KR102093509B1 - 알로스 제조용 조성물 및 알로스 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 예는 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI), 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 발현하는 재조합 균주 또는 이들을 이용하여 알룰로스를 알로스로 전환하는 방법 등을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI) 또는 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 발현하는 재조합 균주는 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환 반응시 높은 활성을 나타내고, 열 안정성이 우수하고, 다양한 반응 조건에서 부반응물인 D-알트로스(D-altrose)를 생성시키지 않거나 극소량으로 생성한다.

Description

알로스 제조용 조성물 및 알로스 제조방법{Composition for manufacturing allose and manufacturing method of allose}

본 발명은 알로스 제조용 조성물 및 알로스 제조방법 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 특정 람노스 이성화효소 또는 특정 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 균주에 기반하여 알룰로스로부터 알로스를 제조하기 위한 조성물 및 알룰로스로부터 알로스를 제조하는 방법 등에 관한 것이다.

알로스 (allose)는 포도당 (D-glucose)의 3번 탄소 에피머 (epimer)로서, 사이코스 (psocose)로도 불리우는 알룰로스(allulose)의 이성질체인 희소성 단당류로 알려져 있다. 이러한 알로스는 암세포의 증식의 저해하는 특성을 가지기 때문에 항암물질로 사용되고, 허혈작용으로 인한 장기 손상을 억제하는 기능도 가지기 때문에 장기보존액으로도 사용될 수 있다. 또한, 알로스는 분절된 호중성 백혈구의 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 혈소판의 감소도 억제하는 기능을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 알로스는 현재 의학적으로 매우 주목을 받는 희소성 당류 중 하나이다(Hossain, M. A., Izuishi, K., and H., Maeta. 2003, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 10: 218225.; Hossain, M. A., Izuishi, K., Tokuda, M., Izumori, K., and H. Maeta. 2004, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 11: 181189.; Hossain, M. A., Wakabayashi, H., Izuishi, K., Okano, K., Yachida, S., Tokuda, M., Izumori, K., and H., Maeta. 2006, J. Biosci. Bioeng., 101: 369371.).

이와 같이 알로스는 의약 산업 분야에서 높은 이용 가치가 있음에도 불구하고,자연계에는 극히 미량만이 존재하기 때문에 효과적으로 의약적 응용 분야에 공급되기 위해서는 알로스를 충분한 양으로 확보하는 것이 필요하다. 또한, 지금까지 알로스는 주로 화학적인 합성 방법에 의해서만 생산되어 왔다. 그러나 알로스의 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학적 반응 후 부가적인 당류의 생성, 이로 인한 복잡한 알로스의 분리 및 정제 과정 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경 오염 문제 등이 유발되고 있다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 특정 당류를 환경 친화적이고 특이성은 높게 대량 생산할 수 있는 방법으로서 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 생물학적으로 알로스를 고수율로 얻는 생산 방법이 최근에 주목을 받으며 시도되어 왔다. 구체적인 생물학적 생산 방법으로는 슈도모나스 슈체리(Pseudomonas stutzeri) 유래의 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose Isomerase)를 사용하여 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 방법이 보고되었다(Leang et al., Biochim Biophys Acta. 1674:68-77, 2004). 그러나 슈도모나스 슈체리 유래의 람노스 이성화효소에 의한 알로스 생산은 알로스 외에도 다량의 알트로스(D-altrose)가 생성되는 문제점이 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1895914호에는 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소를 이용하여 알룰로스로부터 알로스를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 한편, 대한민국 등록특허공보 제10-1895914호에는 알룰로스로부터 알로스를 제조할 때 부반응물인 D-알트로스(D-altrose)가 생성되지 않는다는 내용이 기재되어 있으나, 매우 제한적인 특정 조건에서만 부반응물인 D-알트로스(D-altrose)의 생성이 최소화될 뿐 대부분의 조건에서는 여전히 상당량의 D-알트로스(D-altrose)가 생성되어 상업화에 한계점을 가진다.

본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 알룰로스의 알로스로의 전환 효율이 높고 동시에 다양한 반응 조건에서 부반응물인 D-알트로스(D-altrose)를 생성시키지 않거나 극소량으로 생성시키는 신규 람노스 이성화효소를 제공하는데에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 신규 람노스 이성화효소를 제조하는 방법 또는 신규 람노스 이성화효소를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법 또는 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데에 있다.

본 발명의 발명자들은 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래의 람노스 이성화효소를 이용하여 BLAST 염기서열 검색(BlastX)을 실시하여 15종의 내열성 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 획득하고, 각 효소의 아미노산 서열을 정렬하여 비교한 결과, 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)가 가장 진화적 형태임을 확인하였다. 또한, 본 발명의 발명자들은 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 특정 폴리뉴클레오티드를 클로닝하여 재조합 벡터 pStRI를 제작하고, 상기 재조합 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032 균주에 형질전환시켜 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 발현하는 재조합 균주 CgStRI를 제작하였다. 이후, 본 발명의 발명자들은 상기 재조합 균주 CgStRI 균체 또는 균체를 포함하는 배양액을 이용하여 알룰로스의 알로스로의 전환 반응을 실시한 결과, 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI) 또는 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 발현하는 재조합 균주가 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 높은 활성을 나타내고, 열 안정성이 우수하고, 다양한 반응 조건에서 부산물인 D-알트로스(D-altrose)를 생성시키지 않거나 극소량으로 생성한다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 제공한다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 발현시키는 단계; 및 상기 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 분리하는 단계를 포함하는 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)의 제조방법을 제공한다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 포함하는 알로스(allose) 제조용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양액 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 알로스(allose) 제조용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 알룰로스(allulose) 또는 이를 포함하는 기질 용액을 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소 또는 상기 람노스 이성화효소를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알로스(allose) 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 일 예는 알룰로스(allulose) 또는 이를 포함하는 기질 용액을 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양액, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알로스(allose) 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 예에 따른 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI) 또는 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 발현하는 재조합 균주는 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환 반응시 높은 활성을 나타내고, 열 안정성이 우수하고, 다양한 반응 조건에서 부반응물인 D-알트로스(D-altrose)를 생성시키지 않거나 극소량으로 생성한다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 15종의 내열성 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 정렬하고 비교한 결과이다.
도 2는 발명의 실시예에서 15종의 내열성 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 정렬하고 비교 결과를 바탕으로 작성한 계통 분석 트리이다.
도 3은 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소와 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 4는 재조합 발현벡터 pStRI의 개열 지도이다.
도 5는 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성을 반응 pH별로 나타낸 그래프이다.
도 6은 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성을 반응 온도별로 나타낸 그래프이다.
도 7은 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성을 기질 용액의 알룰로스 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 8은 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성을 반응액 내 금속(망간) 이온 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 9는 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액을 소정의 온도에서 소정의 시간동안 열 처리하였을 때의 잔존 활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 재조합 균주 CgStRI를 이용하여 다양한 반응 온도 및 반응 pH 조건에서 알룰로스를 알로스로 전환 반응시킬 때 반응 시간에 따른 전환율을 나타낸 것이다.
도 11은 재조합 균주 CgCsRI를 이용하여 다양한 반응 온도 및 반응 pH 조건에서 알룰로스를 알로스로 전환 반응시킬 때 반응 시간에 따른 전환율을 나타낸 것이다.
도 12는 재조합 균주 CgStRI를 이용하여 다양한 반응 온도 및 반응 pH 조건에서 알룰로스를 알로스로 전환 반응시킬 때 반응 시간에 따른 부반응물 알트로스의 생성 거동을 나타낸 것이다.
도 13은 재조합 균주 CgCsRI를 이용하여 다양한 반응 온도 및 반응 pH 조건에서 알룰로스를 알로스로 전환 반응시킬 때 반응 시간에 따른 부반응물 알트로스의 생성 거동을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 측면은 측면은 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환시킬 수 있는 신규 람노스 이성화효소(L-Rhamnose isomerase, RI)에 관한 것이다. 상기 람노스 이성화효소는 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila)에서 유래한 것으로서, 60~65℃의 온도 및 6.5~7.0으 pH에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 최대 활성을 가지고, 열 안정성이 우수하고, 다양한 반응 조건에서 부반응물인 D-알트로스(D-altrose)를 생성시키지 않거나 극소량으로 생성한다. 상기 람노스 이성화효소는 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유전체 DNA에 존재하는 무수한 DNA 중 특정 DNA을 중합효소반응에 의해 증폭시키고, 증폭된 특정 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조한 후, 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 균주를 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 상기 재조합 균주를 배양하여 발현시키는 방법으로 얻어질 수 있다. 본 발명에 따른 람노스 이성화효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지나, 본 발명에 따른 라이보스-인산 이성화효소의 균등 범위는 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 람노스 이성화효소의 균등 범위는 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환하는 활성이 유지되는 한, 서열번호 1의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 단백질의 특성이 바뀌지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid replacement)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산의 변형은 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 람노스 이성화효소의 균등 범위는 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 람노스 이성화효소의 균등 범위는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95%이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 하기 표 1은 보존적 아미노산 치환에 의해 단백질 내 아미노산을 대체할 수 있는 아미노산들을 보여준다.

펩티드 내 아미노산 잔기	보존적 치환기
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Gln	Asn
Cys	Ser
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr, Gly
Thr	Ser, Val
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

본 발명의 다른 측면은 신규 람노스 이성화효소를 제조하는 방법 또는 신규 람노스 이성화효소를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들에 관한 것이다. 상기 신규 람노스 이성화효소를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들로는 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 재조합 균주 등이 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 바람직하게는 서열 번호 2의 염기 서열로 이루어진다. 본 발명에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형(non-modified) 또는 변형된(modified) 모든 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일-및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA 또는 이들의 하이브리드 분자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 균등 범위는 서열번호 2의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 2의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 2의 염기 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 재조합 벡터는 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공지의 표준 방법을 사용하여 클로닝 벡터나 발현 벡터 내로 삽입한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 용어 "클로닝 벡터"는 숙주 세포 내로 DNA 단편을 운반하고 이를 재생산할 수 있는 물질로 정의된다. 본 발명에서 클로닝 벡터는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal), 전사 종결 서열(transcription termination sequence) 및 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제(endonuclease) 제한효소 절단위치(restriction site)를 포함한다. 또한, 클로닝 벡터는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명에서 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal) 및 전사 종결 서열(transcription termination sequence)의 상류(upstream)에 위치할 수 있고, 적어도 하나의 엔도뉴클레아제(endonuclease) 제한효소 절단위치(restriction site)가 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal) 및 전사 종결 서열(transcription termination sequence)의 상류(upstream)에 위치할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 적절한 숙주 안에서 클로닝된 DNA의 전사와 번역을 위해 필요한 DNA 서열로 정의된다. 또한, 본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 발현 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코드하는 유전자 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA, 추가적 발현 조절 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는 데 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 단일 폴리뉴클레오티드 상의 폴리뉴클레오티드 서열 연관성으로 하나의 기능이 다른 것에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있는 경우) 프로모터는 코딩 서열과 연결되어 작동되거나, 리보좀 결합 자리가 번역을 촉진시킬 수 있도록 위치하고 있다면, 리보좀 결합 자리는 코딩 서열에 연결되어 작동되는 것이다. 코딩 서열은 센스 방향 또는 안티센스 방향에서 조절 서열에 연결되어 작동될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이고, 상기 발현 벡터는 바람직하게는 도 4의 개열 지도를 갖는다.

또한, 상기 재조합 균주는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것이다. 상기 재조합 균주는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 발현하기 때문에 알룰로스의 알로스로의 전환 반응과 관련하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소와 등가의 효과를 가지며 서로 호환되어 사용될 수 있다. 본 발명에서 용어, "재조합 균주"는 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 갖는 발현 벡터가 숙주 세포(또는 숙주 균주)에 도입되어 형질전환된 세포(또는 균주)를 의미한다. 상기 발현 벡터를 숙주 세포(또는 숙주 균주)에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposemmediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포로는 원핵 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포 등 당업계에 공지된 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 바람직하게는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 대장균일 수 있다. 상기 대장균으로 BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 등을 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 상기 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스속 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아속 균주, 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬라속 균주, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 균주를 사용하여도 무방하다. 또한, 상기 재조합 균주가 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 반응에 이용되는 경우 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것이 바람직하다. 상기 식품학적으로 안전한 균주는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally accepted as safe) 균주를 의미하며, 예를 들어 코리네박테리움속 균주일 수 있다. 상기 코리네박테리움속 균주는 L-라이신, L-쓰레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 코리네박테리움속 균주는 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주이고, 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 균주 특성을 보유하고 있다. 또한, 코리네박테리움속 균주는 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이며, 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있으며, 이로 인하여 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 보인다. 상기 코리네박테리움속 균주의 구체적인 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등이 있다.

또한, 상기 람노스 이성화효소의 제조방법은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 람노스 이성화효소를 발현시키는 단계; 및 상기 람노스 이성화효소가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 람노스 이성화효소를 분리하는 단계를 포함한다. 숙주 세포에 의한 단백질의 발현은 유도 인자인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 사용하여 발현을 유도할 수 있고, 유도시간은 단백질의 양을 최대화되게 조절할 수 있다. 본 발명에서 람노스 이성화효소는 재조합 균주의 파쇄물로부터 회수될 수 있다. 단백질 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 또는 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 예를 들어, 숙주 세포에 의해 발현된 단백질의 분리 또는 정제 방법으로는 전기영동, 원심분리, 겔 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 또는 복합 방법을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한편, 본 발명에서 재조합 균주의 파쇄물로부터 람노스 이성화효소를 분리하는 단계는 바람직하게는 펩티드 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 수행될 수 있다. 상기 펩티드 태그로는 HA 태그, FLAG 태그, His 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein), c-myc 태그, V5 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 또는 MBP(maltose binding protein) 등과 같이 공지의 다양한 태그를 사용할 수 있으며, 이중 His 태그인 것이 바람직하다. His-태깅된 단백질은 Ni-NTA(니켈-니트릴로트리아세트산) 수지의 칼럼 상에 특이적으로 트랩핑되며, EDTA 또는 이미다졸에 의해 용출될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법 또는 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들에 관한 것이다. 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들로는 알로스(allose) 제조용 조성물이 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "조성물"이란 2가지 이상의 성분이 균일하게 혼합되어 있는 상태의 물질을 의미하여, 완제품뿐만 아니라 완제품 제조를 위한 중간 소재를 포함하는 개념이다.

상기 알로스(allose) 제조용 조성물의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 포함한다. 또한, 상기 알로스(allose) 제조용 조성물의 다른 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양액 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "배양액"이란 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 미생물이 포함되는 개념이다.

또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법의 일 예는 알룰로스(allulose)를 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법의 다른 예는 알룰로스(allulose)를 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양액, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 상기 람노스 이성화효소 또는 상기 재조합 균주는 바람직하게는 담체에 고정화된다. 상기 담체는 고정된 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 담체로 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량 면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되며, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 알로스(allose) 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다. 일 예로, 알로스(allose)의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 바람직하게는 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 재조합 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 반응 온도는 55~70℃, 효소 또는 재조합 균주의 활성을 고려할 때 바람직하게는 55~65℃의 범위이고, 반응 pH는 6.0~7.5, 효소 또는 재조합 균주의 활성을 고려할 때 바람직하게는 6.5~7의 범위이다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 효소 기질인 알룰로스(allulose)의 농도는 특별히 제한되지 않으나, 생산성 내지 경제성을 고려할 때 전체 반응물을 기준으로 반응 초기에 1~35%(w/v)인 것이 바람직하고, 5~30%(w/v)인 것이 더 바람직하고, 5~20%(w/v)인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 제조하는 방법에서 사용되는 효소의 양은 전체 반응물 기준으로 0.01~0.5 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.05~0.2 ㎎/㎖일 수 있다. 또한, 재조합 균주를 이용하여 알룰로스(allulose)로부터 알로스(allose)를 제조하는 경우 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것이 바람직하다. 상기 식품학적으로 안전한 균주는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally accepted as safe) 균주를 의미하며, 예를 들어 코리네박테리움속 균주일 수 있다. 상기 코리네박테리움속 균주는 L-라이신, L-쓰레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 코리네박테리움속 균주는 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주이고, 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 균주 특성을 보유하고 있다. 또한, 코리네박테리움속 균주는 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이며, 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있으며, 이로 인하여 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 보인다. 상기 코리네박테리움속 균주의 구체적인 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등이 있다. 또한, 본 발명에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환 반응은 금속 이온의 존재하에서 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 금속 이온은 Mn^{2 +}, Ni^{2 +} 및 Co^{2 +}로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 Mn^{2 +} 또는 Ni²⁺일 수 있으며, 가장 바람직하게는 Mn^{2 +} 일 수 있다. 또한, 본 발명에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환 반응시 전체 반응물 내 금속 이온의 농도는 0.1~6 mM인 것이 바람직하고 0.5~5 mM인 것이 더 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.

1. 알로스 제조에 적합한 람노스 이성화효소의 선별

대한민국 등록특허공보 제10-1895914호에서 알로스 제조에 적합하다고 보고된 알려진 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래의 람노스 이성화효소를 이용하여 BLAST 염기서열 검색(BlastX)을 실시하였다. BLAST 염기서열 검색(BlastX) 결과로부터 다음과 같은 15종의 내열성 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 획득하였다.

* WP_015358360.1 Thermoclostridium stercorarium

* WP_114298639.1 Anaerobacterium chartisolvens

* WP_096230837.1 Thermoanaerobacterium sp

* WP_103082453.1 Pseudoclostridium thermosuccinogenes

* WP_039765395.1 Caldicellulosiruptor sp

* WP_013788824.1 Thermoanaerobacterium xylanolyticum

* WP_014757168.1 Thermoanaerobacterium aotearoense

* WP_045413624.1 Thermoanaerobacterium saccharolyticum

* WP_011916438.1 Caldicellulosiruptor saccharolyticus

* RKX86092.1 Spirochaetes bacterium

* WP_015254186.1 Thermobacillus composti

* PWM20605.1 Clostridiales bacterium

* WP_073337583.1 Clostridium grantii

* WP_066250430.1 Geobacillus sp.

* WP_014624937.1 Spirochaeta thermophila

이후, 15종의 내열성 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 정렬하고 비교하였다. 도 1은 본 발명의 실시예에서 15종의 내열성 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 정렬하고 비교한 결과이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 다양한 균주에서 유래한 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)는 특정 아미노산 서열을 공유하는 반면, 대부분의 서열에서 차이를 보였다. 특히, 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)는 일부 도메인은 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래의 람노스 이성화효소와 유사하였고, 도 1에 표시된 2개의 박스와 같이 일부 도메인은 자체적으로 가지고 있는 고유한 서열인 것으로 확인되었다. 즉, 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)는 다른 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)와 달리 특정 아미노산 서열이 결실되어 있는 특징을 보였다. 아미노산 서열 정렬 결과를 바탕으로 계통유전학적 분석을 실시하였다. 도 2는 발명의 실시예에서 15종의 내열성 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 정렬하고 비교 결과를 바탕으로 작성한 계통 분석 트리이다. 도 2에서 보이는 바와 같이 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)는 다른 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)와 비교하였을 때 가장 진화된 형태임이 확인되었다. 람노스 이성화효소의 아미노산 서열 정렬 결과와 계통유전학적 분석 결과에 기초하여 알로스 제조에 적합한 람노스 이성화효소로 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)를 선별하였다. 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어져 있고, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어져 있다.

2. 스피로체타 써모필라 ( Spirochaeta thermophila ) 유래 람노스 이성화효소와 클로스트리디움 스터코랄리움 ( Clostridium stercorariu m ) 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열 비교

도 3은 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소와 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열을 비교한 결과이다. 도 3에서 'St_RI'는 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소를 나타내고 'Cs_RI'는 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래 람노스 이성화효소를 나타낸다. 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소는 전체 420개의 아미노산으로 구성되어 있고, 보존 단백질 영역 패밀리(Conserved Protein Domain Family) 검색 결과, AP endonuclease family 2 도메인을 갖는 것으로 확인되었다. 또한, 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소와 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래 람노스 이성화효소의 아미노산 서열 유사도는 약 57.4%이었다.

3. 스피로체타 써모필라 ( Spirochaeta thermophila ) 유래 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 균주의 제작

(1) 람노스 이성화효소가 클로닝된 재조합 발현벡터 pStRI의 제작

스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 균주로부터 L-람노스 이성화효소(L-Rhamnose isomerase, RI)를 증폭하기 위하여, 해당 균주의 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하고 해당 RI 유전자 부분의 단편을 증폭하여 E. coli/Corynebacterium shuttle vector인 pEkEx2(Gene. 1991;102:93-98)에 클로닝 하였다.

먼저, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 중합연쇄반응(PCR)을 수행하여 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 균주의 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 L-람노스 이성화효소(L-Rhamnose isomerase, RI)의 코딩 서열 및 주변 서열을 포함하는 염기 서열을 증폭하였다. 이후, 증폭된 산물을 정제하고, 염기 서열 분석을 통해 증폭된 산물의 염기 서열을 확인하였다. 이후, 증폭된 산물에 해당하는 단편을 주형(Template)으로 이용하고, 좌측 RI ORF(PstI) 단편 증폭 프라이머 및 우측 RI ORF(KpnI) 단편 증폭 프라이머를 이용하여 중합연쇄반응(PCR)을 수행하고 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 균주 유래 L-람노스 이성화효소(L-Rhamnose isomerase, RI)의 ORF(open reading frame) 단편만을 특이적으로 증폭하였다. 이때, 클로닝을 위해 ORF(open reading frame) 단편의 양쪽 염기 서열에 제한효소인 PstI과 KpnI에 해당하는 염기 서열을 첨가하여 중합연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 하기 표 2에 2번의 중합연쇄반응(PCR)에 사용한 프라이머 및 염기 서열을 나타내었다.

프라이머 종류	프라이머 염기 서열(5' ---> 3')
정방향 프라이머	CGAGAGAGGACGTGGAGTTC
역방향 프라이머	CCAACCCGTAGAGCTTGGTA
좌측 RI ORF(PstI) 단편 증폭 프라이머	CTGCAGATGACATCGAACGACAGAGT
우측 RI ORF(KpnI) 단편 증폭 프라이머	GTCGACTCAGGTCCGCTTCGAAAGCA

또한, 중합연쇄반응(PCR)의 조건은 다음과 같다.

* PCR 장치 : Thermocycler(TP600, TAKARA BIO Inc., JAPAN)

* 반응액 조성 : 100μM의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 올리고뉴클레오타이드 1pM, 주형 DNA 100ng, pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물(바이오니아) 1 유니트

* PCR 주기 : 25~30

* 1주기 온도 프로파일 : 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1.5분

이후, 증폭 단편 및 pEkEx2 벡터 각각에 제한효소인 PstI과 KpnI를 동일하게 처리하고 정제한 후, T4-DNA ligase로 증폭 단편을 pEkEx2 벡터에 접합하여 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 균주 유래 L-람노스 이성화효소(L-Rhamnose isomerase, RI)가 클로닝된 재조합 발현벡터를 제작하고 이를 pStRI로 명명하였다. 도 4는 재조합 발현벡터 pStRI의 개열 지도이다. 도 4에서 용어 'StRI'는 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 균주 유래 L-람노스 이성화효소(L-Rhamnose isomerase, RI)를 코딩하는 염기 서열을 나타낸다. 이후, 재조합 발현벡터를 E. coli DH5alpha 균주에 heat shock 방법을 이용하여 형질전환하고, 형질전환된 균주를 50 ㎍/㎕의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트에 도말하여 최종 형성되는 콜로니를 분리하였다. 분리한 콜로니로부터 플라스미드를 추출하고 추출한 플라스미드에 목적 유전자가 정확히 삽입되었는지 여부를 PCR 및 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

(2) 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 균주 CgStRI의 제작

재조합 발현벡터 pStRI를 E. coli JM110 균주에 heat shock 방법을 이용하여 형질전환하고, 형질전환된 균주를 50 ㎍/㎕의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트에 도말하여 최종 형성되는 콜로니를 분리한 후, 분리된 콜로니를 50 ㎍/㎕의 카나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에 접종하여 37℃, 250 rpm의 조건에서 약 14~16 hr 동안 배양하였다. 이후, 배양한 균주로부터 플라스미드를 획득한 후, 획득한 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032 균주에 전기천공법(FEMS Microbiology lettes. 123: 343-347. 1994)으로 형질전환하였다. 이후, 전기천공한 균주를 50 ㎍/㎕의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트에 도말하여 콜로니를 분리하고, 재조합 발현벡터 pStRI가 형질전환되었는지를 PCR 및 염기 서열 분석을 통해 확인하였다. 최종적으로 재조합 발현벡터 pStRI의 삽입이 확인된 재조합 균주를 CgStRI로 명명하였다.

4. 재조합 균주 CgStRI를 이용한 알로스의 제조 및 다양한 특성

(1) 재조합 균주 CgStRI의 활성화

앞에서 제작한 CgStRI 재조합 균주를 50 ㎍/㎕의 카나마이신을 함유하는 LB 한전 플레이트에 도말하고 약 30℃에서 약 48 hr 동안 배양하여 활성화하였다.

(2) 재조합 균주 CgStRI의 배양 및 배양된 균체의 알로스 전환 활성 측정(Flask Test)

활성화된 CgStRI 재조합 균주를 50㎖의 종 배양 배지(Seed medium; 증류수에 Glucose 2.7%(w/w), Urea 0.3%(w/w), YPA 0.5%(w/w), Biotin 100 ppb, Thiamine 200 ppb, KH₂PO₄ 0.1%(w/w), K₂HPO₄ 0.1%(w/w), MgSO₄ 0.1%(w/w), FeSO₄ 10 ppm, MnSO₄ 10 ppm이 포함되어 있음)가 수용된 500㎖ 용량 baffled flask에 접종하고, 30℃ 및 200 rpm의 조건에서 약 24 hr 동안 진탕 배양하였다. 종 배양 종료 후, 종 배양액 30㎖를 원심분리(5000 rpm, 5분)하여 균체를 회수하고, 회수한 균체를 3㎖의 증류수에 현탁하여 CgStRI 균체 현탁액을 제조하였다. 알룰로스(Allulose)를 증류수에 용해하고 1% NaOH 수용액으로 pH를 조정하여 알룰로스 농도가 1.25%(w/v)인 기질 용액(pH 7.8)을 제조하였다. 이후, 기질 용액 4㎖에 CgStRI 균체 현탁액 1㎖를 첨가하여 알룰로스 농도가 1%(w/v)인 반응액을 제조하였다. 이후, 반응액을 50℃ 및 100 rpm의 조건으로 8 hr 동안 교반하여 효소 전환 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량을 측정하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다.

* HPLC 장치 : Agilent 2000 series

* 칼럼 : SP-0810 column, Column oven 80℃

* 이동상(mobile phase) : ddH₂O, flow rate 0.8 ㎖/min

* 검출 : RI detector, 50℃

HPLC 분석 결과, 1%(w/v) 농도의 알룰로스는 0.31%(w/v) 농도의 알로스로 전환되었고, 재조합 균주 CgStRI의 균체에 의한 알룰로스의 알로스로의 전환율은 약 31% 이었다.

(3) 재조합 균주 CgStRI의 배양액을 이용한 스케일-업(Scale-up) 전환 반응

활성화된 CgStRI 재조합 균주를 300㎖의 종 배양 배지(Seed medium; 증류수에 Glucose 2.7%(w/w), Urea 0.3%(w/w), YPA 0.5%(w/w), Biotin 100 ppb, Thiamine 200 ppb, KH₂PO₄ 0.1%(w/w), K₂HPO₄ 0.1%(w/w), MgSO₄ 0.1%(w/w), FeSO₄ 10 ppm, MnSO₄ 10 ppm이 용해되어 있음)가 수용된 2L 용량 baffled flask에 접종하고, 30℃ 및 200 rpm의 조건에서 약 24 hr 동안 진탕 배양하였다. 이후, 1.5L의 본 배양 배지(Main medium; 증류수에 Glucose 6.0%(w/w), MgSO₄ 0.1%(w/w), FeSO₄ 10 ppm, MnSO₄ 10 ppm, ZnSO₄ 10 ppm, Biotin 100 ppb, Thiamine 1.0 ppm, YPA 0.5%(w/w), KH₂PO₄ 0.1%(w/w), K₂HPO₄ 0.1%(w/w), (NH₄)₂SO₄ 0.3%(w/w)가 용해되어 있음)가 수용된 5L 용량의 발효조에 재조합 균주 CgStRI의 종 배양액 100㎖를 접종하고 pH 7.0, 30℃, 1.0 vvm, 650 rpm의 조건에서 약 24 hr 동안 배양하였다. 본 배양 종료 후 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액을 이용하여 알룰로스의 알로스로의 전환 반응을 실시하였다. 구체적으로, 알룰로스(Allulose)를 증류수에 용해하고 1% NaOH 수용액으로 pH를 조정하여 알룰로스 농도가 64%(w/v)인 기질 용액(pH 7.8)을 제조하였다. 이후, 상기 기질 용액 250㎖에 1M 농도의 MnCl₂ 용액 500㎕를 첨가하고 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 250㎖를 첨가하여 알룰로스 농도가 32%(w/v)인 반응액을 제조하였다. 이후, 3% NaOH 수용액을 이용하여 반응액의 pH를 7.0으로 유지시키면서 60℃에서 22 hr 동안 효소 전환 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량을 측정하였다. HPLC 분석 결과, 32%(w/v) 농도의 알룰로스는 8.68%(w/v) 농도의 알로스로 전환되었고, 재조합 균주 CgStRI의 배양액에 의한 알룰로스의 알로스로의 전환율은 약 27.2% 이었다.

(4) 재조합 균주 CgStRI의 반응 pH, 반응 온도, 기질 농도 및 금속 이온 농도에 따른 알룰로스의 알로스로의 전환 활성

1) 재조합 균주 CgStRI의 최적 반응 pH

알룰로스 농도가 12.44%(w/v)인 기질 용액 350㎖에 앞에서 수득한 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 150㎖를 첨가하고 MnCl₂ 농도가 1 mM이 되도록 처리하여 반응액을 제조하였다. 이후, 반응액의 pH를 각각 6.0, 6.5 및 7.0으로 유지시키면서 60℃에서 22 hr 동안 효소 전환 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량을 측정하고 알룰로스의 알로스로의 전환율을 계산하였다. 도 5는 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성을 반응 pH별로 나타낸 그래프이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 재조합 균주 CgStRI는 약 6.5~7.0의 pH에서 높은 전환 활성을 나타냈고, pH 7에서 최대 전환 활성을 나타냈다.

2) 재조합 균주 CgStRI의 최적 반응 온도

알룰로스 농도가 12.44%(w/v)인 기질 용액 350㎖에 앞에서 수득한 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 150㎖를 첨가하고 MnCl₂ 농도가 1 mM이 되도록 처리하여 반응액을 제조하였다. 이후, 반응액별로 서로 다른 온도(55℃, 60℃, 65℃) 조건에서 반응액의 pH를 7.0으로 유지시키면서 22 hr 동안 효소 전환 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량을 측정하고 알룰로스의 알로스로의 전환율을 계산하였다. 도 6은 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성을 반응 온도별로 나타낸 그래프이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 재조합 균주 CgStRI는 약 60~65℃의 온도에서 높은 전환 활성을 나타냈고, 65℃의 온도에서 최대 전환 활성을 나타냈다.

4) 재조합 균주 CgStRI의 최적 기질 농도

알룰로스 농도가 각각 12.44%(w/v), 24.89%(w/v), 49.78%(w/v)인 기질 용액 350㎖에 앞에서 수득한 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 150㎖를 첨가하고 MnCl₂ 농도가 1 mM이 되도록 처리하여 기질 농도가 서로 다른 반응액을 제조하였다. 이후, 반응액의 pH를 7.0으로 유지시키면서 60℃에서 22 hr 동안 효소 전환 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량을 측정하고 알룰로스의 알로스로의 전환율을 계산하였다. 도 7은 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성을 기질 용액의 알룰로스 농도별로 나타낸 그래프이다. 도 7에서 기질 농도로 표시된 '8%, 16%, 32%'는 반응액을 기준으로 한 반응 초기의 농도 값이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 재조합 균주 CgStRI는 반응액의 알룰로스 기질 농도가 약 8~16%(w/v)일 때 높은 전환 활성을 나타냈고, 반응액의 알룰로스 기질 농도가 8%(w/v)일 때 최대 전환 활성을 나타냈다.

5) 재조합 균주 CgStRI의 최적 금속 이온 농도

알룰로스 농도가 74.67%(w/v)인 기질 용액 350㎖에 앞에서 수득한 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 150㎖를 첨가하고 MnCl₂ 농도가 각각 0, 1, 2, 4 mM이 되도록 처리하여 금속 이온 농도가 서로 다른 반응액을 제조하였다. 이후, 반응액의 pH를 7.0으로 유지시키면서 60℃에서 22 hr 동안 효소 전환 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량을 측정하고 알룰로스의 알로스로의 전환율을 계산하였다. 도 8은 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성을 반응액 내 금속(망간) 이온 농도별로 나타낸 그래프이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 재조합 균주 CgStRI는 반응액의 망간 이온 농도가 1-4 mM일 때 높은 전환 활성을 나타냈고, 반응액의 망간 이온 농도가 4 mM일 때 최대 전환 활성을 나타냈다.

(5) 재조합 균주 CgStRI의 열 안정성

앞에서 수득한 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 500㎖를 각각 50, 55, 60, 65, 70℃에 25 hr 동안 보관하여서, 소정의 보관 시간 간격(2, 4, 8, 12, 16, 20, 25 hr)으로 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 5㎖를 샘플링하였다. 알룰로스 농도가 2%(w/v)인 기질 용액 5㎖에 샘플링한 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 5㎖를 첨가하고 MnSO₄ 농도가 1 mM이 되도록 처리하여 반응액을 제조하였다. 이후, 반응액의 pH를 7.0으로 유지시키면서 60℃에서 4 hr 동안 효소 전환 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량을 측정하고 알룰로스의 알로스로의 전환율을 계산하였다. 도 9는 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액을 소정의 온도에서 소정의 시간동안 열 처리하였을 때의 잔존 활성을 나타낸 그래프이다. 도 9에서 X축은 열 처리 시간을 나타낸다. 도 9에서 보이는 바와 같이 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액은 55~60℃의 온도에서 12 hr 동안 열처리하는 경우에도 약 90% 이상의 활성을 유지하는 것으로 나타났다. 재조합 균주 CgStRI의 알룰로스의 알로스로의 전환 반응시 최대 활성을 나타내는 반응 온도가 60~65℃이고 재조합 균주 CgStRI의 열 안정성이 지속하는 온도가 55~60℃인 점을 고려할 때 상업적 관점의 최적 반응 온도는 60℃이다.

5. 서로 다른 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타 미쿰( Corynebacterium glutamicum ) 균주들 간의 알룰로스의 알로스로의 전환 활성 비교 및 부반응물인 알트로스의 생성 여부

(1) 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgStRI를 이용한 실험방법

활성화된 CgStRI 재조합 균주를 300㎖의 종 배양 배지(Seed medium; 증류수에 Glucose 2.7%(w/w), Urea 0.3%(w/w), YPA 0.5%(w/w), Biotin 100 ppb, Thiamine 200 ppb, KH₂PO₄ 0.1%(w/w), K₂HPO₄ 0.1%(w/w), MgSO₄ 0.1%(w/w), FeSO₄ 10 ppm, MnSO₄ 10 ppm이 용해되어 있음)가 수용된 2L 용량 baffled flask에 접종하고, 30℃ 및 200 rpm의 조건에서 약 24 hr 동안 진탕 배양하였다. 이후, 1.5L의 본 배양 배지(Main medium; 증류수에 Glucose 6.0%(w/w), MgSO₄ 0.1%(w/w), FeSO₄ 10 ppm, MnSO₄ 10 ppm, ZnSO₄ 10 ppm, Biotin 100 ppb, Thiamine 1.0 ppm, YPA 0.5%(w/w), KH₂PO₄ 0.1%(w/w), K₂HPO₄ 0.1%(w/w), (NH₄)₂SO₄ 0.3%(w/w)가 용해되어 있음)가 수용된 5L 용량의 발효조에 재조합 균주 CgStRI의 종 배양액 100㎖를 접종하고 pH 7.0, 30℃, 1.0 vvm, 650 rpm의 조건에서 약 24 hr 동안 배양하였다.

이후, 알룰로스 농도가 64%(w/v)인 기질 용액 250㎖에 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 250㎖를 첨가하고 MnSO₄ 농도가 1 mM이 되도록 처리하여 반응액을 제조하였다. 이후, 반응액의 pH를 각각 6.5 및 7.0으로 유지시키면서 서로 다른 온도(50℃, 55℃, 60℃)에서 48 hr 동안 효소 전환 반응을 진행하였다.

또한, 재조합 균주 CgStRI의 본 배양액 450㎖를 원심분리(5000 rpm, 5분)하여 균체를 회수하고, 회수한 균체를 250㎖의 증류수에 현탁하여 CgStRI 균체 현탁액을 제조하였다. 이후, 알룰로스 농도가 64%(w/v)인 기질 용액 250㎖에 재조합 균주 CgStRI의 균체 현탁액 250㎖를 첨가하고 MnSO₄ 농도가 1 mM이 되도록 처리하여 반응액을 제조하였다. 이후, 반응액의 pH를 7.0으로 유지시키면서 60℃에서 48 hr 동안 효소 전환 반응을 진행하였다. 도 10 내지 도 13에서 균체 현탁액을 사용하여 진행한 실험을 '60℃, pH 7.0*'으로 표시하였다.

반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량 및 부반응 생성물인 알트로스의 함량을 측정하였다.

(2) 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgCsRI를 이용한 실험방법

스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 균주로부터 재조합 벡터 StRI 및 재조합 균주 CgCsRI를 제작하는 방법과 동일한 방법을 사용하여 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 클로닝된 재조합 벡터 CsRI 및 상기 재조합 벡터 CsRI의 도입에 의해 형질전환되고 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgCsRI를 제작하였다. 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 유래 람노스 이성화효소(Rhamnose isomerase, RI)는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어져 있고, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기 서열로 이루어져 있다.

클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유전체로부터 L-람노스 이성화효소(L-Rhamnose isomerase, RI)의 코딩 서열 및 주변 서열을 포함하는 염기 서열을 증폭하기 위해 사용한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 그리고 증폭된 RI 유전자 부분의 단편에서 L-람노스 이성화효소(L-Rhamnose isomerase, RI)의 ORF(open reading frame) 단편만을 특이적으로 증폭하고 ORF(open reading frame) 단편의 양쪽 염기 서열에 제한효소인 PstI과 KpnI에 해당하는 염기 서열을 첨가하기 위해 사용한 좌측 RI ORF(PstI) 단편 증폭 프라이머 및 우측 RI ORF(KpnI) 단편 증폭 프라이머의 염기 서열 정보는 하기 표 3과 같다.

프라이머 종류	프라이머 염기 서열(5' ---> 3')
정방향 프라이머	CAACGGCGAGATAAAAGGAA
역방향 프라이머	CCTGCAGCCTGTGAAATTCT
좌측 RI ORF(PstI) 단편 증폭 프라이머	CTGCAGATGTATTTATACAACAAGGA
우측 RI ORF(KpnI) 단편 증폭 프라이머	GTCGACTCACTTTCTTAAGGACAGCA

이후, 제작한 재조합 균주 CgCsRI를 재조합 균주 CgStRI에 실시한 방법과 동일한 방법으로 활성화하고 종 배양 및 본 배양을 통해 재조합 균주 CgCsRI의 본 배양액과 CgCsRI 균체 현탁액을 수득하였다. 이후, 앞에서 기술한 재조합 균주 CgStRI 실험과 동일한 조건 및 동일한 방법으로 알룰로스의 알로스로의 전환 반응을 수행하고, 반응 종료 후 HPLC를 이용하여 알룰로스로부터 전환생성된 알로스의 함량 및 부반응 생성물인 알트로스의 함량을 측정하였다.

(3) 서로 다른 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주들 간의 반응 양상 비교

도 10은 재조합 균주 CgStRI를 이용하여 다양한 반응 온도 및 반응 pH 조건에서 알룰로스를 알로스로 전환 반응시킬 때 반응 시간에 따른 전환율을 나타낸 것이다. 도 11은 재조합 균주 CgCsRI를 이용하여 다양한 반응 온도 및 반응 pH 조건에서 알룰로스를 알로스로 전환 반응시킬 때 반응 시간에 따른 전환율을 나타낸 것이다. 도 12는 재조합 균주 CgStRI를 이용하여 다양한 반응 온도 및 반응 pH 조건에서 알룰로스를 알로스로 전환 반응시킬 때 반응 시간에 따른 부반응물 알트로스의 생성 거동을 나타낸 것이다. 도 13은 재조합 균주 CgCsRI를 이용하여 다양한 반응 온도 및 반응 pH 조건에서 알룰로스를 알로스로 전환 반응시킬 때 반응 시간에 따른 부반응물 알트로스의 생성 거동을 나타낸 것이다. 도 10 내지 도 13에서 보이는 바와 같이 스피로체타 써모필라(Spirochaeta thermophila) 유래 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgStRI는 클로스트리디움 스터코랄리움(Clostridium stercorarium) 균주 유래 람노스 이성화효소를 발현하는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgCsRI에 비해 알룰로스의 알로스로의 전환 활성은 더 높고, 반면 부반응물인 알트로스의 생성은 현저하게 낮았다. 구체적으로, 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgStRI의 경우 다양한 반응 조건에서 부반응물인 알트로스의 생성량이 최대 0.2% 미만으로서 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgCsRI의 알트로스 최대 생성량인 2.3%에 비해 10배 이상 감소하는 결과를 보였다.

본 발명의 실시예에서 알룰로스를 알로스로 전환하기 위해 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgStRI의 균체 현탁액 또는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgStRI의 배양액을 사용하였다. 상기 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주는 균체 내에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 가지고 있고, 알룰로스의 알로스로의 전환 반응은 상기 람노스 이성화효소에 의해 진행된다. 따라서, 알룰로스를 알로스로 전환하는 반응과 관련하여 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주 CgStRI는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소와 등가의 효과를 가지는 것으로 평가할 수 있다.

이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Composition for manufacturing allose and manufacturing method of allose <130> ZDP-18-0319 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 420 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> L-Rhamnose isomerase derived from Spirochaeta thermophila <400> 1 Met Thr Ser Asn Asp Arg Val Glu Arg Ala Phe Glu Glu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Arg Tyr Ala Asp Leu Gly Val Asp Val Glu Ala Ala Val Lys Arg Cys 20 25 30 Ala Glu Ile Pro Val Ser Ile His Cys Trp Gln Gly Asp Asp Val Val 35 40 45 Gly Leu Glu Gly Lys Asp Thr Leu Ser Gly Gly Gly Ile Leu Ala Thr 50 55 60 Gly Asn Tyr Pro Gly Arg Ala Arg Ser Gly Asp Glu Leu Arg Gln Asp 65 70 75 80 Ala Ala Lys Ala Phe Ser Leu Val Pro Gly Thr Lys Arg Phe Asn Leu 85 90 95 His Ala Met Tyr Ala Glu Thr Glu Gly Lys Arg Val Asp Arg Asp Ala 100 105 110 Leu Glu Pro Arg His Phe Glu Lys Trp Val Glu Trp Ala Lys Ser Leu 115 120 125 Gly Ile Gly Leu Asp Phe Asn Pro Thr Phe Phe Ser His Pro Leu Ala 130 135 140 Asp Ser Gly Phe Thr Leu Ser His Pro Asp Glu Gly Val Arg Ala Phe 145 150 155 160 Trp Val Arg His Ala Ile Ala Cys Glu Arg Ile Ala Ala Tyr Phe Ala 165 170 175 Ser Glu Leu Asp Gly Val Cys Ile Asn Asn Leu Trp Ile Pro Asp Gly 180 185 190 Trp Lys Asp Ile Pro Val Asp Arg Leu Gly Pro Arg Glu Arg Leu Leu 195 200 205 Ala Ser Leu Asp Glu Ile Tyr Arg Glu Arg Leu Pro Gly Val Ile Asp 210 215 220 Thr Val Glu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ser Glu Ser Tyr Val Thr 225 230 235 240 Gly Ser His Glu Phe Tyr Leu Gly Tyr Ala Val Ser Arg Asn Val Gly 245 250 255 Val Cys Leu Asp Met Gly His Phe His Pro Thr Glu Thr Ile His Asp 260 265 270 Lys Ile Ser Ser Leu Val Leu Phe Val Pro His Val Leu Ile His Met 275 280 285 Ser Arg Gly Val Arg Trp Asp Ser Asp His Val Val Leu Phe Thr Asp 290 295 300 Asp Val Arg Ala Val Ala Ala Glu Met Val Arg Leu Gly Arg Trp Glu 305 310 315 320 Lys Ile His Leu Ala Val Asp Tyr Phe Asp Ala Ser Ile Asn Arg Ile 325 330 335 Leu Ala Trp Val Ile Gly Ala Arg Ala Val Gln Lys Ala Leu Leu Ser 340 345 350 Ala Phe Leu Glu Pro Val Gly Arg Leu Glu Glu Leu Glu Ala Glu Gly 355 360 365 Arg Leu Gly Glu Arg Leu Ala Leu Met Glu Asp Val Lys Ser Leu Pro 370 375 380 Phe Ala Ala Val Trp Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Gln Asp Val Pro Leu 385 390 395 400 Asp Val Glu Trp Ile Arg Glu Val Glu Ala Tyr Glu Arg Gln Val Leu 405 410 415 Ser Lys Arg Thr 420 <210> 2 <211> 1263 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Polynucleotide coding L-Rhamnose isomerase derived from Spirochaeta thermophila <400> 2 atgacatcga acgacagagt tgaacgggcc ttcgaagagg cgaaggctcg gtacgcggac 60 ctcggtgtgg atgtggaggc cgcggtgaag aggtgtgcgg agatccccgt ctccatccac 120 tgctggcagg gcgacgatgt ggtggggctt gagggtaagg atacgctctc tggtgggggt 180 atcctcgcga ccggcaacta cccgggaagg gcgcggagcg gtgacgagct ccgccaggat 240 gcggccaagg ccttctccct cgtcccgggg acgaagcgtt tcaacctcca cgcgatgtat 300 gcggagaccg aggggaagcg ggtggacagg gacgccctcg aaccgagaca ctttgagaag 360 tgggtggagt gggccaagtc tttgggaata gggctcgact tcaatcccac cttcttctcc 420 catcccctgg cggattcggg gttcaccttg agccatccgg acgagggtgt gcgggccttc 480 tgggtgagac acgccatcgc ctgcgagcgg atcgctgcgt atttcgcctc tgagctggat 540 ggggtgtgca tcaacaacct ctggatcccg gacggctgga aggacatccc cgtcgacagg 600 ctgggaccca gggagcggct gctcgcatcg ctcgacgaga tctacaggga gcgtctcccg 660 ggtgtgatcg acacggtgga gtccaagctc ttcggcatcg gttcggaatc ctatgtgacc 720 ggctcgcacg agttctatct gggctatgcg gtgagccgga acgtgggcgt gtgtctcgac 780 atgggccact tccatcccac cgagacgatc cacgacaaga tctcctcgct cgtcctcttc 840 gttccacacg tgctcatcca catgagcaga ggggtgcggt gggattcgga ccacgtggtg 900 ctcttcacgg acgacgtgcg tgcggtggca gccgagatgg tgcgtctcgg taggtgggag 960 aagatacacc tcgccgtgga ctacttcgat gcgagcatca accgtatcct cgcgtgggtg 1020 atcggtgccc gggccgtgca gaaggccctc ctctcggcct tcctcgaacc ggtgggccgt 1080 ctcgaggagc tcgaagcgga ggggcgcctc ggtgaacggc tcgccctcat ggaggatgtg 1140 aagagcctcc cgtttgccgc ggtgtgggat tactactgtc tctcccagga tgtgcccctc 1200 gatgtggagt ggatccgcga ggtggaggcc tacgagagac aggtgctttc gaagcggacc 1260 tga 1263 <210> 3 <211> 425 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> L-Rhamnose isomerase derived from Clostridium stercorarium <400> 3 Met Tyr Leu Tyr Asn Lys Asp Arg Ile Glu Gln Asp Tyr Lys Ala Ala 1 5 10 15 Lys Glu Ile Tyr Ala Ala Tyr Gly Val Asp Thr Asp Arg Val Met Glu 20 25 30 Glu Met Lys Thr Ile Pro Val Ser Ile His Cys Trp Gln Gly Asp Asp 35 40 45 Val Val Gly Phe Glu Asn Ala Gly Gly Thr Ser Ser Gly Gly Ile Met 50 55 60 Ala Thr Gly Asn Tyr Pro Gly Arg Ala Arg Asn Gly Asp Glu Leu Arg 65 70 75 80 Gln Asp Met Asp Lys Ala Leu Ser Leu Ile Pro Gly Lys His Arg Val 85 90 95 Asn Ile His Ala Met Tyr Ala Glu Thr Gly Gly Lys Lys Val Asp Arg 100 105 110 Asp Glu Ile Thr Val Glu His Phe Gln Arg Trp Ile Asp Trp Ala Arg 115 120 125 Glu Lys Gly Ile Gly Ile Asp Phe Asn Pro Thr Phe Phe Ala His Pro 130 135 140 Leu Ala Asp Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Asn Pro Asp Glu Lys Ile Arg 145 150 155 160 Lys Phe Trp Ile Glu His Ala Lys Arg Ser Arg Glu Ile Ala Ala Ala 165 170 175 Ile Gly Lys Ala Leu Asn Ser Pro Cys Val Asn Asn Ile Trp Ile Pro 180 185 190 Asp Gly Ser Lys Asp Leu Pro Ala Asp Arg Ile Thr Lys Arg Gln Ile 195 200 205 Leu Lys Glu Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Lys Lys Tyr Asp Arg Asn 210 215 220 Phe Leu Val Asp Ser Val Glu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ser Glu 225 230 235 240 Ser Tyr Val Val Gly Ser His Glu Phe Tyr Met Gly Tyr Val Met Ser 245 250 255 Arg Asp Asp Val Ile Leu Cys Leu Asp Ala Gly His Phe His Pro Thr 260 265 270 Glu Thr Ile Ala Asp Lys Ile Ser Ser Ile Leu Ala Phe Lys Asp Glu 275 280 285 Leu Leu Leu His Val Ser Arg Gly Val Arg Trp Asp Ser Asp His Val 290 295 300 Val Ile Phe Asn Asp Asp Thr Leu Ala Ile Ala Gln Glu Ile Lys Arg 305 310 315 320 Cys Asp Ala Tyr Arg Lys Val His Ile Ala Leu Asp Phe Phe Asp Ala 325 330 335 Ser Ile Asn Arg Ile Thr Ala Trp Val Thr Gly Thr Arg Ala Thr Leu 340 345 350 Lys Ala Ile Met Tyr Ser Leu Leu Glu Pro Thr His Leu Leu Val Glu 355 360 365 Ala Glu Lys Asp Gly Asn Leu Gly Asn Arg Leu Ala Leu Met Glu Glu 370 375 380 Phe Lys Ala Leu Pro Phe Gly Ala Val Trp Asn Lys Tyr Cys Ala Glu 385 390 395 400 Asn Asn Val Pro Val Gly Ser Ala Trp Leu Glu Glu Val Arg Lys Tyr 405 410 415 Glu Glu Glu Val Leu Ser Leu Arg Lys 420 425 <210> 4 <211> 1278 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Polynucleotide coding L-Rhamnose isomerase derived from Clostridium stercorarium <400> 4 atgtatttat acaacaagga cagaattgag caggactaca aagccgcaaa ggaaatatac 60 gcagcatatg gtgttgatac cgacagggtt atggaagaaa tgaaaacaat cccggtttca 120 attcactgct ggcagggcga tgacgttgta gggtttgaaa atgcgggcgg aacgtccagc 180 ggcggaataa tggccaccgg aaattacccc ggcagggcgc gtaacggcga tgagttaaga 240 caggacatgg acaaagcgtt gagtttaatc cccgggaaac acagggttaa tattcatgcg 300 atgtatgcag agaccggcgg taaaaaagtg gatcgggacg aaataaccgt tgaacatttt 360 cagcgctgga tagactgggc aagggaaaaa ggtatcggaa tagatttcaa tcccacgttt 420 tttgcacatc ctctcgccga ttcaggttat actctttcaa atcccgatga aaaaatacgt 480 aaattctgga tagaacatgc caaacgttca agagaaattg ccgcggcaat aggtaaggcg 540 ttaaattcac cttgcgtgaa caatatatgg attcctgacg gttcaaagga tttgcctgcc 600 gacaggataa caaaacggca aatattgaaa gaagctcttg atgaaatact ggataagaaa 660 tacgacagaa actttcttgt cgattcagtg gaatcaaagc ttttcggcat cggttccgaa 720 agctatgttg taggttccca cgaattctat atgggatatg tgatgagccg tgacgatgta 780 attctttgcc ttgatgccgg acatttccat cccaccgaaa caatagccga caaaatttct 840 tcaattctgg ccttcaagga tgaactgctg ctgcatgtga gccgcggggt acgctgggac 900 agcgaccatg tggttatatt caatgacgat actttggcga tagcgcagga gattaagaga 960 tgcgacgcat accggaaggt tcacattgcc ctcgatttct ttgatgcgtc aataaacaga 1020 atcaccgcat gggtaaccgg aacaagggca acactgaaag ctattatgta ttcattgctt 1080 gagcccacac acctgctggt tgaagcggaa aaagacggta atctcggaaa caggcttgcg 1140 ctgatggaag aatttaaggc gctgcctttt ggtgcggtat ggaacaaata ctgtgctgaa 1200 aacaatgtac ctgttggatc ggcatggctg gaagaagtga ggaaatacga ggaagaagtg 1260 ctgtccttaa gaaagtga 1278

Claims (10)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 포함하는 알로스(allose) 제조용 조성물.
   
2. 재조합 균주, 이의 배양액 또는 이의 파쇄물에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 조성물로서,
   상기 재조합 균주는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 제조용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 제조용 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 4의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 제조용 조성물.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 제조용 조성물.
   
6. 알룰로스(allulose) 또는 이를 포함하는 기질 용액을 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소 또는 상기 람노스 이성화효소를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알로스(allose) 제조방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 반응 온도는 55~65℃이고 반응 pH는 6.0~7.0이고 반응 초기의 알룰로스(allulose) 농도는 5~30%(w/v)인 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 제조방법.
   
8. 알룰로스(allulose) 또는 이를 포함하는 기질 용액을 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양액, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 제조방법으로서,
   상기 재조합 균주는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 람노스 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 제조방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 제조방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 반응 온도는 55~65℃이고 반응 pH는 6.0~7.0이고 반응 초기의 알룰로스(allulose) 농도는 5~30%(w/v)인 것을 특징으로 하는 알로스(allose) 제조방법.

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