5×105 0.8 ───────────────────────────────────
【００２０】
【表３】 表３ ＯＭ２７９株の場合 ─────────────────────────────────── 青 白 合計 （白／合計）×100 サンプルNo.1 7.4×102 8.9×102 1.6×103 55 サンプルNo.2 3.5×102 4.8×102 8.3×102 58 サンプルNo.3 7.1×10 9.4×10 1.7×102 55 サンプルNo.4 7.8 2.9×10 3.7×10 79 サンプルNo.5 0 0 0 ───────────────────────────────────
【００２１】すなわち、No. ４の条件で約７９％の効率
で、部位特異的変異ミュータントが得られた。このよう
に、従来のギャップトデュプレックス法だとファージプ
ラスミド若しくはヘルパーファージの感染により１本鎖
ＤＮＡの調製を必要とするため、全工程に少なくとも３
日を必要としたが、本方法では２日で高い効率で部位特
異的変異ミュータントを得ることができた。
で、部位特異的変異ミュータントが得られた。このよう
に、従来のギャップトデュプレックス法だとファージプ
ラスミド若しくはヘルパーファージの感染により１本鎖
ＤＮＡの調製を必要とするため、全工程に少なくとも３
日を必要としたが、本方法では２日で高い効率で部位特
異的変異ミュータントを得ることができた。
【００２２】実施例３ １９９２年、エルセビア サイエンス（Elsevier Scien
ce) 出版発行、T.O.ヨシダ（Yoshida)ら、モレキュラー
アプローチズ トゥ ザ スタディ アンドトリート
メント オブ ヒューマン ディズィーズ（Molecular
Approaches to the Study and Treatment of Human Dis
ease) 、第８章、第５１〜５５頁に記載のヒトATIII cD
NA（約１．５kbp)をpKF396のHindIII/XbaIサイトに挿入
したプラスミドp396ATを作製し、ヒトATIII 遺伝子に部
位特異的変異を導入しヒトATIII 分子異常症のＤＮＡを
作製することを試みた。図５にプラスミドp396ATの構造
を示す。図中、各プライマーの小文字は変異部位を、
（PvuII)は２箇所のアンバーコドンがいずれもグルタミ
ンコドンに復帰した場合に出現するPvuII サイトを示
す。ヒトATIII 分子異常症は、野生型のArg406がMet に
変わり、コドンＡＧＧがＡＴＧになっているため、制限
酵素StuIの認識配列ＡＧＧＣＣＴが消失する。よって、
部位特異的変異が導入されているかの確認は、StuIで切
断されるかされないかで行える。ポイントミューテーシ
ョンを導入する変異プライマー（Kyt)として、配列表の
配列番号８に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチド
を作製した。すなわち、１０番目のＧがＴに変わるよう
に合成した。次に下記の表４に示すサンプルを調製し
た。
ce) 出版発行、T.O.ヨシダ（Yoshida)ら、モレキュラー
アプローチズ トゥ ザ スタディ アンドトリート
メント オブ ヒューマン ディズィーズ（Molecular
Approaches to the Study and Treatment of Human Dis
ease) 、第８章、第５１〜５５頁に記載のヒトATIII cD
NA（約１．５kbp)をpKF396のHindIII/XbaIサイトに挿入
したプラスミドp396ATを作製し、ヒトATIII 遺伝子に部
位特異的変異を導入しヒトATIII 分子異常症のＤＮＡを
作製することを試みた。図５にプラスミドp396ATの構造
を示す。図中、各プライマーの小文字は変異部位を、
（PvuII)は２箇所のアンバーコドンがいずれもグルタミ
ンコドンに復帰した場合に出現するPvuII サイトを示
す。ヒトATIII 分子異常症は、野生型のArg406がMet に
変わり、コドンＡＧＧがＡＴＧになっているため、制限
酵素StuIの認識配列ＡＧＧＣＣＴが消失する。よって、
部位特異的変異が導入されているかの確認は、StuIで切
断されるかされないかで行える。ポイントミューテーシ
ョンを導入する変異プライマー（Kyt)として、配列表の
配列番号８に示す５′末端リン酸化オリゴヌクレオチド
を作製した。すなわち、１０番目のＧがＴに変わるよう
に合成した。次に下記の表４に示すサンプルを調製し
た。
【００２３】
【表４】 表 ４ ─────────────────────────────────── ５×ＢＡ緩衝液 p396AT6 CQ2 Kyt サンプルNo.6 ４μｌ 25fmol 250 fmol 25pmol サンプルNo.7 ４μｌ 25fmol 0 25pmol ───────────────────────────────────
【００２４】それぞれ蒸留滅菌水で全量２０μｌにした
のち、実施例２と同様の手順で変異導入を行った。ＴＨ
３α株とＯＭ２７９株のコロニー数を下記表５に示す。
のち、実施例２と同様の手順で変異導入を行った。ＴＨ
３α株とＯＭ２７９株のコロニー数を下記表５に示す。
【００２５】
【表５】 表 ５ ─────────────────────────────────── ＴＨ３α株 ＯＭ２７９株 サンプルNo.6 8.2×104 81 サンプルNo.7 1.1×105 0 ───────────────────────────────────
【００２６】サンプルNo. ６のＯＭ２７９株のコロニー
を無作為に７個拾い、１５μｇ／mlのクロラムフェニコ
ールを含むＬＳ培地２mlで、３７℃一晩振とう培養し
た。培養後、培養液１mlより、アルカリ−ＳＤＳ法でプ
ラスミドＤＮＡを抽出し、適当量を制限酵素StuI、Hind
III 、StuI／HindIII 、PvuII で切断処理を行い、部位
特異的変異導入の有無を確認した。その結果、6 個のプ
ラスミドについて部位特異的変異が導入されていた。
を無作為に７個拾い、１５μｇ／mlのクロラムフェニコ
ールを含むＬＳ培地２mlで、３７℃一晩振とう培養し
た。培養後、培養液１mlより、アルカリ−ＳＤＳ法でプ
ラスミドＤＮＡを抽出し、適当量を制限酵素StuI、Hind
III 、StuI／HindIII 、PvuII で切断処理を行い、部位
特異的変異導入の有無を確認した。その結果、6 個のプ
ラスミドについて部位特異的変異が導入されていた。
【００２７】
【発明の効果】本発明によって、遺伝子工学の分野で有
用なより簡便な部位特異的変異導入方法、及びそれに用
いるためのベクターが提供された。
用なより簡便な部位特異的変異導入方法、及びそれに用
いるためのベクターが提供された。
【００２８】
【００２９】配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AACTAGACCG TTTAGCTGGA 20
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAATGGCAAG AGCTTATGCA TTTC 24
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGTTTTTCC GGGGATCGCA GTGG 24
【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCCATACAAC CGATAGATTG TCGC 24
【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CATTCGTGAC TACGCCTAAG CGAGACGAAA TAC 33
【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AACCAGACCG TTCAGCTGGA 20
【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGCTATGACC TGATTACGCC AAGC 24
【００３６】配列番号：８ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGGCCAACAT GCCTTTCCT 19
【図１】本発明による部位特異的変異導入の典型的な流
れを示す図である。
れを示す図である。
【図２】pKF396〜pKF399の構築過程を示す図である。
【図３】pKF396〜pKF399の構造を示す図である。
【図４】pKF296〜pKF299の構築過程を示す図である。
【図５】p396AT6 の構造を示す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 部位特異的変異導入方法において、部位
特異的変異の標的となるＤＮＡ断片を挿入した２本鎖Ｄ
ＮＡベクターを熱変性することにより１本鎖ＤＮＡを形
成させる工程を含むことを特徴とする部位特異的変異導
入方法。 - 【請求項２】 選択プライマーを用いて１本鎖ＤＮＡか
ら２本鎖ＤＮＡを調製する工程を含む請求項１に記載の
部位特異的変異導入方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の方法に用いるた
めのベクターであって、１箇所以上のアンバーコドンを
含むクロラムフェニコール耐性遺伝子又はカナマイシン
耐性遺伝子を有することを特徴とする部位特異的変異導
入用ベクター。 - 【請求項４】 pKF396、pKF397、pKF398、pKF399、pKF2
96、pKF297、pKF298、pKF299から選択される請求項３に
記載のベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06348495A JP3743525B2 (ja) | 1994-03-02 | 1995-02-28 | 部位特異的変異導入方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5479594 | 1994-03-02 | ||
| JP6-54795 | 1994-03-02 | ||
| JP06348495A JP3743525B2 (ja) | 1994-03-02 | 1995-02-28 | 部位特異的変異導入方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07289262A true JPH07289262A (ja) | 1995-11-07 |
| JP3743525B2 JP3743525B2 (ja) | 2006-02-08 |
Family
ID=26395605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06348495A Expired - Fee Related JP3743525B2 (ja) | 1994-03-02 | 1995-02-28 | 部位特異的変異導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3743525B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6448048B1 (en) * | 1996-07-11 | 2002-09-10 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for effecting site-directed mutagenesis |
| WO2009136471A1 (ja) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | 天野エンザイム株式会社 | β－アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
| WO2010047047A1 (ja) | 2008-10-24 | 2010-04-29 | 天野エンザイム株式会社 | タンナーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
| WO2011001722A1 (ja) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | 天野エンザイム株式会社 | マルトトリオシル転移酵素及びその製造方法並びに用途 |
| WO2011007404A1 (ja) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | 天野エンザイム株式会社 | β－アミラーゼを利用した食品の改質方法 |
| WO2014042237A1 (ja) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | 天野エンザイム株式会社 | 糖質酸化酵素とその製造方法並びに用途 |
-
1995
- 1995-02-28 JP JP06348495A patent/JP3743525B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6448048B1 (en) * | 1996-07-11 | 2002-09-10 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for effecting site-directed mutagenesis |
| WO2009136471A1 (ja) | 2008-05-08 | 2009-11-12 | 天野エンザイム株式会社 | β－アミラーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
| WO2010047047A1 (ja) | 2008-10-24 | 2010-04-29 | 天野エンザイム株式会社 | タンナーゼ、それをコードする遺伝子及びその製造法 |
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| WO2011007404A1 (ja) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | 天野エンザイム株式会社 | β－アミラーゼを利用した食品の改質方法 |
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