KR100533116B1

KR100533116B1 - 내열성 ｄＴＤＰ-글루코스 합성효소 및 그 유전자

Info

Publication number: KR100533116B1
Application number: KR10-2003-0085500A
Authority: KR
Inventors: 우진석; 송재경; 이희찬; 류광경; 강선엽; 김대희; 김동현; 양지영; 정영수; 이의복
Original assignee: 주식회사 진켐
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2003-11-28
Publication date: 2005-12-02
Also published as: KR20050051839A

Abstract

본 발명은 호열성 균주인 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK24 유래의 dTDP-글루코스 합성효소(dTDP-glucose synthase), 그 유전자 및 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 이용한 dTDP-글루코스 합성효소의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 dTDP-글루코스 합성효소는 고온에서 안정한 특성을 가지고 있어, 항생제 개발 등 이러한 내열성 효소를 필요로 하는 각종 분야에 매우 유용하게 적용될 것으로 기대된다.

Description

내열성 ｄＴＤＰ-글루코스 합성효소 및 그 유전자 {A Heat-resistant dTDP-Glucose Synthase and Its Gene}

본 발명은 호열성 균주인 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK24 유래의 dTDP-글루코스 합성효소(dTDP-glucose synthase: dTGS), 그 유전자 및 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 이용한 dTDP-글루코스 합성효소의 제조방법에 관한 것이다.

dTDP-글루코스 합성효소는 글루코스-1-인산과 dTTP와 반응하여 dTDP-글루코스를 합성하는 효소로 공지되어 있다 (Li, Q. et al., Microbiol., 149: 2463-74, 2003; Yoo, J.C. et al., J. Biochem. Mol. Biol.. 32: 363-9, 1999; Marolda, C.L. & Valvano, M.A., J. Bacteriol., 177: 5539-46, 1995; Ma, Y. et al., Microbiol., 143: 937-45, 1997). 이러한 dTDP-글루코스 합성효소는 스트렙토마이시즈 (Streptomyces), 비브리오(Vibrio), 에쉐리히아(Escherichia) 속 등의 각종 미생물에서 다양하게 발견되어 정제된 바 있다.

일반적으로, dTDP-글루코스 합성효소는 생체내에서, 하기 반응식 1에 제시된 바와 같이, 글루코스-인산과 dTTP와 반응에 의해 dTDP-글루코스로 전환시키는 기능을 가진다.

상기 dTDP-글루코스 합성효소의 생체내 역할과 관련하여, 마크롤라이드(macrolide), 안트라사이클린(anthracycline) 등의 항생물질들을 비롯해 생물학적 활성을 지닌 많은 이차 대사물질들은 일반적으로 디옥시헥소즈(deoxyhexose) 또는 디옥시헥소즈 부분을 포함하고 있으며, 이들 디옥시당은 미생물내에서 상기 dTDP-글루코스 합성효소에 의해 이들의 출발물질인 dTDP-글루코스로 전환된다 (Sohng, J.K. et al., J. Biochem. Mol. Biol., 31:475-83, 1998).

상기 이차 대사물질의 디옥시당(글리콘)은 항생물질의 생물학적 활성 및 친화력에 직간접적으로 관여하고 있는 중요한 부분으로, 항생제의 내성에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 여러 가지 디옥시당을 어글리콘에 결합시켜 다양한 화합물을 제조함으로써, 기존의 항생제보다 훨씬 강력하고 내성이 극복된 항생 신물질을 개발하기 위해 광범위한 노력을 기울이고 있다. 이를 위해서는, 다량의 디옥시당 생합성 출발물질인 dTDP-글루코스가 필요하다.

내열성 효소는 구조적으로 안정하여 높은 온도에서 작용함으로서 효소공학적으로 매우 유용한 연구대상이 되어 왔다. 또한 내열성 효소는 유전공학적인 생산이 용이하고, 그 재조합 효소의 정제가 단순한 열처리 과정으로 가능하여 학문적으로나 산업적으로 활용의 폭이 넓다고 할 수 있다. 더 나아가 환경친화적인 정밀화학산업기술의 대체방안을 마련할 수 있는 대안으로 떠오르고 있다. 이러한 맥락에서 기술선진국에서는 유전체 연구사업중에서 제일 먼저 호열균의 유전체 해석에 전념하였고, 그 결과로 유전체 정보를 이용하여 유전체 기능분석과 산업기술개발에 집중 노력하고 있다.

이러한 흐름에 맞추어 본 발명자들은 화산온천에서 서식하는 호열균 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK24의 유전체 해석연구를 진행하여 왔고, 그 중에서도 탄수화물 효소관련 유전체 연구를 수행하여 써머스 칼도필러스가 생산하는 TDP-디하이드라타제(dTDPDH) 및 그 유전자에 대한 특허를 출원한 바 있다 (대한민국 특허공개 2003-0006794).

본 발명자들은 호열성 균주 써머스 칼도필러스 GK24에서 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 분리하여, 상기 유전자를 대장균에서 발현시킨 다음, 상기 발현된 dTDP-글루코스 합성효소의 활성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK24 유래의 내열성을 가지는 dTDP-글루코스 합성효소 및 그 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 이용한 dTDP-글루코스 합성효소의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 dTDP-글루코스 합성효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.

상기 dTDP-글루코스 합성효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK24 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 dTDP-글루코스 합성효소를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 미생물을, 상기 dTDP-글루코스 합성효소 유전자의 발현을 유도하는 조건하에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 배양물로부터 dTDP-글루코스 합성효소를 회수하는 단계를 포함하는 내열성 dTDP-글루코스 합성효소의 제조방법을 제공한다.

dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 분리하기 위하여, 우선 써머스 칼도필러스 GK24의 전체 염색체 DNA를 제한효소에 의해 약 30~50kb의 단편으로 절단하였다. 상기 절단된 단편을 코스미드 벡터와 람다 패킹 시스템(lamda packing system)을 이용하여 써머스 칼도필러스 GK24 염색체 유전자 라이브러리(library)를 제작한 후, PCR 방법에 의해 제조된 dTDPDH의 유전자 프로브(probe)를 사용하여 상기 라이브러리로부터 이 효소를 포함하는 BamHI 4.2kb 유전자 단편을 동정하고, 이 유전자 단편을 pBluscript 벡터내로 도입시켜 벡터 pKCB80을 제조하였다.

상기 BamHI 4.2kb 유전자 단편을 포함하는 벡터 pKBC80의 염기서열을 분석한 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 총 4,204개의 염기로 구성되어 있으며, 그 중에 첫 번째 orf1이 dTDP-글루코스 합성효소와 상동성을 보이며 총 1,068bp로 구성되어 있다. dTDP-글루코스 합성효소 유전자는 BamHI 4.2kb 유전자 단편내 33bp에서 시작하여 1100bp에 위치하고 있으며, 총 1,068개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 상기 유전자와 그 효소의 상세한 염기서열 및 아미노산 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2로서 제시되어 있다.

본 발명에 따라 내열성의 dTDP-글루코스 합성효소를 제조하는 방법은 먼저, 시작 코돈과 제한효소 부위를 포함하도록 변형된 dTDPDH 유전자를 PCR 방법에 의해 합성하고, 이를 발현벡터 pET32a내로 삽입하여 목적하는 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 함유하는 신규 재조합 벡터 pSNP110을 제조하였다. 상기 재조합 벡터 pSNP110의 제조과정은 도 2에 개략적으로 도시되어 있다.

상기 재조합 벡터를 이용하여 미생물 예를 들면, 대장균(E. coli)을 형질전환시켜 형질전환체를 제조하고, 이 형질전환된 미생물을 배양함으로써, dTDP-글루코스 합성효소 유전자의 발현을 유도하였다. 이후, 배양된 미생물 균체로부터 내열성 재조합 효소(dTDP-글루코스 합성효소)를 수득하였다.

따라서, 본 발명은 상기 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pSNP110 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 E. coli BL21(DE23)/pSNP110을 제공한다.

상기 E. coli BL21(DE23)/pSNP110을 배양하여 발현된 dTDP-글루코즈 합성효소를 분리한 다음, 여러 조건에서 효소활성을 측정하였다.

본 발명의 재조합 dTDP-글루코스 합성효소 효소는 종래에 분리, 정제 및 클로닝한 다른 효소와는 달리 약 70~80℃의 고온에서도 높은 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자의 형질전환 숙주세포로 대장균만을 예시하였으나, 다른 종류의 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 숙주세포로 사용하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 써머스 칼도필러스 GK24로부터 전체 염색체 DNA의 분리

당해 기술분야에 알려진 방법(Taguchi, H. et al., J. Biochem., 93:7-13, 1983)에 따라, 써머스 칼도필러스 GK24 균주(Taguchi, H. et al., J. Biochem., 91:1343-8, 1982)를 72℃에서 약 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하였다. 균체 2g을 식염수(saline)-EDTA로 수회 세척한 후, 5㎖의 식염수-Tris에 용해시켜 전체 염색체 DNA를 분리 및 정제하였다.

실시예 2: dTDP-글루코스 합성효소 유전자의 동정

본 실시예에서는 다음의 과정에 의해 써머스 칼도필러스 GK24의 전체 염색체 DNA로부터 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 분리하고, 그 염기서열을 결정하였다.

상기 실시예 1에서 분리한 써머스 칼도필러스 GK24의 전체 염색체 DNA를 제한효소인 Sau3A를 이용하여 약 30~50kb의 길이가 되도록 부분 절단하였다. 유전자 라이브러리를 만들기 위하여, 상기 절단된 염색체 유전자 단편들을 다중복제 코스미드(cosmid) 벡터인 pOJ446에 삽입하였다. 우선, 제한효소 HapI와 BamHI으로 절단한 pOJ446(Eli Lilly Co.)을 상기 유전자 단편들과 혼합하여 결합(ligation)시켰다. 이후, 람다 팩킹 시스템(lamda packing system)에 의해 이 결합 혼합물을 E. coli XL1-blue와 혼합하여 형질도입시킨 후, LB 고형배지에 37℃에서 12시간 동안 배양하여, 이것을 써머스 칼도필러스 GK24 염색체 유전자 라이브러리로서 사용하였다.

상기에서 제조한 써머스 칼도필러스 GK24 유전자 라이브러리로부터 dTDP-글루코스 4,6-디하이드라타제 유전자를 찾기 위해, 후술하는 바와 같이, 우선 PCR 프라이머를 합성한 후, 이를 이용한 PCR 방법에 의해 유전자 프로브(probe)를 제조하였다.

PCR 프라이머는 염기서열이 알려져 있는 dTDP-글루코스 4,6-디하이드라타제 유전자중 유사성이 가장 높은 5종의 유전자, graE, chlE, strE, orf2 및 rfbB(Yoo, J.C. et al., J. Microbiol. Biotechnol., 9:206-12, 1999)의 염기서열 중 공통서열을 바탕으로 하되, 코돈내 G/C 함량(일반적으로 써머스 계통 균주의 유전자 G/C 함량은 69%이며, 방선균의 G/C 함량은 첫 번째 코돈의 경우 50%, 두 번째 코돈의 경우 75% 그리고 마지막 코돈의 경우 90% 이상임)을 함께 고려하여, 단순한 유전자 코돈을 선택하여 제작하였다.

상기 5종의 dTDPDH 유전자중 특히 높은 공통성과 단순한 유전자 코돈을 보이는 곳을 선택하여 다음의 서열을 갖는 2종의 PCR 프라이머 JKS1[HFAAESHV 5'-CACTTCGGSGGSGAGTCSCACGT-3'(서열번호 3) S=G/C] 및 JKS2[STDEVYG 5'-GGSCCGTAGTTGTTSGAGCA-3' (서열번호 4) S=G/C]를 합성하였다.

통상의 PCR 방법에 따라, 상기한 프라이머를 이용하여 써머스 칼도필러스 GK24 염색체 유전자로부터 340bp의 dTDP-글루코스 4,6-디하이드라타제 유전자 프로브를 수득하였다.

상기 유전자 프로브를 이용하여 통상의 콜로니 혼성화(colony hybridization) 방법에 의해 써머스 칼도필러스 라이브러리로부터 10개의 콜로니를 분리하고, 그중 하나를 코스미드 pSMTC1으로 명명하였다.

이를 제한효소 BamHI으로 절단하여 dTDP-글루코스 4,6-디하이드라타제 및 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 포함하고 있는 BamHI 4.2kb 유전자 단편을 수득한 후, 이를 pBluscript 벡터(Stratagene Co.)내로 도입시켜 플라스미드 pKCB80을 제조하였다.

이후, 상기 플라스미드 pKCB80을 서브 클론과 제거 방법으로 주형을 제작하여 자동 염기서열 분석기로 분석한 결과, 도 1에 도시된 바와 같은 유전자 지도와 서열번호 1의 염기서열을 얻었다.

제한효소 절단, 코스미드 라이브러리의 제조, 형질전환, 콜로니 혼성화 방법 등은 일반적인 분자생물학적 실험방법(Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel et al. (1995) Short protocols in Molecular Biology. 3rd ed., John & Wiley Sons)에 따라 실시하였다.

도 1에 따르면, BamHI 4.2kb 유전자 단편은 총 4,204개의 염기로 구성되어 있으며, 총 3개의 orf를 포함하고 있다. 첫 번째 orf1은 1,068bp의 염기서열로 이루어진 유전자로, dTDP-글루코스 합성효소와 상동성을 가지고 있으며, orf2는 dTDP-글루코스 4,6-디하이드라타제와 상동성을 보이는 981bp의 염기서열이고, 마지막 orf3은 888bp로 구성된, dTDP-4-케토-L-람노즈 환원효소와 상동성을 나타내는 유전자인 것으로 밝혀졌다.

그중, dTDP-글루코스 합성효소 유전자는 BamHI 4.2kb 유전자 단편내 33bp의 시작 코돈(ATG)으로부터 출발하여 1100bp의 종결 코돈(TGA) 사이에 위치하고 있으며, 총 1,068개의 뉴클레오티드로 구성되고, G+C 함량은 68% 이었다. TDP-글루코스 합성효소 유전자는 기존에 알려져 있는 스트렙토마이스 아질라시우스(Streptomyces agillaceous) dTDP-글루코스 합성효소 유전자인 rmlA-2(Lombo, F. et al., J. Bacteriol., 179:3354-7, 1997), 스트렙토코코스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiac)의 rfbA(Tettelin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:12391-6, 2002), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)의 rmlA(Li, Q. et al., Microbiol., 149:2463-74, 2003), 포토라드스루미네신스(Phtorhabdusluminescens)의 rffH(Parkhill, J. et al., Nature, 413:523-7, 2001) 및 스트렙토마이스 그리세우스 (Streptomyces griseous)의 strD(Distler, J. et al., Nucleic Acids Res., 15:8041-56, 1987) 효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, 대략 45~73%의 상동성을 나타냈다.

이 유전자로부터 발현된 폴리펩타이드는 총 355개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 계산된 분자량은 38kDa이었다. 상기 발현된 dTDP-글루코스 합성효소의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다.

실시예 3 : 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조

본 실시예에서는 dTDP-글루코스 합성효소 유전자의 발현을 위하여, 이 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 미생물을 제조하였다.

이에 앞서, 먼저 다음과 같은 dTDP-글루코스 합성효소 유전자의 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 2종을 합성하였다. 정방향 프라이머 TGS-1은 상기 dTDPDH 유전자의 시작 코돈(ATG)의 앞부분에 해당하는 30-35번째 염기를, 발현 벡터내로 클로닝하기 위하여 제한효소 NdeI 부위를 포함하도록 변형하여 염기서열 5'-AGT CATATG AAGGCTCTCGTGC-3'(서열번호 5)를 제작하였고, 역방향 프라이머 TGS-2는 1101-1106번째 위치의 염기를 HindIII 제한효소 부위를 갖도록 변형하여 5'-CGA AAGCTT TCATGTGTGGATC-3'(서열번호 6)을 제작하였다.

실시예 2의 pKCB80을 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 62℃의 아닐링(annealing), 74℃의 중합(polymerization) 및 94℃의 변성(denaturing) 과정을 수십회 반복 실시함으로써 PCR 방법에 의해 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 합성 및 증폭시킨 후, 이를 아가로즈 전기영동에 적용시켜 약 1kb의 유전자 띠를 확인하였다.

발현 벡터로서 암피실린 유전자를 포함하는 pET32a(Novagen Co.)와 상기 PCR 과정에 의해 수득한 dTDP-글루코스 합성효소 유전자 단편을 제한효소 NdeI과 HindIII로 처리한 다음, 함께 결합시킴으로써 pET32a 벡터내로 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 삽입시켜 재조합 벡터 pSNP110을 제조하였다. 그 제조과정은 도 2에 개략적으로 제시되어 있다.

이후, 재조합 벡터 pSNP110을 E. coli BL21(DE23)에 형질전환시켜 E. coli BL21(DE23)/pSNP110[E. coli dTGS]을 제작하였다.

실시예 4: 형질전환체로부터 dTDP-글루코스 합성효소의 제조

상기 실시예 3에서 제작된 E. coli dTGS로부터 내열성 dTDP-글루코스 합성효소를 얻기 위하여, 상기 형질전환된 E.coli dTGS를 LB 배지에 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

배양된 균을 5%(v/v)의 양으로 새로운 배지에 접종하여 37℃에서 600nm에서 OD가 0.6이 될 때까지 배양한 후, 약 0.4mM의 IPTG를 첨가하고, 20℃에서 약 21시간 동안 계속 배양하여 dTDP-글루코스 합성효소 유전자의 발현을 유도하였다.

상기 배양물 500㎖를 3,000rpm 정도에서 약 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수한 다음, 완충용액(50mM Tris-HCl, pH 7.5)에 균체를 현탁시키고, 유리 조각과 분쇄기를 사용하여 세포를 파쇄하였다. 이 현탁액을 12,000rpm 정도에서 약 20분 동안 다시 원심분리한 후, 상층액을 회수하였다. 이 상층액을 70℃에서 약 25분 동안 열처리하여 대장균 유래의 단백질을 침전시킨 후, 약 12,000rpm 정도에서 약 20분 동안 또다시 원심분리하여 변성된 단백질을 분리하였다.

이를 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하여 약 38kDa의 재조합 dTDP-글루코스 합성효소를 수득하였다. 상기 수득된 효소의 전기영동 결과에 대한 사진은 도 3에 제시되어 있다.

도 3에서, 1레인은 분자량 마커(molecular weight marker)를, 2레인은 E. coli BL21(DE23)의 세포 추출물(cell free extract)을, 3레인은 E.coli dTGS 세포 추출물을 원심분리하여 침전된 효소를 분리한 용액을 나타낸다.

실시예 5: dTDP-글루코스 합성효소의 활성 및 고온에서의 반응성

재조합 효소(dTDP-글루코스 합성효소)의 촉매 활성을 측정하기 위하여, 상기 실시예 4에서 수득한 세포추출물 30㎕, 20mM dTTP, 20mM MgCl₂, 50mM 글루코스-1-인산, 50mM Tris/HCl(pH 7.0) 및 1unit의 inorganic pyrophosphate를 총 100㎕로 20분 동안 70℃에서 반응하여 254nm 광학분광기(UV director)와 Mightsyl, RP-18 column이 부착되어 있는 HPLC에 의해 분석하였다. 분석조건은 100mM K₂HPO₄ 완충용액을 1ml/min 전개속도로 하였다. 분석결과, E. coli dTGS 세포 추출물의 dTDP-글루코스 합성효소의 optimun specific activity는 70℃에서 10,529 nM/min·mg이었고, 90℃에서는 5,296 nM/min·mg이었다.

또한, 본 발명의 재조합 dTDP-글루코스 합성효소에 대한 반응성을 30~90℃의 온도에서 조사한 결과, 75℃의 온도에서 최대 활성을 나타냈다. 따라서, 본 효소는 약 70~80℃의 고온에서도 작용하는 내열성의 dTDP-글루코스 합성효소인 것으로 밝혀졌다 (도 4).

Mg²⁺ (20 mM), Zn²⁺ (20 mM), Cu²⁺ (20 mM), Co²⁺ (20 mM), Fe²⁺ (20 mM), Ca²⁺ (20 mM), Fe³⁺ (20 mM) 및 Ni²⁺ (20 mM) 등 금속이온에 대한 상기 효소의 반응성을 조사한 결과, Mg²⁺를 첨가한 경우에 가장 크게 나타났고, Ni⁺²를 첨가한 경우 가장 작게 나타났다 (도 5). 도 5에서, 1은 Mg²⁺를, 2는 Zn²⁺를, 3은 Cu²⁺를, 4는 Co²⁺를, 5는 Fe²⁺를, 6은 Ca²⁺를, 7은 Fe³⁺를, 8은 Ni²⁺를 나타낸다.

상기 효소는 낮은 pH에서부터 높은 pH까지 50% 이상의 반응성을 나타냈으며, 50mM Tris/HCI 완충용액을 사용한 경우, pH 6.0에서 활성이 가장 크게 나타났다 (도 6).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK24로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 가지는 dTDP-글루코스 합성효소 유전자 및 상기 유전자가 코딩하는 dTDP-글루코스 합성효소를 제공하는 효과가 있다. 본 발명은 또한 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 이용한 dTDP-글루코스 합성효소의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 의하면, 고온에서도 안정한 dTDP-글루코스 합성효소를 생산하는 것이 가능하므로 제약업계 등 이러한 내열성 효소를 필요로 하는 광범위한 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK24의 유전자 라이브러리(library) 유래의 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 함유하는 BamHI 4.2kb 유전자 단편의 유전자 지도이다.

도 2는 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pSNP110의 제조과정을 개략적으로 도시한 것이다.

도 3은 재조합 벡터 pSNP110로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다.

도 4는 온도변화에 따른 재조합 dTDP-글루코스 합성효소의 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 금속이온에 대한 재조합 dTDP-글루코스 합성효소의 활성변화를 나타낸 그래프이다. 1은 Mg²⁺를, 2는 Zn²⁺를, 3은 Cu²⁺를, 4는 Co²⁺를, 5는 Fe²⁺를, 6은 Ca²⁺를, 7은 Fe³⁺를, 8은 Ni²⁺를 나타낸다.

도 6은 pH 변화에 따른 재조합 dTDP-글루코스 합성효소의 활성을 나타낸 그래프이다.

<110> GENECHEM INC. <120> A Heat-resistant dTDP-Glucose Synthase and Its Gene <130> P03-315 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1122 <212> DNA <213> Thermus caldophilus GK24 <400> 1 cacggagccc ccggaccact atggtgagtc gaatgaaggc tctcgtgctg tccggcggtg 60 ccggaacccg gctgaggccg atcacccaca cctcggccaa gcaattggtg cccgtcgcca 120 acaaacccgt gctgttctac gggctggagt ccctcgcgga cgcgggtatc acggacgtcg 180 ggatgatcgt cggtgacacg gccgcggaga tcgaggaagc ggtcggcgac ggatcggcgt 240 tcggtctcaa ggtcacctac attccccagg aacagcccct cgggctggcc cacgccgtgc 300 tgatcgcccg tgactggctc ggcgacgacg acttcgtgat gtacctcggc gacaacttca 360 tcgtcggcgg catcaccggt ctcgtcgacg agttccgccg tcaccggccc gacgcgcaga 420 tcctgctcac ccgcgtcgcc gacccccgct ccttcggcgt ggccgaactc gacgcgtccg 480 ggcaggtgat cggcctggag gagaagcccg acgaccccaa gagcgacctc gcgctggtgg 540 gcgtctacct cttcaccccc gcgatccacg acgcggtgcg cgccatccgc ccctcctggc 600 ggggcgaact cgaaatcacc cacgccatcc agcatttgat cgacgcccgc gccgacgtgc 660 gctgtaccgt catccacggc tactggaagg acaccggcaa cgtcgtcgac atgctcgagg 720 tcaaccgctc ggtcctcgaa gggctcgacc gccgcatcga cggcgacatc gacgacgact 780 cggaggccat cggccgggtg gtcgtggagg aaggggcgcg gatcgtcggc tcacgcatcg 840 tcggccccgc cgtgatcgcc gccggtacgg tcgtcacaca ttcctacatc ggccccttca 900 cctccgtcgc cgagaactgc cggatcaccg acagcgaggt cgagttctcc atcgtgctgc 960 gggactcctc catcgacggc gtgagccgca tcgaggcctc gctgatcggc cggcacgtcg 1020 aggtgacccc ggcacccagc gtccccagcg cccaccgact cgtcctcgga gaccacagca 1080 aggtgcagat ccacacatga acctcctcgt caccggcgcc gc 1122 <210> 2 <211> 357 <212> PRT <213> Thermus caldophilus GK24 <400> 2 Met Lys Ala Leu Val Leu Ser Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Arg Pro 1 5 10 15 Ile Thr His Thr Ser Ala Lys Gln Leu Val Pro Val Ala Asn Lys Pro 20 25 30 Val Leu Phe Tyr Gly Leu Glu Ser Leu Ala Asp Ala Gly Ile Thr Asp 35 40 45 Val Gly Met Ile Val Gly Asp Thr Ala Ala Glu Ile Glu Glu Ala Val 50 55 60 Gly Asp Gly Ser Ala Phe Gly Leu Lys Val Thr Tyr Ile Pro Gln Glu 65 70 75 80 Gln Pro Leu Gly Leu Ala His Ala Val Leu Ile Ala Arg Asp Trp Leu 85 90 95 Gly Asp Asp Asp Phe Val Met Tyr Leu Gly Asp Asn Phe Ile Val Gly 100 105 110 Gly Ile Thr Gly Leu Val Asp Glu Phe Arg Arg His Arg Pro Asp Ala 115 120 125 Gln Ile Leu Leu Thr Arg Val Ala Asp Pro Arg Ser Phe Gly Val Ala 130 135 140 Glu Leu Asp Ala Ser Gly Gln Val Ile Gly Leu Glu Glu Lys Pro Asp 145 150 155 160 Asp Pro Lys Ser Asp Leu Ala Leu Val Gly Val Tyr Leu Phe Thr Pro 165 170 175 Ala Ile His Asp Ala Val Arg Ala Ile Arg Pro Ser Trp Arg Gly Glu 180 185 190 Leu Glu Ile Thr His Ala Ile Gln His Leu Ile Asp Ala Arg Ala Asp 195 200 205 Val Arg Cys Thr Val Ile His Gly Tyr Trp Lys Asp Thr Gly Asn Val 210 215 220 Val Asp Met Leu Glu Val Asn Arg Ser Val Leu Glu Gly Leu Asp Arg 225 230 235 240 Arg Ile Asp Gly Asp Ile Asp Asp Asp Ser Glu Ala Ile Gly Arg Val 245 250 255 Val Val Glu Glu Gly Ala Arg Ile Val Gly Ser Arg Ile Val Gly Pro 260 265 270 Ala Val Ile Ala Ala Gly Thr Val Val Thr His Ser Tyr Ile Gly Pro 275 280 285 Phe Thr Ser Val Ala Glu Asn Cys Arg Ile Thr Asp Ser Glu Val Glu 290 295 300 Phe Ser Ile Val Leu Arg Asp Ser Ser Ile Asp Gly Val Ser Arg Ile 305 310 315 320 Glu Ala Ser Leu Ile Gly Arg His Val Glu Val Thr Pro Ala Pro Ser 325 330 335 Val Pro Ser Ala His Arg Leu Val Leu Gly Asp His Ser Lys Val Gln 340 345 350 Ile His Thr *** Xaa 355 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 cacttcggsg gsgagtcsca cgt 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ggsccgtagt tgttsgagca 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 5 agtcatatga aggctctcgt gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 cgaaagcttt catgtgtgga tc 22

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 dTDP-글루코스 합성효소를 코딩하는 유전자.
제1항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 dTDP-글루코스 합성효소를 코딩하는 유전자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) GK24 유래인 것을 특징으로 하는 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 dTDP-글루코스 합성효소.
제4항에 있어서, 최적온도가 약 75℃이고, 최적 pH가 약 6인 것을 특징으로 하는 dTDP-글루코스 합성효소.
제1항의 dTDP-글루코스 합성효소 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제6항에 있어서, pSNP110인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제6항 또는 제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 내열성 dTDP-글루코스 합성효소의 제조방법:

(a) 상기 제8항의 형질전환된 미생물을, 상기 제1항의 dTDP-글루코스 합성효소 유전자의 발현을 유도하는 조건하에서 배양하는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 배양물로부터 dTDP-글루코스 합성효소를 회수하는 단계.