KR20230100925A - 항시발현용 신규 프로모터 변이체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대장균(Escherichia coli)의 gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 프로모터의 일부 뉴클레오티드가 결실된 신규 프로모터 변이체를 제공한다. 본 발명에 따른 신규 프로모터 변이체는 목적 단백질, 특히 효소를 대장균에서 항시적으로 고발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신규 프로모터 변이체를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 재조합 균주를 이용하면 목적 단백질, 특히 효소를 경제적으로 대량생산할 수 있다. 일 예로 본 발명에 따른 신규 프로모터 변이체를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 재조합 균주를 이용하면 알룰로스 에피머화 효소를 경제적으로 대량생산하거나 과당으로부터 알룰로스를 경제적으로 대량생산할 수 있다.
Description
본 발명은 신규 프로모터 변이체 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 목적 단백질을 항시적으로 고발현시킬 수 있는 신규 프로모터 변이체 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.
분자 생물학이 발전하면서 유전자의 발현을 조절하는 여러 가지 기작이 밝혀져 왔다. 유전자의 발현이라 함은 세포 내에서 일어나는 전사(transcription) 및 번역(translation)을 통해 유전자에 입력되어 있는 코드에 따라 단백질을 합성하는 일련의 과정을 일컫는다. 특히, 전사 과정은 유전자 발현의 초기 단계로서, RNA 중합 효소가 여러 보조 인자들의 도움을 받아서 유전자의 상위에 존재하는 프로모터(promoter) 서열에 결합함으로써 개시가 되고, 전사인자(TF, transcription factor)는 그러한 보조 인자들 가운데 하나로서, 프로모터 서열에 직접 결합을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 원핵생물에서 유전자 발현의 조절은 주로 전사 단계에서 일어나므로 계속 새로운 전사인자 및 프로모터가 연구자들에 의해 밝혀지고 있다.
산업적으로 효소 등과 같은 외래 단백질을 생산하기 위해 주로 외래 단백질 유전자를 포함하는 pET 타입의 발현벡터로 대장균 등과 같은 원핵생물을 형질전환시켜 제작한 형질전환체를 발현 시스템으로 사용한다. pET 타입의 발현벡터로 형질전환된 원핵생물 발현 시스템은 일반적으로 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 등과 같은 고가의 발현 유도체(inducer)가 필요하고, 유도체 농도나 설비, 발현유도 시간 등을 세밀하게 조절해야 하는 단점이 있다.
한편, 과당을 알룰로스(또는 사이코스)로 전환하는 활성을 가진 사이코스 에피머화 효소(또는 알룰로스 에피머화 효소)를 대량생산하기 위해 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주인 코리네박테리움속 균주를 숙주세포로 사용하는 발현 시스템이 제시되고 있다. 코리네박테리움속 균주 기반의 사이코스 에피머화 효소(또는 알룰로스 에피머화 효소) 발현 시스템과 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1656063호에는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며, 코리네박테리움속 균주에서 상기 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하는 유전자 발현 카세트가 개시되어 있고, 상기 조절서열은 전사 프로모터, 제1 리보솜 결합 영역 (ribosome binding region, RBS) 서열 및 제1 스페이스 서열, 링커 서열 및 제2 RBS 서열 등으로 구성되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1695830호에는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 핵산서열과, 그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며 코리네박테리움속 균주에서 상기 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하는 유전자 발현 카세트가 개시되어 있고, 상기 조절 서열은 대장균(E.coli) 유래 전사 프로모터(transcription promoter)를 포함한다. 그러나, 코리네박테리움 기반의 사이코스 에피머화 효소(또는 알룰로스 에피머화 효소) 발현 시스템은 사용할 수 있는 프로모터들의 발현 수준이 낮고 선택의 폭이 작아서 효소 대량 발현시스템에는 적합하지 않다.
따라서, 사이코스 에피머화 효소(또는 알룰로스 에피머화 효소)의 대량생산 또는 사이코스 에피머화 효소(또는 알룰로스 에피머화 효소)를 이용한 과당으로부터 알룰로스의 대량생산을 위해 대장균 숙주세포의 일반적인 배양조건에서 성장저해 없이 외래 단백질을 안정적이고 높은 수준으로 발현할 수 있는 항시발현 프로모터 및 이를 포함하는 항시발현 시스템의 개발이 요구된다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 목적 단백질을 항시적으로 고발현시킬 수 있는 신규 프로모터 변이체를 제공하는데에 있다. 또한, 본 발명의 목적은 상기 신규 프로모터 변이체의 다양한 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 대장균(Escherichia coli)의 gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 발현하기 위한 프로모터인 gapA 유전자 프로모터를 알룰로스 에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결하여 재조합 발현벡터를 제작하고 이를 대장균에 도입하여 형질전환시켰다. 이때, gapA 프로모터 또는 알룰로스 에피머화 효소 유전자 서열에 무작위적 변이가 발생하여, 본 발명의 발명자들은 도입한 재조합 발현벡터와 다른 다양한 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균들을 확보하였다. 상기 무작위적 변이를 통해 확보한 재조합 발현벡터들 중 알룰로스 에피머화 효소 유전자 서열에는 변이가 발생하지 않고 gapA 유전자 프로모터에만 변이가 발생한 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균들의 알룰로스 에피머화 효소 발현 활성을 비교한 결과, gapA 유전자 프로모터의 염기 서열 중 130번째 뉴클레오티드인 아데닌(A)이 결실된 프로모터 변이체가 알룰로스 에피머화 효소를 항시적으로 고발현시킬 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 예는 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결되고 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 상기 발현 벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 상기 재조합 균주를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 바람직한 일 예는 기질 함유 용액에 상기 재조합 균주를 첨가하고 효소 전환반응을 진행시키는 단계를 포함하는 기질로부터 효소 전환반응 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 프로모터 변이체는 목적 단백질, 특히 효소를 대장균에서 항시적으로 고발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신규 프로모터 변이체를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 재조합 균주를 이용하면 목적 단백질, 특히 효소를 경제적으로 대량생산할 수 있다. 일 예로 본 발명에 따른 신규 프로모터 변이체를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 재조합 균주를 이용하면 알룰로스 에피머화 효소를 경제적으로 대량생산하거나 과당으로부터 알룰로스를 경제적으로 대량생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 제조한 재조합 발현벡터 pPgapAm1-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 개열지도이다.
도 2는 발명의 실시예에서 제조한 재조합 발현벡터 pPgapAm2-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 개열지도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 제조한 재조합 발현벡터 pPblma-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 개열지도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 제작한 재조합 대장균을 이용하여 과당의 알룰로스로의 전환 반응을 진행할 때 반응시간에 따른 전환율을 나타낸 것이다.
도 2는 발명의 실시예에서 제조한 재조합 발현벡터 pPgapAm2-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 개열지도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에서 제조한 재조합 발현벡터 pPblma-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 개열지도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 제작한 재조합 대장균을 이용하여 과당의 알룰로스로의 전환 반응을 진행할 때 반응시간에 따른 전환율을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '프로모터'는 전사 대상인 목적 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 상기 목적 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절하는 최소의 핵산 서열을 의미한다. 또한, 상기 프로모터에는 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는데에 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 상기 프로모터에는 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다. 원핵생물에서의 프로모터는 대개 RNA 중합효소가 결합하는 전사 시작 지점(Transcription Start Site) 바로 근처의 결합부위로 정의된다.
본 발명에서 사용되는 용어인 프로모터 변이체는 기본 프로모터의 핵산 서열 중 일부 뉴클레오티드가 결실, 부가 또는 치환되어 기본 프로모터와 다르거나 향상된 목적 단백질 발현 활성을 갖는 프로모터로 정의된다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '상동성'은 천연형(wild type) 또는 동일 활성을 갖는 변이체의 핵산 서열과의 동일성을 나타내는 것으로, 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '목적 단백질'은 외래 단백질로서 상기 단백질을 발현하는 형질전환된 균주(또는 숙주세포)에서는 정상적으로는 존재할 수 없는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '폴리뉴클레오티드'는 비변형(non-modified) 또는 변형된(modified) 모든 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일-및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA 또는 이들의 하이브리드 분자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '작동가능하게 연결된(operably linked)'은 프로모터 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 프로모터가 목적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 상태로 정의된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있는 경우) 프로모터는 코딩 서열과 연결되어 작동되거나, 리보좀 결합 자리가 번역을 촉진시킬 수 있도록 위치하고 있다면, 리보좀 결합 자리는 코딩 서열에 연결되어 작동되는 것이다. 코딩 서열은 센스 방향 또는 안티센스 방향에서 조절 서열에 연결되어 작동될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '재조합 벡터'는 프로모터 변이체 또는 목적 유전자를 제한효소를 이용하여 잘라내고 이를 벡터에 삽입하여 제작한 재조합 DNA로 정의된다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '클로닝 벡터'는 숙주 세포 내로 DNA 단편을 운반하고 이를 재생산할 수 있는 물질로 정의된다. 상기 클로닝 벡터는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal), 전사 종결 서열(transcription termination sequence) 및 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)를 포함할 수 있다. 상기 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제(endonuclease) 제한효소 절단위치(restriction site)를 포함한다. 또한, 클로닝 벡터는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 또한, 클로닝 벡터 내에서 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal) 및 전사 종결 서열(transcription termination sequence)의 상류(upstream)에 위치할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '발현 벡터'는 적절한 숙주 안에서 클로닝된 DNA의 전사와 번역을 위해 필요한 DNA 서열로 정의되고, 구체적으로 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않는다. 발현 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코딩하는 유전자 및 종결코돈 터미네이터를 포함한다. 또한, 발현 벡터는 그 외에 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA, 추가적 발현 조절 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 상기 선택마커 영역은 목적하는 벡터를 선별하기 위한 항생물질의 선택마커 유전자일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '재조합 균주'는 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 갖는 발현 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미한다. 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposemmediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법, 열충격(heat shock) 방법 등이 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어인 '기질'은 효소의 작용에 의해 다른 화합물로 전환되거나 전환되게 되어있는 임의의 물질 또는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 단일 화합물뿐만 아니라 용제, 혼합물 및 최소한 하나의 기질을 포함하는 다른 재료와 같은 화합물의 조합 및 이들의 유도체를 포괄한다.
본 발명의 일 측면은 목적 단백질을 항시적으로 고발현시킬 수 있는 신규 프로모터 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체는 서열번호 9의 염기 서열로 구성된다. 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체는 서열번호 1의 염기 서열로 구성된 대장균(Escherichia coli) 유래 gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 프로모터가 변이된 것으로서, 구체적으로 서열번호 1의 염기 서열 중 130번째 뉴클레오티드인 아데닌이 결실된 것이다. 상기 서열번호 1의 염기 서열 중 130번째 뉴클레오티드인 아데닌은 리보솜 결합부위(Ribosome-Binding Site, RBS)에 해당한다. 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체를 포함하는 발현 시스템은 대장균에서 목적 단백질을 항시적으로 고발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체는 항시발현용 프로모터로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체는 서열번호 9의 염기 서열로 구성되나 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체의 균등 범위가 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체의 균등 범위는 목적 단백질을 항시적으로 고발현시키는 기능이 유지되는 범위 내에서 서열번호 9의 염기 서열 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 삽입 및/또는 결실된 프로모터를 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체의 균등 범위는 서열번호 9의 염기 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 9의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 9의 염기 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 신규 프로모터 변이체의 염기 서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일 또는 유사한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체의 균등 범위는 목적 단백질을 항시적으로 고발현시키는 기능이 유지되는 범위 내에서 서열번호 9의 염기 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95%이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체의 다양한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체의 용도로는 재조합 벡터, 발현 벡터, 재조합 균주, 목적 단백질의 생산방법, 재조합 균주를 이용하여 목적 단백질의 기능을 발휘하는 방법 등이 있으며 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 재조합 벡터는 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체를 포함한다.
상기 재조합 벡터는 클로닝 벡터일 수 있다. 상기 클로닝 벡터는 복제원점, 목적 단백질 유전자를 클로닝하기 위한 다중 클로닝 부위(Multi clonig site, MCS), 전사 종결 서열(transcription termination sequence) 및 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 상기 선택 마커는 벡터로 형질 전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다. 예를 들어, 상기 선택 마커는 카나마이신(Kanamycin) 항생제 저항성 유전자 또는 암피실린(Ampicillin) 항생제 저항성 유전자와 같은 약물 내성 유전자일 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결되고 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체를 포함한다. 상기 프로모터 변이체는 바람직하게는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류(upstream)에 위치한다. 본 발명의 일 예에 따른 발현 벡터를 통해 발현되는 목적 단백질은 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어, 탄수화물의 생합성 또는 대사에 관여하는 단백질, 지질 및 지방산의 생합성 또는 대사에 관여하는 단백질, 단백질 및 펩타이드의 생합성 또는 대사에 관여하는 단백질 등에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 목적 단백질은 프로모터 변이체의 발현 조절 활성을 고려할 때 효소인 것이 바람직하다. 상기 효소의 종류는 크게 제한되지 않으며, D-알룰로스 3-에피머화 효소(D-allulose 3-epimerase), D-타가토스 3-에피머화 효소(D-tagatose 3-epimerase), (1→4)-α-D-글루칸 1-α-D-글루코실무타제[(1→4)-alpha-D-glucan 1-alpha-D-glucosylmutase], 4-α-D-{(1→4)-α-D-글루카노}트레할로스 트레할로하이드롤라제[4-alpha-D-{(1→4)-alpha-D-glucano}trehalose trehalohydrolase], L-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase), 과당-6-인산-3-에피머화 효소(fructose-6-phosphate-3-epimerase) 등에서 선택될 수 있고, D-알룰로스 3-에피머화 효소(D-allulose 3-epimerase), (1→4)-α-D-글루칸 1-α-D-글루코실무타제[(1→4)-alpha-D-glucan 1-alpha-D-glucosylmutase], 4-α-D-{(1→4)-α-D-글루카노}트레할로스 트레할로하이드롤라제[4-alpha-D-{(1→4)-alpha-D-glucano}trehalose trehalohydrolase]에서 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 기재하지 않았으나, 본 발명의 신규 프로모터 변이체는 서열번호 1의 염기 서열로 구성된 대장균(Escherichia coli) 유래 gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 프로모터와 비교할 때 (1→4)-α-D-글루칸 1-α-D-글루코실무타제[(1→4)-alpha-D-glucan 1-alpha-D-glucosylmutase], 4-α-D-{(1→4)-α-D-글루카노}트레할로스 트레할로하이드롤라제[4-alpha-D-{(1→4)-alpha-D-glucano}trehalose trehalohydrolase] 등을 약 1.4~1.5배 수준으로 더 많이 발현시켰다. 상기 알룰로스 에피머화 효소는 과당을 알룰로스로 전환하는 활성을 가지는 효소라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 또한, 상기 알룰로스 에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기 서열, 서열번호 6의 염기 서열 또는 서열번호 8의 염기 서열로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명은 알룰로스 에피머화 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-1919713호, 대한민국 등록특허공보 제10-2187354호, 대한민국 등록특허공보 제10-1656063호, 대한민국 등록특허공보 제10-1695830호, 대한민국 등록특허공보 제10-2189458호, 대한민국 등록특허공보 제10-1539097호, 대한민국 등록특허공보 제10-1539096호, 대한민국 등록특허공보 제10-1455759호, 대한민국 등록특허공보 제10-1318422호 등에 개시된 내용을 포함한다. 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 발현 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는다. 도 1의 개열지도를 가지는 발현 벡터는 pUC 유래 복제원점(replication origin, ori), 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진 프로모터 변이체(PgapAm1), 서열번호 8의 염기 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]), 카나마이신 저항성 유전자 마커(KanR) 등이 순차적으로 연결된 구조를 갖는다.
본 발명의 일 예에 따른 재조합 균주는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결되고 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체로 이루어진 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터의 도입에 의해 숙주세포가 형질전환된 것이다. 본 발명에서 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포로는 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체가 원할하게 작동할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 원핵 생물인 것이 바람직하고, 신규 프로모터 변이체의 발현 조절 활성, DNA의 도입 효율, 도입된 DNA의 발현 효율 등을 고려할 때 대장균인 것이 더 바람직하다. 상기 대장균으로 BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 예에 따른 재조합 균주는 바람직하게는 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁된 재조합 대장균(Escherichia coli) DS00004(수탁번호 : KCCM13092P; 수탁일자 : 2021. 12. 14)이다. 상기 재조합 대장균(Escherichia coli) DS00004(수탁번호 : KCCM13092P; 수탁일자 : 2021. 12. 14)는 숙주세포인 대장균 DH5α가 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 발현 벡터 pPgapAm1-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 도입에 의해 형질전환된 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 목적 단백질의 제조방법은 전술한 재조합 균주를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계 ; 및 재조합 균주의 배양액 또는 재조합 균주의 균체로부터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 목적 단백질은 그 종류에 의해 발현 후 재조합 균주의 균체 내에 존재하거나 재조합 균주의 균체 밖으로 분비될 수 있다. 예를 들어 목적 단백질이 알룰로스 에피머화 효소인 경우 재조합 균주에 의해 생산된 알룰로스 에피머화 효소는 재조합 균주의 균체 내에 존재하게 된다. 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 알룰로스 에피머화 효소의 제조방법은 알룰로스 에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결되고 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체로 이루어진 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터의 도입에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 알룰로스 에피머화 효소를 발현시키는 단계; 및 상기 알룰로스 에피머화 효소가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 알룰로스 에피머화 효소를 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 예에 따른 신규 프로모터 변이체는 항시발현 벡터이므로 단백질 발현 유도 인자인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) 등을 사용하지 않고 발현을 유도할 수 있다. 본 발명에서 알룰로스 에피머화 효소는 재조합 균주의 파쇄물로부터 회수될 수 있다. 단백질 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학적 분리 기술에 의해서 분리 또는 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 예를 들어, 숙주세포에 의해 발현된 단백질의 분리 또는 정제 방법으로는 전기영동, 원심분리, 겔 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 또는 복합 방법을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한편, 본 발명에서 재조합 균주의 파쇄물로부터 알룰로스 에피머화 효소를 분리하는 단계는 바람직하게는 펩티드 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 수행될 수 있다. 상기 펩티드 태그로는 HA 태그, FLAG 태그, His 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein), c-myc 태그, V5 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 또는 MBP(maltose binding protein) 등과 같이 공지의 다양한 태그를 사용할 수 있으며, 이중 His 태그인 것이 바람직하다. His-태깅된 단백질은 Ni-NTA(니켈-니트릴로트리아세트산) 수지의 칼럼 상에 특이적으로 트랩핑되며, EDTA 또는 이미다졸에 의해 용출될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 재조합 균주는 목적 단백질을 제조하기 위해 사용되는 것 외에 목적 단백질의 기능을 간접적으로 발휘시키는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 목적 단백질이 효소인 경우 본 발명의 일 예에 따른 재조합 균주는 기질로부터 효소전환 반응에 의한 생성물을 제조하는데에 사용될 수 있다. 구체적으로 목적 단백질이 알룰로스 에피머화 효소인 경우, 본 발명은 과당 함유 용액에 재조합 균주를 첨가하고 반응시키는 단계를 포함하는 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 재조합 균주는 알룰로스 에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결되고 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체로 이루어진 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터의 도입에 의해 형질전환된 숙주세포이며, 바람직하게는 재조합 대장균(Escherichia coli) DS00004(수탁번호 : KCCM13092P; 수탁일자 : 2021. 12. 14)이다. 또한, 상기 과당 함유 용액은 알룰로스 에피머화 효소의 활성을 촉진하기 위해 Ca2+, Mn2+와 같은 금속 이온을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 반응 온도는 60~70℃, 바람직하게는 60~67℃, 재조합 균주의 원활한 효소 발현, 효소의 안정성 및 최대 활성을 고려할 때 더 바람직하게는 60~65℃의 범위이고, 반응 pH는 6.5~8, 바람직하게는 6.5~7.5, 더 바람직하게는 6.5~7의 범위이다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 과당의 농도는 특별히 제한되지 않으나, 생산성 내지 경제성을 고려할 때 전체 반응물을 기준으로 1~75%(w/w)인 것이 바람직하고, 4~35%(w/w)인 것이 더 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1 : 효소 유전자 발현을 위한 프로모터의 확보
1.1. gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 프로모터의 확보
gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 프로모터는 대장균(Escherichia coli)의 gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 발현하기 위한 프로모터로서, 서열번호 1의 염기 서열로 구성되고, 대장균 내에서 강한 항시발현을 유도하는 프로모터로 알려져있다[Thouvenot et al (2004) The strong efficiency of the Escherichia coli gapA P1 promoter depends on a complex combination of functional determinants, Biochemical Journal 383:371-382. DOI: 10.1042/BJ20040792 참조].
대장균으로부터 gapA(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 프로모터 부위에 해당하는 폴리뉴클레오티드 단편을 확보하기 위해, 대장균 MG1655의 유전체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고 하기 표 1에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 증폭산물을 pGEM-Teasy vector(Promega Co., USA)에 클로닝하고 염기 서열을 분석한 결과, 137 bp의 길이를 가지고 서열번호 1의 염기 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 단편임을 확인하였다.
| 프라이머 명 | 프라이머 설명 | 프라이머 염기 서열(5'→3') |
| PgapA-F | gapA 프로모터 순방향 프라이머 | AGGCGAGTCAGTCGCGTAAT |
| PgapA-R | gapA 프로모터 역방향 프라이머 | ATATTCCTCCAGCTATTTGTTAG |
1.2. BLMA 유전자 프로모터의 확보
BLMA 유전자 프로모터는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 말토게닉아밀라제(maltogenic amylase) 유전자를 발현하기 위한 프로모터로서, 서열번호 2의 염기 서열로 구성되고, 대장균 내에서 외래 유전자의 안정적인 고발현을 유도하는 프로모터로 알려져있다[TAE-JIP KIM et al (1999) Modes of Action of Acarbose Hydrolysis and Transglycosylation Catalyzed by a Thermostable Maltogenic Amylase, the Gene for Which Was Cloned from a Thermus Strain 참조].
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 말토게닉아밀라제(maltogenic amylase) 유전자의 프로모터 부위에 해당하는 폴리뉴클레오티드 단편을 확보하기 위해, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) ATCC 14580의 유전체 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하고 하기 표 2에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 증폭산물을 pGEM-Teasy vector(Promega Co., USA)에 클로닝하고 염기 서열을 분석한 결과, 115 bp의 길이를 가지고 서열번호 2의 염기 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 단편임을 확인하였다.
| 프라이머 명 | 프라이머 설명 | 프라이머 염기 서열(5'→3') |
| Pblma-F | BLMA 프로모터 순방향 프라이머 | GGTGTCTCATTCTGTTACCG |
| Pblma-R | BLMA 프로모터 역방향 프라이머 | GTTTCCCCCTTTTGGTTGTC |
실시예 2 : 알룰로스 에피머화 효소 변이체 클로닝 벡터의 확보
본 발명의 출원인은 대한민국 등록특허공보 제10-14739180호를 통해 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래된 야생형 D-알룰로스 에피머화 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 개시하였다. 상기 야생형 D-알룰로스 에피머화 효소는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기 서열로 구성된다.
또한, 본 발명의 출원인은 대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호를 통해 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 향상된 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 개시하였다. 상기 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 야생형 D-알룰로스 에피머화 효소의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 것으로서, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 염기 서열로 구성된다.
또한, 본 발명의 출원인은 고온 조건에서 열 안정성이 매우 우수한 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I를 도출하고 2021년 12월 14일에 출원하였다(대한민국 특허출원 제10-2021-0178690호, 미공개 상태). 상기 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 야생형 D-알룰로스 에피머화 효소의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 77번째 위치에 존재하는 알라닌(Als)이 세린(Ser)으로 치환되고 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 것으로서, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되고, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 염기 서열로 구성된다.
D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 폴리뉴클레오티드(서열번호 6)을 기반으로 overlap extension polymerase chain reaction 방법을 이용하여 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 제작하였다. 구체적으로, 100μM의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)가 첨가된 반응액에 하기 표 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머(A77S 순방향 프라이머, A77S 역방향 프라이머) 1pM, 템플레이트(주형)로 이용되는 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 폴리뉴클레오티드(서열번호 6) 100ng을 혼합하고 Thermocycler(TP600, TAKARA BIO Inc., JAPAN)를 이용하여 pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물(Bioneer) 1 유니트의 존재 하에 25~30주기로 PCR 반응을 수행하였다. 프라이머 조합을 통해 변이체 단편을 증폭한 뒤, 증폭된 단편을 주형으로 하고 하기 표 3의 NdeI과 XhoI 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드 프라이머(NdeI 순방향 프라이머, XhoI 역방향 프라이머)를 사용하여 overlap extentention PCR을 통해 최종적으로 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편(서열번호 8)을 제작하였다. 이후, 제작된 폴리뉴클레오티드 단편을 제한효소 NdeI과 XhoI을 사용하여 pET28a vector(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하고 클로닝 벡터를 확보하였다.
| 프라이머 설명 | 프라이머 염기 서열(5'→3') |
| A77S 순방향 프라이머 | AATACGACCTGAGCAGCGACGATCCGGCGGTG |
| A77S 역방향 프라이머 | GATCGTCGCTGCTCAGGTCGTATTTGGCCTCCA |
| NdeI 순방향 프라이머 | GCATGCCATATGAACCCGATTGGAATGCA |
| XhoI 역방향 프라이머 | GCATGCCTCGAGCGCGGTCAGCTCCTTGAGGA |
실시예 3 : 프로모터와 알룰로스 에피머화 효소 변이체 유전자의 연결 단편 제조
3.1. gapA 프로모터와 알룰로스 에피머화 효소 변이체 유전자가 연결된 DNA 단편 제조
gapA 프로모터를 증폭하기 위해, 실시예 1에서 확보한 gapA 프로모터가 클로닝된 pGEM-Teasy vector를 주형으로 하고 하기 표 4의 프라이머 세트(XhoI-PgapA, PgapA-FpDPE_R)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
또한, 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체인 W29K/A77S/G216S/M234I의 유전자를 증폭하기 위해, 실시예 2에서 확보한 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 유전자가 클로닝된 pET28a vector(Novagen)를 주형으로 하고 하기 표 4의 프라이머 세트(PgapA-FpDPE_F, PstI-FpDPE)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
| 프라이머 명 | 프라이머 설명 | 프라이머 염기 서열(5'→3') |
| XhoI-PgapA | 순방향 프라이머 | TTTGCGCTCGAGAGGCGAGTCAGTCGCGTAAT |
| PgapA-FpDPE_R | 역방향 프라이머 | TGCATTCCAATCGGGTTCATATATTCCTCCAGCTATTTGT |
| PgapA-FpDPE_F | 순방향 프라이머 | ACAAATAGCTGGAGGAATATATGAACCCGATTGGAATGCA |
| PstI-FpDPE | 역방향 프라이머 | GCATGCTGCAGTTACGCGGTCAGCTCCTTGA |
이렇게 증폭된 gapA 프로모터 단편과 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 유전자 단편은 증폭 시 사용한 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 두개의 단편을 주형으로 하고 상기 표 4의 XhoI과 PstI 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 프라이머(XhoI-PgapA, PstI-FpDPE)를 사용하여 overlap extension PCR을 수행하고 하나의 증폭된 단편을 얻었다. 확보한 gapA 프로모터와 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 유전자가 연결된 DNA 단편을 'PgapA-FpDPE'로 명명하였다.
3.2. BLMA 프로모터와 알룰로스 에피머화 효소 유전자가 연결된 DNA 단편 제조
BLMA 프로모터를 증폭하기 위해, 실시예 1에서 확보한 BLMA 프로모터가 클로닝된 pGEM-Teasy vector를 주형으로 하고 하기 표 5의 프라이머 세트(XhoI-Pblma, Pblma-FpDPE_R)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
또한, 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체인 W29K/A77S/G216S/M234I의 유전자를 증폭하기 위해, 실시예 2에서 확보한 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 유전자가 클로닝된 pET28a vector(Novagen)를 주형으로 하고 하기 표 5의 프라이머 세트(Pblma-FpDPE_F, PstI-FpDPE)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
| 프라이머 명 | 프라이머 설명 | 프라이머 염기 서열(5'→3') |
| XhoI-Pblma | 순방향 프라이머 | TTTGCGCTCGAGGGTGTCTCATTCTGTTACCG |
| Pblma-FpDPE_R | 역방향 프라이머 | TGCATTCCAATCGGGTTCATGTTTCCCCCTTTTGGTTGTC |
| Pblma-FpDPE_F | 순방향 프라이머 | GACAACCAAAAGGGGGAAACATGAACCCGATTGGAATGCA |
| PstI-FpDPE | 역방향 프라이머 | GCATGCTGCAGTTACGCGGTCAGCTCCTTGA |
이렇게 증폭된 BLMA 프로모터 단편과 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 유전자 단편은 증폭 시 사용한 프라이머의 상보적 서열로 인하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 두개의 단편을 주형으로 하고 상기 표 5의 XhoI과 PstI 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 프라이머(XhoI-Pblma, PstI-FpDPE)를 사용하여 overlap extension PCR을 수행하고 하나의 증폭된 단편을 얻었다. 확보한 BLMA 프로모터와 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 유전자가 연결된 DNA 단편을 'Pblma-FpDPE'로 명명하였다.
실시예 4 : D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 발현벡터의 제조
4.1. gapA 프로모터를 가지는 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 발현벡터의 제조
pTrc99A vector(Pharmacia, US)로부터 유전자 조작을 통해 대장균에서 복제가 가능한 pUC 유래 복제원점(replication origin), 제한효소 XhoI 부위와 PstI 부위와 같은 다중 클로닝 부위(Multi clonig site, MCS), 전사 종결자(transcription terminator) 및 카나마이신(Kanamycin) 항생제 저항성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 이후, 실시예 3에서 제작한 폴리뉴클레오티드 단편 PgapA-FpDPE를 제한효소 XhoI과 PstI으로 절단한 후 이를 동일한 제한 효소 위치를 가지는 상기 재조합 플라스미드 벡터와 결찰(ligation) 하여 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 발현벡터 pPgapA-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]를 제조하였다. 이후, D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 발현벡터를 열충격(heat shock) 방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning 참조)으로 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신 내성을 가지는 콜로니를 확보하였고, 6개의 콜로니를 선택하여 재조합 발현벡터 pPgapA-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I] 6종을 회수한 후 염기 서열을 분석하였다. pPgapA-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I] 재조합 발현벡터 6종의 서열분석 결과, 도입된 gapA 프로모터 또는 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I 유전자 서열에 각각 무작위적 변이가 확인되었고, 무작위적 변이 내용을 하기 표 6에 나타내었다.
| 콜로니(colony) 구분 | gapA 프로모터 서열 변이 내용 | W29K/A77S/G216S/M234I 유전자 서열 변이 내용 |
| colony 1 | 130번째 뉴클레오티드(A) 1 bp 결실/리보솜 결합부위(Ribosome-Binding Site, RBS) 변이에 해당함 | 일치 |
| colony 2 | 일치 | 1번째 뉴클레오티드(A) 1 bp 결실/개시코돈(ATG) 상실에 해당함 |
| colony 3 | 일치 | 4번째 뉴클레오티드(A) 1 bp 결실/프레임 시프트 돌연변이에 해당함 |
| colony 4 | 일치 | 10번째 뉴클레오티드(A) 1 bp 결실/프레임 시프트 돌연변이에 해당함 |
| colony 5 | 132~136번째 뉴클레오티드(GAATA) 5 bp 결실/RBS 변이에 해당함 | 일치 |
| colony 6 | 일치 | 168번째 뉴클레오티드 치환 변이(C→A)/종결코돈(TGA) 획득에 해당하고 55번째 알라닌 이후 전사 종결됨 |
상기 표 6에서 보이는 바와 같이 콜로니 2, 3, 4 내지 6에서 회수한 재조합 발현벡터의 경우 알룰로스 에피머화 효소 변이체 유전자 서열에 변이가 발생하여 목적하는 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 만들기 위한 번역(translation)을 하지 못할 것으로 예상된다. 반면 콜로니 1 혹은 5에서 회수한 재조합 발현벡터의 경우 gapA 프로모터의 리보솜 결합부위(Ribosome-Binding Site, RBS) 서열에 변이가 발생하였으나 효소 유전자 서열은 일치하므로 목적하는 효소의 발현의 가능성이 있다고 판단하였다. 콜로니 1에서 회수한 재조합 발현벡터 내의 변이 프로모터를 'gapAm1'이라 명명하고 콜로니 5에서 회수한 재조합 발현벡터 내의 변이 프로모터를 'gapAm2'라 명명하였다. gapAm1 프로모터는 서열번호 9의 염기 서열로 구성되고, gapAm2 프로모터는 서열번호 10의 염기 서열로 구성된다. 또한, 콜로니 1에서 회수한 재조합 발현벡터를 'pPgapAm1-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]'로 재명명하고, 콜로니 5에서 회수한 재조합 발현벡터를 'pPgapAm2-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]'로 재명명하였다. 도 1은 본 발명의 실시예에서 제조한 재조합 발현벡터 pPgapAm1-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 개열지도이다. 도 2는 발명의 실시예에서 제조한 재조합 발현벡터 pPgapAm2-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 개열지도이다.
4.2. BLMA 프로모터를 가지는 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 발현벡터의 제조
pTrc99A vector(Pharmacia, US)로부터 유전자 조작을 통해 대장균에서 복제가 가능한 pUC 유래 복제원점(replication origin), 제한효소 XhoI 부위와 PstI 부위와 같은 다중 클로닝 부위(Multi clonig site, MCS), 전사 종결자(transcription terminator) 및 카나마이신(Kanamycin) 항생제 저항성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 이후, 실시예 3에서 제작한 폴리뉴클레오티드 단편 Pblma-FpDPE를 제한효소 XhoI과 PstI으로 절단한 후 이를 동일한 제한 효소 위치를 가지는 상기 재조합 플라스미드 벡터와 결찰(ligation) 하여 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 발현벡터를 pPblma-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]를 제조하였다. 이후, D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 발현벡터를 열충격(heat shock) 방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning 참조)으로 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신 내성을 가지는 콜로니를 확보하였고, 6개의 콜로니를 선택하여 재조합 발현벡터 pPblma-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I] 6종을 회수한 후 염기 서열을 분석하였다. 재조합 발현벡터 pPblma-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I] 6종의 서열분석 결과 모두 의도한대로의 BLMA 프로모터 및 알룰로스 에피머화 효소 변이체 유전자 서열이 존재하는 것을 확인하였다. 도 3은 본 발명의 실시예에서 제조한 재조합 발현벡터 pPblma-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]의 개열지도이다.
실시예 5 : D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 발현벡터에 의한 형질전환체 제조
실시예 4에서 제조한 재조합 발현벡터 pPgapAm1-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I], pPgapAm2-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I] 및 pPblma-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I] 각각을 대장균(E.coli) W3110에 열충격(heat shock) 방법으로 도입하였다. 이후, 카나마이신 항생제 내성 여부를 확인하고 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주를 선별하였다. 제작된 재조합 대장균에 글리세린 용액을 최종농도가 20%(v/v)가 되도록 첨가하고, 효소 발현을 위한 배양을 실시하기 전에 -70℃에서 냉동 보관하였다.
실시예 6 : 재조합 균주에 의한 과당의 알룰로스로의 전환율 측정 및 프로모터의 효소 발현 세기 비교
D-알룰로스 에피머화 효소는 과당을 알룰로스로 전환시킬 수 있으므로, 재조합 균주의 효소 발현량에 비례하는 과당의 알룰로스로의 전환율 측정을 통해 재조합 균주 내의 각 프로모터들의 효소 발현 유도 세기를 비교하였다.
재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 배양하기 위해, 1L 용량의 플라스크에 카나마이신을 최종농도 50 ㎍/㎖으로 포함하는 LB 배지 100㎖를 수용하고, 여기에 실시예 5에서 제작한 재조합 대장균 1㎖를 접종하였다. 이후, 플라스크를 진탕 배양기에 옮기고 30℃의 온도 조건 및 140 rpm의 진탕 조건을 유지하면서 14 hr 동안 재조합 대장균을 배양하고, 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하였다. 이후, 30%(w/w) 과당 및 1mM 황산망간(MnSO4)의 금속 이온이 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)에 회수한 균체를 1 ㎎/㎖의 농도로 첨가하고 62℃에서 소정의 시간 동안 반응을 진행시킨 후에 반응 생성액의 온도를 4℃로 낮추어 반응을 정지시키고 16,600×g 및 4℃의 조건에서 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 상등액 내 알룰로스 농도 및 과당 농도를 측정하고, 측정된 결과로부터 과당의 알룰로스로의 전환율을 계산한 후, 전환율을 효소 활성의 지표로 사용하였다. 도 4는 본 발명의 실시예에서 제작한 재조합 대장균을 이용하여 과당의 알룰로스로의 전환 반응을 진행할 때 반응시간에 따른 전환율을 나타낸 것이다. 도 4에서 'PgapAm1'은 재조합 발현벡터 pPgapAm1-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]로 형질전환된 재조합 대장균을 나타내고, 'PgapAm2'는 재조합 발현벡터 pPgapAm2-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]로 형질전환된 대장균을 나타내고, 'Pblma'는 재조합 발현벡터 pPblma-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]로 형질전환된 대장균을 나타낸다. 도 4에서 보이는 바와 같이 gapAm1 프로모터가 도입된 재조합 대장균은 gapAm2 프로모터 또는 BLMA 프로모터가 도입된 재조합 대장균에 비해 매우 높은 과당의 알룰로스로의 전환율을 나타냈고, 이러한 결과로부터 gapAm1 프로모터의 효소 발현 유도 효과가 gapAm2 프로모터 또는 BLMA 프로모터에 비해 매우 강하다는 것을 알 수 있다.
실시예 7 : 재조합 균주의 기탁
상기 실시예 6에서 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 가장 높은, 재조합 발현벡터 pPgapAm1-FpDPE[W29K/A77S/G216S/M234I]로 형질전환된 재조합 대장균을 'DS00004'로 명명하였다. 또한, 상기 재조합 대장균 DS00004를 2021년 12월 14일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM; 주소 : 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제내2가길 45 유림빌딩 3F)에 부다페스트 조약에 의거한 국제특허기탁을 진행하여 수탁번호 KCCM13092BP를 부여받았다. 상기 재조합 대장균(Escherichia coli) DS00004(수탁번호 : KCCM13092P)는 부다페스트 조약에 규정된 절차 내에서 제3자에게 분양될 수 있다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> DAESANG CORPORATION
<120> Novel promoter variant for constitutive expression and use of the
same
<130> ZDP-21-0377
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 137
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Promoter gapA
<400> 1
aggcgagtca gtcgcgtaat gcttaggcac aggattgatt tgtcgcaatg attgacacga 60
ttccgcttga cgctgcgtaa ggtttttgta attttacagg caacctttta ttcactaaca 120
aatagctgga ggaatat 137
<210> 2
<211> 115
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Promoter BLMA
<400> 2
ggtgtctcat tctgttaccg ttaacagctg aaaatgattg ttcctgttac cgccgtcatg 60
ataatttcag aataaaagcc ggtttatcac agccggacaa ccaaaagggg gaaac 115
<210> 3
<211> 294
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Wild type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor
plautii
<400> 3
Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp
1 5 10 15
Glu Ile Ala Tyr Ile Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Trp Leu Gly Phe
20 25 30
Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala
35 40 45
Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile
50 55 60
Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu
85 90 95
Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala
100 105 110
Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg
115 120 125
Arg Lys Glu Glu Leu Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val
130 135 140
Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe
145 150 155 160
Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys
165 170 175
Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met
180 185 190
Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro
195 200 205
Trp Leu Gly His Phe His Val Gly Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly
210 215 220
Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Met Ala Ala Ala Leu Lys Gln
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly
245 250 255
Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly
260 265 270
Ala Gly Glu Ala Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe
275 280 285
Leu Lys Glu Leu Thr Ala
290
<210> 4
<211> 885
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Polynucleotide coding wild type D-allulose 3-epimerase derived
from Flavonifractor plautii
<400> 4
atgaacccga ttggaatgca ctacggcttc tggagccaca actgggacga gattgcatac 60
atacccctga tggagaagct ggcctggctg ggctttgaca tctgcgaggt ggcctccgcc 120
gagtggggct attacgacga cgccaggctg cgggagctga aggcctgcgc cgatcacaac 180
ggcctgggca tcacctattc catcggcctg gaggccaaat acgacctggc cagcgacgat 240
ccggcggtgc gggagaacgg catccgccat gtcacccgca tcctggagag catgcccaag 300
gtgggggcgg ccatcctcaa cggcgtgtcc tacgccgggt ggcaggccct gcccgaccac 360
ggaatcaccc tggacgagaa gcgccgcaag gaggagcttg ccctggagtc catgtcccgg 420
ctcatgaagg tggcggagga ctgcggcgtg ctctactgct gcgaggtggt caaccgcttc 480
gagcagtacc tgctcaacac cgccaaagag ggcgtggagt ttgtcaagcg cctgggcagt 540
cccaacgccc gggtgctgct ggataccttc cacatgaaca tcgaggagga cagcatggtg 600
gacgccattc tggaggcggg cccctggctg gggcatttcc acgtggggga gaacaaccgc 660
cgccccgccg gctccaccaa ccgcctgccc tggaaggaca tggccgccgc cctcaagcag 720
gtgaactacc agggggccat tgtgatggag cccttcgtgc tcatgggggg taccattccc 780
tatgatatca aggtctggcg ggatctcagc ggcggggccg gggaggccgg gctggacgag 840
atggcgggcc gggcctgccg gttcctcaag gagctgaccg cgtaa 885
<210> 5
<211> 294
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D-allulose 3-epimerase variant W29K/G216S/M234I
<400> 5
Met Asn Pro Ile Gly Met His Tyr Gly Phe Trp Ser His Asn Trp Asp
1 5 10 15
Glu Ile Ala Tyr Ile Pro Leu Met Glu Lys Leu Ala Lys Leu Gly Phe
20 25 30
Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala
35 40 45
Arg Leu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Ala Asp His Asn Gly Leu Gly Ile
50 55 60
Thr Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Ala Ser Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu
85 90 95
Ser Met Pro Lys Val Gly Ala Ala Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ala
100 105 110
Gly Trp Gln Ala Leu Pro Asp His Gly Ile Thr Leu Asp Glu Lys Arg
115 120 125
Arg Lys Glu Glu Leu Ala Leu Glu Ser Met Ser Arg Leu Met Lys Val
130 135 140
Ala Glu Asp Cys Gly Val Leu Tyr Cys Cys Glu Val Val Asn Arg Phe
145 150 155 160
Glu Gln Tyr Leu Leu Asn Thr Ala Lys Glu Gly Val Glu Phe Val Lys
165 170 175
Arg Leu Gly Ser Pro Asn Ala Arg Val Leu Leu Asp Thr Phe His Met
180 185 190
Asn Ile Glu Glu Asp Ser Met Val Asp Ala Ile Leu Glu Ala Gly Pro
195 200 205
Trp Leu Gly His Phe His Val Ser Glu Asn Asn Arg Arg Pro Ala Gly
210 215 220
Ser Thr Asn Arg Leu Pro Trp Lys Asp Ile Ala Ala Ala Leu Lys Gln
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gln Gly Ala Ile Val Met Glu Pro Phe Val Leu Met Gly
245 250 255
Gly Thr Ile Pro Tyr Asp Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly
260 265 270
Ala Gly Glu Ala Gly Leu Asp Glu Met Ala Gly Arg Ala Cys Arg Phe
275 280 285
Leu Lys Glu Leu Thr Ala
290
<210> 6
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polynucleotide coding D-allulose 3-epimerase variant
W29K/G216S/M234I
<400> 6
atgaacccga ttggaatgca ctacggcttc tggagccaca actgggacga gattgcatac 60
atacccctga tggagaagct ggccaaactg ggctttgaca tctgcgaggt ggcctccgcc 120
gagtggggct attacgacga cgccaggctg cgggagctga aggcctgcgc cgatcacaac 180
ggcctgggca tcacctattc catcggcctg gaggccaaat acgacctggc cagcgacgat 240
ccggcggtgc gggagaacgg catccgccat gtcacccgca tcctggagag catgcccaag 300
gtgggggcgg ccatcctcaa cggcgtgtcc tacgccgggt ggcaggccct gcccgaccac 360
ggaatcaccc tggacgagaa gcgccgcaag gaggagcttg ccctggagtc catgtcccgg 420
ctcatgaagg tggcggagga ctgcggcgtg ctctactgct gcgaggtggt caaccgcttc 480
gagcagtacc tgctcaacac cgccaaagag ggcgtggagt ttgtcaagcg cctgggcagt 540
cccaacgccc gggtgctgct ggataccttc cacatgaaca tcgaggagga cagcatggtg 600
gacgccattc tggaggcggg cccctggctg gggcatttcc acgtgagcga gaacaaccgc 660
cgccccgccg gctccaccaa ccgcctgccc tggaaggaca ttgccgccgc cctcaagcag 720
gtgaactacc agggggccat tgtgatggag cccttcgtgc tcatgggggg taccattccc 780
tatgatatca aggtctggcg ggatctcagc ggcggggccg gggaggccgg gctggacgag 840
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<211> 294
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Asp Ile Cys Glu Val Ala Ser Ala Glu Trp Gly Tyr Tyr Asp Asp Ala
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Pro Ala Val Arg Glu Asn Gly Ile Arg His Val Thr Arg Ile Leu Glu
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Promoter gapAm1
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ttccgcttga cgctgcgtaa ggtttttgta attttacagg caacctttta ttcactaaca 120
aatagctgga gt 132
Claims (10)
- 서열번호 9의 염기 서열로 구성된 프로모터 변이체.
- 제1항의 프로모터 변이체를 포함하는 재조합 벡터.
- 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결된 제1항의 프로모터 변이체를 포함하는 발현 벡터.
- 제3항에 있어서, 상기 목적 단백질은 효소인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제4항에 있어서, 상기 효소는 알룰로스 에피머화 효소인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 알룰로스 에피머화 효소는 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 알룰로스 에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기 서열, 서열번호 6의 염기 서열 또는 서열번호 8의 염기 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 형질전환된 재조합 균주.
- 제8항에 있어서, 상기 재조합 균주는 재조합 대장균(Escherichia coli) DS00004(수탁번호 : KCCM13092P)인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
- 과당 함유 용액에 제9항의 재조합 균주를 첨가하고 반응시키는 단계를 포함하는 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법.
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ID=87185802
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2021
- 2021-12-29 KR KR1020210190611A patent/KR20230100925A/ko not_active Application Discontinuation
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