JPH04252193A - 蛋白質の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え技術によ
り、非耐熱性蛋白質遺伝子を好熱性菌であるサーマス属
菌中において発現させ、耐熱性蛋白質を産生させる方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】一般
に、蛋白質は熱に対して不安定である。しかし、好熱性
菌はその生育温度が５０℃以上と高く、その菌の持つ酵
素は、そのような高い生育温度付近で最大活性を示す。 また、好熱性菌の構成蛋白質は、高い生育温度において
も十分高次構造を保っている。

【０００３】そこで、常温では安定だが高温では不安定
な酵素などの蛋白質を、高い温度においても安定にその
機能を発現するような蛋白質に置き換えることができれ
ば、その酵素などの蛋白質を使用した系が安定化され、
特に、工業的なプロセスにおいての使用に有益である。

【０００４】近年、種々の好熱性菌から各種蛋白質が分
離精製され、常温で安定な蛋白質と同様な機能を有する
蛋白質が幾つか見出されている。しかし、このような方
法では、見出される蛋白質の種類も制限される。常温で
は安定だが高温では不安定な酵素などの蛋白質を、人工
的に、高い温度においても安定にその機能を発現するよ
うな耐熱性の蛋白質に変えることができれば、それら蛋
白質の利用範囲は著しく広がる。

【０００５】Ｌｉａｏらは、中度好熱菌であるバチルス
属菌に、外来遺伝子を核外遺伝子として導入し、カナマ
イシン耐性遺伝子を選択マーカーとしてカナマイシン耐
性の菌を選択し、該外来遺伝子を発現する菌を得ている
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．，８３，５７６−５８０（１９８６）〕。

【０００６】本発明者らは、高度好熱性菌であるサーマ
ス属菌を用い、耐熱性の蛋白質にしたいと考える蛋白質
をコードする非耐熱性構造遺伝子を形質転換し、相同部
位組換えにより上記非耐熱性構造遺伝子を染色体に導入
し、耐熱性蛋白質を得る方法に着目し、鋭意検討した結
果、７０℃以上の高い温度においても安定に機能を発現
するような耐熱性の蛋白質が得られることを知得し、本
発明に到達した。

【０００７】以下本発明を説明するに、本発明の要旨は
、選択マーカーとなり得る遺伝子を欠失させたサーマス
属菌を、該選択マーカー遺伝子と非耐熱性構造遺伝子が
該選択マーカー遺伝子のフランキング領域ではさまれた
ＤＮＡ断片を含むＤＮＡで形質転換して、相同部位組換
えを行い、次いで昇温して、該選択マーカーおよび非耐
熱性構造遺伝子を発現する形質転換体を選択し、さらに
該形質転換体を培養して、該非耐熱性構造遺伝子のコー
ドする蛋白質を耐熱性蛋白質として発現させることを特
徴とする蛋白質の産生方法に存する。

【０００８】以下に本発明を説明する。 ■　　宿主（ホスト） 本発明で用いられる宿主は、サーマス属菌由来で選択マ
ーカーとなり得る遺伝子を欠失した、あるいは欠失させ
たサーマス属菌である。この場合の選択マーカーとは、
外来遺伝子で宿主を形質転換させた場合、容易にスクリ
ーニングできるものである。抗生物質は、一般に、熱に
弱いので、７０℃以上の温度においても安定な蛋白質を
得ようとする場合には、選択マーカー遺伝子としては、
抗生物質抵抗性遺伝子以外の宿主由来の構造遺伝子を選
択マーカー遺伝子とするのが好ましい。このような選択
マーカー遺伝子としては、例えば、実施例に示すような
ＩＰＭＤＨ（イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）
を挙げることができる。ＩＰＭＤＨを選択マーカーとし
た場合、この遺伝子（ｌｅｕＢまたは、ｌｅｕＢ遺伝子
）を含む外来ＤＮＡで形質転換した上記宿主だけがロイ
シンの含まない培地で生育することができる。選択マー
カーとしては、このロイシン合成系の蛋白質以外でも、
例えば、栄養素を合成する過程で用いられる酵素でも良
いし、いわゆる生育するのに不可欠な酵素あるいは蛋白
質（ｈｏｕｓｅ　　ｋｅｅｐｉｎｇ　　ｐｒｏｔｅｉｎ
）であれば、それを用いることも可能である。

【０００９】選択マーカーを欠失させるには、例えば、
後述の実施例Ａの■に示すように、選択マーカーとすべ
き、該選択マーカーをコードする遺伝子を欠失させた、
プラスミドｐＴＨ４ＬＰ５を用いて野生株を形質転換さ
せ、その後、相同部位組換えにより、容易に得ることが
できる。

【００１０】■　　発現ベクター 上記■の宿主を形質転換するために本発明で使用するＤ
ＮＡの特徴は、■で記載した選択マーカー遺伝子と耐熱
性蛋白質として産生させたい所望の蛋白質をコードする
非耐熱性構造遺伝子を、該選択マーカー遺伝子の５′側
と３′側の近傍領域、即ちフランキング領域ではさまれ
たＤＮＡ断片を含むことにある。本発明においては、か
かるＤＮＡは、形質転換体のなかで核外遺伝子として存
在させて発現させるのではなく、後述の相同部位組換え
によって染色体の選択マーカー遺伝子の位置に組み込み
、染色体にもともとあるプロモーター領域、オペレータ
ー領域等を利用して目的の非耐熱性構造遺伝子を発現さ
せるので、選択マーカー遺伝子と非耐熱性構造遺伝子が
該選択マーカー遺伝子のフランキング領域ではさまれた
ＤＮＡ断片は、宿主の染色体と相同組換えし得る形態で
あれば特に制限はない。もとよりかかるＤＮＡ断片を発
現ベクターに組み込んで使用してもよい。

【００１１】本発明の非耐熱性構造遺伝子とは、常温で
は正常な蛋白機能を有するが、温度を上げるに従ってそ
の機能が低下し、ついには失われてしまうような蛋白質
をコードするような遺伝子であり、その由来は種を問わ
ず全てのものが適用できる。例えば、大腸菌のＩＰＭＤ
Ｈや制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶなど）、市販さ
れている制限酵素のうち３７℃付近で反応させるもの（
ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩなど）、ヒトのｔ−
ＰＡ、ＡｐｏＥ、カリクレン、ＩＬ−１からＩＬ−１１
まで、ＧＭ−ＣＳＦとその受容体、ウイルスの構成蛋白
質などの遺伝子が挙げられる。

【００１２】前述のフランキング領域、即ち、「選択マ
ーカー遺伝子の５′側と３′側の近傍領域」としては、
通常、選択マーカーをコードする遺伝子の開始コドンか
ら上流に存在する約２００ｂｐ以上の長さを持つ領域と
終結コドンから下流に存在する約２００ｂｐ以上の領域
が使用される。５′側領域と３′側領域の長さは、長い
分には差し支えない（染色体そのものも、この役割を果
たすことができる）。しかしながら、非耐熱性構造遺伝
子を設計通り宿主に導入するためには一般に大腸菌など
の宿主・ベクターを用いて該発現ベクターを構築して形
質転換を行うのが好ましいのであるが、余り長い領域を
用いると、大腸菌などの宿主・ベクターでの形質転換の
効率が悪くなるので、あらかじめこの事を考慮して５′
側領域及び３′側領域共、約２００ｂｐ〜約３Ｋｂｐ、
好ましくは、約４００ｂｐ〜約１Ｋｂｐの長さの範囲か
ら選んで用いると良い。

【００１３】発現ベクターとしては、図１−図５に示す
プラスミドｐＴＨ４ＢＬＰ５，ｐＬ９５Ｃ，ｐＩＴ１２
，ｐＩＴ１３，ｐＩＴ１２などが使用することができる
。これら発現ベクターに、所望の非耐熱性構造遺伝子を
導入する。基本構成としては、該選択マーカー遺伝子と
非耐熱性構造遺伝子の両方あるいはどちらかが、該選択
マーカー遺伝子の両側の領域ではさまれたＤＮＡを含む
発現ベクターである。

【００１４】■　　宿主の形質転換 宿主の形質転換は、例えば、Ｙ．Ｋｏｙａｍａら（Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２１，３３８−３４０（１９８
６））の報告した方法に従って行うことができる。形質
転換させる時、ＤＮＡまたは、形質転換させたい遺伝子
を持つプラスミドを保持する菌（たとえば大腸菌）を培
養液に混ぜるが、その時の温度は約５０℃から８０℃の
適度なものを選び培養する。

【００１５】また、形質転換時に用いる培養液としては
、サーマス属菌用最少培地を用いカルシウムイオンとマ
グネシウムイオンの２価のイオン濃度を、それぞれ１〜
３ｍＭに調製することにより、形質転換の効率を上げる
ことができるので好ましい。 ■　　相同部位組換え 上記■のようにして形質転換し、約５０〜８０℃の温度
の条件下において相同部位組換えを行う。例えば、図６
に示すように、染色体ＤＮＡの選択マーカー遺伝子のフ
ランキング領域と発現ベクター中の該フランキング領域
との相同の２つの領域が組換えをおこし、染色体上に発
現ベクター中の非耐熱性構造遺伝子が組み込まれる。

【００１６】この組換えは、形質転換後、サーマス属菌
用最少培地プレートで、約５０〜７０℃の温度の条件下
で２４〜４８時間培養している間におこる。充分に相同
組換えを行わせるため、再度、同じ培地プレートで同じ
条件下で培養し、続いてサーマス属菌用栄養培地で約６
０〜７０℃で１２〜２４時間培養後、最後にサーマス属
菌用最少培地で約６０〜８０℃の温度の条件の下で４８
〜９６時間培養する。このように、培養を繰りかえし行
なうことは、相同組換えを充分に行なわせるのに効果的
であると同時に、導入した非耐熱性構造遺伝子を、耐熱
性の構造遺伝子に変えるのにも効果的である。

【００１７】■　　目的の蛋白質が発現している形質転
換体を得る手順。

【００１８】上記のように形質転換を行った後、例えば
、後述の実施例に示すようなサーマス属用最少培地プレ
ートで形質転換の時より５〜１５℃程度低いか同じ温度
で、２４時間から４８時間ぐらい培養する。生育してき
たものを、同培地プレートで今度は、形質転換後の最初
の培養より５℃〜１０℃高いか、同じくらいの温度で、
２４〜４８時間培養する。ここで生育してきた菌をサー
マス属菌用の栄養培地で充分培養し該菌が生育できる範
囲のなるべく高い温度（この温度は組込む非耐熱性蛋白
質の性質による）の条件下でサーマス属菌用最少培地を
用い、４８〜９６時間培養する。

【００１９】このような、培養の繰りかえしや培地の種
類を途中で変えることは、必ずしも、この通りやらなく
てもよいが、重要なのはこのような方法を行なうことに
よって、相同部位組換えや、導入された非耐熱性構造遺
伝子を耐熱性構造遺伝子に変異させることを、充分に行
なわせることにある。

【００２０】生育してきた菌を単離して染色体に目的の
該遺伝子が組込まれているかどうかをサザンハイブリダ
イゼーション等の方法を用いて調べ、該形質転換体から
組込まれた非耐熱性構造遺伝子がコードする蛋白質を精
製し耐熱性を調べる。例えば、それが酵素なら、高い温
度（５０−８５℃）における活性を調べて耐熱度を測定
し、耐熱性を持った目的の蛋白質が得られていることを
確認する。耐熱性を持った目的の蛋白質を産生する菌の
染色体から、始めに組込まれた該非耐熱性構造遺伝子を
クローニングし塩基配列を確認すると、通常、１以上の
塩基が元の塩基から変化している。この塩基の変化によ
り１以上のアミノ酸が変異をおこしている。この変異に
より、この非耐熱性蛋白質は耐熱性のものとなる。この
変異の場所と種類をあらかじめ予想することは難しいが
、上記の様な方法で行なえば、非耐熱性蛋白質を耐熱性
のものとして得ることができる。

【００２１】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はその要旨を越えないかぎり以下
の実施例によって限定されるものではない。なお、以下
の実施例における操作は、特に記載する場合を除き次の
Ｉ−Ｖの方法によった。

【００２２】Ｉ　　制限酵素によるＤＮＡの切断は、市
販されている制限酵素を用い、その標品に示されている
組成の緩衝液を用い、１μｇのＤＮＡに対し２単位の酵
素を使用して、３７℃で１時間反応させた。

【００２３】ＩＩ　　大腸菌の形質転換はＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ２４９，Ｃｏ
ｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｓ．
大腸菌からのプラスミドの精製は、同ｐ８６の記載方法
に従った。

【００２４】ＩＩＩ　Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅによるＤ
ＮＡの連結は、以下のようにして行った。連結する２個
の断片は、１μｇ／１０μｌになるように、連結用緩衝
液〔６６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、６．６ｍＭ
の塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオスレイトールか
らなる。〕に溶解し、６６μＭのＡＴＰを加え、さらに
Ｔ４リガーゼを０．１単位／μｇＤＮＡとなるように加
えて４℃で１８時間反応させた。

【００２５】ＩＶ　　ＤＮＡ溶液からのＤＮＡ精製のた
めには、次のような操作を行う。反応液等のＤＮＡを含
む溶液に対し等量のフェノール／クロロホルムを加えた
後激しく混和し、遠心分離操作により核酸を含む水相を
回収するいわゆるフェノール／クロロホルム抽出を行う
。

【００２６】この様にして得られた水相に、１０分の１
量の３Ｍ酢酸ナトリウムもしくは等量の４Ｍ酢酸アンモ
ニウムと水相の２倍容のエタノールを加えて混和し、−
２０℃で一晩もしくは−８０℃で１５分以上静置した後
、１５，０００回転で遠心を行い核酸を沈澱物として回
収する、いわゆるエタノール沈澱を行う。

【００２７】Ｖ　　ＤＮＡのゲルからの切り出しは、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ．
１６４，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒに
記載の方法に従った。

【００２８】ＶＩ　　好熱菌サーマス属の形質転換は、
基本的にはＹ．Ｋｏｙａｍａら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１２１，３３８−３４０（１９８６））の報告した
方法に従った。また培地組成については、２価イオンの
濃度による影響を考え次のようなものを用いることもで
きる。これをサーマス属菌用最少培地（８ｇポリペプト
ン、４ｇ酵母エキス、２ｇＮａＣｌ／滅菌水１リットル
；上記組成の他に２ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　，２ｍＭ　　
ＣａＣｌ２　の濃度で２価イオンが含まれている。これ
らを混合後、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調製した。）と呼
び用いることとした。

【００２９】またプレートを作成する場合、１リットル
用の組成にまず滅菌水５００ｃｃを加え、それとは別に
ジュランガム１０ｇ／５００ｃｃ調製し別々にオートク
レーブ後、混ぜ合わせ、冷めないうちに（約６０−７０
℃以上あるうちに）シャーレにまく。またジュランガム
を溶かすときに水を加熱しながら、スターラーで攪拌し
、ジュランガムを少しずつ入れ溶かすようにして泡を作
らないようにする。この操作は好熱菌を死滅させるのに
有効であった。また形質転換する場合でなく、普通の培
養の時は、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．８
９，６７７−６８２（１９８１））に従い、これをサー
マス属菌用栄養培地として以下に用いた。この培地での
プレートの作成は、前記のプレートの作成方法と同様に
おこなった。

【００３０】ＶＩＩ　ＤＮＡの突出末端を平滑末端化す
る方法は次の様にして行った。つまり、約０．１−２μ
ｇのＤＮＡに２０μｌの滅菌水、１０×ｎｉｃｋ　　ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　　ｂｕｆｆｅｒ（この溶液の組
成は、次の文献Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ
（１９８２）　　Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒ
ｂｏｒの記載の方法に従った）２．５μｌを加え、さら
にこの溶液にｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
のそれぞれの濃度が２ｍＭになっている溶液を１μｌ加
え、最後に東洋紡（株）製のＫｌｅｎｏｗ　　ｆｒａｇ
ｍｅｎｔを０．５μｌ（５単位）加え、１６℃、３０分
反応させた。

【００３１】Ａ　　ｌｅｕＢ遺伝子を欠損させた好熱菌
（サーマス属菌）の作成 ■　　好熱菌（サーマス属菌）のｌｅｕＢ遺伝子とその
周辺の領域の単離 該遺伝子の単離は、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．８９，６７７−６８２（１９８１））に従い、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ　認識配列を両側に持ちｌｅｕＢ遺伝子を
含むＤＮＡ断片（この様なＤＮＡ断片を両末端の制限酵
素の種類の名前を使って今後呼ぶこととする。つまりこ
の場合は、ＨｉｎｄＩＩＩ　断片ということとなる）を
プラスミドｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩＩＩ　認識配列に
ライゲーションしてｐＨＢ１を得た。更に、上記の報告
に従い前記ＤＮＡ断片を短くし、ＢａｍＨＩ認識配列を
中に一つと両側に持ち、ｌｅｕＢ遺伝子を含む長さ約９
６０ｂｐのＤＮＡ断片を得て、報告通りのプラスミドｐ
ＨＢ２を得た。

【００３２】■　　ＨＢ２７のｌｅｕＢ遺伝子のみ欠損
させた株ＭＴ１０６の作成 図１に示すｐＨＢ１　　２μｇを１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ及び
６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　から成る緩衝液（以下、「緩衝
液Ｈ」と称する）１００μｌ中で、制限酵素ＢａｍＨＩ
　　０．２単位と３７℃、１時間反応させ、このＤＮＡ
を部分切断させた。この反応液を０．８％アガロースで
常法に従い電気泳動を行い図１に示す欠失領域のみが除
かれた長さのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し
た。このＤＮＡ断片を前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，ｐ１６６に従って乾燥させた。このサン
プルを滅菌水４０μｌで溶解した後、このＤＮＡ溶液３
．５μｌを用いて反応液ｔｏｔａ１１０μｌの系でＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ４単位によってセルフライゲーショ
ンさせ、常法によりエタノール沈澱後、このサンプルを
乾燥させた。このサンプルを滅菌水４０μｌで溶解した
後、このＤＮＡ溶液２０μｌを反応溶液２２μｌで制限
酵素ＰｍａＣＩ　　１２単位で３７℃、１時間反応後（
この制限酵素ＰｍａＣＩを用いたのは、前述の除いたは
ずの欠失領域が除かれていなかった場合、欠失領域内の
みで切断されるこの酵素によって欠失領域を除けなかっ
たプラスミドだけが形質転換されないようにするためで
ある。）、大腸菌ＨＢ１０１をこの溶液で形質転換させ
、形質転換体を単離し、そこからプラスミドを常法に従
い調製し図１に示すｐＴＨ４ＢＬＰ５を得た。

【００３３】このｐＴＨ４ＢＬＰ５　　５μｇをＨｉｎ
ｄＩＩＩ　７単位により１０μｌの系で切断し、この溶
液をサーマス属菌用最少培地４８８μｌに混ぜ、サーマ
ス属菌の野生株の一つであるＨＢ２７５μｌ（このよう
に形質転換させる場合、菌を充分に生育させた、例えば
１昼夜、溶液を５０％のグリセロールとして保存させた
ものを使用する）を加え７０℃で１昼夜培養した。これ
をサーマス属菌用栄養培地プレートに１枚あたり２００
コロニー出るようにしてまき、７０℃で１昼夜培養した
。次に、サーマス属菌用最少培地プレートに常法に従っ
てレプリカし、７０℃で２昼夜培養した。ここでサーマ
ス属菌用栄養培地では生育でき、サーマス属菌用最少培
地で生育できない、つまりロイシン要求性を持った株を
選択した。これをＭＴ１０６と名づけた。

【００３４】Ｂ　　好熱菌（サーマス属）を形質転換さ
せるインテグレーションベクターの作成 ■　　ベクターｐＢＬ５Ｃの作成 図２に示す様に、実施例Ａの■と同様の方法でｐＨＢ１
より今度はｌｅｕＢ遺伝子を含む領域とその両どなりに
位置するＢａｍＨＩ断片がｐＨＢ１と同じ順番になるよ
うにしてｐＵＣ１９のＢａｍＨＩの位置に挿入して得ら
れたｐＴＨ４ＢＬ５　　１μｇをＢａｍＨＩで部分分解
し、平滑末端化してセルフライゲーションし大腸菌ＪＭ
１０９を形質転換させた。これからプラスミドを調製し
ｐＢＬ５Ｃを得た。このプラスミドは、図２に示す様に
ｌｅｕＢ遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片の５′側のＢａｍ
ＨＩ断片の５′末端は、ＢａｍＨＩ認識配列が失われて
いる。

【００３５】■　　異種遺伝子発現用ベクターの作成ｐ
ＢＬ５Ｃ　　１０μｇをＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ　で
切断した。これに滅菌水３８μｌと５×Ｂａ１３１ｂｕ
ｆｆｅｒ（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７．
２）、３Ｍ　　ＮａＣｌ，６２．５ｍＭ　　ＣａＣｌ２
　，６２．５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　，５ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ）１０μｌを加え混和後、Ｂａ１３１（ＮＥＢ社製）
２（２単位）を加え３０℃、１０秒反応後、すかさず０
．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　　１０μｌを混和しエタノール沈
澱を行った。次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末
端化した後電気泳動でｌｅｕＢ遺伝子が含まれている方
のＤＮＡ断片を切り出し、Ｖに従って後処理後乾燥させ
た。これを滅菌水４０μｌに溶解させた。これをＡ液と
する。

【００３６】次にｐＵＣ１１９　　１０μｇをＨｉｎｄ
ＩＩＩ　とＥｃｏＲＩで切断し、前述のＶＩＩ　の方法
に従って、平滑末端化し常法によりＩＶの方法に従いエ
タノール沈澱後、乾燥させ滅菌水１０μｌに溶解させた
。これをＢ液とする。Ａ液３８μｌとＢ液２μｌを混和
させ、ライゲーション後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換
させ、これからｐＬ９５Ｃを得た。このプラスミドは、
いわゆるマルチクローニングサイトを失っている。この
プラスミドを実施例Ａの■と同様にしてｌｅｕＢ遺伝子
のみを欠失させたｐＩＴ１２を（図３）得た。

【００３７】また、ｐＨＢ１をＢａｍＨＩで切断後、ｌ
ｅｕＢ遺伝子を持つ約１．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片をｐ
ＵＣ１９のＢａｍＨＩ認識配列部位に挿入したｐＵｌｅ
ｕＢを常法により得て、実施例Ｂの■示したのと同様に
ｌｅｕＢ遺伝子の３′側にあるＢａｍＨＩ認識配列部位
が喪失したプラスミドｐＵｌｅｕＢＡを得た。これをＫ
ｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断後エタノール沈澱、乾燥後、
滅菌水２５０μｌに溶解した。この溶液１０μｌと図４
に示した３つの制限酵素認識配列（ＢａｍＨＩ，Ｅｃｏ
ＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ　）を持つＤＮＡをライゲーショ
ンさせ、ｐＵＬＢＨＥを得た。（図４）次にｐＵＬＢＨ
ＥをＢａｍＨＩで切断後、ｌｅｕＢ遺伝子を持つ約１．
２ｋｂのＢａｍＨＩ断片をｐＩＴ１２のＢａｍＨＩ認識
配列部位に挿入したｐＩＴ１３を常法により得た。（図
５）この様にして得られたプラスミドｐＩＴ１３の３つ
の制限酵素認識配列（ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ　）には他にも任意の制限酵素認識配列を導入
することが可能で（この場合ｐＩＴ１３が切断されない
制限酵素を選択する事が普通である）、この手段により
このプラスミドを改良する事ができる。

【００３８】Ｃ　　好熱菌のＩＰＭＤＨ（イソプロピル
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）と常温菌である枯草菌のＩ
ＰＭＤＨのキメラ蛋白の作成とその耐熱化■　　常温菌
蛋白質の耐熱化とその遺伝子の解析該キメラ蛋白質は常
温では活性があるが、好熱菌の生育温度である約５５℃
以上では活性を失う。そこで次の様な方法で該蛋白質を
耐熱化した。

【００３９】Ｉｍａｉら（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ
．Ｒｅｓ．１５．４９８８（１９８７））によって報告
された、バチルス属菌（枯草菌）のＩＰＭＤＨ（イソプ
ロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）の遺伝子の塩基配列
のナンバー（開始コドンのＡＴＧのＡを１としたもの）
で２２９番目から４０５番目の塩基の領域に相当するＤ
ＮＡ断片を好熱菌であるサーマス属菌のＩＰＭＤＨ（イ
ソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）のアミノ酸レベ
ルで相当するＤＮＡの領域と入れ換え、該キメラ遺伝子
を含むＢａｍＨＩ断片（約１．２ｋｂ）を、ｐＵＣ１９
のＢａｍＨＩ認識部位に導入しプラスミドｐＮＯＢＬ２
を得た。次いで、該キメラ遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片
を、ｐＢＬ５ＣのｌｅｕＢを含むＢａｍＨＩ断片と入れ
かえ、これをｐＩＴＩＮＢ２とした。

【００４０】そこで、ＭＴ１０６をｐＩＴＩＮＢ２で形
質転換（７０℃）させ、サーマス属菌用最少培地プレー
トにまき６０℃で２昼夜培養後、生育してきたコロニー
を更にサーマス属菌用最少培地プレートにまき７０℃で
１昼夜培養した。これで得られた株をＮＢ２６と名付け
た。これをサーマス属菌用栄養培地５ｃｃで１昼夜、７
０℃で振とう培養し、この培養液５ｃｃをサーマス属菌
用最少培地プレートにひろげ、８０℃で培養した。生育
してきたコロニーを拾いＭＮ２６１と名付けた。

【００４１】この株に該キメラＩＰＭＤＨ遺伝子が入っ
ているか否かを確かめるために■染色体ＤＮＡの単離■
サザンブロッティング■ハイブリダイゼーション■キメ
ラ遺伝子の塩基配列の決定を行った。■、■、■は全て
、文献Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）
　　Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒの記載
に従い該キメラＩＰＭＤＨ遺伝子が入っていることを確
認した。さらに、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．８９，６７７−６８２（１９８１））に従って該キ
メラＩＰＭＤＨ遺伝子を単離し、該構造遺伝子の全塩基
配列を文献Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ（１
９８２）　　Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏ
ｒの記載に従い決定した。元の配列から変異があったの
は、Ｎ末端から数えて９３番目のアミノ酸であるイソロ
イシンがロイシンに変異し、遺伝子は１番目のコドンで
あるＡがＣに変わっていた。

【００４２】この変異が耐熱化のために起きたことを確
かめるために次の様な操作を行った。前記で塩基配列を
決定した該変異キメラＩＰＭＤＨ遺伝子を含む約１．２
ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩ認
識配列に常法により挿入しｐＵＩＨ１２を得た。この時
、該キメラＩＰＭＤＨ遺伝子の＋鎖が、ｐＵＣ１１９の
ｌａｃＺ遺伝子のプロモーターと同じ鎖になる様に入っ
ているものを選択した。この選択方法の一つとして次の
様な操作を行った。ｐＵＩＨ１２で大腸菌ＪＡ２２１を
形質転換しＭ９培地（大腸菌用最少培地；文献Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）　　Ｃｏｌ
ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒの記載に従い作成
した）にチアミンとトリプトファンを加えて生育するコ
ロニーＭＮ２６３を選んだ。

【００４３】■　　該耐熱化キメラ蛋白質の精製と活性
測定■で得たＭＮ２６３を３リットルの５０μｇ／ｃｃ
アンピシリンを含む２×ＹＴ（文献Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）　　Ｃｏｌｄ　　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒの記載に従い作成した）で培
養し湿菌体約３０ｇを得た。この菌体からＴａｎａｋａ
らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９，６７７−６８２（１
９８１））に従い、ＩＰＭＤＨの活性のあるフラクショ
ンを得た。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（文献Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）　　Ｃｏｌｄ　
　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）にかけ単一バンドを
常法により採取（文献Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８２）　　Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　
Ｈａｒｂｏｒ）し、５０％グリセロールを加え−２０℃
で保存した。

【００４４】活性の測定は、前記のグリセロールで保存
された溶液を用いて、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．８９，６７７−６８２（１９８１））に準じて
行った。結果は、図７に示すようにＭＮ２６３から精製
した該耐熱化キメラ蛋白質は単にキメラにしただけの該
蛋白質とは明かな耐熱性の差があった。もちろん、この
差はＣの■で示した様に常温菌である枯草菌のＩＰＭＤ
Ｈの遺伝子由来の塩基配列が一つ変異し、それによりア
ミノ酸が一つ変異したことによる差である。

【００４５】

【発明の効果】本発明方法により、人為的に任意の蛋白
質に耐熱性を持たせる事ができる。これにより、従来、
常温でもともと不安定であった蛋白質や、長く活性を保
持できなかった蛋白質をその性質を失うことなく、それ
らの蛋白質の安定性や、活性の持続性を高めることがで
きる。

【００４６】本発明のかかる効果は、常温では活性があ
り安定な蛋白質でも、温度を上げるにつれ、その性質が
少しずつ失うような全ての蛋白質に適用し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】選択マーカーであるＩＰＭＤＨの構造遺伝子を
欠失させたプラスミドｐＴＨ４ＢＬＰ５を作成するため
の概略図である。図中、Ｂ，Ｈ及びＫは、それぞれＢａ
ｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ　、ＫｐｎＩの認識配列を示し
、長方形は欠失領域を示す。

【図２】好熱菌（サーマス属菌）のＩＰＭＤＨ（イソプ
ロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ）の遺伝子と常温菌で
ある枯草菌のＩＰＭＤＨ遺伝子のキメラ蛋白遺伝子をも
つプラスミドｐＩＴＩＮＢ２を作成するための概略図で
ある。

【図３】図２に示すｐＢＬ５Ｃからのサーマス属菌由来
のＤＮＡと、ｐＵＣ１１９由来のマルチクローニングサ
イトを失ったＤＮＡ断片を連結したプラスミドｐＬ９５
Ｃを得るための概略図と、ｐＬ９５ＣのｌｅｕＢを含む
ＢａｍＨＩ断片のみ欠失させたプラスミドｐＩＴ１２を
得るための概略図を示す。

【図４】クローニングサイトＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ　及び、ＥｃｏＲＩをもつプラスミドｐＵＬＢＨＥを
得るための概略図である。

【図５】クローニングサイトＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ　及び、ＥｃｏＲＩをもつプラスミドｐＩＴ１３を得
るための概略図である。

【図６】本発明における相同部位組換えの例を説明する
ための概略図を示す。

【図７】７０℃熱処理後のＩＰＭＤＨの残存活性（５０
℃で測定）を示す図である。横軸は熱処理時間（分）を
示し、縦軸は残存活性（％）を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　選択マーカーとなり得る遺伝子を欠失
   させたサーマス属菌を、該選択マーカー遺伝子と非耐熱
   性構造遺伝子が該選択マーカー遺伝子のフランキング領
   域ではさまれたＤＮＡ断片を含むＤＮＡで形質転換して
   、相同部位組換えを行い、次いで昇温して、該選択マー
   カーおよび非耐熱性構造遺伝子を発現する形質転換体を
   選択し、さらに該形質転換体を培養して、該非耐熱性構
   造遺伝子のコードする蛋白質を耐熱性蛋白質として発現
   させることを特徴とする蛋白質の産生方法。
2. 【請求項２】　　選択マーカー遺伝子が、イソプロピル
   リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とす
   る請求項１記載の蛋白質の産生方法。